Nghiên Cứu Phương Pháp Phân Tích Và Quan Trắc Một Số Hợp Chất Hữu Cơ (Nhóm Paraben Và Bisphenol) Gây Rối Loạn Nội Tiết Trong Môi Trường Trong Nhà.pdf

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Đặng Thị Liễu NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ QUAN TRẮC MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ NHÓM PARABEN VÀ BISPHENOL GÂY RỐI LOẠN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Thị Liễu

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ QUAN TRẮC MỘT

SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ (NHÓM PARABEN VÀ BISPHENOL) GÂY RỐI LOẠN NỘI TIẾT TRONG MÔI TRƯỜNG TRONG NHÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2021

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Thị Liễu

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ QUAN TRẮC MỘT

SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ (NHÓM PARABEN VÀ BISPHENOL) GÂY RỐI LOẠN NỘI TIẾT TRONG MÔI TRƯỜNG TRONG NHÀ

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440112.02

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VŨ ĐỨC NAM

PGS.TS TRẦN MẠNH TRÍ

Hà Nội – Năm 2021

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo, tập thể cán bộ, nhân viên Phòng thí nghiệm trọng điểm nghiên cứu về Dioxin – Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và thực hiện đề tài này

Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN, đặc biệt là các thầy cô tại Khoa Hóa học đã tận tình giảng dạy và tạo điều kiện tốt cho em trong quá trình học tập Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân yêu

đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày…… tháng……năm 2021

Học viên

Đặng Thị Liễu

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về paraben và bisphenol 3

1.1.1 Giới thiệu về paraben 3

1.1.2 Giới thiệu về bisphenol 6

1.2 Ứng dụng của paraben và bisphenol 7

1.2.1 Khả năng kháng khuẩn của paraben 7

1.2.2 Ứng dụng của bisphenol 9

1.3 Sự có mặt của paraben, bisphenol trong môi trường và những ảnh hưởng của chúng đến con người 10

1.3.1 Sự có mặt của paraben và bisphenol trong môi trường 10

1.3.2 Ảnh hưởng của paraben và bisphenol đến sức khỏe con người 12

1.4 Một số phương pháp phân tích paraben và bisphenol 18

1.4.1 Phương pháp điện di mao quản (CE) 18

1.4.2 Phương pháp sắc kí khí ghép nối khối phổ (GC/MS) 19

1.4.3 Phương pháp sắc kí lỏng 21

1.5 Các thông số cơ bản của phương pháp phân tích 25

1.5.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 25

1.5.2 Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng) 26

1.5.3 Khoảng tuyến tính 27

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Hóa chất, thiết bị 28

2.2.1 Hóa chất 28

2.2.2 Thiết bị 31

2.3 Nội dung nghiên cứu 32

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Xác định các điều kiện phân tích 32

2.4.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 36

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả khảo sát và xác định các điều kiện phân tích 39

3.1.1 Điều kiện sắc ký 39

3.1.2 Xác định các thông số của detector khối phổ 39

3.1.3 Quy trình xử lý mẫu 41

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 45

3.2.1 Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 45

3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 46

3.2.3 Độ lặp lại và độ thu hồi 48

3.3 Phân tích paraben và bisphenol trong mẫu bụi trong nhà 49

3.3.1 Quy trình chuẩn phân tích paraben và bisphenol trong mẫu bụi trong nhà 49

3.3.2 Kết quả phân tích paraben, bisphenol trong mẫu bụi trong nhà ở Hà Nội 51

3.3.3 So sánh với hàm lượng paraben và bisphenol với các địa điểm khác 55

3.4 Đánh giá rủi ro phơi nhiễm paraben và bisphenol đến con người 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 69

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EDCs Endocrine-disrupting chemicals Hóa chất gây rối loạn nội

DLLME Dispersive Liquid–Liquid

Microextraction

Phân tán vi chất

lỏng-lỏng

UPLC Ultra-Performance Liquid

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

IDL Instrumental Detection Limit Giới hạn phát hiện của

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Yêu cầu đối với bao bì, dụng cụ từ nhựa polycarbonate (PC) 18

Bảng 2.1: Mảnh ion của các paraben và bisphenol 33

Bảng 2.2: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 37

Bảng 2.3: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) 38

Bảng 3.1: Thời gian lưu của các paraben và bisphenol 41

Bảng 3.2: Độ thu hồi các paraben tương ứng với tỉ lệ dung môi chiết khác nhau 42 Bảng 3.3: Độ thu hồi các paraben tương ứng với thể tích rửa giải khác nhau 43

Bảng 3.4: Độ thu hồi hai bisphenol tương ứng với tỉ lệ dung môi chiết khác nhau 44

Bảng 3.5: Độ thu hồi hai bisphenol tương ứng với thể tích rửa giải khác nhau 44

Bảng 3.6: Phương trình đường chuẩn của các paraben và bisphenol 45

Bảng 3.7: IDL và IQL của các paraben và bisphenol 46

Bảng 3.8: MDL và MQL của các paraben và bisphenol 47

Bảng 3.9: Độ thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối của các paraben, bisphenol 48

Bảng 3.10: Hàm lượng paraben trong các mẫu bụi trong nhà 51

Bảng 3.11: Hàm lượng bisphenol trong các mẫu bụi trong nhà 53

Bảng 3.12: Hàm lượng paraben trong các nghiên cứu khác 56

Bảng 3.13: Hàm lượng bisphenol trong các nghiên cứu khác 56

Bảng 3.14: Độ phơi nhiễm của paraben, bisphenol theo từng nhóm tuổi 58

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cơ chế gây rối loạn nội tiết 13 Hình 2.1: Thiết bị LC-MS/MS (hãng Thermo Scientific) dùng để phân tích hàm lượng paraben trong mẫu bụi 31 Hình 2.2 : Thiết bị LC-MS/MS (hãng Shimadzu) dùng để phân tích hàm lượng bisphenol trong mẫu bụi 32 Hình 3.1: Tỉ lệ phần trăm về hàm lượng của từng paraben so với hàm lượng paraben tổng của các mẫu bụi 53 Hình 3.2: Tỉ lệ phần trăm về hàm lượng của từng bisphenol so với hàm lượng paraben tổng của các mẫu bụi 55

MỞ ĐẦU

Trong hai thập kỷ trở lại đây, các chất gây rối loạn nội tiết, gọi tắt là EDCs (endocrine disrupting chemicals), được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thương mại chẳng hạn như phthalate, siloxane, paraben, bisphenol A (BPA), triclosan, benzophenone-3, glycol ether, v.v Các hóa chất này được cho là các chất gây rối loạn nội tiết bởi những bằng chứng gần đây cho thấy chúng là tác nhân làm thay đổi hệ hormone của động vật phòng thí nghiệm, đặc biệt là hormone sinh sản Do được sử dụng rất rộng rãi nên các hợp chất gây rối loạn tuyến nội tiết xuất hiện trong hầu hết các môi trường khác nhau, đe doạ hệ sinh thái và sức khoẻ con người

Thuộc nhóm các chất gây rối loạn nội tiết, các paraben (các ester của acid

p-hydroxybenzoic) là các hóa chất tổng hợp có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, ngành mỹ phẩm, dược phẩm Paraben có tác dụng sát khuẩn, tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn và diệt nhiều loại vi nấm, do đó chúng được sử dụng làm chất bảo quản hóa học phổ biến và lâu đời Bisphenol là nhóm hợp chất bao gồm hai nhân phenol

được liên kết bằng cầu nối là các hydrocarbon Cùng với sự phát triển của ngành

công nghiệp nhựa thì vai trò của bisphenol ngày càng tăng lên Trong đó, bisphenol A (BPA) là nguyên liệu ban đầu để tổng hợp chất dẻo, chủ yếu là một số nhựa polycarbonate và nhựa epoxy, còn bisphenol F (BPF) được sử dụng để sản xuất nhựa epoxy và lớp phủ

Paraben được chỉ ra trong một số nghiên cứu có gây ảnh hưởng đến da như

dị ứng hay lão hóa da Paraben có thể hoạt động tương tự như hormone oestrogen trong các tế bào của cơ thể Các hoạt động này có liên quan nhất định đến bệnh ung thư vú BPA có liên quan đến nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe con người, bao gồm béo phì, tiểu đường, vú và ung thư tuyến tiền liệt, các vấn đề về thần kinh và sinh sản

