Nghiên Cứu Phát Triển Quy Trình Phát Hiện Vi Khuẩn Burkholderia Pseudomallei Bằng Kỹ Thuật Loop-Mediated Isothermal Amplification (Lamp) Tại Hiện Trường..pdf

Tên mồi Trình tự 5’-3’ 3.2.2 Tối ƣu phản ứng LAMP 3.2.2.1 Tối ƣu nhiệt độ phản ứng LAMP Nhận thấy ở tất cả các nhiệt độ, gen đích đều được khuếch đại tạo thành những băng dạng C khi bă

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CẤN DUY HƯNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

VI KHUẨN Burkholderia pseudomallei BẰNG KỸ THUẬT LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION

(LAMP) TẠI HIỆN TRƯỜNG

Ngành: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8420101.22

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 2021

Luận văn được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Văn Tổng

TS Trần Thị Thanh Huyền

Phản biện:

1 TS Bùi Tiến Sỹ

2 TS Bùi Thị Việt Hà

Luận văn được bảo vệ vào hồi 14:00 ngày 25/11/2021 tại phòng 327T1 trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

MỞ ĐẦU

Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei (B pseudomallei) là một trực khuẩn Gram âm sinh

sống trong môi trường tự nhiên tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới đặc biệt phân bố rộng rãi

tại vùng đông bắc Thái Lan và bắc Australia Vi khuẩn B pseudomallei xâm nhập vào cơ thế người

và động vật thông qua các vết xước ngoài da, các sol khí hay qua đường tiêu hóa và gây bệnh melioidosis

Melioidosis là một căn bệnh nhiễm trùng cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao, lên tới 40% cả khi được điều trị Một trong những nguyên nhân gây tử vong cao của bệnh là bệnh cảnh đa dạng giống với các bệnh thông thường khác, gây khó khăn cho các bác sĩ lâm sàng trong việc chẩn đoán Bên cạnh đó, bệnh có thời gian tiến triển nhanh (48 – 72 giờ) và có thể gây biến chứng nguy hiểm dẫn tới tử vong cho người bệnh

Việt Nam là Quốc gia nằm trong khu vực Đông Nam Á, toàn bộ lãnh thổ nằm trong vùng nhiệt đới, thuộc vùng lưu hành cao của bệnh và cũng là Quốc gia có tỷ lệ người dân làm nông nghiệp cao trên thế giới Do số lượng người dân làm canh tác nông nghiệp và tiếp xúc trực tiếp với

môi trường tự nhiên (đất, nước) cao dẫn tới tỉ lệ lây nhiễm vi khuẩn B pseuodomallei cao hơn so

với những Quốc gia khác

Theo thống kê, số ca bệnh melioidosis trên thế giới đạt 165,000 ca mỗi năm Tại Việt Nam, hàng năm vẫn có những ca bệnh melioidosis được báo cáo và thu thập với số lượng tăng dần qua Riêng trong năm 2020, số lượng ca bệnh tăng vọt tại các tỉnh thành miền trung (Huế, Quãng Ngãi)

sau các trận bão, lũ kéo dài cho thấy mức độ lây nhiễm nhanh của vi khuẩn B pseudomallei từ môi

trường

Hiện nay, nuôi cấy vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán vi khuẩn B

pseudomallei Tuy nhiên, phương pháp này tốn thời gian, trung bình từ 2 đến 3 ngày, điều này gây

khó khăn đối với các trường hợp bệnh nhân có tốc độ tiến triển nhanh, gây khó khăn trong công tác điều trị Bên cạnh đó, độ nhạy của kỹ thuật không cao, việc phát hiện khuẩn lạc dựa trên hình thái khuẩn lạc và các đặc tính sinh hóa phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của kĩ thuật viên do vi khuẩn này có hình thái phát triển giống với các chủng vi khuẩn gây bệnh thông thường dẫn đến bỏ sót trong chẩn đoán bệnh

