Nghiên cứu phương pháp xác Định một số paraben trong mẫu cá bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (lc ms ms)

Nghiên cứu phương pháp xác định một số paraben trong mẫu cá bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC MS MS)

TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ PARABEN

Paraben (các ester của p-hydroxybenzoic acid) được biết đến là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học được sử dụng trong nhiều loại sản phẩm chăm sóc cá nhân, dược phẩm và thực phẩm Từ những năm 1920, paraben đã được được sử dụng như những chất bảo quản lý tưởng nhất do đặc tính ức chế sự phát triển của nấm nem và sinh vật, làm tăng thời hạn sử dụng mà không làm thay đổi tính chất của sản phẩm và chi phí sản xuất thấp [54] Một số paraben được tìm thấy trong tự nhiên; tuy nhiên hầu hết các paraben dùng trong thương mại được tổng hợp từ phản ứng ester hóa acid p-hydroxybenzoic và alcohol tương ứng (methanol, ethanol, n-propanol,…) với sự có mặt của xúc tác thích hợp (acid sulfuric đậm đặc hoặc acid p- toluenesulfonic) [70]

Hình 1.1 Cấu tạo chung của paraben

Công thức hóa học chung của các paraben là para-hydroxybenzoate trong đó

R có thể là nhóm alkyl hay aryl Cấu trúc khác nhau của gốc R sẽ dẫn đến những tính chất hóa học và tính chất vật lý rất riêng biệt của các paraben, từ đó làm thay đổi hoạt tính sinh học của chúng [49] Một số paraben thường gặp (do được sử dụng phổ biến) bao gồm methylparaben (MeP), ethylparaben (EtP), propylparaben (PrP), iso- propylparaben (iPrP), butylparaben (BuP), benzylparaben (BzP), heptylparaben (HeP), trong đó phổ biến là methylparaben và ethylparaben

Bảng 1.1: Một số paraben được tổng hợp và sử dụng phổ biến

STT Tên gọi Viết tắt CTPT KLPT

7 Benzyl paraben BzP C14H12O3 228,24 Ở điều kiện thường, các paraben là những tinh thể không màu hoặc màu trắng, không mùi, không vị Methylparaben (MeP), propylparaben (PrP), iso-propylparaben

(iPrP) tan trong nước tốt hơn so với các paraben còn lại, nhìn chung các paraben đều tan tốt trong dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, glycerol, propylene glycol) Mặc dù ít tan trong nước nhưng độ tan của paraben vừa đủ để cho phép tạo được nồng độ có tác dụng, đồng thời độ tan giảm dần theo chiều tăng chuỗi alkyl [72]

Paraben ổn định trong môi trường acid, còn trong môi trường môi trường kiềm, paraben có thể bị thủy phân thành hydroxybenzoic và alcohol tương ứng Theo đó, đối với sự thủy phân, sự gia tăng chiều dài chuỗi alkyl thì tính kháng khuẩn của paraben càng tăng lên [49]

Một số nghiên cứu trước đây đã ghi nhận được methylparaben bị thủy phân do acid p-hydroxybenzoic trong nước, với thời gian bán hủy (t1/2) từ vài chục giờ đến vài ngày dưới điều kiện môi trường sinh học khác nhau Paraben đã được mô tả là dễ phân hủy sinh học trong điều kiện hiếu khí, với khả năng phân hủy sinh học khoảng 90% nhu cầu oxy lý thuyết (đối với MeP, EtP và PrP) [70] Tuy nhiên, một nghiên cứu lại cho rằng việc phân hủy sinh học trong bùn hoạt tính được thực hiện dễ hơn các quá trình phi sinh học hấp phụ [49] Kết quả đã chỉ ra một số paraben mục tiêu với chuỗi alkyl ngắn bao gồm MeP, EtP, PrP, BuP, iBuP gần như hoàn toàn phân hủy sinh học (99%) trong vòng dưới 5 ngày, với thời gian bán hủy đều không vượt quá 3 ngày Độ bền của các hợp chất tăng lên theo chiều dài của chuỗi alkyl và mức độ chlor hóa Thời gian bán hủy của dẫn xuất halogen hóa của methylparaben lên đến 10 ngày

Bảng 1.2: Tính chất vật lý của một số paraben

MeP EtP PrP i PrP BuP BzP HeP

Nhiệt độ sôi (C) 270,5 297,5 132,8 – 181,0 – – Độ tan trong nước ở

(Dữ liệu được tổng hợp từ Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (Us Environmental Protection Agency’s EPT Suite TM ))

1.1.2 Đặc tính kháng khuẩn của paraben

Paraben có hoạt tính sát khuẩn và diệt nhiều loại vi nấm do chúng làm thay đổi đặc tính của màng tế bào, khiến cho cấu trúc lớp màng thay đổi và làm cho các chất tan trong tế bào bị rò rỉ ra ngoài [17] Paraben được cho là phá vỡ quá trình vận chuyển chất qua màng hoặc ức chế tổng hợp ADN và ARN hoặc một số enzyme quan trọng Trong một nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn của bốn loại paraben gồm MeP, EtP, PrP, BuP đối với vi khuẩn gây bệnh sâu răng, kết quả thu được cho thấy khả năng kháng khuẩn của paraben tăng dần theo chiều tăng của chuỗi alkyl Tuy nhiên khả năng tan trong nước lại giảm dần, trong khi vi khuẩn và nấm men thường phát triển trong môi trường ẩm ướt Do vậy các đồng phân có chuỗi alkyl ngắn thuờng được lựa chọn với mục đích bảo quản [10] Để tăng hiệu quả bảo quản, các paraben được sử dụng kết hợp với nhau Ví dụ trong nhiều loại thuốc tiêm chích, người ta phối hợp 0,18% MeP với 0,02% PrP để làm chất bảo quản sát khuẩn [59] Hoạt tính kháng khuẩn của paraben mạnh nhất với vi khuẩn gram dương và kém nhất với

Paraben có tính ổn định hóa học cao trong một số khoảng biến thiên nhiệt độ rộng và dải pH từ 3 đến 8 [22] Do có tính trơ về mặt hóa học, paraben ít khi phản ứng với các thành phần trong sản phẩm Paraben không màu, không vị, không gây ra sự thay đổi trong tính đồng nhất và màu sắc của sản phẩm [5] Sự kết hợp của các tính chất này làm cho việc tìm kiếm một chất bảo quản thay thế thỏa đáng cho paraben sẽ tương đối khó khăn Các loại mỹ phẩm không chứa paraben thường có giá thành đắt và thời hạn sử dụng ngắn Một số chất bảo quản thông dụng khác bao gồm