Do những hiểu biết về sự tích lũy và rủi ro phơi nhiễm của các hợp chất paraben, bisphenol trong môi trường trong nhà tại Việt Nam vẫn còn hạn chế Vì vậy, luận văn này đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu phương pháp phân tích và quan

trắc một số hợp chất hữu cơ (nhóm paraben và bisphenol) gây rối loạn nội tiết trong môi trường trong nhà”

Mục tiêu của đề tài:

- Tối ưu hóa được quy trình để phân tích các hợp chất nhóm paraben và bisphenol trong mẫu bụi bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép nối khối phổ

- Sử dụng quy trình đã chuẩn hóa để xác định hàm lượng các paraben và bisphenol trong mẫu bụi trong nhà Từ các số liệu hàm lượng các paraben và bisphenol thu được tiến hành đánh giá mức độ phơi nhiễm từng loại paraben, bisphenol đối với các nhóm lứa tuổi khác nhau

Nội dung nghiên cứu:

- Xây dựng quy trình xử lý mẫu và phân tích 7 paraben và 2 bisphenol trong mẫu bụi trong nhà bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ

- Đánh giá phương pháp nghiên cứu bằng cách xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (MQL)

- Từ số liệu thu được tiến hành so sánh với các nghiên cứu khác trên thế giới

và bước đầu đánh giá rủi ro phơi nhiễm của paraben và bisphenol đến con người

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Giới thiệu về paraben

Paraben là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học, được sử dụng phổ biến và lâu đời Về mặt hóa học, paraben là một loạt các ester của acid

p-hydroxybenzoic hay còn được gọi là acid 4-hydroxybenzoic Tất cả các paraben

sử dụng trong các sản phẩm thương mại đều được tổng hợp, mặc dù một số

paraben cũng được tìm thấy trong tự nhiên Paraben được tổng hợp từ acid hydroxybenzoic và alcohol tương ứng như methanol, ethanol hoặc n-propanol, v.v Acid p-hydroxybenzoic lần lượt được sản xuất công nghiệp từ sự điều chỉnh phản

p-ứng Kolbe-Schmitt là sử dụng kali phenoxide và carbon dioxide [8,11]

Paraben được giới thiệu lần đầu tiên vào giữa những năm 1920 với vai trò là chất bảo quản trong ngành dược Tuy nhiên, sau đó nhóm chất này trở thành chất bảo quản được sử dụng rộng rãi hơn trong nhiều sản phẩm thương mại khác chẳng hạn như trong sản phẩm chăm sóc cá nhân, thực phẩm và các sản phẩm tiêu dùng khác Paraben có một số đặc điểm như tính ổn định, khả năng hòa tan trong nước, bền vững, khó bay hơi và hoạt động kháng khuẩn phổ rộng khiến chúng trở thành chất bảo quản phổ biến trong các sản phẩm tiêu dùng [44]

Các paraben thường gặp và được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu trong

luận văn này là methylparaben (MeP), ethylparaben (EtP), n-propylparaben PrP), isopropylparaben (isoPrP), butylparaben (BuP), benzylparaben (BzP) và

(n-heptylparaben (HepP) Ở điều kiện bình thường, 7 paraben nghiên cứu đều là

những tinh thể màu trắng Methylparaben (MeP), n-propylparaben (n-PrP),

isopropylparaben (isoPrP) tan tốt trong nước, các paraben còn lại khó tan trong

nước, tan tốt trong dung môi hữu cơ như methanol và ethanol

- Khối lượng phân tử: 152,15 (g/mol)

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 166.17 (g/mol)

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 180,08 (g/mol)

- Khối lượng phân tử: 180,22 (g/mol)

- Điểm sôi: 160 oC

 Butylparaben (BuP)

- Danh pháp IUPAC: Butyl 4-hydroxybenzoate

- Công thức phân tử: C11H14O3

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 194,23 (g/mol)

- Điểm nóng chảy: 68-69oC

 Benzylparaben (BzP)

- Danh pháp IUPAC: Benzyl 4-hydroxybenzoate

- Công thức phân tử: C14H12O3

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 228.24 (g/mol)

- Khối lượng phân tử: 236,31 (g/mol)

- Điểm nóng chảy: 49-51 oC

1.1.2 Giới thiệu về bisphenol

Bisphenol là nhóm hợp chất bao gồm hai nhân phenol được liên kết bằng cầu

nối là các hydrocarbon Hầu hết chúng đều dựa trên nhóm diphenylmethane

(C6H5)2CH2 Các trường hợp ngoại lệ là bisphenol S, P và M Bisphenol là tên

thông thường, chữ cái sau đề cập đến một trong các chất phản ứng Trong đó, bisphenol A là đại diện phổ biến nhất của nhóm này, thường được gọi đơn giản là

"bisphenol” [5]

Bisphenol là những chất không màu, không mùi và hầu hết chúng ở thể rắn ở nhiệt độ phòng Điểm nóng chảy khoảng từ 100 đến 200oC Bisphenol hầu như không hòa tan trong nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ như actone, alcohol

Độ hòa tan của chúng trong dung môi hữu cơ được xác định bởi các nhóm thế của chúng Điểm sôi của bisphenol rất cao vì kích thước và độ phân cực của phân tử Bisphenol có thể được sản xuất bằng cách ngưng tụ ketone hoặc aldehyde với phenol, bằng phản ứng của diols hoặc dihalides với phenol, hoặc bằng cách ngưng

tụ hydroxymetylphenol với phenol

Tầm quan trọng của bisphenol liên tục tăng lên cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp nhựa từ khoảng cuối những năm 1930 Chúng được sử dụng làm băng keo cho phích nước cao cấp, nhựa nhiệt dẻo, và nguyên liệu thô cho vecni và chất chống oxy hóa cho máy chà sàn, nhựa, dầu và chất béo

Các bisphenol được thực hiện trong nghiên cứu này là bisphenol A (BPA) và bisphenol F (BPF) Bisphenol A lần đầu tiên được báo cáo bởi Dianin vào năm

1891 Sau đó nó được tổng hợp bởi Zincke vào năm 1905 từ phenol và acetone Là một hóa chất công nghiệp quan trọng bisphenol A chủ yếu là được sử dụng làm chất trung gian trong sản xuất nhựa polycarbonate (PC) và nhựa epoxy Bisphenol

F (BPF) đang thay thế bisphenol A (BPA) trong sản xuất các sản phẩm có chứa nhựa polycarbonate và nhựa epoxy Nó được sử dụng trong ngành công nghiệp như một cách để tăng độ dày và độ bền của vật liệu BPF cũng được sử dụng trong lớp lót, sơn mài, chất kết dính, chất dẻo và lớp phủ của đồ uống và đồ hộp thực

phẩm [42] Trong nghiên cứu này tiến hành phân tích hai bisphenol là: bisphenol

A (BPA) và bisphenol F (BPF)

- Danh pháp IUPAC: 4,4'-(propane-2,2-diyl)diphenol

- Tên khác: BPA; 2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane

- Công thức phân tử: C15H16O2

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 228 (g/mol)

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 200 g/mol

- Điểm nóng chảy: 162,5 oC

1.2 Ứng dụng của paraben và bisphenol

1.2.1 Khả năng kháng khuẩn của paraben

Các paraben có tác dụng sát khuẩn, tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác nhau

và diệt nhiều loại vi nấm Paraben có hoạt tính kháng khuẩn là do chúng làm thay đổi đặc tính của màng tế bào, khiến cho cấu trúc lớp màng tế bào thay đổi Paraben đã được sử dụng rất lâu trong công nghiệp mỹ phẩm với tác dụng chủ yếu

là chống lại các tác động của nấm mốc và vi khuẩn giúp đảm bảo chất lượng ban

đầu sản phẩm Nó được sử dụng trong một số sản phẩm thuốc và sử dụng nhiều nhất trong các sản phẩm mỹ phẩm chăm sóc cá nhân Thêm vào đó, paraben còn

có giá thành phải chăng, hiệu quả bảo quản tốt, không màu, không mùi, dễ dàng kết hợp với các hợp chất trong mỹ phẩm mà không mang lại kích ứng Đồng thời, paraben độ pH nằm từ khoảng 3 đến 8, đây là độ pH chuẩn phù hợp với hầu hết các loại mỹ phẩm hiện nay

