Nghiên cứu xác Định một số diamin trong nước tiểu bằng phương pháp lc ms ms Nghiên cứu xác Định một số diamin trong nước tiểu bằng phương pháp lc ms ms
TỔNG QUAN
Giới thiệu về isocyanat
Isocyanat là tên gọi chung của các hợp chất hóa học có chứa một hoặc nhiều nhóm – NCO (nitơ, cacbon, oxy) liên kết với một gốc hữu cơ, được viết tắt là R- NCO Isocyanat có thể được phân loại theo số lượng nhóm isocyanat (NCO) gắn với gốc tự do, kết quả tạo ra có monoisocyanat, diisocyanat, triisocyanat, bản chất của các gốc hữu cơ có thể là hợp chất thơm, aliphatic hoặc alicyclic
Trong thực tế, nhóm hợp chất isocyanat chứa 1 nhóm NCO rất ít được sử dụng Thông thường, thuật ngữ isocyanat được đề cập đến tất cả các chất hóa học có chứa hai hoặc nhiều nhóm -NCO như diisocyanat hoặc polyisocyanat Diisocyanat gồm 2 nhóm N=C=O kết hợp với một hợp chất thơm hoặc hợp chất béo Các diisocyanat cũng dễ dàng phản ứng với các hợp chất chứa các nguyên tử hydro hoạt động, do đó chúng dễ dàng phản ứng với nước, rượu, amin để tạo thành dime hoặc trime Oligome (còn gọi là polyisocyanat, tiền polyme, hoặc homopolyme) thường bao gồm một hỗn hợp các đồng phân của các phân tử có chứa hai hoặc nhiều nhóm NCO Các sản phẩm thương mại được sử dụng trong nhiều quy trình sản xuất thường được tạo thành từ diisocyanat và oligome
Các isocyanat thương mại chính được sử dụng bao gồm methylene diphenyl diisocyanat (MDI), hexamethylene diisocyanat (HDI), isophorone diisocyanat (IPDI), các polymer và tiền polymer của chúng Isocyanat được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp in, sơn phủ bề mặt dưới dạng tạo các hợp chất urethane hoặc polyurethane, đặc biệt trong công nghệ sơn phủ sử dụng sơn hai thành phần
Một số loại isocyanat thường gặp
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của MDI
- MDI tinh khiết là dạng rắn ở nhiệt độ phòng
- MDI lỏng có màu vàng, mùi nhẹ Ứng dụng của MDI
- MDI được sử dụng trong các sản phẩm như nhựa nhiệt dẻo polyuretan, sợi, keo, lớp phủ bề mặt, lốp, bánh xe công nghiệp, đế giày,
- Các sản phẩm bằng nhựa polyme MDI phù hợp cho nhiều ngành công nghiệp, sản xuất và đặc biệt sử dụng cho tấm cách nhiệt tủ lạnh, trang trí nội thất ô tô và chỗ ngồi, vật liệu xây dựng, công nghiệp sơn, keo dán, chất kết dính, bao bì, đồ nội thất
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của 1,6 hexamethylene diisocyanat (HDI)
- Hexamethylene diisocyanat (HDI) là một chất lỏng không màu hoặc hơi vàng
- HDI không được sử dụng như các monomer mà được sản xuất trong công nghiệp như một loại polymer Hơn nữa HDI có thể được chế biến trong công nghiệp với các polyol để tăng trọng lượng phân tử Những sản phẩm này thường chỉ chứa 0,5% HDI monomer, chúng được sử dụng trong công nghiệp làm chất phủ bề mặt rất tốt Ngoài dùng cho các loại sơn thì HDI còn được cho vào các chất bịt kín, chất kết dính
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của IPDI
- IPDI tinh khiết là lỏng màu vàng ở nhiệt độ phòng
- IPDI lỏng có màu vàng, mùi hăng Ứng dụng của IPDI
Sử dụng trong sản xuất nhựa polyester / polyurethane để sử dụng làm thành phần của lớp phủ sử dụng trên nền kim loại và các bề mặt tiếp xúc với thực phẩm sử dụng nhiều lần
Ảnh hưởng của isocyanat
Mức độ ảnh hưởng của isocyanatđến sức khỏe người lao động phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ tiếp xúc, thời gian tiếp xúc, con đường tiếp xúc
Isocyanatlà chất kích ứng và nhạy cảm mạnh với da và đường hô hấp Chúng có thể gây ra nhiều loại bệnh khác nhau cho phổi và cơ quan hô hấp, đặc biệt là hen phế quản nghề nghiệp (Occupational Asthma – OA) có thể biểu hiện sau vài tháng hoặc nhiều năm tiếp xúc Các triệu chứng ngay lập tức xuất hiện nếu người bị bệnh tiếp xúc với isocyanatdù ở nồng độ rất nhỏ Ngày nay, isocyanatlà nguyên nhân hàng đầu của bệnh hen phế quản nghề nghiệp ở các nước công nghiệp hóa, tất cả các nhóm chức isocyanattừ monomer đến oligomer đều góp phần gây bệnh [24] Ảnh hưởng sức khỏe khi tiếp xúc isocyanatbao gồm kích ứng da, mắt, đau thắt ngực, thở khó khăn,[3, 4, 19, 23] nổi mề đay, chàm tiếp xúc Theo tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) 2,4-TDI và 2,6-TDI được phân loại là chất có khả năng gây ung thư ở người và được biết là gây ra ung thư ở động vật Các ảnh hưởng chính tới sức khỏe con người của isocyanatthường được nhắc đến là gây hen phế quản nghề nghiệp và các vấn đề về phổi khác, cũng như kích thích mắt, mũi, cổ họng và da
Tất cả các isocyanatgây kích ứng da (đỏ, khô, chàm) có thể đạt đến mức bỏng độ 3 Một số nghiên cứu cũng báo cáo viêm da dị ứng do tiếp xúc Tiếp xúc với hơi và bình xịt làm mắt kích ứng biểu hiện bằng chảy nước mắt, cảm giác nóng bỏng hoặc thậm chí là viêm kết mạc, cùng với kích ứng ở đường hô hấp trên gây đau họng hoặc chảy nước mũi Nồng độ trong không khí cao có thể gây ra mắt và mũi bị kích ứng Tiếp xúc ở mức cao như trường hợp sự cố đổ tràn có thể gây kích ứng phế quản xuất hiện như hội chứng rối loạn chức năng đường hô hấp, kích ứng phế nang và chứng phù nề phổi, triệu chứng có thể xuất hiện trong vòng 48 giờ sau khi tiếp xúc
Tiếp xúc, con đường xâm nhập, các chất chuyển hóa và đào thải