5 formaldehyde (dung dịch trong nước còn gọi là formol), quaternium-15, imidazolidinyl ure, diazolidinyl ure và dimethylodimethyl hydantoin được đề xuất áp dụng nhưng chúng thường gây dị ứng và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người [41] Việc thay thế sử dụng chất bảo quản tự nhiên cũng đã được thử nghiệm, bao gồm chiết xuất từ hạt nho (GSE) Tuy nhiên, GSE có thể tương tác với các thuốc do khả năng ức chế CYP3A4 - một enzyme quan trọng liên quan đến sự chuyển hóa của thuốc [43] Các chất bảo quản tự nhiên khác bao gồm thymol, cinamaldehyde, alkyl isothiocyanate, acid ascobic và chiết xuất thảo mộc cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong ống nghiệm, tuy nhiên một vài nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn trong thực phẩm tiêu dùng đã đem lại kết quả không rõ ràng [41] Vì vậy, paraben vẫn được lựa chọn là chất bảo quản trong nhiều ngành công nghiệp với các hợp chất mạch alkyl ngắn đơn chất hoặc kết hợp trong khoảng nồng độ cho phép

1.1.3 Tác động của paraben đối với cơ thể con người

Mặc dù các hóa chất này được sử dụng rộng rãi gần một thế kỷ nhưng nhiều vấn đề liên quan đến tác động của chúng đối với sức khỏe con người vẫn chưa được giải thích hoàn toàn rõ ràng Do đó paraben ngày càng thu hút được sự chú ý do ảnh hưởng tiềm tàng của chúng và bị liệt kê là một trong những tác nhân gây rối loạn hệ thống nội tiết Paraben dễ dàng được cơ thể con người hấp thụ Môi trường tiếp xúc với paraben xảy ra thông qua sự hấp thụ qua da, đường hô hấp hoặc ăn phải chất paraben có trong các sản phẩm; những hợp chất này sau đó nhanh chóng được chuyển hóa ở gan và bài tiết qua nước tiểu trong vòng 24 đến 48 giờ [25]

1.1.3.1 Dị ứng da Ở những người có làn da bình thường, paraben hầu như không gây kích ứng Tuy nhiên, paraben có thể gây kích ứng da, viêm da và gây bệnh rosacea ở những người dị ứng paraben (chiếm một tỉ lệ nhỏ trong dân số) Tỉ lệ báo cáo nhạy cảm đối với paraben dao động từ 0,5% đến 3,5% [32] Một số nghiên cứu cho thấy BzP là chất có khả năng gây dị ứng mạnh nhất, có thể là do khối lượng phân tử lớn và từ đó dự đoán về khả năng gây dị ứng sẽ tỷ lệ thuận với khối lượng phân tử [18] Ngoài ra, một số trường hợp bị dị ứng qua đường tiêm dưới da cũng được phát hiện Mặc dù cơ chế gây dị ứng của paraben vẫn chưa được nghiên cứu và công bố chính xác nhưng vẫn xuất hiện các trường hợp dị ứng với nhóm chất này [47]

Methylparaben vốn được coi là chất ít có khả năng gây ra phản ứng bất lợi nhưng đã được phát hiện có ảnh hưởng không tốt đối với tế bào sừng của da người trong điều kiện kết hợp tiếp xúc tia UVB (các tia UV có bước sóng 315–280 nm) Tia UVB với cường độ 15 mJ/cm 2 và 30 mJ/cm 2 (tương ứng với cường độ UVB trung bình khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong vòng 1 phút vào ngày đẹp trời ở châu Âu) hầu như không gây hại đến tế bào sừng Tuy nhiên khi kết hợp sử dụng MeP 0,003% và việc chiếu xạ bằng tia UVB với cường độ như trên thì lượng tế bào sừng bị hoại tử tăng lên đáng kể Quá trình này được lý giải là do MeP và các sản phẩm chuyển hóa của nó kết hợp với ánh sáng mặt trời gây tổn hại đối với ADN trên da [22, 58] Cơ chế tác động của MeP được mô tả trong Hình 1.2 [32]

Hình 1.2 Cơ chế gây hại ADN trên da của hợp chất paraben

1.1.3.3 Paraben tiềm ẩn khả năng gây rối loạn nội tiết và ung thư vú

Hoạt tính estrogen của paraben lần đầu tiên được xác định vào năm 1998 và đã được xác nhận vitro và in vitro [35, 58].Bằng chứng từ các nghiên cứu cho thấy paraben có thể liên kết với các thụ thể estrogen và gây ức chế estrogen sulfotransferase - một loại enzyme làm bất hoạt estrogen Điều này làm tăng các gen quy định estrogen và tăng khả năng sản sinh ra các tế bào này [53, 60] BuP và PrP có hoạt tính estrogen cao hơn MeP hoặc EtP, nhưng BuP và PrP được phát hiện có nồng độ thấp hơn methylparaben ở người từ 10 đến 1000 lần [67] Mặc dù nhiều báo cáo đã xác nhận rằng paraben bị thủy phân trong sinh vật, tuy nhiên chúng được tìm thấy là hoàn toàn ổn định trong các tế bào ung thư vú MCF7 đồng nhất [19] Sự ổn định của paraben có thể dẫn đến sự tích tụ của chúng trong mô khối u vú Giá trị trung bình của tổng nồng độ paraben trong mô của khối u của vú tương ứng là 20,6 ± 4,2 ng/g (n ) và 9,8 ng/g (n=9) đối với các mẫu thu thập ở Anh và Ấn Độ [19, 54] Nồng độ phát hiện cao nhất trong khối u là 26,5 ng/g đối với BuP [19] Sau đó, quá

7 trình tranh luận về sự hiện diện của paraben trong mô ung thư vú đã được khảo sát Các dữ liệu cho thấy không có hoặc có nồng độ thấp paraben ở một nhóm nhỏ các bệnh nhân và không có sự so sánh với các kiểm soát thông thường Đồng thời, không thể nhận dạng được nguồn paraben ở 7/40 bệnh nhân được xác định có nhiễm paraben nhưng lại chưa bao giờ sử dụng mỹ phẩm Bằng chứng xác nhận cũng không có mối tương quan giữa nồng độ paraben và tuổi bệnh nhân (37-91 tuổi), thời gian cho bú sữa (0-23 tháng), vị trí khối u hoặc bản chất thụ thể estrogen khối u [67] Do đó, chưa hoàn toàn có mối liên hệ rõ ràng giữa các hợp chất paraben với bệnh ung thư vú và nguy cơ tiềm ẩn của nó

Bên cạnh đó, paraben cũng có những tác động tiêu cực làm giảm khả năng sinh sản hormone sinh dục ở nam giới – testosterone [45] Đây được cho là một trong những nguyên nhân gây ra vô sinh ở nam giới Ở các nước phát triển, khoảng 15% các cặp vợ chồng bị ảnh hưởng bởi vô sinh, gần một nửa trong những trường hợp này xảy ra ở nam giới, thông qua khả năng di chuyển của tinh trùng kém hoặc do số lượng tinh trùng thấp Một số lượng đáng kể các trường hợp vô sinh nam là kết quả của việc tiếp xúc với các sản phẩm nhân tạo và ty thể của tinh hoàn đặc biệt bị ảnh hưởng bởi độc tính do thuốc Nghiên cứu in vitro cho thấy tinh trùng người không thể sống được khi tiếp xúc với paraben ở nồng độ paraben 1% [48] Thí nghiệm khác trên chuột nhắt cũng cho thấy số lượng và hoạt động tinh trùng giảm đáng kể khi tiếp xúc với iPrP [22] Các bằng chứng chỉ ra rằng paraben có thể không an toàn và cho thấy rằng sự tương tác của các paraben đối với chức năng ty thể trong tinh hoàn có thể là nguyên nhân trong việc giải thích sự đóng góp của paraben dẫn đến giảm khả năng sinh sản [45]