Theo báo cáo vào năm 1984, người ta ước tính rằng paraben đã được sử dụng trong 13200 công thức mỹ phẩm khác nhau và một cuộc khảo sát trên 215 sản phẩm mỹ phẩm của Rastogi và cộng sự (1995) đã tìm thấy paraben trong 99% mỹ phẩm lưu lại trên da và 77% sản phẩm mỹ phẩm rửa trôi [40] Nhiều nghiên cứu gần đây tiếp tục cho thấy sự hiện diện của paraben, chủ yếu là methylparaben và propylparaben (kết hợp với phthalate) trong phần lớn các loại mỹ phẩm chăm sóc

cơ thể được phân tích, bao gồm chất khử mùi, kem và nước thơm Cũng theo một nghiên cứu khác Ying Guo và cộng sự (2013) các paraben được tìm thấy trong năm loại sản phẩm chăm sóc cá nhân là kem mặt, sữa dưỡng thể, sữa rửa mặt, kem dưỡng da tay, dầu gội, sữa tắm ở Thiên Tân, Trung Quốc Trong bốn paraben được nghiên cứu là MeP, EtP, PrP, BuP thì methyl paraben (MeP) và n-propyl paraben (PrP) được phát hiện nhiều nhất với tỉ lệ phát hiện 75% [19]

Theo nghiên cứu của Steinberga và cộng sự (1999) đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của paraben trong nước súc miệng chống lại vi khuẩn gây bệnh trong khoang miệng Nước súc miệng có chứa paraben có ảnh hưởng nhỏ và ngắn hạn đến số lượng liên cầu khuẩn và vi khuẩn lactobacilli trong nước bọt của con người [45] Nghiên cứu tiếp theo của Steinberg và cộng sự (2001), kết quả chỉ ra rằng

paraben là chất kháng khuẩn tiềm năng chống lại vi khuẩn Streptococcus sobrinus

sống cố định hoặc sinh vật phù du được tìm thấy trong khoang miệng Bốn dẫn xuất của paraben đã được sử dụng trong nghiên cứu này là methylparaben (MeP), ethylparaben (EtP), propylparaben (PrP) và butylparaben (BuP) Hiệu quả kháng khuẩn như sau: MeP> EtP> PrP = BuP trên vi khuẩn sống cố định và MeP> EtP = PrP> BuP trên vi khuẩn phù du [44] Đặc tính kháng khuẩn được cho là tăng lên theo chiều tăng mạch carbon của gốc alkyl Tuy nhiên, theo chiều tăng độ dài của

gốc alkyl khả năng tan trong nước giảm dần, trong khi vi khuẩn thường phát triển trong môi trường nước Do vậy các đồng phân có chuỗi alkyl ngắn thường được lựa chọn sử dụng với mục đích bảo quản Để tăng hiệu quả bảo quản, các paraben được sử dụng kết hợp với nhau Thông thường, người ta phối hợp hai paraben trở lên, như phối hợp 0,18% methyl paraben và 0,02% propyl paraben để làm chất bảo quản sát khuẩn trong nhiều loại thuốc tiêm chích hoặc phối hợp paraben với một

số hóa chất khác

1.2.2 Ứng dụng của bisphenol

BPA là nguyên liệu ban đầu để tổng hợp chất dẻo, chủ yếu là một số polycarbonate và nhựa epoxy, một số polysulfone và các vật liệu thích hợp nhất định Loại nhựa được sử dụng có thành phần BPA thì chắc chắn và dai, nó được sản xuất thành nhiều loại hàng tiêu dùng phổ biến như chai nhựa, dụng cụ thể thao, đĩa CD và DVD, thiết bị điện tử, ô tô, kính xây dựng, thiết bị an toàn thể thao, thiết bị y tế (ví dụ như keo dán nha khoa), bộ đồ ăn, chai lọ tái sử dụng (ví dụ như bình sữa trẻ em) và hộp đựng thực phẩm Bisphenol A là một hóa chất có khối lượng sản xuất cao vì nhu cầu ngày càng tăng đối với nhựa polycarbonate và nhựa epoxy Trong năm 2015, ước tính có khoảng 4 triệu tấn hóa chất BPA được sản xuất để sản xuất nhựa polycarbonate, khiến nó trở thành một trong những hóa chất được sản xuất nhiều nhất trên toàn thế giới Theo tác giả Staples và cộng sự (1998) bisphenol A (BPA) được sử dụng trong nhiều loại các sản phẩm tiêu dùng, chẳng hạn như bình sữa cho trẻ sơ sinh và lớp phủ cho đồ hộp thực phẩm [47]

Bisphenol A (BPA) đang được quan tâm như là một hóa chất gây rối loạn nội tiết và những ảnh hưởng có thể có của nó đối với sức khỏe con người Điều này đã thúc đẩy ngành công nghiệp tìm kiếm hóa chất thay thế như bisphenol F (BPF) [25] BPF được sử dụng để sản xuất nhựa epoxy và lớp phủ, đặc biệt đối với các

hệ thống cần tăng độ dày và độ bền như lớp lót bể và đường ống, sàn công nghiệp, lớp phủ mặt cầu đường, chất kết dính kết cấu, vữa, lớp phủ và vecni điện [16] Nhựa epoxy BPF cũng được sử dụng cho một số sản phẩm tiêu dùng như sơn mài, vecni, lớp lót, chất kết dính, chất dẻo, ống nước, chất trám răng và bao bì thực phẩm

1.3 Sự có mặt của paraben, bisphenol trong môi trường và những ảnh hưởng của chúng đến con người

1.3.1 Sự có mặt của paraben và bisphenol trong môi trường

Paraben được sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản chống vi khuẩn trong thực

phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm sản phẩm do dải hoạt động rộng, độ trơ và giá cả thấp Paraben cũng tập hợp một số tiêu chí cho một chất bảo quản lý tưởng: chúng

ổn định và hiệu quả trong phạm vi pH rộng, đủ hòa tan trong nước để tạo ra một nồng độ hiệu quả trong pha nước, không có mùi hoặc vị giác của sự đổi màu Chúng được tìm thấy trong dầu gội đầu, kem dưỡng ẩm thương mại, gel cạo râu, chất bôi trơn cá nhân, sản phẩm chống nắng, đồ trang điểm và kem đánh răng Chính bởi những ứng dụng rộng rãi của các paraben, do đó chúng có khả năng phân bố ở khắp mọi nơi trong các môi trường khác nhau Trong một nghiên cứu năm 2012 về sự xuất hiện của paraben trong 158 mẫu bụi trong nhà ở Mỹ, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản Nghiên cứu này, đã chỉ ra sự có mặt của sáu paraben (MeP, EtP, PrP, BuP, BzP, HeP) trong mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân là một nguồn quan trọng gây ô nhiễm bụi trong nhà Trong số tất cả các paraben, thì MeP và PrP là các hợp chất chiếm ưu thế với tỷ lệ phát hiện là 100% trong bụi từ bốn quốc gia MeP chiếm 42−73% tổng nồng độ paraben, PrP chiếm 12−46% tổng nồng độ paraben phát hiện [52]

Paraben cũng được tìm thấy trong môi trường bụi trong nhà ở một số tỉnh thành phía Bắc của Việt Nam Giá trị trung bình paraben tổng là 196 (ng/g) Trong

đó mẫu bụi thu được từ khu tái chế nhựa rác thải ở Triều Khúc- Hà Nội và Bùi Dâu- Hưng Yên có mức ô nhiễm paraben cao nhất trung bình 298 (ng/g) [1] Trong một nghiên cứu của Liao và cộng sự (2013) về sự xuất hiện của paraben trong thực phẩm từ Trung Quốc Trong nghiên cứu này, nồng độ của sáu paraben được xác định trong 13 loại mẫu thực phẩm (n = 282), bao gồm ngũ cốc

và các sản phẩm ngũ cốc, thịt, cá và hải sản, trứng, sản phẩm từ sữa, sản phẩm đậu, trái cây, rau, bánh quy, đồ uống, dầu ăn, gia vị và những thứ khác, được thu thập từ chín thành phố ở Trung Quốc Hầu như tất cả (tỷ lệ phát hiện 99%) các mẫu thực phẩm chứa ít nhất một trong số các paraben được phân tích [32]

Ngoài ra, đáng chú ý hơn paraben còn được tìm thấy trong các môi trường nước như nước ăn uống, nước bể bơi và nước sông Theo một nghiên cứu của

Wenhui Li và cộng sự (2015) điều tra sự có mặt của paraben tại 39 hồ bơi ở Bắc

Kinh, Trung Quốc Trong nghiên cứu này, có sự xuất hiện và phân bố của tám paraben Trong đó, MeP và PrP là những paraben được phát hiện nhiều nhất (100%) trong các mẫu nước bể bơi, đáng chú ý là octyl paraben, một paraben có chuỗi dài hơn, lần đầu tiên được phát hiện trong nghiên cứu này [33]