1.3.1 Tiếp xúc, con đường xâm nhập
Các ngành nghề chính tiếp xúc với isocyanat bao gồm ngành sơn ô tô, xe máy, sản xuất tạo lớp phủ bề mặt, bọt polyuretan, keo dán, nhựa, chất đàn hồi, chất kết dính và chất bịt kín … isocyanat xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua 2 con đường:
Hô hấp: Hầu hết các phơi nhiễm xảy ra khi hít phải, diisoxyanat dễ hấp thu qua đường hô hấp Tổng lượng hấp thu đường hô hấp được ước tính là 99% ở chuột và 97% ở người khi thở bằng mũi Dự đoán sự hấp thu hô hấp của con người giảm xuống 87% trong điều kiện thở bằng miệng Tốc độ hấp thu của HDI hít vào đường thở ở người được ước tính cao hơn chuột [27]
Tiếp xúc da và mắt: isoxyanat xâm nhập vào cơ thể con người qua đường da và mắt thường ở dạng hơi và sol khí Khi tiếp xúc HDI qua da gây ra viêm da tiếp xúc dị ứng, nghiên cứu cho thấy rằng khoảng 90% HDI biến mất khỏi bề mặt da trong vòng 30 phút khi tiếp xúc với HDI trong etyl axetat [30]
1.3.2 Các chất chuyển hóa và đào thải
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của HDA
HDA có công thức phân tử: C6H16N2
Khối lượng phõn tử: 116.208 gãmol −1 pKa = 10,51
Khi xâm nhập vào cơ thể người, hexamethylene diisocyanat(HDI) chuyển hóa thành Hexamethylene diamine HDA trong mẫu nước tiểu [20, 17] Theo nghiên cứu của tác giả Mirmohammadi và các cộng sự (2011) cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ HDI trong không khí và nồng độ HDA trong nước tiểu r = 0,857 [20] ( nghiên cứu trên 40 công nhân) Hội nghị các nhà vệ sinh công nghiệp của Chính
8 phủ Mỹ (ACGIH) đã đề xuất chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với 1,6-hexamethylen diisocyanat(HDI) là 1,6-hexamethyllen diamine (HDA) niệu ≤ 15 àg/g creatinine [5] (mẫu nướ1.4c tiểu cuối ca làm việc) Thời gian bỏn hủy của HDI trong mẫu nước tiểu khoảng 2,5 giờ [31] Tỉ lệ chuyển hóa của HDI tạo amin tương ứng là 39% sau 2 giờ tiếp xúc.[31] Sơ đồ chuyển hóa khi tiếp xúc với HDI được trình bày trong hình 1.4 [10]
Hình 1.5 Sơ đồ sản phẩm chuyển hóa của 1,6 Hexametylen diisoxyanat trong cơ thể người
Quá trình chuyển hóa chính của HDI trong cơ thể bao gồm phản ứng với các nhóm amin, hydroxyl và thiol của protein (hình 1.4) HDI có thể bị thủy phân trực tiếp thành HDA hoặc tạo thành các sản phẩm trung gian như monoacetyl-HDA hoặc diacetyl-HDA thông qua các phản ứng enzym Các sản phẩm trung gian này có thể oxy hóa tạo thành hợp chất nitroso hoặc phản ứng với nhóm thiol trên protein để tạo thành các sản phẩm liên hợp với HDA hoặc HDA đã được acetyl hóa HDA cũng có thể được chuyển hóa thành mono- và diacetylated-HDA thông qua phản ứng N-acetylation Cuối cùng, các hợp chất này được bài tiết qua nước tiểu.
Quá trình acetyl hóa nhanh của HDA sẽ làm tăng lượng diacetyl-HDA trong nước tiểu trong khi quá trình acetyl hóa chậm sẽ dẫn đến lượng monoacetyl HDA (3A) tự do hoặc protein cao hơn Nghiên cứu của Wikman (2002) đã chỉ ra rằng những công nhân tiếp xúc HDI có acetyl chậm NAT1 có nguy cơ phát triển hen suyễn gấp 2,5 lần [33]
Hình 1.6 Công thức cấu tạo của MDA
MDA có công thức phân tử: C13H14N2
Khối lượng phân tử: 198,27 g/mol pKa = 3,92
Thuộc nhóm 2B chất gây ung thư
Khi xâm nhập vào cơ thể người đặc biệt là hấp thụ qua da, methylene diphenyl diisocyanat (MDI) chuyển hóa thành 4,4’-diphenylmethane diamine (MDA) trong nước tiểu [7, 12, 5] Hệ số tương quan cao giữa nồng độ MDI trong không khí và nồng độ MDA trong mẫu nước tiểu có r = 0,755 Hội nghị các nhà vệ sinh công
10 nghiệp của Chính phủ Mỹ (ACGIH) đã đề xuất chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với methylene diisocyanat (MDI) là 4,4’- diphenylmethane diamine (MDA) niệu ≤ 10 àg/g creatinine [5] (mẫu nước tiểu cuối ca làm việc) Thời gian bán hủy của MDI trong mẫu nước tiểu khoảng 2,5 giờ [31]
Hình 1.7 Công thức cấu tạo của IPDA
IPDA có công thức phân tử: C10H22N2
Khối lượng phân tử: 170,30 g/mol pKa = 10,54
Khi xâm nhập vào cơ thể người đặc biệt là hấp thụ qua da, isophorone diisocyanat (IPDI) chuyển hóa thành isophoronediamine (IPDA) trong nước tiểu
[31] Thời gian bán hủy của IPDI trong mẫu nước tiểu khoảng 2,8 giờ [31] Tỉ lệ chuyển hóa của IPDI tạo amin tương ứng là 27% sau 2 giờ tiếp xúc [31] Hiện tại chưa có tiêu chuẩn giám sát sinh học cho chất này
Bảng 1.1 Giới hạn nồng độ của diamin trong mẫu nước tiểu
Giỏm sỏt sinh học (àg/g creatinin)
HDA MDA 2,6-TDA 2,4-TDA IPDA Đức (1) 15 10 5 -
1 (Tổng Isocyanat (àmol/mol creatinin))
“-’’ Chưa có tiêu chuẩn giám sát
(3) HSE’s Health & Safety Laboratory “Monitored by analysis of isocyanat metabolites in urine”
Các phương pháp phân tích HDA, MDA, IPDA
1.4.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Rosenberg (2002) cùng cộng sự đã phát triển phương pháp phân tích các chất chuyển hóa của diisocyanat ở công nhân tiếp xúc với sản phẩm phân hủy nhiệt của polyurethan bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Mẫu nước tiểu được điều chỉnh pH dưới hoặc bằng 4 bằng axit H2SO4 và bảo quản ở -20 độ C cho đến khi phân tích Chất chuẩn nội được thêm vào 1 mL nước tiểu, mẫu được thủy phân ở 100 độ C trong vòng 90 phút.