1.1.4 Các nguồn phát thải paraben trong môi trường

Cho đến nay, sự tồn tại và xu hướng phân bố các paraben trong môi trường tự nhiên như nước mặt, nước thải, đất, trầm tích, không khí, cây trồng và sinh vật,… đã được chứng minh bằng một số lượng lớn các công trình nghiên cứu khoa học được thực hiện tại nhiều quốc gia trong vài thập kỉ qua Sau khi được phát thải ra môi trường, các paraben trải qua một loạt biến đổi về mặt vật lí, hóa học và sinh học Sự hấp thụ, bay hơi và phân hủy là những quá trình chính Ngoài ra, những tính chất vật lí như độ tan trong nước, hằng số định Henry, khả năng bay hơi,… cũng ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển và phân bố paraben [26]

1.1.4.1 Paraben trong môi trường tự nhiên

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PARABEN

1.2.1 Các phương pháp chiết tách paraben Để phân tích một số paraben trong các đối tượng mẫu trước hết cần phải tiến hành chuẩn bị mẫu hay xử lý mẫu để chiết tách các chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu ban đầu Phương pháp xử lý mẫu cần đảm bảo các yêu cầu bao gồm không làm thất thoát chất phân tích, không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích, hạn chế ảnh hưởng hiệu ứng nền mẫu Việc lựa chọn phương pháp xử lý mẫu còn phải phụ thuộc vào cấu tạo nền mẫu, khả năng bay hơi hoặc nồng độ tham khảo của chất phân tích [44]

Nhằm xác định hàm lượng paraben trong cá biển, một số phương pháp chiết tách đã được áp dụng cho hiệu suất thu hồi cao như chiết siêu âm, chiết rung lắc cơ học, chiết QuEChERS, chiết tách có hỗ trợ của vi sóng (MAE), chiết dung môi tăng tốc,… Tùy vào mục đích và điều kiện phòng thí nghiệm mà áp dụng các phương pháp chiết phù hợp Bên cạnh đó, việc lựa chọn dung môi chiết cũng rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả của quá trình chiết tách Dung môi lựa chọn cần có tính chọn lọc cao, hòa tan tốt chất phân tích, dễ dàng tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu và loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng trong nền mẫu Dung môi chiết các paraben từ nền mẫu có thể là một chất hay hỗn hợp các chất Theo các tài liệu được công bố thì methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp methanol:acetonitrile, acetone:hexane, dichloromethane:hexane với các tỉ lệ thể tích khác nhau thường được sử dụng để chiết tách các paraben trong mẫu cá biển [20, 40, 44]

1.2.1.1 Phương pháp chiết rung lắc cơ học

Phương pháp chiết rung lắc cơ học là phương pháp chiết cổ điển, sử dụng chủ yếu cho các nền mẫu môi trường rắn (bụi, đất, trầm tích) và mẫu sinh học (sinh vật, tế bào) Phương pháp này dựa trên nguyên tắc khuấy trộn của dung dịch để gia tăng tương tác của nền mẫu với dung môi chiết sử dụng, từ đó chất phân tích có thể được chiết triệt để vào pha hữu cơ Ưu điểm nổi bật của phương pháp là sử dụng ít dung môi, hạn chế ảnh hưởng tới môi trường; tuy nhiên hiệu suất chiết không cao và thời gian phân tích dài do tốc độ máy lắc thường không cao (100-300 vòng/phút)

Trong một nghiên cứu, đối với nhóm cá nước ngọt tại vùng ven biển New York (Hoa Kỳ), 9 paraben và chất chuyển hóa paraben đã được chiết bằng phương pháp rung lắc cơ học với 10 mL hỗn hợp dung môi MeOH:MeCN (v:v, 1:1) ở nhiệt độ phòng trong 60 phút [36] Phương pháp cho kết quả độ thu hồi ở mức chấp nhận được 40-75% Trong khi đó, ở một nghiên cứu khác thực hiện trên nhóm cá biển tại Brazil cũng sử dụng phương pháp rung lắc cơ học với 15 mL hỗn hợp dung môi MeOH: MeCN: UPW (v:v:v, 45:45:10) ở nhiệt độ phòng trong 30 phút đã cho kết quả độ thu hồi tốt hơn 76-108% (RSD < 7%) [42]

1.2.1.2 Phương pháp chiết siêu âm

Phương pháp chiết siêu âm sử dụng năng lượng của sóng siêu âm được cung cấp từ thiết bị để chiết mẫu cũng hay được áp dụng Dưới tác dụng của năng lượng sóng siêu âm có tần số cao, cấu trúc ban đầu của chất phân tích bị phá vỡ và phân bố lại (hay hòa tan) vào dung môi chiết, tạo điều kiện tốt cho cân bằng chiết xảy ra dễ

12 dàng, nhanh hơn và triệt để hơn Do đó, phương pháp chiết này đòi hỏi lượng dung môi nhiều hơn do thường chiết lặp 2-3 lần trong 10-30 phút

Một nghiên cứu phân tích paraben trong mẫu sinh vật biển thu thập tại châu Âu mở rộng qua Bắc Phi, phương pháp chiết siêu âm với 6 mL dung môi ACN ở 35

C trong 10 phút đã được áp dụng Dịch chiết sau đó được cô đặc dưới dòng N2 đến

1 mL rồi phân tích trên hệ thống GC-MS Kết quả độ thu hồi của các paraben ổn định qua các lần lặp lại và đều lớn hơn 80% [9]

Phương pháp chiết QuEChERS dựa trên nguyên tắc chiết mẫu một lần bằng dung môi chủ yếu là acetonitrile đã được ổn định pH và tách nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng – lỏng nhờ hỗn hợp muối MgSO4 và NaCl Kỹ thuật tinh sạch bằng chiết pha rắn phân tán thường được sử dụng kết hợp nhằm loại các acic hữu cơ, lipid và các tạp chất khác nhờ sử dụng đơn chất hoặc hỗn hợp chất hấp phụ như PSA, C18, HLB Đây là phương pháp chiết tách không làm phá vỡ cấu trúc hợp chất, tối thiểu hóa các bước chuẩn bị mẫu, thời gian chiết ngắn, lượng dung môi không quá nhiều, phù hợp với cả các nền mẫu thực phẩm chứa nhóm chất mang màu đặc trưng Để phương pháp chiết đạt hiệu suất cao cần tập trung vào các yếu tố bao gồm dung môi chiết, tỷ lệ hỗn hợp muối và thời gian vortex

Một nghiên cứu trước đây về phân tích paraben trong thực phẩm biển đã tối ưu hóa thành công phương pháp chiết QuEChERS Tỷ lệ muối MgSO4:NaCl theo khối lượng đã được khảo sát ở các tỷ lệ 4:1, 3:2 và 1:1 Dựa theo kết quả, nghiên cứu đã lựa chọn tỷ lệ muối MgSO4:NaCl (4:1) theo khối lượng do độ thu hồi các paraben khả quan nhất Mẫu thực phẩm biển được chiết QuEChERS với hỗn hợp muối MgSO4:NaCl (4:1), 9 mL UPW, 10 mL MeCN, vortex ở 2000 vòng/phút trong 10 phút rồi kết hợp thêm quá trình tinh sạch dịch chiết hữu cơ bằng vật liệu hấp phụ Hiệu suất thu hồi các paraben đạt được trong khoảng 65-118% (RSD < 5%) [48]