Không chỉ trong không khí và nước, paraben còn được tìm thấy trong các môi trường khác như đất, bùn, nước mặt và trầm tích [13, 21] Tóm lại, do sự phổ biến và được sử dụng rộng rãi nên paraben đã được phân bố trong hầu hết các môi trường xung quanh con người

Bisphenol được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất nhựa Trong đó,

BPA được sử dụng trong sản xuất nhựa polycarbonate, một loại nhựa có mặt hầu hết ở các bao bì thực phẩm, ngoài ra còn có ở vật liệu công nghiệp (như lớp phủ bên trong lon nhựa thực phẩm, giấy nhiệt – biên lai bán hàng, bình sữa trẻ em, …), chất trám răng và các sản phẩm vệ sinh cá nhân Sự rửa trôi BPA từ những vật liệu này vào thực phẩm được coi là nguyên nhân chính khiến con người tiếp xúc với BPA

BPA không có liên kết hóa học với các thành phần chính trong sản phẩm, nên sau thời gian sống của sản phẩm, chúng có khả năng xâm nhập vào môi trường nước và trầm tích qua sự tồn lưu của chúng trong nước thải

Qua một nghiên cứu của Trần Bích Châu và cộng sự (2019) về sự tích lũy BPA trong trầm tích khu vực tiếp nhận nước thải sau xử lý của bãi chôn lấp Phước Hiệp, TP Hồ Chí Minh Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra tại 4 vị trí nghiên cứu, 28 mẫu được thu trong 2 mùa mưa và mùa khô để đánh giá sơ bộ sự biến thiên nồng

độ BPA theo không gian và thời gian trong trầm tích tại khu vực BPA được phát hiện trong tất cả các mẫu thu được tại các vị trí lấy mẫu (tần suất phát hiện 100%),

có giá trị dao động từ 18, 56 - 80,79 (ng/g) [2]

Do BPA phổ biến trong môi trường và con người tiếp xúc liên tục hàng ngày thông qua chế độ ăn uống, nước uống và nhiều nguồn khác BPA hiện được công

nhận là chất gây rối loạn nội tiết và ngày càng có nhiều lo ngại về những nguy cơ

mà BPA gây ra cho sức khỏe con người Khi mối quan tâm về sự an toàn của bisphenol A (BPA) tiếp tục gia tăng, hợp chất này đang dần dần được được thay thế trong các ứng dụng công nghiệp chẳng hạn như BPF và BPS Tuy nhiên, những chất thay thế này có cấu trúc hóa học tương tự như BPA và được cho là có tác dụng độc hại tương tự Một nghiên cứu của Lehmler và cộng sự (2018), nghiên cứu này đã phân tích mức bisphenol trong nước tiểu ở người lớn (n = 1808) và trẻ

em (n= 868) BPA, BPS và BPF lần lượt được phát hiện trong 95,7%; 89,4% và 66,5% mẫu nước tiểu được chọn ngẫu nhiên Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng sự tiếp xúc của dân số Hoa Kỳ nói chung với các chất thay thế BPA là hầu như phổ biến [29] Cũng theo nghiên cứu khác của Liao và Kannan (2013) nghiên cứu về nồng độ các bisphenol trong thực phẩm ở Hoa Kỳ Tổng số 267 mẫu thực phẩm từ một số cửa hàng tạp hóa bán lẻ như đồ uống, các sản phẩm từ sữa, cá và hải sản, các đồ đóng hộp, v.v Có đến 75% các mẫu thực phẩm chứa nồng độ bisphenol có thể phát hiện được và tổng nồng độ dao động từ 0,10 đến 1130 ng/g trọng lượng tươi, với giá trị trung bình tổng thể là 4,38 ng/g Trong đó, BPA và BPF là các chất tương tự chiếm ưu thế, trung bình lần lượt là 42% và 17% trong tổng nồng độ bisphenol [31]

Do những ứng dụng rộng rãi mà bisphenol có mặt ở hầu hết ở các môi trường xung quanh con người như không khí, thức ăn, nguồn nước, v.v

1.3.2 Ảnh hưởng của paraben và bisphenol đến sức khỏe con người

Do sự có mặt rộng rãi của paraben và bisphenol trong môi trường Vì vậy con người dễ dàng bị phơi nhiễm với paraben và bisphenol qua các con đường trực tiếp hay gián tiếp từ không khí, nước, đồ dùng, thiết bị, thức ăn đóng hộp, sản phẩm chăm sóc cá nhân v.v

Vào đầu những năm 1990, các nhà khoa học tại Hội nghị ở Wisconsin đã đặt

ra thuật ngữ “hóa chất gây rối loạn nội tiết” (EDCs) Theo định nghĩa của WHO, hóa chất gây rối loạn nội tiết “là một chất hoặc hỗn hợp làm thay đổi (các) chức năng của hệ thống nội tiết và do đó gây ra các ảnh hưởng xấu đến sức khỏe ở một sinh vật còn nguyên vẹn, hoặc con cháu hoặc quần thể EDCs được phân loại bao

gồm: thuốc trừ sâu hữu cơ chloro, bisphenol, phthalate, paraben Trong tuyên bố khoa học đầu tiên của Hiệp hội Nội tiết cho thấy các chất gây rối loạn nội tiết có ảnh hưởng đến sinh sản nam và nữ, phát triển vú và ung thư, ung thư tuyến tiền liệt, nội tiết thần kinh, tuyến giáp, chuyển hóa và béo phì, và nội tiết tim mạch [12]

Hình 1.1: Cơ chế gây rối loạn nội tiết

Trên hình 1.1 thể hiện cơ chế gây rối loạn tuyến nội tiết của các hợp chất

EDCs trong cơ thể người và động vật Trong đó, A: Hormone tự nhiên phản ứng với chất tiếp nhận hormone trong tế bào; B: EDCs gây kích thích giả lên tế bào do

có cấu trúc tương đồng với hormone trong cơ thể Nó có thể bắt chước hoạt động của các hormone trong cơ thể như: oestrogen (oestrogen là một loại hormone do một số cơ quan sinh dục nữ tiết ra) hay androgen (androgen là hormone nội tiết tố

có trong cơ thể của cả nam giới và nữ giới) gây nhầm lẫn cho hệ nội tiết cơ thể Ngoài ra, các hợp chất EDCs còn làm mất tác dụng của hormone, thay đổi chu trình chuyển hóa và tổng hợp của hormone hoặc mô phỏng vị trí của các thụ thể của hormone, gây nhiễm các hệ thống xác định thông tin có mối liên hệ gián tiếp với hệ thống nội tiết như hệ thống thần kinh hay miễn dịch [35]

Mặc dù paraben đã được sử dụng rộng rãi từ những năm 1920, nhiều vấn đề liên quan đến tác động của chúng đối với sức khỏe con người vẫn chưa được giải

thích Nhiều chuyên gia đã đánh giá tác động của việc phơi nhiễm paraben cấp tính và mãn tính Những thử nghiệm này đã dẫn đến việc phân loại paraben là hóa chất gây rối loạn nội tiết (EDCs) [7, 37]

Ngoài ra còn có một số ảnh hưởng của paraben đến sức khỏe con người được chỉ ra:

Dị ứng da: Kể từ những năm 1960, tranh cãi xung quanh việc sử dụng và an

toàn của nó như một nguyên nhân tiềm ẩn của viêm da tiếp xúc dị ứng Theo một báo cáo của Christen M Mowad (2000) về hai trường hợp viêm da tiếp xúc dị ứng với paraben thông qua việc sử dụng các sản phẩm chăm sóc cá nhân hàng ngày [36] Ngoài ra, trong một số nghiên cứu thì cho rằng ảnh hưởng BzP là chất có khả năng gây dị ứng mạnh nhất, có thể là do khối lượng phân tử lớn hơn và từ đó có thể đưa ra phán đoán về khả năng gây dị ứng sẽ tăng lên tỉ lệ thuận với khối lượng phân tử