Trong hơn một thập kỷ gần đây, bên cạnh các kỹ thuật phân tử khuếch đại axit nucleic bằng phương pháp luân nhiệt như PCR thì việc ứng dụng phát triển các kỹ thuật đẳng nhiệt như LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) đã giúp cho việc phát hiện các tác nhân gây bệnh được đơn giản hóa, nhanh và chính xác hơn Hơn nữa, sản phẩm của phản ứng có thể được phát hiện bằng mắt thường thông qua việc sử dụng các chỉ thị màu là một điểm nổi trội đặc biệt của phương

pháp này giúp rút ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm được chi phí đầu tư các trang thiết bị đắt

tiền đi kèm

Tại Việt Nam, nuôi cấy vẫn là phương pháp chủ đạo trong chẩn đoán melioidosis, các

phương pháp phân tử với độ chính xác cao hầu hết chỉ được thực hiện tại các cơ sở y tế lớn Đối

với các khu vực hạn chế về trang thiết bị, việc phát hiện vi khuẩn B pseudomallei hay các tác nhân

vi sinh vật khác vẫn là một khó khăn lớn Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát

triển quy trình phát hiện vi khuẩn Burkholderia pseudomallei bằng kỹ thuật Loop-mediated

isothermal amplification (LAMP) tại hiện trường” với các mục tiêu:

1 Thiết lập phản ứng LAMP đặc hiệu phát hiện vi khuẩn B pseudomallei

2 Thiết lập quy trình phát hiện vi khuẩn B pseudomallei tại hiện trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Bệnh melioidosis

1.1.1 Tìm hiểu chung

1.1.2 Dịch tễ học

1.1.2.1 Trên thế giới

1.1.2.2 Tại Việt Nam

1.1.3 Triệu chứng

1.1.3.1 Thể cấp tính

1.1.3.2 Thể mạn tính

1.1.3.3 Thể tiềm ẩn

1.1.4 Điều trị

1.2 Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei

1.2.1 Đặc điểm sinh học

1.2.2 Đặc điểm hình thái

1.2.3 Đặc điểm hệ gen

1.2.4 Các yếu tố độc lực

1.2.5 Phân bố trong tự nhiên

1.3.1 Nguyên lý kỹ thuật LAMP

1.3.2 Đánh giá kết quả của LAMP

1.3.2.1 Đánh giá kết quả bằng điện di

1.3.2.2 Đánh giá kết quả không bằng điện di

1.4 Tính ưu việt của kỹ thuật LAMP

1.5 Một số ứng dụng của kỹ thuật LAMP trong phát hiện tác nhân gây bệnh

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực hiện nghiên cứu

2.1.2 Hóa chất sinh phẩm

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Thu thập mẫu

2.2.2.2 Nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

2.2.2.3 Tách chiết DNA vi khuẩn

2.2.2.4 PCR và giải trình tự vùng gen TTSSs – 1 của vi khuẩn B pseudomallei 2.2.2.5 Phản ứng LAMP xác định vi khuẩn B pseudomallei

2.2.2.6 Kỹ thuật Real Time PCR

2.2.2.7 Kỹ thuật điện di

2.2.2.8 Kỹ thuật tinh sạch DNA sau điện di

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả PCR xác định vùng trình tự TTSSs – 1 của vi khuẩn B pseudomallei

Phản ứng PCR được thiết kế dựa trên cặp mồi khuếch đại vùng trình tự gen TTSSs – 1 đặc

trưng của vi khuẩn B pseudomallei Kết quả PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và soi dưới

đèn UV

Các băng điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen TTSS-1 sau khi tinh sạch bằng Kit Thermo GenJET Gel Extraction và điện di kiểm tra đều cho kết quả đơn băng DNA với chiều dài đúng 740

bp có độ sáng cao, không có hiện tượng vệt mờ kèm theo

Toàn bộ mẫu được gửi đi giải trình tự đều thỏa mãn với nồng độ cao hơn 40 ng/μL theo chỉ

hiện phân tích, so sánh với trình tự của chủng đối chứng của vi khuẩn B pseudomallei K96243

(trên Genbank) và tìm kiếm vùng trình tự bảo tồn phục vụ cho việc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP

Theo trình tự thu nhận sau khi thực hiện giải mã, mẫu giải trình tự cho tín hiệu rõ ràng, riêng biệt Mỗi loại nucleotide cho tín hiệu riêng với màu sắc khác nhau được phân biệt bởi máy giải trình tự Các tín hiệu không có sự chồng chéo hay giao thoa với nhau Trình tự nucleotide sẽ được phân tích, so sánh với trình tự tham chiếu sử dụng phần mềm Bioedit