1.2.2 Các kỹ thuật làm sạch

Trong hầu hết các phương pháp chiết tách, một số chất gây nhiễu có trong nền mẫu sẽ được chiết xuất đồng thời cùng paraben do sự phức tạp vốn có của mẫu cá Các chất gây nhiễu có thể dẫn đến sự nhiễu nền trong khối phổ, làm giảm độ chọn lọc và độ nhạy của thiết bị Để hạn chế vấn đề này, sau khi chiết tách, dịch chiết mẫu cá sẽ được làm sạch bằng cách sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn có chứa chất hấp phụ (PSA, C18, MCX, HLB,…) hoặc sắc ký cột nhồi silica gel hoặc silica gel alumina

Chiết pha rắn đã trở thành một kỹ thuật phổ biến được áp dụng để làm sạch mẫu và làm giàu trong các lĩnh vực nhờ tính linh hoạt và độ chọn lọc tốt hơn so với các kỹ thuật xử lý mẫu khác So với kỹ thuật chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn sử dụng ít dung môi hơn, hạn chế khả năng hình thành nhũ tương, thể tích mẫu có thể nhỏ hơn và dễ tự động hóa Về nguyên tắc, phương pháp chiết pha rắn sử dụng các chất hấp phụ ở dạng rắn, có kớch thước nhỏ (5-10 àm) và diện tớch bề mặt lớn (50-100 m 2 /g) Chất hấp phụ hay còn được gọi là pha tĩnh, sẽ được nhồi vào một cột nhỏ (dung lượng 5-10 mL) Mẫu ở dạng lỏng có chứa chất phân tích sẽ được đi qua cột Tại đây các chất có trong mẫu sẽ tương tác với pha tĩnh, nhóm chất cần phân tích sẽ được giữ lại, các nhóm tạp chất còn lại sẽ theo dung môi đi ra khỏi cột Sau đó sử dụng dung môi thích hợp để rửa giải các chất phân tích [7]

Sử dụng cột nhồi sắc ký trong quá trình xử lý mẫu là một kỹ thuật cổ điển nhưng rất hiệu quả trong việc làm sạch dịch chiết Dựa vào tương tác giữa các hợp chất, vật liệu nhồi cột và dung môi, có thể giữ lại chất phân tích và đồng thời loại bỏ tạp chất ra khỏi dịch chiết Một số nghiên cứu trước đây về phân tích paraben, các cột sắc ký silica gel và silica gel/alumina chủ yếu được sử dụng để tinh sạch dịch chiết trước khi phân tích đối với các mẫu môi trường và trầm tích Silica gel là chất hấp phụ phân cực có ứng dụng trong việc tách các hợp chất có độ phân cực trung bình hoặc yếu như steroid, acid amine, lipid, alkaloid [23] Alumina có tính phân cực hơn silica gel, có tính base nhẹ và hoạt động ổn định trong khoảng pH tốt hơn silica gel Alumina có khả năng loại bỏ nước, acid hữu cơ, kim loại nặng, chất màu So với chiết pha rắn, kỹ thuật nhồi cột mang những ưu điểm như giá thành vật liệu rẻ, dụng cụ đơn giản và có thể tối ưu được lượng chất nhồi cột Tuy nhiên kỹ thuật này không tự động hóa nên có thể cho hiệu suất làm sạch, làm giàu thấp hơn

1.2.3 Các phương pháp phân tích paraben

1.2.3.1 Điện di mao quản Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion bằng việc sử dụng một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm được đặt trong điện trường Do độ linh động của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Phương pháp điện di mao quản đã được áp dụng để phân tích bốn paraben bao gồm MeP, EtP, PrP và BuP trong thực phẩm biển Mẫu sau khi được chiết bằng phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán (DLLME) được bơm vào hệ thống

14 điện di mao quản với detector UV-VIS tại bước sóng 298 nm Nghiên cứu này đã sử dụng cột mao quản silica núng chảy với đường kớnh trong 75 àm, tổng chiều dài 48,5 cm với chiều dài hiệu dụng tới detector là 40 cm Mẫu được bơm tại anode và chất phân tích đươc phát hiện tại cathode ở cuối mao quản Nhiệt độ mao quản được duy trì ở 12 C, điện thế 25 kV và dung dịch điện di nền là đệm borat 25 mM tại pH 9,2 chứa 5,0% acetonitrile Các chất phân tích được bơm trong thời gian 5 giây ở áp suất

50 mbar Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) dao động từ 0,9 μg/mL (đối với EtP) và cao nhất là 2,1 μg/mL (đối với MeP) [23]

Ngoài ra, phương pháp điện di mao quản cũng được ứng dụng để phân tích 4 paraben là MeP, EtP, PrP và BuP trong mỹ phẩm Ban đầu, mẫu được chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE), sau đó phân tích 4 paraben bằng phương pháp điện di (CE) Đồng thời, tiến hành nghiên cứu so sánh hai phương pháp điện di mao quản (CE) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đối với quá trình phân tích paraben

HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG SIÊU HIỆU NĂNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ BA TỨ CỰC (UHPLC-MS/MS)

KHỐI PHỔ BA TỨ CỰC (UHPLC-MS/MS)

Cho đến nay, có khá nhiều công trình nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng paraben trong nhiều nền mẫu bằng nhiều phương pháp khác nhau Tuy nhiên, trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm và tham khảo các công bố trước đây, trong nghiên cứu này phương pháp xác định hàm lượng paraben được tiến hành trờn cột sắc ký lỏng Supelcosil LC-18 (3 mm x 150 mm; 3 àm) và hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng Dionex UHPLC Ultimate 3000 + ghép nối detector khối phổ TSQ Quantis TM Triple Quadrupole (Thermo Fisher Scientific)

Hình 1.3 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng Dionex UHPLC Ultimate 3000+ ghép nối detector khối phổ TSQ QuantisTM Triple Quadrupole (Thermo Fisher Scientific)

UHPLC-MS/MS là một phương pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh vực hoá phân tích, điển hình là phân tích lượng vết và siêu vết Hai thiết bị trên khi ghép nối với nhau có thể tách và định lượng các chất có nồng độ 10 -10 gam hoặc nhỏ hơn nữa, đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các phương pháp phân tích công cụ khác [3, 34] Ngoài ra với hệ thống này, những mẫu không bền trong thời gian bảo quản cũng có có thể được phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc phân tích các hỗn

21 hợp phức tạp Nhờ đó có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế trước khi đưa vào khối phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối với các kỹ thuật viên

Nhờ áp lực của dòng pha động dưới áp suất cao, các chất di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Trong quá trình di chuyển, tốc độ của mỗi chất là khác nhau do hệ số phân bố của chúng đối với pha tĩnh và pha động Do đó thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào pha tĩnh (thành phần pha tĩnh, kích thước hạt, kích thước cột) và pha động (tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng) và bản chất chất phân tích