16 giờ Sau đó thêm 0,5 g NaCl và 4 mL dung dich NaOH bão hòa, các amin được chiết trong dung dịch toluen 3 lần, mỗi lần 2 mL Thờm 20 àL HFBA vào dung dịch toluen đã chiết trước đó, thuốc thử acyl hóa dư thừa đã được loại bỏ sau 30 phút chiết bằng dung dịch đệm phosphate (4 mL dung dịch KH2PO4 1M, pH =7,0) Lớp toluene được giữ lại và sấy khô trên natri sulfat Mẫu được làm khô bằng khí N2 và được hũa tan trong 60 àL etyl axetat Thể tớch bơm mẫu 1 àL Giới hạn định lượng của hexamethylenediamin (HDA), isophoronediamine (IpDA) và 4''- diaminodicyclohexyl metan (4,4'-DDHM) là 5 nmol/L Phương pháp này có giới hạn định lượng thấp, tuy nhiên thời gian xử lý mẫu dài hơn 16 tiếng trải qua nhiều bước chiết lỏng lỏng [26]
Gaines và các cộng sự (2010) xác định HDA ở công nhân tiếp xúc với HDI trờn sắc ký khớ khối phổ GC-MS 1 mL nước tiểu thờm 10àL chất nội chuẩn và 100àL acid H2SO4 thủy phõn ở 100 0 C trong 4 giờ Sau đú mẫu được trung hũa với 4 mL NaOH bão hòa, trộn với 0,5 g natri clorua (NaCl), chiết ba lần với 2 mL toluen Các mẫu sau đó được dẫn xuất với 20 μL heptafluorobutyric anhydrit trong 60 phút ở 55 °C Sau khi làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng, 0,4 mL đệm phosphat kali 1 M (pH = 7) được thêm vào để loại bỏ tác nhân dẫn xuất dư Lớp hữu cơ được giữ lại
Để loại bỏ nước khỏi mẫu, người ta thêm MgSO4 và Na2SO4 Chất hữu cơ sau đó được chuyển sang lọ sạch và thổi khô bằng N2 với áp suất 2 psi trong 2 giờ đầu tiên Sau đó, áp suất được tăng lên 5 psi để làm khô 1 mL mẫu còn lại Cặn được hòa tan trong 200 μL etyl axetat để bơm vào thiết bị GC-MS Nghiên cứu trên 417 mẫu nước tiểu cho thấy nồng độ HDA dao động từ 0 (158/417 mẫu) đến 65,9 ng/mL Nồng độ HDA được chuẩn hóa theo nồng độ creatinin, dao động từ 0 đến 21,6 μg/g creatinin.
Tinnerberg và cộng sự (1995) đã phát triển phương pháp LC-MS để phân tích HDA và IPDA trong nước tiểu, trong khi phương pháp GC-MS được sử dụng để xác định HDA và IPDA trong huyết thanh Mẫu máu và nước tiểu được thủy phân trong môi trường kiềm trong 4 giờ Tỷ lệ chuyển hóa HDI thành amin tương ứng là 39% đối với HDI và 27% đối với IPDA sau 2 giờ tiếp xúc Giới hạn phát hiện của HDA và IPDA trong nước tiểu và huyết thanh là dưới 0,1 ng/mL Thời gian bán hủy của HDA và IPDA trong nước tiểu lần lượt là 2,5 giờ và 2,8 giờ.
1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Skarping và Dalene (1994) nghiên cứu xác định HDA và IPDA trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp LC-MS Phương pháp xử lý mẫu được xử dụng là: Lấy 1mL nước tiểu thêm 1,5mL NaOH của 5 mol/L thêm tiếp 50 μL HCl 1 mol/L chứa 1 μg/L chất nội chuẩn TDHDA Mẫu đươc lắc đều sau đó thủy phân hỗn hợp ở 100°C trong
4 giờ Tiếp theo thêm 4 mL dung dịch NaOH bão hòa và 3 mL toluene vào mẫu Lắc hỗn hợp trong 10 phút sau đó đem ly tâm ở 1500 vòng trong 10 phút Chuyển lớp toluen ở trên vào 1 ống 10 sạch khác, thêm 20 μL thuốc thử anhydrit, lắc trong vòng
10 phút Loại bỏ lượng acid dư bằng cách chiết với 2 mL dung dịch đệm phosphate (pH 7,5) Làm khô lớp hữu cơ toluen ở 40°C, sau đó hòa tan cặn thu được trong 100 μL pha động để phân tích trên LC-MS Giới hạn phát hiện cho HDA và IPDA là 0,1 μg/L [28]
Marand và các cộng sự (2004) nghiên cứu xác định 4,4′-methylenedianilin (MDA), toluen diamin (TDA), naphthalen diamin (NDA), Hexamethylene diamine (HDA), isophoronediamine (IPDA), methylenedi(cyclohexylamin) (HMDA) and
4,4A-methylen-(2-chloroanilin) (MOCA) trong nước tiểu và huyết tương bằng phương pháp LC -MS/MS Phương pháp xử lý mẫu được xử dụng là: 1 mL nước tiểu hoặc 0,5 mL huyết tương thêm 1,5 mL H2SO4 3M, 100 μL nội chuẩn nồng độ 0,1 ng/mL; thủy phân mẫu ở 100°C trong 16 giờ Sau khi thủy phân các amin trong mẫu được chiết vào 2 mL toluene bằng cách thêm 5 mL NaOH bão hòa, lắc trong 10 phút và ly tâm trong 10 phút Lớp hữu cơ được chuyển sang ống nghiệm mới, 20 μL anhydrid acid perfluorofatty đã được thêm vào và lắc hỗn hợp trong khoảng 10 giây Thuốc thử và acid tạo thành được loại bỏ bằng cách chiết với 2 mL dung dịch đệm phosphate 1 M (pH 7,5) Làm khô mẫu bằng máy ly tâm chân không (model SC210A, Hoa Kỳ) Hòa tan cặn trong 100 μL acetonitril và được đặt trong bể siêu âm trong 10 phút chuyển dung dịch vào vial và phân tích bằng LC-MS/MS [18]
Li và các công sự (2018) nghiên cứu MDA trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp LC-MS/MS Phương pháp xử lý mẫu được xử dụng: Mẫu nước tiểu được thủy phân với acid sulfuric và chiết bằng acetonitril, sau đó được tách trên cột Shim-pack XR-ODS Khoảng tuyến tính là 0,05 ~ 20,00 ng/mL Hệ số liên quan là 0,9995 Giới hạn phát hiện là 0,02 ng/mL, hiệu suất thu hồi đạt từ 91,0% ~ 103,4% Độ lệch chuẩn tương đối nằm trong khoảng 2,7% ~ 7,3% [16]
Bhandari và các công sự (2018) nghiên cứu xác định 1,6-hexamethylenediamine (HDA), isophoronediamine (IPDA), β-methylamino-L-alanine (BMAA) và trimethylamine N-oxide (TMAO) trong nước tiểu bằng phương pháp UPLC- MS/MS Phương pháp xử lý mẫu được xử dụng là: 250 μL nước tiểu trộn với 100 μL HCl 6 N thêm 50 μL của hỗn hợp chất nội chuẩn và 600 μL nước Mẫu đã được đặt trong một khối gia nhiệt đặt ở 80°C trong 4 h Sau đó làm nguội mẫu đến nhiệt độ phòng Điều chỉnh theo pH ~ 1,0 bằng cách sử dụng 500 μL của NaOH 1 N trước khi thực hiện chiết pha rắn (SPE) Sau quá trình chiết mẫu được làm khô bằng khí N2 ở 60°C Cặn được hòa tan với 1 mL nước và methanol (95:5 v/v) chứa 0,1% heptafluorobutyric (HFBA), 2 μL mẫu được bơm vào hệ thống phân tích Ưu điểm của phương pháp là thời gian phân tích nhanh 4 chất ra pic sau 2,6 phút, thời gian chạy 1 mẫu chỉ mất 5 phút Giới hạn phát hiện của HDA là 0,15 μg/L, của IPDA là 0,05 μg/L…[6]
Nghiên cứu của Maggy Lépine và cộng sự (2019) xác định 4,4′-methylenedianiline (MDA), toluenediamine (2,4-TDA; 2,6-TDA), và hexamethylenediamine (HDA) bằng phương pháp UHPLC-MS/MS.