Lão hóa da: Trong một số nghiên cứu đã chỉ ra methylparaben tăng cường

khả năng gây hại của tia UVB (Ultraviolet B) đối với các tế bào sừng trên da Tia UVB là nguyên nhân chính gây nên bỏng nắng, kích ứng da và ung thư da Tia UVB với cường độ 15 mJ/cm2 và 30 mJ/cm2 (tương ứng với cường độ UVB trung bình khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong vòng 1 phút vào ngày đẹp trời ở châu Âu) hầu như không gây hại đến tế bào sừng Tuy nhiên khi kết hợp sử dụng methylparaben 0,003% và việc chiếu xạ bằng tia UVB với cường độ như trên thì lượng tế bào sừng bị hoại tử tăng lên đáng kể [54] Methylparaben và các sản phẩm chuyển hóa của methylparaben, kết hợp với ánh sáng mặt trời có thể gây tổn hại đối với ADN trên da [38]

Ung thư vú: Mặc dù chưa có những bằng chứng cụ thể, nhưng một số nghiên

cứu chỉ ra mối liên hệ giữa các hợp chất paraben với bệnh ung thư vú và nguy cơ tiềm tàng của nó Theo nghiên cứu của Darbre và cộng sự (2004) đã tìm thấy paraben trong các mô vú của bệnh nhân cắt bỏ vú nhưng không tìm thấy paraben

là một nguyên nhân của bệnh ung thư [9] Cũng theo nghiên cứu mới của Darbre

và cộng sự (2014) cho rằng paraben có thể kích hoạt sự phát triển trong tế bào biểu

mô vú của con người Nghiên cứu này đã phát hiện phát hiện sự có mặt của

paraben trong tế bào ung thư vú, paraben được cho là có hoạt tính giống oestrogen (nội tiết tố của nữ giới) có thể kích thích sự tăng sinh tế bào ung thư vú ở người, tiếp xúc lâu dài (> 20 tuần) với paraben dẫn đến gia tăng hoạt động di cư và xâm lấn trong các tế bào ung thư vú ở người [10] Tuy nhiên các nghiên cứu này chưa

đủ bằng chứng để cho thấy nguy cơ ung thư từ việc sử dụng sản phẩm có chứa paraben

Các hợp chất paraben đã được biết đến là có hoạt tính lên hệ hormone sinh sản ở động vật cái (còn gọi là oestrogen) Oestrogen là một trong những hormone sinh dục nữ chính Oestrogen ảnh hưởng đến nhiều bộ phận của cơ thể và có thể gây ra các vấn đề khi nó mất cân bằng Có quá nhiều ostrogen có thể dẫn đến các vấn đề nhỏ như mụn trứng cá và táo bón hoặc các tình trạng nghiêm trọng hơn như ung thư vú Có một số ít oestrogen có thể gây ra các vấn đề như xương kém phát triển và các triệu chứng mãn kinh Mà oestrogen được biết là có ảnh hưởng đến tỷ

lệ mắc bệnh ung thư vú và việc ngưng hoạt động của oestrogen vẫn là phương pháp ưu tiên điều trị cho các khối u vú nhạy cảm với hormone Theo Byford J.E và cộng sự (2002) khi tiến hành nghiên cứu hoạt tính oestrogen của các hợp chất

paraben (methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, n-butylparaben) trong

các tế bào ung thư vú nuôi cấy MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) MCF-7

là một dòng tế bào ung thư vú [6] Paraben có thể làm tăng biểu hiện của các gen quy định oestrogen và tăng khả năng sản sinh các tế bào này Liên kết của các paraben với tế bào MCF-7 tăng lên theo chiều dài chuỗi alkyl, tuy nhiên liên kết

này khá yếu Các paraben bao gồm: MeP, EtP, n-PrP, BuP đều có hoạt tính lên

oestrogen Trong đó MeP là chất có hoạt tính oestrogen yếu nhất với cường độ thấp hơn khoảng 2,5 triệu lần so với 17-estradiol (một loại oestrogen có trong tự nhiên) Hoạt tính oestrogen mạnh lên theo chiều tăng của chuỗi alkyl như EtP, PrP và BuP lần lượt có cường độ thấp hơn khoảng 150 nghìn lần, 30 nghìn lần, và

10 nghìn so với 17-estradiol [41]

Trước những bằng chứng về tác hại của paraben đối với sức khỏe con người, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP ngày 13/04/2015 quy định về việc sử dụng một số chất trong mỹ phẩm Theo đó, có 5 paraben đã bị cấm

sử dụng ở Việt Nam từ ngày 30/7/2015 là Iso-PrP, Iso-BuP, PhP, BzP và PenP

Cũng theo công văn này, PrP và các muối được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối

đa 0,4% (tính theo acid) và dạng hỗn hợp các paraben khác với tổng nồng độ tối

đa là 0,8% (tính theo acid) Thời hạn công bố đối với các sản phẩm mới sản xuất trong nước, nhập khẩu đến hết ngày 31/12/2015 Các sản phẩm sản xuất trong nước, nhập khẩu được phép lưu hành trên thị trường đến hết ngày 30/6/2016

Bisphenol cũng được liệt kê là một trong những hóa chất phá vỡ nội tiết

BPA có liên quan đến nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe con người, bao gồm béo phì, tiểu đường, vú và ung thư tuyến tiền liệt, các vấn đề về thần kinh và sinh sản [22, 26] Do các đặc tính và tác động lên não giống như hormone, BPA đã được xác định là một chất có thể đặc biệt gây hại cho thai nhi, trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ

Các nghiên cứu cho thấy BPA có thể được giải phóng vào thực phẩm và đồ uống Cụ thể, người ta lo ngại rằng trẻ sơ sinh có thể tiếp xúc với BPA khi thêm nước sôi vào bình sữa khi pha sữa

BPA đã được thử nghiệm như một oestrogen nhân tạo đã có từ đầu những năm 1930 Các phân tử bisphenol có tác dụng tương tự như oestrogen do đó chúng ảnh hưởng đến việc điều chỉnh nội tiết tố và hoạt động của các thụ thể oestrogen Ảnh hưởng tiêu cực của chúng đối với sự trưởng thành của tế bào trứng, quá trình sinh tinh và sự phát triển của hệ sinh sản [24] Cũng trong nghiên cứu của Perez và cộng sự (1998) đã chỉ ra nhóm chất gây rối loạn nội tiết mô phỏng oestrogen này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là trong chất dẻo Bisphenol F, bisphenol A được phát hiện là có tác dụng oestrogen trong một thử nghiệm sinh học với tế bào ung thư vú MCF-7 ở người trong môi trường nuôi cấy [39]

Ngoài ra, nhiều bằng chứng chỉ ra rằng BPA có thể phá vỡ hormone tuyến giáp BPA tham gia vào hoạt động của hormone tuyến giáp không chỉ như một chất đối kháng thụ thể hormone tuyến giáp mà còn thông qua một số cơ chế khác [27]

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy BPA có tác động đến khả năng sinh sản của con người và chịu trách nhiệm cho các bệnh lý sinh sản như hội chứng bất sản tinh hoàn, tinh hoàn ẩn, ung thư và giảm khả năng sinh sản ở nam

giới và mất nang trứng ở nữ Do đó, một số bisphenol khác đang đượng sử dụng thay thế BPA như BPF, BPS Tuy nhiên, theo các nghiên cứu thì BPS, BPF cũng hoạt động mặt nội tiết tố như BPA và có tác dụng phá vỡ nội tiết [14, 25] Theo một nghiên cứu của Asad Ullah và cộng sự (2019) về ảnh hưởng của bisphenol F- một chất tương tự bisphenol A trên các chức năng sinh sản chuột đực Kết quả nghiên cứu trên nghiên cứu trong ống nghiệm cho thấy rằng phơi nhiễm BPF đáng

kể BPF cho thấy có tác dụng đối kháng với hormone sinh sản nam và gây ra những thay đổi về hình thái tinh hoàn Nó tác động trực tiếp lên các enzym chống oxy hóa và bài tiết testosterone [50]

Năm 2017 Cơ quan Hóa chất Châu Âu đã liệt kê BPA là một chất gây lo ngại rất cao bởi BPA có thể gây ra những rối loạn nội tiết Để hạn chế tác hại của bisphenol thì Liên minh Châu Âu (European Union- EU) đã đưa ra những quy định về giới hạn hàm lượng bisphenol

Theo chỉ thị (European Union- EU) 2017/898 sửa đổi 2009/48/EC và Quy định (EU) 2016/2235 thì đối với đồ chơi cho trẻ dưới 36 tháng tuổi hoặc các đồ chơi dễ cho vào miệng thì giới hạn ≤ 0,04 mg/L BPA phân tán ra, còn giấy in nhiệt

là ≤ 0,02% (hàm lượng BPA) (200 mg/kg)