Sử dụng công cụ ClustalW Multiple Alignment của phần mềm Bioedit trong việc khảo sát so sánh trình tự của các chủng nghiên cứu Vùng trình tự bảo tồn chung tương đồng nhau giữa các chủng được lựa chọn là vùng trình tự giống nhau, không có sự sai khác giữa các nucleotide, độ dài của vùng trình tự phụ thuộc vào sản phẩm của phản ứng LAMP Trong nghiên cứu này, nhóm

nghiên cứu lựa chọn vùng trình tự thuộc vùng gen TTSSs – 1 của chủng vi khuẩn B pseudomallei

làm vùng đặc hiệu được hướng đến phục vụ cho việc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP

3.2 Thiết kế phản ứng LAMP xác định vi khuẩn B pseudomallei

3.2.1 Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP

Sử dụng phần mềm PrimerExproler V5 với vùng trình tự bảo tồn của gen T3SS1 lựa chọn để

thiết kế mồi LAMP Các bộ mồi được lựa chọn theo một số tiêu chí chính đã được khuyến cáo

C

dao động từ 40% đến 65% Mồi được lựa chọn phải ít có khả năng tạo cấu trúc bậc 2 Kiểm tra độ đặc hiệu lý thuyết của các mồi bằng công cụ Blast của NCBI để đảm bảo các bộ mồi có độ đặc hiệu cao với gen đích Dựa vào những tiêu chí trên, bộ mồi được thiết kế có trình tự như sau:

Tên mồi Trình tự (5’-3’)

3.2.2 Tối ƣu phản ứng LAMP

3.2.2.1 Tối ƣu nhiệt độ phản ứng LAMP

Nhận thấy ở tất cả các nhiệt độ, gen đích đều được khuếch đại tạo thành những băng dạng

C khi băng khuếch đại xuất hiện không rõ, các nhiệt độ khác đều cho kết quả tương đồng từ sự đổi màu rõ rệt từ cam sang xanh

lá của SYBR, các băng điện di xuất hiện rõ, riêng biệt Kết quả này có sự khác biệt với nhiệt độ thực hiện phản ứng LAMP của nhóm tác giả Narisara và cộng sự với nhiệt độ ủ được thực hiện tại

được chọn làm nhiệt độ tối ưu cho phản ứng LAMP

3.2.2.2 Tối ƣu thời gian phản ứng LAMP

Kết quả cho thấy: sau 30 phút gen đích đã được khuếch đại với lượng sản phẩm đủ lớn để phát hiện bằng phương pháp điện di trên gel agarose Sau 45 phút, sản phẩm khuếch đại với số lượng lớn, hình thành các băng rõ nét, dễ nhận biết Thời gian phản ứng 45 phút cũng nằm trong

khoảng thời gian đề xuất tối ưu theo enzyme Bst polymerase của nhà sản xuất Do đó, chúng tôi lựa chọn thời gian tối ưu cho phản ứng LAMP khuếch đại gen đích phát hiện vi khuẩn B pseudomallei

là 45 phút

3.2.2.3 Tối ƣu nồng độ enzyme Bst DNA polymerase phản ứng LAMP

Kết quả cho thấy tại nồng độ 40 U/ml phản ứng đã diễn ra và cho kết quả tương đồng với các giá trị còn lại Trong đó kết quả với nồng độ 160 và 320 (U/ml) cho kết quả tương đồng với nhau, đều rõ ràng hơn so với nồng độ 40 và 80 Tuy nhiên chúng tôi lựa chọn nồng độ 80 U/ml là nồng

độ tối ưu thực hiện phản ứng LAMP để đảm bảo phản ứng vẫn diễn ra mà vẫn tiết kiệm được chi phí

3.2.2.4 Tối ƣu nồng độ MgSO 4 phản ứng LAMP

Nồng độ MgSO4 có ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp DNA của phản ứng LAMP Kết quả khảo sát cho thấy ở nồng độ MgSO4 6mM phản ứng LAMP cho kết quả băng mục tiêu chính xác,

rõ nét nhất Do vậy nồng độ MgSO4 6mM được chọn là tối ưu cho phản ứng LAMP xác định B

pseudomallei

3.2.2.5 Tối ƣu nồng độ mồi phản ứng LAMP

Theo kết quả khảo sát, sản phẩm khuếch đại DNA với tỷ lệ mồi tương ứng với tỷ lệ (2 : 1 : 2) và (4 : 1 : 2) đều xuất hiện các băng cho kết quả mờ tách biệt nhau Với tỉ lệ mồi (8 : 2 : 1) và (10 : 2 : 1) cho kết quả rõ ràng với các băng khuếch đại đậm màu, tách tời Với mẫu sử dụng tỉ lệ mồi (12 : 2 : 1) cho kết quả các băng khuếch đại rõ nét nhất Song dựa trên kết quả khảo sát, chúng tôi lựa chọn tỉ lệ mồi tối ưu trong phản ứng LAMP là (8 : 2 : 1)