8.5) và 2 μL acetic anhydride, 5 μL mẫu được bơm vào hệ thống phân tích Giới hạn phát hiện của HDA là 5 nM, của MDA là 5 nM, 2,6-TDA là 3,2 nM, 2,2-TDA là 1,8 nM Độ thu hồi trên 89,5% hệ số tương quan R 2 > 0,99 [14]
Như vậy, có rất nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng để xác định chất chuyển hóa của isocyanat trong nước tiểu Bảng 1.2 là tóm tắt các kết quả xác định một số diamin bằng phương pháp GC-MS và LC-MS/MS
Bảng 1.2 Tóm tắt kết quả xác định HDA, TDA, MDA bằng phương pháp GC-
MS và LC-MS/MS
STT Các chất PT Nền mẫu
PP phân tích Độ nhạy
Khoảng hàm lượng phát hiện
1 HDA và IPDA Huyết thanh GC-MS LOD: 0,1 ng/mL
Nước tiểu GC-MS MDL:
Nước tiểu GC-MS LOD: 5 nmol/L
4 HDA, IPDA Nước tiểu LC-MS LOD: 0,1 ng/mL
STT Các chất PT Nền mẫu
PP phân tích Độ nhạy
Khoảng hàm lượng phát hiện
- Tronghuyết tương +MDA: 1,5- 6,4 ng/mL
Qua bảng 1.2 cho thấy, phương pháp LC-MS/MS được ứng dụng nhiều trong phân tích xác định hàm lượng HDA, MDA, IPDA trong nền mẫu nước tiểu, giới hạn định lượng của phương pháp thấp hơn so với phương pháp khác Trong khuôn khổ luận văn này, trên cơ sở các điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, phương pháp
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là nồng độ 4,4′-methylenedianiline (MDA), hexamethylene diamine (HDA), isophorone diamine (IPDA) trong mẫu nước tiểu có tiếp xúc nghề nghiệp.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát các điều kiện phân tích đồng thời HDA, MDA, IPDA bằng phương pháp LC-MS/MS
− Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp
− Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: khảo sát thành phần pha động, tỉ lệ các dung môi trong pha động
2.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Trên cơ sở tham khảo tài liệu [6, 14, 18] hai quy trình xử lý mẫu được lựa chọn để khảo sát nhằm xác định đồng thời ba chất HDA, MDA, IPDA trong nước tiểu bằng phương pháp LC-MS/MS là:
− Chiết lỏng- lỏng với toluene
− Làm sạch qua cột SPE
Các quy trình khảo sát cụ thể được nêu trong mục 2.3
Quy trình làm sạch mẫu được chọn để phân tích mẫu thực tế là quy trình loại được tạp, tăng tuổi thọ cho cột phân tích và cho độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu thêm chuẩn nằm trong khoảng cho phép của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (AOAC)
2.2.3 Đánh giá phương pháp phân tích Đánh giá phương pháp phân tích thông qua các thông số sau:
− Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ
− Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
2.2.4 Xác định nồng độ HDA, MDA, TDA trong một số mẫu nước tiểu của công nhân sơn ô tô
Phương pháp phân tích đã được đánh giá và áp dụng để phân tích nước tiểu của công nhân tại gara sơn ô tô ở Bắc Ninh Kết quả phân tích được so sánh với ngưỡng và tiêu chuẩn của Mỹ và Đức.
Thiết bị và dụng cụ phân tích
− Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ gồm hệ thống sắc ký lỏng 1290 Agilent kết hợp với khối phổ G6430
− Cân phân tích Sartorius độ chính xác 0,00001mg
− Máy thổi khô khí Nito Eyela MG-2200
− Máy ly tâm lạnh Z326k HermLe
− Máy sinh hóa Cobas C311 Roche
− Micropipet cú thể tớch điều chỉnh được 20-200àL, 100-1000 àL và 1000- 5000àL
− Bình định mức thủy tinh Duran: 5, 10, 20, 25, 50 và 100 mL, 1 L
− Cột chiết pha rắn MCX Phenomenex (30 mg/3 mL)
Dung môi, hóa chất
Hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho LC-MS/MS
− Chuẩn hexamethylen diamin (HDA) (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 98 %
− Chuẩn 4,4′-methylen dianilin (MDA) (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 98 %
− Chuẩn isophorone diamine (IPDA) (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 98 %
− Ammonium hydroxide NH4OH (25%) (Merck)
2.4.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
* Dung dịch chuẩn gốc: 500 àg/mL
Cân chính xác khoảng 0,0125g ± 0,0001 từng chuẩn gốc HDA, MDA, IPDA vào cốc cân có mỏ riêng biệt Thêm 5 mL MeOH/H2O (50:50 v/v), hòa tan chuẩn, chuyển lần lượt vào các bình định mức 25 mL, tráng rửa cốc cân đựng chuẩn nhiều lần, gộp dịch và định mức đến vạch bằng MeOH/H2O (50:50 v/v), dung dịch các chuẩn gốc thu được cú nồng độ 500 àg/mL Bảo quản 12 thỏng ở nhiệt độ 4 o C
* Dung dịch chuẩn trung gian 10 àg/mL
Hỳt chớnh xỏc 0,2 mL từng dung dịch chuẩn gốc 500 àg/mL bằng pipet, lần lượt cho vào các bình định mức 10 mL, thêm MeOH/H2O (50:50 v/v), lắc đều, định mức tới vạch Dung dịch chuẩn trung gian của từng chuẩn cú nồng độ 10 àg/mL Bảo quản ở 4 o C, sử dụng trong 1 tháng
* Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc
Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp được pha chế từ các chuẩn đơn trung gian Hút chính xác 1 mL lần lượt từng chuẩn đơn trung gian vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL MeOH/H2O (50:50 v/v), lắc đều, định mức tới vạch Hỗn hợp chuẩn làm việc thu được có nồng độ 100 ng/mL Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc sẽ được pha mới vào mỗi ngày phân tích mẫu
Dãy chuẩn HDA, MDA, IPDA có nồng độ nằm trong khoảng từ 0,5 ng/mL đến 100,0 ng/mL Dãy chuẩn gồm 8 điểm chuẩn có nồng độ lần lượt là 0,5 - 1,0- 5,0- 10,0-20,0- 40,0- 60,0- 100,0 ng/mL
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ được sử dụng là sự kết hợp giữa khối phổ 6430 và hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 1290 của Agilent, sở hữu độ nhạy cao, phù hợp với các mẫu thực sinh học có nền phức tạp Do đặc điểm này, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn hệ thống này để định lượng HDA, MDA, IPDA trong mẫu nước tiểu.