Theo Quy định (EU) 2018/213 sửa đổi quy định (EC) 10/2011 có hiệu lực từ ngày 06/09/2018 thì cấm hàm lượng bisphenol A có trong cốc uống nước PC (polycarbonate) hoặc bình sữa cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, cấm hàm lượng BPA phân tán trong thực phẩm tiếp xúc trực tiếp với các sản phẩm có lớp phủ chứa BPA ở mặt trong và vật phẩm trong nhóm thực phẩm dành cho trẻ em theo quy định (EU) 609/2013 Giới hạn hàm lượng BPA phân tán trong nhựa tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm là ≤ 0,05 mg/kg, thực phẩm tiếp xúc trực tiếp với các sản phẩm

có lớp phủ chứa BPA ở mặt trong là ≤ 0,05 mg/kg

Hiện nay ở Việt Nam chưa có một quy định nào về giới hạn cho phép của bisphenol trong môi trường và thực phẩm

Theo QCVN 12-1:2011/BYT ban hành 30 tháng 8 năm 2011 thì mức giới hạn an toàn yêu cầu đối với bao bì, dụng cụ từ nhựa polycarbonate (PC)

Bảng 1.1: Yêu cầu đối với bao bì, dụng cụ từ nhựa polycarbonate (PC)

Bisphenol A

250C trong 1 giờ Heptan

2,5 μg/mL

600C trong 30 phút Ethanol 20%

600C trong 30 phút Nước

600C trong 30 phút Acid acetic 4%

1.4 Một số phương pháp phân tích paraben và bisphenol

Hiện nay đã có rất nhiều các phương pháp dùng để phân tích định tính, định lượng nhóm paraben và bisphenol Một số phương pháp phổ biến như: phương pháp điện di mao quản (CE), phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp sắc ký khí, v.v

1.4.2 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Điện di mao quản (CE- capillary electrophoresis) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong dung dịch chất điện ly có chất đệm pH dưới tác dụng một điện trường (E) nhất định được sinh ra do thế V

Phương pháp điện di mao quản được tác giả Uysa và Güray (2008) xác định bốn paraben là metyl-, etyl-, propyl- và butyl-paraben trong mẫu dược phẩm và

mỹ phẩm Mẫu sau khi được chiết tách bằng hệ chiết pha rắn (SPE) sau đó một mẫu được bơm qua ống mao dẫn trong 10 giây ở chế độ phun thủy động lực học thấp và tách trong 10 phút trong bộ đệm chạy tách Tín hiệu được ghi ở 200 nm Kết quả tối ưu thu được khi sử dụng đệm chạy có chứa đệm borat 20 mM (pH 9,0) với 10% methanol và bằng cách đặt điện áp 20 kV Moxifloxazin được sử dụng làm chất nội chuẩn Tất cả các paraben được tách ra trong vòng 10 phút cho thấy phuơng pháp CE đơn giản, nhanh chóng, hiệu quả, rẻ và đáng tin cậy Phương pháp đã được phát triển và xác nhận để phân tích metyl, etyl, propyl, và butyl paraben Phương pháp này cho thấy độ lặp lại, độ tuyến tính và độ nhạy tốt nên có

thể áp dụng để xác định paraben trong dược phẩm và một số sản phẩm mỹ phẩm [49]

Ngoài ra, trong nghiên cứu của Alshana và cộng sự (2015) sử dụng phân tích paraben trong sữa mẹ và các mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng phương pháp phân tán vi chất lỏng - lỏng (DLLME) với chiết xuất ngược trước khi mẫu đưa vào máy điện di mao quản (CE)

để phát hiện bốn paraben: MeP, EtP, PrP và BuP Sử dụng cột mao quản silica nóng chảy với đường kính trong 75µm, tổng chiều dài 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng tới detector là 40 cm Bơm mẫu tại anot và phát hiện chất phân tích tại catot

ở cuối mao quản Nhiệt độ mao quản được duy trì ở 120C, điện thế 25kV và dung dịch điện di nền là đệm borat 25 mM tại pH 9,2 chứa 5,0% acetonitrile (ACN) Đồ thị đường chuẩn cho thấy tuyến tính tốt với các hệ số hồi quy (R2) cao hơn 0,9957

và độ lệch chuẩn tương đối (% RSD) thấp hơn 3,5% Giới hạn phát hiện (MDL) của phương pháp dao động từ 0,9 μg/mL (đối với EtP) và cao nhất là 2,1 μg/mL (đối với MeP) Nghiên cứu này cho thấy DLLME – CE là một phương pháp đơn giản và nhanh chóng để xác định paraben trong sữa mẹ và thực phẩm với độ thu hồi tương đối trong khoảng 86,7- 103,3% [5]

Đối với nhóm bisphenol, theo một nghiên cứu của Amna Farooq (2015) phân tích bisphenol A trong mẫu nước trên hai phương pháp phân tích khác nhau là điện

di mao quản (CE) và phương pháp sắc kí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS) Các mẫu nước sông được phân tích trên CE bằng phương pháp thêm chuẩn Còn phương phương pháp LC/MS được phát triển có thể phát hiện BPA ở mức 50 ppb bằng cách sử dụng triclosan làm chất nội chuẩn Kết quả cho thấy ở cả hai phương pháp thì nồng độ BPA trong nước môi trường nằm trong khoảng dưới 15 ppm Các mẫu được phân tích trên hai thiết bị khác nhau CE và LC/MS cho kết quả phù hợp với nhau BPA nồng độ được định lượng trong tất cả các mẫu nước môi trường dưới mức độc hại cho con người [15]

1.4.3 Phương pháp sắc kí khí ghép nối khối phổ (GC/MS)

Phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay Phương pháp này có độ nhạy và độ tin cậy cao, từ

lâu đã được sử dụng để định lượng các hợp chất hữu cơ, vô cơ Phương pháp được

sử dụng rộng rãi và thành công với các chất dễ bay hơi

Theo nghiên cứu Styarini và cộng sự (2017), phương pháp GC/MS sử dụng cột DB-5MS (30m x 0,25mm x 0,25 µm) đã được phát triển để xác định đồng thời

benzoic acid, metyl paraben và n-butyl paraben trong nước tương ở mức ppm

Khoảng 2 gam mẫu nước tương được cân chính xác vào ống ly tâm và thêm khoảng 8 mL nước sau đó cân lại khối lượng Mẫu được chiết qua cột C18 và làm sạch bằng 4 mL methanol 10% (v/v) trong dung dịch phosphoric acid 1% Sau đó các chất cần phân tích được rửa giải bằng 3 mL methanol Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45 mm và được pha loãng rồi đưa vào hệ thống GC/MS Kết quả của nghiên cứu này chứng tỏ rằng phương pháp này là phù hợp, có kết quả tốt và đáng tin cậy [46]

Cũng trong một nghiên cứu của Perry G Wang và cộng sự (2013), đưa ra một phương pháp phân tích nhanh và nhạy để xác định các ester metyl‐, etyl‐,

propyl‐ và butyl của p-hydroxybenzoic acid (paraben) trong các sản phẩm chăm

sóc cá nhân Các mẫu mỹ phẩm có khối lượng khoảng 100 mg cân trong vào ống

ly tâm 15 mL, sau đó được chiết siêu âm, ly tâm trong dung dịch MeOH chứa chất nội chuẩn và làm sạch lọc qua bộ lọc PTFE (polytetrafluoroethylene) 0,2 µm Đánh giá độ nhạy, hiệu suất chiết và độ thu hồi của các chất phân tích tương ứng Kết quả cho thấy hệ số hồi quy R2 ≥ 0,995 cho bốn paraben được nghiên cứu Độ thu hồi dao động từ 97% đến 107% và hiệu suất chiết một lần >97% Phương pháp này đã được áp dụng để phân tích paraben ở 26 sản phẩm chăm sóc cá nhân [51] Theo tác giả Imanaka và cộng sự (2001) một phương pháp phân tích sử dụng GC/MS được phát triển để tìm bisphenol A (BPA) trong thực phẩm đóng hộp và thực phẩm tươi sống như rau, trái cây và thịt BPA được chiết từ các mẫu bằng acetone, sau đó dịch chiết được cô đặc ở nhiệt độ dưới400C trong chân không để tạo ra dung dịch nước, dung dịch này được rửa bằng hexane sau khi kiềm hóa và chiết bằng 50% diethylether - hexane sau khi acid hóa Các chất chiết xuất được làm sạch trên PSA (cột trao đổi ion) hoặc cột C18 (cột pha đảo) sau đó BPA được xác định bằng GC/MS Phương pháp này có thể áp dụng để phát hiện và xác định

dư lượng BPA trong mẫu thực phẩm ở mức 1 ng/g Trong số thực phẩm đóng hộp, BPA được tìm thấy trong 6 mẫu bắp bò, 1 mẫu gà, 9 mẫu bắp ngọt và 3 mẫu đậu ở các mức 17- 602 ng/g, 212 ng/g, 2,3- 75 ng/g và 3,5- 26 ng/g tương ứng BPA cũng được phát hiện trong 1 sản phẩm súp (11 ng/g) Đối với các sản phẩm sữa, không phát hiện BPA trong bơ và sữa Trong số các loại thực phẩm tươi sống, BPA được phát hiện trong 2 mẫu cá và 3 mẫu gan ở mức độ vết [23]