3.2.2.6 Tối ƣu thể tích DNA sử dụng phản ứng LAMP

Trong thí nghiệm này, kết quả giữa các thể tích khác nhau không có sự khác biệt lớn Phản ứng LAMP có thể khuếch đại đoạn gen đích lên số lượng lớn chỉ với lượng khuôn thấp ban đầu Thế tích 2 μL được sử dụng làm thể tích DNA khuôn đưa vào tối ưu và sử dụng trong các thí nghiệm sau

3.2.2.7 Tối ƣu nồng độ dNTPs phản ứng LAMP

Dựa vào kết quả khảo sát, tất cả các thể tích tham gia phản ứng đều cho kết quả dương tính Tại các nồng độ 1 và 1,2 mM, kết quả băng khuếch đại mờ, trong khi 2 nồng độ dNTPs 1,4 và 1,6

mM cho kết quả tương đồng với băng rõ ràng Do đó, 1,4 mM được lựa chọn làm nồng độ tối ưu cho các phản ứng tiếp theo

3.2.2.8 Tối ƣu nồng độ SYBR sử dụng trong phản ứng LAMP

Theo kết quả thực hiện khảo sát cho thấy, màu SYBR đổi màu đối với tất cả các ống phản ứng đúng theo lý thuyết Trong điều kiện ánh sáng thường, màu sáng của ống 40X xanh đậm, nổi bật hơn hẳn so với 2 ống 20X và 10X còn lại, điều này xảy ra tương tự đối với cả 2 trường hợp bổ sung SYBR trước và sau phản ứng Ống chứa SYBR nồng độ 10X của cả 2 trường hợp cho kết quả xanh nhạt tương tự nhau và vẫn có thể quan sát thấy đổi màu bằng mắt thường Đối với ống chưa SYBR với nồng độ 20X, tại ống được tra SYBR sau, màu xanh chuyển màu đậm hơn so với màu SYBR của ống được tra trước Tuy nhiên sự khác biệt là không nhiều Khi được soi dưới ánh sáng

UV, các tube 40X của cả hai trường hợp đều phát sáng mạnh, không còn nhìn rõ màu xanh của tube Trường hợp tube được tra trước, tube 20X và tube 10X cho màu xanh lá nổi bật và ít có sự khác biệt về cường độ Trường hợp tube được tra sau, tube 20X trở nên sáng mạnh hơn hẳn so với

tube 10X Trong tất cả các trường hợp, khác biệt dễ nhận thấy nhất là 2 tube 20X của 2 trường hợp khi tube được tra sau phát sáng mạnh hơn so với tube được tra SYBR trước Sản phẩm điện di của

cả 6 mẫu là tương tự nhau, hầu như không có sự khác biệt Các băng điện di đều và rõ nét

3.3.1 Ngƣỡng phát hiện của phản ứng LAMP

Kết quả cho thấy phản ứng LAMP có thể phát hiện được gen đích với nồng độ tối thiểu là 4 bản copy của gen trên một phản ứng Tại nồng độ pha loãng thấp hơn (2 copies/phản ứng), không

có sự xuất hiện của các băng DNA đặc trưng Do đó, đối với mẫu chứng dương là plasmid được sử dụng, phản ứng LAMP có ngưỡng phát hiện với số lượng tối thiểu 2 copies trong phản ứng

3.3.2 Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng LAMP

Kết quả cho thấy, chỉ DNA từ vi khuẩn B pseudomallei được khuếch đại gen TTSSs-1 tạo

thành các dải DNA như trên hình, trong khi đó các mẫu đối chứng đều không Điều này chứng tỏ

các cặp mồi LAMP được thiết kế có độ đặc hiệu cao đối với vi khuẩn B pseudomallei

3.3.3 Đánh giá độ nhạy của phản ứng LAMP

3.3.3.1 Thiết lập mẫu giả định chứa vi khuẩn B pseudomallei

Mẫu vi khuẩn được sử dụng để gây nhiễm là chủng vi khuẩn B pseudomallei đang được

nuôi trong dung dịch sau khi phân lập thành công Nồng độ ban đầu của mẫu gây nhiễm được xác định bằng phản ứng Real – time PCR