Hình 2.1 Thiết bị LC-MS/MS 6430 được sử dụng trong nghiên cứu
+ IS (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phân phân tích ion Thế ion hóa quyết định loại ion chuyển đến bộ phận phân tích khối Đối với loại ion dương, IS = 4000 ÷ 5500V, ion âm IS = -3000 ÷ - 4000V
Khi hoạt động, máy in phun sử dụng hai loại mực chính là GS1 và GS2 GS1 (Ion Source Gas 1) có tác dụng làm cho quá trình hình thành các giọt mực được thuận lợi hơn Áp suất khí của GS1 thường cao hơn so với GS2, giúp đẩy mực ra ngoài đầu phun một cách dễ dàng, góp phần tạo nên những bản in sắc nét và ổn định.
Hình 2.2 Sơ đồ bộ phân tích khối phổ ba tứ cực
+ GS2 (Ion Source Gas 2): Áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay hơi dung môi
+ TEM (Temperature): Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào (Gas2) Nhiệt độ góp phần thúc đẩy quá trình hóa hơi các giọt chất phân tích khi đi ra khỏi đầu phun
Luồng khí sạch N2 được thổi giữa khe hở hai màn chắn của bộ phận ion hóa và phân tích phổ chính là CUR (Curtain Gas) Nó đẩy các giọt dung môi và phân tử trung tính để nguồn ion mẹ sạch hơn.
+ DP (Declustering Potential): Thế đầu vào, thế áp vào màn chắn của bộ phận phân tích khối Nó có tác dụng bẻ gẫy cụm ion [M+H3O + ] + và khử nhiễu hóa học tạo thành, làm tăng độ nhạy của phép phân tích Tuy nhiên, thế này cũng được quá cao, vì nó sẽ bẻ gẫy luôn cả cấu trúc của phân tử ion mẹ
+ EP (Entrance Potential): Thế áp vào nguồn ion mẹ
+ CE (Collision Energy): Thế áp vào Q2, tạo ra năng lượng để phân mảnh ion mẹ
+ CXP (Collision Cell Exit Potential): Thế áp giữa Q2 và Q3
+ CAD (Collision Gas Pressure): Kiểm soát áp suất khí N2 trong Q2, thúc đẩy quá trình phân mảnh thứ cấp, ngoài ra còn có tác dụng làm mát các ion con và hướng chúng đến Q3
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên pha tĩnh và pha động, do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển khác nhau và tách ra khỏi nhau Cột sắc ký C18 (100mm x 2,1mm, 2 àm) và tiền cột tương ứng của hóng Waters, Mỹ được lựa chọn trong nghiờn cứu này Loại dung môi, tỉ lệ các thành phần dung môi, tốc độ rửa giải của pha động ảnh hưởng đến hiệu quả tách các chất Đây là lí do cần phải khảo sát thành phần hệ pha động, tốc độ rửa giải trong quá trình phân tích đồng thời HDA, MDA, IPDA
Dựa trên một số tham khảo [14, 6, 18] và các dung môi, hóa chất của phòng thí nghiệm, 06 hệ pha động được lựa chọn để khảo sát trong nghiên cứu bao gồm:
− Hệ pha động 1: kênh A: acid heptafluorobutyric (HFBA) 0,1 %, trong nước, kênh B: ACN;
− Hệ pha động 2: kênh A: acid trifluoroacetic (TFA) 0,1 %, trong nước: ACN;
− Hệ pha động 3: kênh A: acid formic 0,1 % trong nước, kênh B: ACN;
− Hệ pha động 4: kênh A: acid heptafluorobutyric (HFBA) 0,1 %, trong nước, kênh B: MeOH;
− Hệ pha động 5: kênh A: acid trifluoroacetic (TFA) 0,1 %, trong nước: MeOH
− Hệ pha động 6: kênh A: acid formic 0,1 % trong nước, kênh B: MeOH
2.5.2 Phương pháp xử lý mẫu
Lấy mẫu nước tiểu cuối ca của công nhân phun sơn Thể tích mẫu 10 mL vào lọ nhựa có nắp vặn Mẫu được bảo quản trong thùng giữ nhiệt có gel đá lạnh trước khi đưa về phòng thí nghiệm Mẫu nước tiểu có thể được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C trong vòng 30 ngày [14, 6] Mẫu nước tiểu được bảo quản trong tủ âm sâu ở -80 o C có thể bảo quản trong vòng 6 tháng Nếu chưa phân tích thì chia thành các ống nhỏ thể tích 1,5 mL, lưu vào tủ lạnh nhiệt độ bảo quản -80 o C khi phân tích thì lấy ra từng ống, khi phân tích xong thì bỏ, không lưu lại các mẫu đã rã đông 1 lần, vì có thể ảnh hưởng đến chất lượng kết quả phân tích mẫu
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Mẫu nước tiểu có nền mẫu phức tạp Do đó để loại tạp, làm sạch, làm giầu mẫu và tăng tuổi thọ cho thiết bị LC-MS/MS, hai quy trình xử lý mẫu là chiết qua cột chiết pha rắn và chiết lỏng lỏng được lựa chọn khảo sát Quy trình xử lý mẫu được trình bày ở bảng 2.1 và hình 2.3, 2.4
Bảng 2.1 Quy trình xử lý mẫu
Chiết mẫu với toluene sau khi được thủy phân
Làm sạch qua cột SPE sau khi được thủy phân
- Chiết lỏng lỏng với dung dịch toluene
- Lọc mẫu qua giấy lọc và màng lọc 0,22 àm
- Thủy phân với acid HCl
- Hoạt hóa cột: 1 mL MeOH, 1 mL H2O
- Rửa tạp bằng 1 mL H2O, 1 mL MeOH
- Rửa giải: dung dịch NH4OH5% trong MeOH
- Thổi khô bằng khí Nito
- Hòa cặn bằng dung dịch 0,1 % HFPA trong nước
Hình 2.3 Quy trình xử lí mẫu nước tiểu 1
250 àL nước tiểu + 100 àL HCl 6 N +650 àL H2O Làm nóng ở nhiệt độ 80 o C trong vòng 4 giờ sử dụng bộ điều nhiệt
+ 500 àL NaOH 1 N làm nguội ở nhiệt độ phũng NaOH 1 N
Quy trình xử lí mẫu nước tiểu 1
Thêm toluene, lấy lớp dịch phía trên đưa vào lọ đựng mẫu màu nâu
250 àL nước tiểu + 100 àL HCl 6 N +650 àL H 2 O
Làm lạnh ở nhiệt độ phòng
Làm nóng ở nhiệt độ 80 o C trong vòng 4 giờ sử dụng bộ điều nhiệt
SPE (Strata XC 30mg, 3 mL)
Thổi khô bằng khi Nito ở 60 o C
• Rửa tạp: 1 mL HCl 0,1N trong nước
• Rửa giải: 0,5 mL NH4OH 10% (2 lần)
Hòa cặn 1 mL dd H 2 O/MeOH (95:5 v/v) với 1 % HFBA
Bơm 5 àLvào LC-MSMS Lọc qua m àng lọc 0,22 àm
Quy trình xử lí mẫu nước tiểu 2
Hình 2.4 Quy trình xử lí mẫu nước tiểu 2