Ngoài ra cũng trong một nghiên cứu của Goodson và cộng sự (2002), Bisphenol A (BPA) và bisphenol F (BPF) đã được xác định trong nhiều loại thực phẩm đóng hộp bằng phương pháp GC/MS Các sản phẩm đóng hộp sau đây được phân tích: cá trong môi trường nước, rau, đồ uống, súp, món tráng miệng, quả, sữa bột trẻ em, mì ống, và các sản phẩm thịt Trong đó, BPF không được phát hiện trong bất kỳ thực phẩm đóng hộp nào với giới hạn phát hiện là 0,005 mg/kg đối với đồng phân 2,2', 2,4' và 0,01 mg/kg đối với đồng phân 4,4' BPA được phát hiện trong 38 mẫu với giới hạn phát hiện là 0,002 mg/kg Trong số này, BPA được định lượng trong 37 loại thực phẩm đóng hộp ở mức từ 0,007 mg/kg, với một mẫu thịt chứa mức trung bình là 0,38 mg/kg Tất cả các mẫu khác chứa < 0,07 mg/kg BPA Phương pháp phân tích GC/MS được phát triển trong nghiên cứu đã được chứng minh là đáng tin cậy, có giới hạn phát hiện BPA và BPF thấp và có thể áp dụng cho nhiều loại thực phẩm [18]

1.4.4 Phương pháp sắc kí lỏng

1.4.4.1 Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC là một kỹ thuật để tách hỗn hợp các chất thành các thành phần riêng biệt dựa trên sự tương tác giữa chất phân tích với pha động (thường là chất lỏng) và pha tĩnh (thông thường là các chất rắn) Pha động mang theo chất phân phân tích di chuyển qua pha tĩnh đứng yên Các thành phần trong mẫu tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn so với các thành phần có tương tác yếu hơn [3]

Tác giả Kreuz và cộng sự (1999) ứng dụng phương pháp HPLC để phân tích kali sorbat, methylparaben và propylparaben trong dung dịch huyền phù Nhóm tác giả sử dụng cột Eclipse XDB-C8 (3,0 ×150 mm, 5 µm) Pha động gồm kênh A

có thành phần 20% acetonitrile , 80% dung dịch muối citrate 0,02M, đệm pH= 5,0

và kênh B là acetonitrile Chương trình gradient tuyến tính được thiết lập như sau:

0 phút, 100% kênh A; 35phút, 70% kênh A và 30% kênh B; 36phút, 100% kênh A; 46phút, 100% kênh A Tốc độ dòng là 0,5 mL/phút Detector sử dụng bước sóng 260 nm Thể tích bơm là 50 µL Trong nghiên cứu này, methylparaben có giới hạn phát hiện (MDL) là 0,8 ng/mL, giới hạn định lượng (MQL) là 3,0 ng/mL, khoảng tuyến tính từ 0,3348-0,9917µg/mL Propylparaben có giới hạn phát hiện là 1,0 ng/mL, giới hạn định lượng là 4 ng/mL, khoảng tuyến tính từ 0,0339-0,1016 µg/mL [28]

Dựa trên những nguyên lý của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), tác giả Yoshida và cộng sự (2001) đã dùng phương pháp này để xác định BPA trong các đồ hộp đựng rau quả BPA được chiết bằng acetonitril từ phần rắn của thực phẩm đóng hộp và bằng cột OASIS HLB từ phần nước tương ứng Cả hai phần dịch chiết đều được làm sạch trên cột Florisil Việc tách HPLC được thực hiện trên cột Wakosil II 3C18 RS (4,6 x 150mm) với acetonitril-nước (40:60) như một pha động với tốc độ dòng 0,8 mL/phút BPA có thể được phát hiện bằng detector UV ở bước sóng 228 nm Các giới hạn định lượng lần lượt là 10 ng/g đối với phần rắn và 5 ng/mL đối với phần nước BPA chủ yếu được phát hiện trong phần rắn của thực phẩm đóng hộp và được tìm thấy ở mức tối đa là 11 μg mỗi lon Kết quả từ phân tích BPA của thực phẩm đóng hộp và thí nghiệm phân vùng cho thấy BPA thoát ra khỏi bề mặt đồ hộp có thể chuyển từ phần nước sang phần rắn trong quá trình bảo quản ở một số loại thực phẩm như ngô đóng hộp [53]

1.4.4.2 Sắc kí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS/MS)

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện nay Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do Sau đó, các ion được đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và

mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Theo tác giả Sosvorova và cộng sự (2017) đã xác định đồng thời các bisphenol (BPA, BPS, BPF, BPAF), paraben (metyl-, ethyl-, propyl-, butyl-, benzyl-paraben) và các oestrogen (estrone, estradiol, estriol) trong huyết tương người trong một lần chạy bằng phương pháp LC/MS/MS Chương trình tách sắc

ký được thực hiện trên cột Kinetex C18 1,7 µm (150 × 3,0 mm) với tốc độ dòng chảy 0,4 mL/phút ở 50°C Pha động bao gồm nước (dung môi A) và metanol (dung môi B) Gradient được sử dụng: 0 phút, 50:50 (A: B); 2 phút, 50:50 (A: B);

6 min, 10:90 (A: B); 7 phút, 5:95 (A: B); 8 phút 80 giây, 5:95(A: B); 9 phút, 50:50 (A: B); 11 phút, 50:50 (A: B) và dừng phút thứ 11 Phương pháp đã được xác nhận theo hướng dẫn của FDA (Food and Drug Administration) và tất cả các yêu cầu xác nhận đều đạt yêu cầu Theo kết quả phân tích trong huyết tương của những người đàn ông khỏe mạnh có nồng độ BPF cao gấp 3 lần so với BPA BPA được phát hiện ở 45% và BPF trong 40% mẫu huyết tương, trong khi BPS và BPAF không được phát hiện Paraben trong 40%, 5% và 28% mẫu MeP, EtP và PrP, BtP

và BenzylP không được phát hiện E1 (estrone), E2 (estradiol) và E3 (estriol) được phát hiện trong 84%, 79% và 59% mẫu huyết tương Đây là phương pháp đầu tiên cho phép xác định bisphenol, paraben và oestrogen huyết tương trong một lần thực hiện, và cũng là phương pháp đầu tiên xác định nồng độ BPF trong huyết tương người [43]

Tác giả Han và các cộng sự (2016) tiến hành định lượng 4 paraben là methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben trong mẫu hải sản bằng sắc ký lỏng khối phổ Nhóm tác giả sử dụng cột Waters XBridge TM C18 (150 mm × 2,1 mm, 5 µm), nhiệt độ cột ở 300C Thể tích bơm mẫu là 10 µL Pha động sử dụng là ACN (kênh A) và dung dịch acetate 0,1% (kênh B) Rửa giải bằng chế độ gradient với tốc độ dòng đặt cố định ở 30 mL/phút Thành phần pha động thay đổi theo tỷ lệ A:B như sau: 0 phút, 30:70; từ 2 đến 10 phút, 80:20; từ 10,1 đến

20 phút, 30:70 Các paraben được ion hóa bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI), sau đó được định lượng bằng kỹ thuật quét ion (MRM) Methylparaben,

ethylparaben, propylparaben và butylparaben được định lượng với các mảnh ion

có m/z lần lượt là 151, 165, 179, 193 Giới hạn phát hiện (MDL) của phương pháp

đối với các paraben là 10,0 µg/kg [20]