Sau khi đi qua thiết bị sắc kí lỏng, các chất được tách ra khỏi nhau và được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp Nguồn ion được tạo thành đi vào trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Tại đây sẽ xảy ra quá trình bắn phá, các mảnh ion sẽ tới bộ phận lọc Dựa trên tỷ lệ giữa khối lượng và điện tích (m/z), bộ lọc chỉ cho phép các mảnh ion có khối lượng nằm trong một giới hạn đã được lựa chọn đi vào detector Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các ion với các khối lượng khác nhau Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết quả gọi là phổ khối đồ Phương pháp sắc kí lỏng siêu hiệu năng ghép nối khối phổ ba tứ cực (UHPLC- MS/MS) là một phương pháp vô cùng hiện đại với độ nhạy cao được sử dụng trong các nghiên cứu về thành phần các chất trong nhiều nền mẫu khác nhau [3]

Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống UHPLC-MS/MS

1.3.2 Hệ thống sắc ký lỏng

Trong nghiên cứu này, hệ thống UPLC được sử dụng là hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng Dionex UHPLC Ultimate 3000 + với 2 kênh dung môi (sử dụng tối đa

4 kênh) Bên cạnh cải tiến về độ trễ dung môi thì hệ thống Dionex UHPLC Ultimate

3000 + có còn các điểm nổi bật so với các hệ thống trước đây như sau:

 Nhanh hơn 50 lần so với LC thông thường, phân tích nhanh tiết kiệm thời gian

 Có thể vận hành ở áp suất 100 MPa (15000 psi) với tốc độ dòng lên đến 8 mL/phút

 Hệ thống bơm gradient kép, van chuyển mạch cho kỹ thuật sắc ký tiên tiến

 Có thể ghép nối với nhiều loại detector

Cột sắc ký là nơi xảy ra sự tiếp xúc của chất phân tích trong dung môi pha động với chất hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh Các chất khác nhau tương tác và phân bố với chất hấp phụ trên pha tĩnh với các lực khác nhau, dẫn tới thời gian lưu khác nhau Hầu hết các phương pháp sắc ký lỏng, cột pha đảo không phân cực như C18 và ít phân cực như C8 thường được sử dụng rộng rãi [16, 50, 66] Từ đó, việc lựa chọn dung môi nào phù hợp giúp có thể rửa giải chọn lọc và tăng hiệu quả ion hóa chất phân tích trong nguồn ion hóa Trong nghiên cứu, cột Supelcosil LC-18 của hãng Sigma-Aldrich được lựa chọn sử dụng để phân tách các hợp chất paraben

Bảng 1.4 Thông số cột sắc ký lỏng Supelcosil LC-18

Loại cột sắc ký Sắc ký lỏng pha đảo

Chiều dài cột x Đường kính trong 15 cm x 3 mm

Kớch thước hạt nhồi 3 àL

Hình 1.5 Cấu tạo Octadecylsilane (ODS)

Phổ khối là một kỹ thuật phân tích xác định tỷ lệ khối lượng-điện tích (m/z) của các hạt điện Các chất phân tích được ion hóa trong nguồn ion sau đó được tạo thành chùm ion để đi qua hệ thống dẫn ion và được phân tích bằng máy phân tích dựa trên tỷ lệ m/z Các nguồn ion hóa thường được sử dụng: ion hóa bằng phun điện tử (ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI), ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (APPI) Trong đó, kỹ thuật ESI là kỹ thuật ion hóa được sử dụng phổ biến nhất, thường được dùng để phân tích các hợp chất có tính phân cực từ trung bình đến cao, các ion có khối lượng từ 100 đến 150000 đ.v.C, APCI lại ưu đãi cho các hợp chất không phân cực hoặc phân cực trung bình với khối lượng từ 100 đến 2000 đ.v.C APCI cho độ nhạy cao hơn kỹ thuật ESI do sử dụng tốc độ pha động lớn và ít bị ảnh hưởng của nền mẫu do quá trình ion hóa chất phân tích diễn ra trong pha hơi [11]

Thiết bị khối phổ TSQ Quantis TM Triple Quadrupole (Thermo Fisher Scientific) sử dụng nguồn ion hóa phun điện tử ESI Quá trình ion hóa bằng nguồn ESI diễn ra như sau: sau khi đi ra từ hệ sắc ký lỏng tại đầu ống dẫn mao quản, dưới

24 ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang (N2), mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ tích điện tại bề mặt Khí mang nhiệt độ cao sẽ làm bay hơi dung môi, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn sẽ bẻ gãy sức căng bề mặt, làm cho hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ mang điện tích cao, sau đó các ion phân tích chuyển sang thể khí rồi đi vào bộ phận phân tích khối phổ Quá trình ion hóa được minh họa dưới Hình 1.6

Hình 1.6 Kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI

Sau khi được ion hóa tại nguồn ion hóa, chất phân tích được tích điện và di chuyển trong môi trường chân không đến bộ phận phân tách khối Các hệ thống sử dụng hiện nay bao gồm: hệ một tứ cực, hệ ba tứ cực (QqQ), thời gian bay (TOF), bẫy ion (IT), Orbitrap hoặc sự kết hợp của các thiết bị Q-ToF, Q-Orbitrap Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành sử dụng hệ thống phân tích khối hệ ba tứ cực (QqQ) Trong QqQ, có 4 kiểu ghi phổ được sử dụng phổ biến bao gồm Full Scan, Selected Ion Monitoring (SIM), SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring) [11, 33] Đối với nghiên cứu này, chế độ SRM được áp dụng để định lượng các hợp chất paraben theo quy tắc cô lập ion cần chọn ở Q1 (mảnh mẹ), sau đó phân mảnh thành các mảnh ion con tại Q2 rồi cô lập mảnh con cần quan tâm và đưa vào detector để phát hiện Chất phân tích được xác nhận dựa trên các tiêu chí về thời gian lưu (RT) và tỉ lệ cường độ giữa các ion (IR)

CÁC THÔNG SỐ CƠ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL - instrumental detection limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy mà detector có thể đo được và cho tín hiệu của peak cao gấp 3 lần đường nền IDL cho phép đánh giá thiết bị hoạt động có ổn định không, nó bao gồm các loại nhiễu từ linh kiện cơ – điện tử của thiết bị, điều kiện vận hành máy và điều kiện môi trường xung quanh thường được ước lượng qua các dung dịch chuẩn [2, 3]

Giới hạn định lượng của thiết bị (IQL - instrumental quantification limit) là lượng chất nhỏ nhất đưa vào máy đủ để tạo tín hiệu của peak cao gấp khoảng 5 lần đường nền như thế có thể định lượng khi tiến hành phân tích sắc ký Thông thường, ta thường lấy IQL = 3 × IDL IQL cho phép đánh giá thiết bị có đủ điều kiện dùng để định lượng các cấu tử cần phân tích hay không và cho biết nồng độ cấu tử khi bơm vào máy có đủ điều kiện để định lượng hay không [2, 3]

Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL - method detection limit) là giá trị nồng độ chất nhỏ nhất trong mẫu ban đầu sau khi qua quá trình xử lý mẫu và xác định được trên máy để thu được tín hiệu của peak cao gấp 3 lần đường nền [2, 3]

Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL - method quantification limit) là giá trị nồng độ nhỏ nhất của chất cần phân tích trong mẫu ban đầu mà khi sử dụng phương pháp để phân tích có thể định lượng được Tương tự, ta cũng có: MQL = 3 × MDL Từ đó, có thể thấy MDL phụ thuộc vào các yếu tố như: quy trình chiết tách xử lý mẫu, lượng mẫu đem phân tích ban đầu, thể tích dung dịch sau khi cô đặc mẫu và thể tích khi bơm vào máy [2, 3]

1.4.2 Độ thu hồi Độ thu hồi là phần trăm cấu tử chất cần phân tích còn lại sau khi tiến hành xử lý mẫu so với số cấu tử ban đầu có trong mẫu

Công thức tính độ thu hồi (R%):

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết);

Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

1.4.3 Độ lặp lại của phương pháp

SD: Độ lệch chuẩn; n: Số lần thí nghiệm; xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”; ȳ: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm;

RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ của chất phân tích mà phương pháp phân tích cho kết quả tín hiệu phân tích tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích và ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

1.4.5 Độ không đảm bảo đo

Theo Đo lường học - thuật ngữ chung và cơ bản (VIM) thì “độ không đảm đo là thông số đi kèm kết quả đo, đặc trưng cho độ phân tán của các giá trị đo, có thể quy cho giá trị đo một cách hợp lý” Độ không đảm bảo đo cũng được viết dưới dạng độ không đảm bảo đo tuyệt đối và tương đối Độ không đảm bảo đo tuyệt đối biểu thị giới hạn hay biên của độ không đảm bảo liên quan đến phép đo Ví dụ buret có vạch chia 0,1 mL, ước lượng dung sai của nó là ± 0,02 mL, tức là khi đọc trên buret thể tích 11,04 mL thì thể tích thực sẽ là từ 11,02 đến 11,06 mL Khi đó nói rằng ± 0,02 mL là độ không đảm bảo đo tuyệt đối

27 Độ không đảm bảo đo tương đối là là tỷ số giữa độ không đảm bảo đo tuyệt đối và giá trị đo được, nó cho phép so sánh độ lớn của độ không tin cậy trong kết quả đo Cũng giống như sai số tương đối, nó có thể biểu diễn dưới dạng phần trăm

THỰC NGHIỆM

THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng Dionex UHPLC Ultimate 3000 + ghép nối detector khối phổ TSQ Quantis TM Triple Quadrupole (UPLC-MS/MS) của hãng Thermo Fisher Scientific

 Bộ tiêm mẫu tự động UltiMate Autosampler

 Hệ điều nhiệt UltiMate RS Column Compartment

 Cột sắc ký lỏng Supelcosil LC-18 (2,1 x 100 mm, 3 àm)

 Detector khối phổ ba tứ cực TSQ Quantis TM

 Bể rung siêu âm (Power Sonic 410, Hwashin, Hàn Quốc)

 Bộ lọc dung môi (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany)

 Bơm rút áp suất (New Askir 30, CAMI, Italy)

 Cân phân tích (Sartorius, Germany)

 Máy ly tâm (UNIVERSAL 320, Hettich, Germany)

 Thiết bị cô mẫu dùng khí nitrogen (Eyela, Nhật Bản)

 Micropipet loại 100 àL, 200 àL, 1000 àL (Isolab, Đức)

 Bộ chiết pha rắn (Newaskin 30, CAMI, Italy)

 Ống falcon loại 15 mL, 50 mL

 Dụng cụ thủy tinh bao gồm bình định mức 5 mL, 10 mL, 100 mL; cốc thủy tinh; pipet Pasteur và vial 1,5 mL Dụng cụ thủy tinh sau khi sử dụng được rung siêu âm với nước xà phòng trong bể siêu âm 30 phút, rửa lại bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy, tráng nước cất, tráng lại bằng methanol và để khô tự nhiên Đối với pipet Pasteur và vial trước khi sử dụng để vào tủ sấy ở nhiệt độ 50 C

 Cột chiết pha rắn Oasis HLB, PSA và C18 (loại 3cc, 100 mg) (Water, Milford,

 Màng lọc Polytetrafluoroethylene (PTFE) 0,22 àm (Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Germany)

Trong nghiên cứu này, đối tượng phân tích bao gồm 7 chất thuộc nhóm paraben và sử dụng 2 chất chuẩn đánh dấu đồng vị 13 C của paraben làm chất đồng hành với mục đích xác định độ thu hồi, các hợp chất được định lượng bằng phương pháp đường chuẩn ngoại chuẩn Thông tin về các chất chuẩn gốc được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1: Thông tin các chất chuẩn và chất đồng hành

Tên chất Độ tinh khiết Hãng sản xuất

Ngoài ra, một số hóa chất khác được sử dụng trong quá trình xử lý mẫu, chuẩn bị dung dịch làm việc, dung môi pha động hoặc tráng rửa dụng cụ, bao gồm:

 Methanol (MeOH), tinh khiết cho HPLC (Fisher, Mỹ)

 Acetonitrile (ACN), tinh khiết cho HPLC (Fisher, Mỹ)

 Acid formic, acid acetic (>99,8%, Merck, Đức)

 Nước cất loại ion UPW (Mili-Q, Merck, Đức)

 n-hexane và acetone (Merck, Đức)

 Nước cất 2 lần (tráng rửa dụng cụ)

2.1.4 Chuẩn bị pha động, dung môi và dung dịch chuẩn

Pha động A (AcOH 0,05%): Lấy khoảng 500 mL nước deion vào bình định mức 1 L Dùng micropipet hút chính xác 500 μL acid acetic 100% vào bình định mức, lắc xoáy tròn Định mức bằng nước deion đến vạch 1 L, lắc đều Sử dụng bộ lọc dung mụi với màng lọc cellulose acetate 0,45 àm để lọc dung dịch vừa pha; sau đó chuyển vào bình chứa pha động sạch, đậy nắp, rung siêu âm đuổi bọt khí 30 phút

Pha động B (MeOH): Lấy và định mức MeOH vào bình định mức 1 L Sử dụng bộ lọc dung mụi với màng lọc cellulose acetate 0,45 àm để lọc dung dịch vừa pha; sau đó chuyển vào bình chứa pha động sạch, đậy nắp, rung siêu âm đuổi bọt khí

Một số dung môi được chuẩn bị theo mục đích sử dụng và ngày làm thí nghiệm, với cách chuẩn bị được trình bày như sau:

STT Dung dịch cần chuẩn bị Cách chuẩn bị

1 Dung môi chiết ACN chứa 1% acid acetic

Hút 1 mL acid acetic vào bình định mức

100 mL đã chứa sẵn một phần ACN, lắc xoáy tròn Định mức tới vạch bằng ACN, lắc đều và khử bọt khí

2 Dung môi rửa tạp MeOH 5%

Hút 5 mL MeOH vào bình định mức 100 mL đã chứa sẵn một phần nức deion, lắc xoáy tròn Định mức tới vạch bằng nước deion, lắc đều và khử bọt khí