Mẫu sau khi được làm sạch ở các điều kiện khác nhau sẽ được tiến hành phân tích trên thiết bị LC-MS/MS Đánh giá độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn theo 2 quy trình là căn cứ để chọn lựa quy trình xử lý mẫu tối ưu Sau khi lựa chọn được quy trình xử lý mẫu tối ưu theo 1 trong 2 quy trình, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân, dung môi chiết, và thể tích dung môi chiết mẫu
Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá bằng cách so sánh phổ của mẫu chuẩn HDA, MDA, IPDA trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng IP, yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu [2]
2.5.3.2 Giới hạn phát hiện (MDL), giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp
Spike một loạt 10 mẫu chuẩn hỗn hợp HDA, MDA, IPDA nồng độ 0,5ng/mL trên nền mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu nước tiểu không chứa chất phân tích
Theo cách tiếp cận của USEPA, việc tính toán giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp được thực hiện như sau [8]:
- Giá trị giới hạn phát hiện của phương pháp MDL = S*t
Trong đó: S – là độ lệch chuẩn; t - giá trị được tính theo số lần thí nghiệm lặp lại (n = 7 thì t = 3,14; n= 9 thì t = 2,89, );
- Giới hạn định lượng của phương pháp MQL = 3*MDL
Việc lựa chọn nồng độ để khảo sát tính toán MDL phải thỏa mãn:
MDL< [nồng độ thí nghiệm] < 10*MDL
2.5.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích
Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 0,5 đến 300,0 ng/mL và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được và nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát điều kiện LC-MS/MS xác định đồng thời HDA, MDA,
3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS
Tiến hành bơm từng dung dịch chuẩn HDA, MDA, IPDA có nồng độ 5 mg/mL vào hệ thống MS Sau khi chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử mẹ thành các ion con, khảo sát ion mẹ, ion con trên cơ sở tham khảo một số nghiên cứu trước đây [6] Hai ion con được lựa chọn cho mỗi chất, ion con có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng và ion có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận, các kết quả được trình bày như trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích HDA, MDA, IPDA
Năng lượng bắn phá CE (E)
Năng lượng bắn phá Fragmentor
Qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, điều kiện khối phổ hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử của HDA, MDA, IPDA, số khối của các ion mẹ tương ứng với từng chất phân tích, chúng đều có dạng là [M+H] + , mỗi chất thu được 2 ion con Kết quả này cũng phù hợp với kết quả với một số nghiên cứu trước đây [6]
Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lượng và định tính của từng chất Khảo sát các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion, thu được kết quả các thông số tối ưu liệt kê trong bảng 3.2
Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS để phân tích
Curtain Gas (CUR) 35,0 psi Collision Gas (CAD) 7,0 psi IonSpray Voltage (IS) 4000 V Temperature (TEM) 300 o C
Cột tách góp phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách chất Các chất HDA, MDA, IPDA là các chất phân cực vừa phải, do đó cột tách nên được sử dụng là cột tách pha đảo Trong điều kiện phòng thí nghiệm cho phép, cột pha đảo C18 được chọn nhằm phân tách đồng thời ba chất HDA, MDA, IPDA bằng phương pháp LC-MS/MS Để bảo vệ cột, tiền cột được sử dụng để bảo vệ cột với các thông số như sau:
❖ Cột ACE Excel2 Super C18 (100 mm x 2,1mm x 2 àm)
❖ Tiền cột C18 của ACE Excel2 (5 mm x 2,1mm x 2 àm)
3.1.3 Khảo sát lựa chọn pha động
Trong phương pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động không chỉ ảnh hưởng tới quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích Với kĩ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ ion dương, quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất như: acid heptafluorobutyric (HFBA), acid trifluoroacetic (TFA), pentafluoropropionic anhydride (PFPA), acid focmic Dùng
31 dung dịch chuẩn hỗn hợp HDA, MDA, IPDA 25 ng/mL để khảo sát thành phần pha động khi có thêm chất trên
- Pha động: kênh B lần lượt là ACN, và MeOH; kênh A lần lượt là acid heptafluorobutyric (HFBA) 0,1 %, acid trifluoroacetic (TFA) 0,1 %, acid formic 0,1
% trong nước Kết quả thu được ở bảng 3.3 và hình 3.1
Bảng 3.3 Khảo sát thành phần pha động Dung môi tỉ lệ 1:1
Thông số HDA MDA IPDA
Hình 3.1 Khảo sát thành phần pha động
Kết quả khảo sát ở bảng 3.3 và hình 3.1 cho thấy tín hiệu diện tích pic của các chất phân tích tăng khi sử dụng pha động tạo cặp ion theo thứ tự HFPA>TFA> acid focmic Khi sử dụng pha động là MeOH – HFBA 0,1% cho thời gian lưu ngắn, diện tích pic cao nhất, tăng độ nhạy của phương pháp Do đó, pha động MeOH – HFBA 0,1% trong nước được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo
Trong nghiên cứu này, sử dụng pha tĩnh C18 ít phân cực, do đó pha động phải là hệ dung môi phân cực Các chất tan phân cực vừa phải như HDA, MDA, IPDA sẽ lưu giữ trong cột lâu hơn chất tan phân cực Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian lưu và diện tích píc đối với các chất nhóm HDA, MDA, IPDA, pha động được khảo sát trên hai kênh: Kênh A sử dụng dung dịch HFBA 0,1% trong nước, Kênh B sử dụng dung môi MeOH 0,1% HFBA.