đến 10-1 trước khi trộn với cùng một thế tích mẫu Hỗn hợp được tiến hành tách DNA bằng kit thương mại bằng phương pháp Shock nhiệt trước khi được thực hiện chấn đoán bằng phương pháp LAMP

3.3.3.2 Độ nhạy của phản ứng LAMP trên mẫu máu toàn phần

Khi thực hiện xử lý mẫu bằng kit tách chiết thương mại, kỹ thuật LAMP cho kết quả phát

màu xanh Mặc dù sự đổi màu có sự khó khăn trong việc quan sát bằng mắt thường trong điều kiện chiếu sáng qua ánh sáng UV và qua sự khẳng định bằng hình thức điện di Phản ứng realtime PCR cho kết quả khả quan hơn đối với các mẫu được xử lý bằng việc sử dụng kit thương mại khi cho khả năng phát hiện mẫu với số lượng tối thiểu tới 100 copy/µl

nhiên điều này chỉ thể hiện rõ khi thực hiện phản ứng điện di đối với sản phẩm sau quá trình khuếch đại, do sự đổi màu của dung dịch không có sự thay đổi nhiều nếu quan sát bằng mắt thường Phản ứng real time PCR cho thấy sự hạn chế trong việc phát hiện khi tín hiệu khuếch đại lên ở nồng độ 103 copies/µl

3.3.3.3 Độ nhạy của phản ứng LAMP trên mẫu huyết tương

Qua kết quả thực hiện, khi xử lý mẫu bằng kit thương mại, phản ứng LAMP cho kết quả phát hiện với nồng độ thấp nhất là 101 copy/µl, thể hiện đồng thời bằng qua 3 hình thức đánh giá kết quả

là bằng mắt thường khi dung dịch có sự đổi màu qua xanh lá tương phản với ống âm tính không có

sự đổi màu, qua sự phát sáng nổi trội của những mẫu dương tính dưới ánh sáng UV hay qua hình

copy/µl, cho thấy sự nhạy của phản ứng đối với tác nhân gây bệnh

Khi mẫu huyết tương được xử lý bằng phương pháp shock nhiệt, cả hai phương pháp LAMP

và real time PCR đều cho thấy sự ổn định và độ nhạy cao với việc đều phát hiện tại nồng độ tối

là: sự đổi màu tại điều kiện thường khi phản ứng tạo sản phẩm khuếch đại sẽ đổi màu dung dịch sang xanh tương phản với ống nghiệm âm tính không màu; sự phát sáng nổi trội dưới ánh sáng UV

và việc thực hiện bằng hình thức điện di sản phẩm

3.3.3.4 Độ nhạy của phản ứng LAMP trên mẫu nước tiểu

Thực hiện khảo sát trên mẫu nước tiểu, đối với phương pháp tách DNA bằng Kit thương mại (A) Phản ứng LAMP cho độ nhạy thấp hơn so với các mẫu lâm sàng trước đó (máu, huyết tương) khi chỉ phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn khi nồng độ DNA trong dung dịch lớn hơn 103 copy/µl Độ nhạy này áp dụng với cả ba trường hợp đánh giá của phản ứng LAMP là mắt thường (sự đổi màu); sự phát sáng dưới ánh sáng UV và quá trình điện di Ngược lại với LAMP, phản ứng real time PCR vẫn cho thấy sự ổn định đối với các mẫu được xử lý bằng kit thương mại khi phát hiện được tác nhân với nồng độ thấp nhất là 100 copy/µl

Khi sử dụng phương pháp shock nhiệt trong việc xử lý các mẫu nước tiểu, phản ứng LAMP

các mẫu dưới ánh sáng UV khi sự khác biệt giữa các mẫu âm hay dương tính và không nổi trội thì hai trường hợp đánh giá còn lại, người thực hiện có thể dễ dàng phân biệt những trường hợp dương

copy/µl, có sự giảm nhẹ

copy/µl và tăng đối với mẫu máu là 103 copy/µl

Như vậy, bước đầu đánh giá với việc sử dụng ba loại mẫu lâm sàng đặc trưng trong việc chẩn đoán bệnh là mẫu máu, huyết tương và nước tiểu, thông qua hai phương pháp tách chiết DNA