1.4.4.3 Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp đầu dò khối phổ (UPLC-MS/MS)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (UPLC) được dùng để tách một hỗn hợp ra thành nhiều thành phần khác nhau, bằng việc sử dụng áp suất cao đẩy các dung môi qua cột UPLC vận hành ở dưới áp suất rất cao khoảng 15.000 psi UPLC có một ưu điểm rõ ràng so với HPLC đó là nhờ áp suất vận hành cao hơn, UPLC giảm được thời gian phân tích mẫu, giảm chi phí dung môi cũng như đạt được kết quả phân tách và tín hiệu trên detector của chất phân tích cao hơn

Tác giả Dewalque và cộng sự (2014) đã phát triển một phương pháp phân tích dựa trên hệ chiết pha rắn (SPE) trước khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ song song (UPLC-MS/MS) để đo đồng thời bảy chất

chuyển hóa phthalate (monobenzyl phthalate, mono-n-butyl phthalate,

mono-iso-butyl phthalate, mono-2-ethylhexyl phthalate, mono-2-ethyl-5-hydroxyhexyl phthalate, mono-2-ethyl-5-oxohexyl phthalate, monoetyl phthalate), bốn paraben

(metyl paraben, ethyl paraben, n-propyl paraben, n-butyl paraben) và

benzophenone-3 trong nước tiểu Các giới hạn định lượng (MQL) thu được nằm trong khoảng từ 0,30 đến 1,23 ng/mL và đã được chứng minh là tuyến tính (hệ số hồi quy dao động từ 0,987 đến 0,998) và chính xác (độ chính xác của thí nghiệm trong và ngoài nước <17,71%, độ chệch tương đối <5,87%) trong khoảng nồng độ Phương pháp này đã được đánh giá là có độ tin cậy cao để xác định được đồng thời các chất [11]

Cũng theo nghiên cứu của tác giả Cariot và cộng sự (2012) để xác định bisphenol A và các dẫn xuất clo hóa của nó trong sữa mẹ bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) và đo bằng hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép khối phổ song song (UPLC-MS/MS) Bisphenol A được sử dụng làm chất nội chuẩn Đường chuẩn nền nằm trong khoảng từ 0,40 đến 6,40 ng/mL và có độ tuyến tính tốt (R²> 0,99) Phương pháp này chính xác (hệ số dao động trong và giữa ngày là <20% ở hai nồng độ khác nhau (0,40 và 3,20 ng/mL), độ thu hồi dao động từ 81% đến

119% Các giới hạn phát hiện thu được đối với BPA và các dẫn xuất clo hóa của

nó nằm trong khoảng từ 0,01 đến 0,09 ng/mL Giới hạn định lượng cho tất cả các hợp chất là 0,40 ng/mL khi sử dụng 500 μL sữa được cho là phù hợp với nồng độ hiện có trong mẫu thực [8]

Tóm lại, có rất nhiều phương pháp khác nhau đã được ứng dụng để phân tích các paraben và bisphenol Dựa vào tham khảo tài liệu, kết hợp với điều kiện thực

tế của phòng thí nghiệm, luận văn này thực hiện phân tích hàm lượng paraben và bisphenol theo phương pháp LC-MS/MS

1.5 Các thông số cơ bản của phương pháp phân tích

1.5.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

 Giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL hay còn gọi là LOD)

Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng [4]

Để xác định giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL), trước tiên cần phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại ≥ 4 lần Xác định tỷ

lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của peak, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của peak tại nửa chiều cao MDL được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3 [4]

 Giới hạn định lượng của phương pháp (MQL hay còn gọi là LOQ)

Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn Giới hạn định lượng của phương pháp được xác định theo công thức: MQL = 3 x MDL [4] Từ

đó, có thể thấy MDL phụ thuộc vào các yếu tố như: quy trình chiết tách xử lý mẫu, lượng mẫu đem phân tích ban đầu, thể tích dung dịch sau khi cô đặc mẫu và thể tích khi bơm vào máy

1.5.2 Độ lặp lại (độ chụm) và độ thu hồi (độ đúng)

Độ lặp lại là đại lượng đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng

lẻ của cùng một mẫu phân tích, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng một điều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Nên tiến hành ở nồng độ khác nhau (trung bình, thấp, cao) trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ làm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần) Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau:

1n

xxSD

2 i





100 x

SD

% CV

%

Trong đó:

SD: độ lệch chuẩn n: số lần thí nghiệm

xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

x: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối

CV%: Hệ số biến thiên

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Việc xác định độ đúng có thể thực hiện thông qua xác định độ thu hồi (còn gọi là độ tìm lại) của phương pháp

Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu 4 lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:

- Đối với mẫu thử:

100 C

C C

% R

c

m c

 

- Đối với mẫu trắng:

100 C

C

% R

c

tt 

Trong đó: R%: Độ thu hồi, %

Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Bảy paraben được nghiên cứu là: methylparaben (MeP), ethylparaben

(EtP), n-propylparaben (n-PrP), isopropylparaben (isoPrP), butylparaben (BuP),

benzylparaben (BzP) và heptylparaben (HepP)

- Hai bisphenol được nghiên cứu là: bisphenol A (BPA) và bisphenol F (BPF)

- 27 mẫu bụi được thu thập để tiến hành phân tích, trong đó số lượng mẫu để xác định hàm lượng các paraben (n= 16) và bisphenol (n=18) Thông tin về các mẫu bụi được trình bày chi tiết trong Phụ lục 6

- Nhóm Bisphenol: bisphenol A (BPA), bisphenol F (BPF) với độ tinh khiết

> 99,0% được mua của hãng Tokyo Chemical Industry

- Hai chất đồng hành 13C6-methylparaben (13C6-MeP) and 13C6-butylparaben (13C6-BuP) với độ tinh khiết trên 98% được mua từ hãng Sigma-Aldrich

2.2.2.2 Dung môi

Các dung môi methanol, fomic acid (>99,8% của hãng Tokyo Chemical Industry), amoiac, diclomethan (Merck), nước dùng cho sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (Merck), n-hexane và acetone dùng rửa dụng cụ đều là loại dùng cho phân tích với độ tinh khiết cao của Merck

2.2.2.3 Dãy chuẩn

 Nhóm paraben:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben với nồng độ 100 mg/L được chuẩn bị

bằng cách dùng micropipette hút chính xác 100 µL từng dung dịch chuẩn gốc với

nồng độ 1000 mg/L vào lọ nhỏ Sau đó, thêm 900 µL MeOH lắc đều, bịt kín

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben với nồng độ 10 mg/L được chuẩn bị bằng cách dùng micropipette hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 mg/L được pha như trên vào lọ nhỏ Sau đó, thêm 900 µL MeOH lắc đều, bịt kín

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben với nồng độ 1 mg/L được chuẩn bị bằng cách dùng micropipette hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 mg/L được pha như trên vào lọ nhỏ Sau đó, thêm 900 µL MeOH lắc đều, bịt kín Dãy dung dịch chuẩn dùng để dựng đường chuẩn được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn mix 7 paraben nồng độ 1 mg/L và hỗn hợp dung dịch MeOH : H2O (1:1, v/v), các dung dịch này được pha thành dãy đường chuẩn gồm 7 điểm chuẩn

có nồng độ là: 1 µg/L, 2 µg/L, 5 µg/L, 10 µg/L, 20 µg/L, 50 µg/L, 100 µg/L, thể tích của các dung dịch thành phần và dung môi được tính toán và lấy chính xác bằng micropipette như sau:

- 100 µg/L: lấy chính xác 900 µL dung dịch MeOH : H2O vào lọ nhỏ sau đó thêm 100 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben nồng độ 1 mg/L, lắc đều, đậy kín

- 50 µg/L: lấy chính xác 950 µL dung dịch MeOH : H2O vào lọ nhỏ sau đó thêm 50 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben nồng độ 1 mg/L, lắc đều, đậy kín

- 20 µg/L: lấy chính xác 800 µL dung dịch MeOH : H2O vào lọ nhỏ sau đó thêm 200 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben nồng độ 100 µg/L vừa mới được pha ở trên, lắc đều, đậy kín

- 10 µg/L: lấy chính xác 800 µL dung dịch MeOH : H2O vào lọ nhỏ sau đó thêm 200 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben nồng độ 50 µg/L vừa mới được pha, lắc đều, đậy kín

- 5 µg/L: lấy chính xác 750 µL dung dịch MeOH : H2O vào lọ nhỏ sau đó thêm 250 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp 7 paraben nồng độ 20 µg/L vừa mới pha, lắc đều, đậy kín