Chọn dung dịch chuẩn hỗn hợp HDA, MDA, IPDA 25 ng/mL để khảo sát tỉ lệ dung môi Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi pha động được chỉ ra ở hình 3.2 và bảng 3.4 dưới đây
Hình 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi MeOH- 0,1% HFBA
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi MeOH- 0,1% HFBA Thành phần
Thông số HDA MDA IPDA
Kết quả sắc đồ ở hình 3.2 và bảng 3.4 cho thấy, khi phân tích với chế độ đẳng dòng (isocractic) ở tỷ lệ MeOH – HFBA 50% - 50% thu được tín hiệu tốt, thời gian lưu ngắn, các chất có thể tách ra khỏi nhau Do đó, điều kiện này được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo
Dựa trên kết quả khảo sát, các thông số tối ưu cho quá trình phân tích đồng thời HDA, MDA, IPDA bằng phương pháp LC-MS/MS đã được lựa chọn, đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy trong kết quả phân tích.
➢ Cột ACE Excel2 Super C18 (100mm x 2,1mm x 2 àm)
➢ Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch HFBA 0,1% trong nước, kênh B là dung môi MeOH 0,1% HFBA
➢ Tốc độ dòng 0,2 mL/phút
➢ Thể tớch bơm mẫu: 10 àL
➢ Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.1 và 3.2
Sắc kí của chuẩn hỗn hợp 3 diamin HDA, MDA, IPDA với các điều kiện tối ưu thu được thời gian lưu tr theo bảng 3.5 và hình 3.3
Bảng 3.5 Thời gian lưu t r của các diamin trong điều kiện tối ưu
Thông số HDA MDA IPDA t r (phút) 2,60 3,16 3,67
Hình 3.3 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp HDA, MDA, IPDA 20 ng/mL
3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
3.2.1 Khảo sát lựa chọn 2 quy trình xử lý mẫu
Trong thành phần của của nước tiểu gồm các chất như: đường glucose, acid amin, Na + , K + , HCO3 -, Cl - … các chất khác (acid uric, creatinin, ure…), do đó trước khi phân tích trên thiết bị LC-MS/MS cần phải xử lí, tách chiết mẫu để làm giàu mẫu, loại tạp chất, giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện Trên cơ sở tham khảo tài liệu [6, 14, 18] , hai quy trình chiết được khảo sát gồm: chiết lỏng- lỏng bằng toluen và chiết pha rắn sử dụng cột SXC (30 mg, 3 mL) các bước xử lý mẫu được trình bày trong bảng 2.3 và 2.4
Sau đó các mẫu được đo ở các điều kiện như đã khảo sát ở trên, kết quả thu được ở bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát quy trình chiết mẫu nước tiểu
Kết quả thu được từ bảng 3.6 cho thấy mẫu nước tiểu được chiết theo quy trình
Quy trình chiết mẫu nước tiểu 2 được lựa chọn do hiệu suất thu hồi mẫu cao hơn so với quy trình 1, đạt từ 78,0% đến 88,0% đối với các chất HDA, MDA, IPDA Điều này thể hiện sự hiệu quả hơn trong việc loại bỏ tạp chất và làm giàu mẫu, giúp cải thiện chất lượng phân tích và thu được kết quả chính xác hơn.
3.2.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu theo quy trình 2
❖ Khảo sát thời gian ủ mẫu
Sau khi hấp thụ vào cơ thể, HDI phản ứng với các nhóm protein như amin, hydroxyl và thiol HDI có thể thủy phân thành HDA hoặc tạo thành các sản phẩm trung gian (monoacetyl-HDA hoặc diacetyl-HDA) Để chuyển monoacetyl hoặc diacetyl về dạng diamin tương ứng, cần thủy phân mẫu với HCl trong thời gian ủ phù hợp Thời gian ủ mẫu được khảo sát trong khoảng 2-16 giờ, kết quả thu được theo bảng 3.7 và hình 3.4.
Bảng 3.7 Khảo sát thời gian ủ mẫu
Hình 3.4 Khảo sát thời gian ủ mẫu
Kết quả thu được ở bảng 3.7 và hình 3.4 cho thấy thời gian ủ mẫu từ 8 – 16 h thu được hiệu suất thu hồi trên 80% cho cả 3 chất HDA, MDA, IPDA Ở thời gian ủ mẫu ngắn các amin chưa được chuyển hóa hoàn toàn làm giảm tín hiệu đo Khi tăng thời gian ủ mẫu lên 16 giờ hiệu suất thu hồi tăng không đáng kể, do vậy thời gian ủ mẫu 8 giờ được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo
❖ Khảo sát dung môi rửa giải Đối tượng nghiên cứu là các mẫu sinh học có nền mẫu phức tạp Do đó, cần phải có quá trình làm sạch mẫu trước khi bơm vào thiết bị Trong luận văn này, cột SPE được sử dụng để làm sạch mẫu HDA, MDA, IPDA được chiết theo quy trình như ở trên, mẫu được thêm chuẩn ở mức 45 ng/mL đối với dịch chiết và được rửa giải bằng các dung dịch có nồng độ NH4 khác nhau Kết quả thu được theo hình 3.5 và bảng 3.8:
Hình 3.5 Sắc đồ khảo sát nồng độ NH 4 OH rửa giải
Bảng 3.8 Khảo sát dung môi rửa giải đối với các HDA, MDA, IPDA
Đánh giá phương pháp phân tích
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 30 ng/mL trên nền mẫu nước tiểu Sắc đồ được trình bày ở hình 3.8
Hình 3.8 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chất chuẩn và mẫu thêm chuẩn
Kết quả sắc đồ ở hình 3.8 cho thấy, trên sắc đồ mẫu trắng không có tín hiệu của chất phân tích, mẫu chất chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn có pic của HDA, MDA, IPDA ở thời gian trùng khớp với thời gian lưu của chuẩn tương ứng (chênh lệch thời gian lưu không quá 2%) Như vậy, phương pháp là đặc hiệu để phân tích HDA, MDA, IPDA
Bảng 3.10 Thông tin thời gian lưu và mảnh phổ của HDA, MDA, IPDA
Tên chất Thời gian lưu
(phút) Mảnh mẹ Mảnh con IP
Theo cách tính điểm IP đối với mỗi ion mẹ là 1 điểm, mỗi ion con là 1,5 điểm, thiết bị LC-MS/MS là 1 điểm Kết quả thu được trên mẫu chuẩn và trên mẫu trắng thêm chuẩn cho thấy HDA, MDAvà IPDA đều có số điểm IP = 5≥ 4; thỏa mãn yêu cầu phân tích khối phổ LC-MS/MS của AOAC [2] Do vậy phương pháp phân tích có độ đặc hiệu với ba chất HDA, MDAvà IPDA
3.3.2 Khảo sát lập khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
3.3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính
Phân tích dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,5 ng/mL đến 300,0 ng/mL Các dung dịch chuẩn được pha trong dung dịch MeOH:H2O tỷ lệ 1:1 (v:v) Kết quả tín hiệu diện tích pic thu được tương ứng với các nồng độ chuẩn khác nhau được trình bày ở bảng 3.11 và các hình từ 3.9 đến hình 3.11
Bảng 3.11 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ HDA, MDA, IPDA
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ HDA
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ MDA
Nồng độ HDA ng/mL
Nồng độ MDA ng/mL
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ IPDA
Từ kết quả ở bảng 3.11 và các hình 3.9 đến 3.11 cho thấy, khoảng tuyến tính thu được tương ứng với các chất HDA, MDA, IPDA là 0,5-200,0 ng/mL Tuy nhiên để tăng độ chính xác khi định lượng mẫu thật nên khoảng nồng độ 0,5- 100,0 ng/mL được chọn để dựng chuẩn.