2.1.4.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Các dung dịch chuẩn làm việc được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc với dung môi pha loãng là methanol, được chứa trong vial thủy tinh và bảo quản ở -20 °C

Các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg/L được pha trong dung môi MeOH: cân chính xác 10,00 mg chất rắn của 7 chất (MeP, EtP, PrP, iPrP, BuP, HeP, BzP) hòa tan và định mức 10 mL bằng MeOH, lắc đều để hòa tan chuẩn Dung dịch chuẩn được nắp kín, cânvà bảo quản ở -20 C

 Chuẩn trung gian (C mix 50 mg/L)

Dung dịch chuẩn trung gian Cmix 50 mg/L chứa 7 chất paraben có nồng độ

50 mg/L được pha trong dung mụi MeOH: Rỳt 500 àL dung dịch chuẩn gốc cú nồng độ 1000 mg/L của mỗi chất cho vào bình định mức 10 mL chứa sẵn một ít MeOH, sau đó định mức lên chính xác 10 mL bằng MeOH Đậy nắp, lắc đều Dung dịch chuẩn được nắp kín, cân và bảo quản ở -20 C

 Chuẩn trung gian (C mix 1 mg/L)

Dung dịch chuẩn trung gian Cmix 1 mg/L chứa 7 chất paraben có nồng độ 1 mg/L được pha trong dung mụi MeOH: Rỳt 200 àL dung dịch chuẩn gốc cú nồng độ

50 mg/L của mỗi chất cho vào bình định mức 10 mL chứa sẵn một ít MeOH, sau đó định mức lên chính xác 10 mL bằng MeOH, đậy nắp và lắc đều Dung dịch chuẩn được nắp kín, cân và bảo quản ở -20 C

Xây dựng đường chuẩn với 7 điểm chuẩn có nồng độ trong khoảng 1,0–100 àg/L Dung dịch chuẩn làm việc được pha trong dung mụi MeOH, với cỏch chuẩn bị được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc

Nồng độ chuẩn làm việc (àg/L)

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu và xây dựng quy trình phân tích 7 chỉ tiêu paraben bao gồm: methylparaben (MeP), ethylparaben (EtP), propylparaben (PrP), iso-propylparaben

(iPrP), butylparaben (BuP), benzylparaben (BzP) và heptylparaben (HeP) trong mẫu cá được thu thập tại một số khu vực ven biển ở Việt Nam

Mẫu cá được thu thập tại các chợ cá ven biển gần khu vực đánh bắt hoặc các khu vực có mức độ phát triển kinh tế cao vào thời gian cao điểm của dịch vụ du lịch Hai mẫu cá lựa chọn phân tích dễ tìm kiếm, phổ biến ở cả ba miền của Việt Nam, đặc biệt là giá thành rẻ

Trong nghiên cứu, tổng 37 mẫu cá biển được khảo sát bao gồm cá mối thường (Greater lizafish, n) và cá nục bông (Decapterus punctatus, n) Các mẫu cá biển được thu thập tại các chợ cá địa phương ở miền Bắc (Quảng Ninh và Nam Định), miền Trung (Đà Nẵng, Phú Yên, Khánh Hòa) và miền Nam (TP.HCM, Tiền Giang)

33 của Việt Nam vào tháng 08/2022 Mẫu được chứa trong thùng giữ nhiệt có túi đá và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm Sau đó, tất cả các mẫu được đông khô đến khối lượng không đổi bằng hệ thống Buchi L-300 (Buchi Sarl, Pháp) Phần lườn cá được tiến hành tách rời đảm bảo không chứa xương và da, rồi bảo quản ở -20 C trong túi nhôm cho đến khi phân tích

Bảng 2.3: Bảng thông tin mẫu cá

Loài cá Khu vực Vị trí Số lượng mẫu

Miền Bắc Chợ Hạ Long 2

Miền Trung Chợ Thanh Khê

Miền Nam Chợ Hàng Dương

Miền Bắc Chợ Hạ Long 2

Miền Trung Chợ Tuy Hòa

Miền Nam Chợ Hàng Dương

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.3.1 Xây dựng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối detector khối phổ ba tứ cực (UHPLC-MS/MS)

2.3.1.1 Hệ thống sắc ký lỏng Đối với sắc ký lỏng, tốc độ dòng dung môi là một yếu tố vô cùng quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong một hỗn hợp Để khảo sát và lựa chọn tốc độ dòng tối ưu cho phương pháp, tiến hành thay đổi tốc độ dòng trong khi các điều kiện khác giữ nguyên không đổi Cụ thể, khảo sát ở các tốc độ là 0,1; 0,2; 0,3; và 0,6 mL/phút Dung dịch chuẩn gồm 7 paraben ở nồng độ 100 ng/mL được tiêm vào thiết

34 bị với thể tớch 10 àL, với hệ dung mụi pha động được sử dụng là (A): 0,05% AcOH và (B): MeOH

2.3.1.2 Thiết lập thông số cho hệ thống khối phổ ba tứ cực (MS/MS)

Lựa chọn các thông số của hệ thống khối phổ ba tứ cực TSQ Quantis TM để các chất đạt được độ chọn lọc và độ nhạy tối đa Đối với khối phổ ba tứ cực TSQ Quantis TM , tối ưu hóa các thông số cho tất cả các chất bằng cách bơm hỗn hợp dung dịch chuẩn bảy paraben (1000 ng/mL, pha trong dung mụi MeOH) vào hệ thống khối phổ với thể tớch 10 àL Thay đổi từng thông số bao gồm điện thế, tốc độ khí mang, khí bắn phá, mảnh mẹ dự kiến cho đến khi đạt được cường độ tín hiệu peak cao nhất, sau đó chọn làm thông số tối ưu Ngoài ra cùng với việc tham khảo các tài liệu công bố trước đó, các mảnh ion được lựa chọn để định lượng cho các paraben được chỉ ra theo quá trình phân mảnh dưới đây [24]:

Hình 2.1 Sơ đồ phân mảnh của paraben

2.3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Ban đầu phương pháp chiết QuEChERS thông thường được định hướng áp dụng chiết xuất các paraben trong các mẫu cá biển giống như một số nghiên cứu trước đây Tuy nhiên, khi thực hiện phương pháp này thì độ thu hồi của các paraben không đạt yêu cầu, nhất là đối với paraben có cấu trúc cồng kềnh Vì vậy, để có được quy trình xác định đồng thời 7 paraben trong mẫu cá tối ưu nhất, trong nghiên cứu này đã kết hợp phương pháp chiết dung môi cùng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), các yếu tố ảnh hưởng đến độ thu hồi được lựa chọn để khảo sát độc lập bao gồm:

 Khảo sát dung môi chiết

 Khảo sát vật liệu cột chiết

 Khảo sát nhiệt độ của quá trình cô làm giảm thể tích dưới dòng N2

2.3.2.1 Khảo sát dung môi chiết

Acetonitrile (MeCN) thường được lựa chọn là dung môi chiết lý tưởng của phương pháp QuEChERS nhờ khả năng chiết tối đa chất phân tích từ nền mẫu và giảm thiểu tác động từ nền mẫu (lipid, carbohydrate,…) Gần đây, một số báo cáo cũng chỉ ra rằng việc acid hóa acetonitrile cho hiệu suất thu hồi của các chất phân tích nằm trong quy định [12] Vì vậy, nghiên cứu tiến hành đánh giá hiệu suất chiết đối với hai dung môi trên nền mẫu thêm chuẩn, bao gồm MeCN và MeCN chứa 1% acid acetic (1% AA)

Tiến hành chuẩn bị 6 ống falcon loại 15 mL có chứa mẫu Thêm đồng thời vào mỗi ống 20 àL hỗn hợp 7 paraben 1000 ng/mL và 20 àL hỗn hợp chuẩn đồng hành

1000 ng/mL, để cân bằng trong 30 phút Sau đó, thêm vào 3 ống mẫu (MF1, MF2, MF3) 10 mL dung môi chiết MeCN, 3 ống mẫu còn lại (M4, MF5, M6) 10 mL dung môi chiết MeCN chứa 1% AA Các ống mẫu lần lượt được vortex trong 10 phút, rồi ly tâm ngay lập tức với tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút Sau ly tâm, 1 mL dịch chiết được hút vào vial 1,5 mL và mang đi phân tích

So sánh hiệu suất thu hồi để lựa chọn phương án tối ưu cho bước khảo sát tiếp theo và cho quy trình

2.3.2.2 Khảo sát vật liệu cột chiết

Phương pháp QuEChERS thông thường đặc trưng bởi quá trình tinh sạch sử dụng chất hấp phụ hoặc hỗn hợp chất hấp phụ [14, 40] Mục tiêu của nghiên cứu này là thay thế quá trình tinh sạch bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) bởi những ưu điểm nhất định Mức độ tương tác giữa pha tĩnh và hợp chất phân tích sẽ được đánh giá thông qua vật liệu cột SPE Do đó, ba loại cột cùng khối lượng đã được lựa chọn sử dụng trong suốt quá trình nạp mẫu, loại bỏ tạp chất và rửa giải chất phân tích, bao gồm cột C18, PSA và HLB (3cc, 100 mg)

Sau khi chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu bằng dung môi MeCN chứa 1%

AA, 5 mL dịch chiết được pha loãng đến thể tích 100 mL bằng nước siêu tinh khiết Cột SPE khảo sát lần lượt được họat hóa bằng 3 mL MeOH và 3 mL nước siêu tinh khiết; sau đó nạp dịch chiết qua cột với tốc độ 3 mL/phút Kết thúc nạp mẫu, các tạp chất được loại bỏ bằng 10 mL MeOH 5% Cuối cùng, chất phân tích được rửa giải bằng 3 mL MeOH rồi cô đặc dưới dòng N2 đến 1 mL và mang đi phân tích

So sánh hiệu suất thu hồi để lựa chọn phương án tối ưu cho bước khảo sát tiếp theo và cho quy trình

2.3.2.3 Khảo sát nhiệt độ của quá trình cô làm giảm thể tích dưới dòng N 2

Mức độ thất thoát chất trong quá trình làm giàu chất phân tích sử dụng hệ thống thổi dòng nitrogen được ghi nhận do nhiều yếu tố như bản chất chất phân tích, thành phần nền mẫu hoặc nhiệt độ [52] Yếu tố nhiệt độ liên quan trực tiếp đến điều kiện bay hơi dung môi [46] Hai điều kiện nhiệt độ được khảo sát qua thí nghiệm bay hơi methanol dưới dòng nitrogen từ 3 mL đến còn 1 mL bao gồm nhiệt độ phòng (25

Lần lượt cho vào 6 ống falcon (loại 15 mL) 3 mL MeOH Thêm đồng thời 20 àL hỗn hợp 7 paraben 1000 ng/mL và 20 àL hỗn hợp chuẩn đồng hành 1000 ng/mL Sau đó tiến hành quá trình cô đặc làm giảm thể tích xuống V=1 mL bằng cách thổi dòng N2 nhẹ ở hai điều kiện nhiệt độ là nhiệt độ lạnh (4 C) và nhiệt độ phòng (25

C) Phần thể tích cuối cùng được chuyển vào vial và mang đi phân tích

So sánh hiệu suất thu hồi để lựa chọn phương án tối ưu cho các bước khảo sát tiếp theo và cho quy trình.

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp phân tích sau khi tối ưu hóa sẽ được thẩm định thông qua các thông số đánh giá theo tiêu chuẩn châu Âu SANTE 11312/2021, bao gồm khoảng tuyến tính, độ thu hồi, độ lặp lại, độ tái lặp, giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL), giới hạn định lượng của phương pháp (MQL) và hiệu ứng nền (ME)

Xây dựng đường chuẩn với 7 điểm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính, có nồng độ trong khoảng 1–100 àg/L Sau đó xõy dựng đồ thị tuyến tớnh biểu thị mối tương quan giữa nồng độ chất phân tích và tín hiệu diện tích peak Yêu cầu của phương pháp phân tích đối khoảng tuyến tính đó là đường chuẩn thu được phải có hệ số hồi quy tuyến tính R 2 ≥ 0,995 Độ lặp lại được đánh giá bằng phương pháp thêm chuẩn ở ba nồng độ, với 6 lần lặp lại cho mỗi nồng độ và được thực hiện trong cùng một ngày Độ tái lặp được đánh giá bằng phương pháp tương tự như độ lặp lại trong ba ngày liên tiếp Độ thu

37 hồi của chất đồng hành sẽ được sử dụng để tính toán nồng độ cuối cùng của các chất phân tích có trong mẫu thực

Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) được tính toán dựa trên giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL), khối lượng mẫu phân tích (200 mg), lượng thể tích cuối cùng (1 mL) và độ thu hồi trung bình của paraben Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL) được xác định theo công thức MQL=MDL*3

Việc đánh giá hiệu ứng nền mẫu ngày càng được ứng dụng rộng rãi khi phân tích các nền mẫu phức tạp, điển hình là các mô sinh học chứa lipid, hợp chất tạo màu, amine,… Hiệu ứng nền mẫu được xác định theo phương trình sau:

ĐÁNH GIÁ RỦI RO PHƠI NHIỄM

Sự tồn tại của các paraben trong cá biển được coi là tác nhân gây phơi nhiễm hợp chất đối với sức khỏe con người thông qua chế độ ăn uống Việc đánh giá rủi ro sức khỏe con người đối với hợp chất paraben được đánh giá bằng chỉ số nguy cơ (hay còn gọi là chỉ số rủi ro, HI) theo phương trình:

EDI: hàm lượng ước tính hấp thu hằng ngày (mg/kg/ngày);

RfD: liều lượng tham chiếu (dựa theo NIAEL);

IRfood: tỷ lệ thực phẩm tiêu thụ (kg), ước tính là 0,055 kg trọng lượng ướt khi giả sử lượng nước trong cá biển chiếm khoảng 70% [64];

Ci: nồng độ paraben phát hiện trong mẫu cá biển (mg/kg);

BW: trọng lượng cơ thể trung bình (kg), với ước tính BWngười lớn = 60 kg và