Dựa trên đồ thị chuẩn tuyến tính thu được, ta xây dựng đồ thị chuẩn của ba chất HDA, MDA, IPDA trong khoảng 0,5-100,0 ng/mL Hình ảnh đồ thị chuẩn của HDA, MDA, IPDA lần lượt được trình bày trong các hình 3.11, 3.12, 3.13.
Nồng độ IPDA ng/mL
Hình 3.12 Đường chuẩn xác định HDA bằng phương pháp LC-MS/MS
Theo các kết quả trên ta có: a = 367,7; b = 60,8; Sa = 2,27; Sb = 101 Độ lệch chuẩn của phương trình là: Sy = 212,42 Hệ số tương quan R 2 = 0,9998 Khoảng tuyến tính 0,5 – 100,0 ng/mL Phương trình hồi qui của đường chuẩn trên sẽ có dạng: y=(60,8±238,9) +(367,9 ± 5,36)x
Hình 3.83 Đường chuẩn xác định MDA bằng phương pháp LC-MS/MS y = 367.72x + 60.801 R² = 0.9998
Nồng độ HDA ( ng/mL )
Di ện tí ch pic
Nồng độ MDA ng/mL
Theo các kết quả trên ta có: a = 914,7; b = - 69,03 ; Sa = 3,95; Sb = 175,00 Độ lệch chuẩn của phương trình là: Sy = 368,96 Hệ số tương quan R 2 = 0,9999 Khoảng tuyến tính 0,5 – 100,0 ng/mL Phương trình hồi qui của đường chuẩn trên sẽ có dạng: y=(-69,0 ±413,8) +(914,7 ± 9,3)x
Hình 3.94 Đường chuẩn xác định IPDA bằng phương pháp LC-MS/MS
Theo các kết quả trên ta có: a = 704,94; b = 105,74; Sa = 3,21; Sb = 142 Độ lệch chuẩn của phương trình là: Sy = 299,86 Hệ số tương quan R 2 = 0,9999 Khoảng tuyến tính 0,5 – 100,0 ng/mL Phương trình hồi qui của đường chuẩn trên sẽ có dạng: y=(105,7± 335,8) +(704,9 ± 7,59)x
Qua kết quả xây dựng khoảng tuyến tính, bảng tổng hợp phương trình hồi quy, hệ số tương quan và khoảng tuyến tính được trình bầy ở bảng 3.12 y = 704.94x + 105.74 R² = 0.9999
Nồng độ IPDA (ng/mL)
Bảng 3.12 Phương trình đường hồi quy các diamin
Chất phân tích Phương trình hồi quy y = a + bx Hệ số tương quan R 2
Khoảng tuyến tính (ng/mL) HDA y=(60,8±238,9) +(367,9 ± 5,36)x 0,9998 0,5-100
3.3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Với khoảng tuyến tính xác định được, áp dụng hướng dẫn của EPA trong việc xác định giá trị giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL) của phương pháp Phân tích lặp lại 6 lần theo mục 2.6.3.2 ở nồng độ thêm chuẩn 0,5 ng/mL trên nền mẫu trắng Kết quả khảo sát thu được như trong bảng 3.13
Bảng 3.13 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Nồng độ đo được trên thiết bị LC-MS/MS
Từ kết quả bảng 3.13, MDL của HDA, MDA, IPDA lần lượt 0,074; 0,059; 0,053 ng/mL MQL tương ứng của HDA, MDA, IPDA lần lượt 0,243; 0,194; 0,177 ng/mL Các giá trị MDL, MQL thấp cho thấy phương pháp nghiên cứu có độ nhạy cao, phù hợp để phân tích lượng vết, cỡ ppb của HDA, MDA, IPDA trong mẫu nước tiểu
3.4.4 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định diamin trong nước tiểu
Sau khi khảo sát quy trình xử lí mẫu nước tiểu, xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp này bằng cách thêm chuẩn các HDA, MDA, IPDA ở các mức nồng
50 độ 8 ng/mL, 30 ng/mL, 70 ng/mL Các mẫu được lặp lại 10 lần theo quy trình hình 3.7
Bảng 3.13 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định HDA, MDA,
IPDA trong nước tiểu ở mức hàm lượng thêm chuẩn 8 ng/mL
8 ng/mL HDA MDA IPDA
Bảng 3.14 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định HDA, MDA,
IPDA trong nước tiểu ở mức hàm lượng thêm chuẩn 30 ng/mL
30 ng/mL HDA MDA IPDA
Bảng 3.15 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định HDA, MDA,
IPDA trong nước tiểu ở mức hàm lượng thêm chuẩn 70 ng/mL
70 ng/mL HDA MDA IPDA
Lần 6 68,80 98,29 73,12 104,46 66,66 95,23 Lần 7 72,60 103,71 71,91 102,72 67,06 95,81 Lần 8 71,08 101,55 73,95 105,64 69,10 98,71 Lần 9 70,88 101,25 72,01 102,88 66,18 94,55 Lần 10 70,01 100,01 71,76 102,51 67,20 96,00
Hình 3.105 Đồ thị thể hiện hiệu suất thu hồi HDA, MDA, IPDA
Ứng dụng phân tích hàm lượng HDA, MDA, IPDA trong một số mẫu nước tiểu
3.4 Ứng dụng phân tích hàm lượng HDA, MDA, IPDA trong một số mẫu nước tiểu
Trên cơ sở phương pháp đã xây dựng, tiến hành xác định hàm lượng HDA, MDA, IPDA trong 30 mẫu nước tiểu của công nhân Kết quả nồng độ HDA, MDA, IPDA trong mẫu nước tiểu được thể hiện trong bảng 3.17
Bảng 3.16 Kết quả định lượng HDA, MDA, IPDA một số mẫu nước tiểu
HDA MDA IPDA HDA MDA IPDA
(ng/mL) (ng/mL) (ng/mL) (àg/g creatinin)
Hình 3.16 Đồ thị nồng độ HDA, MDA, IPDA trong các mẫu nước tiểu
Qua kết quả phân tích mẫu thực tế cho thấy có 29/30 mẫu có nồng độ HDA
>MQL chiếm tỉ lệ cao 96,67%; 19/30 mẫu có nồng độ MDA> MQL chiếm tỉ lệ 63,33
%; 12/30 mẫu có nồng độ IPDA >MQL Nồng độ của HDA, MDA, IPDA trong mẫu nước tiểu lần lượt là
