Nghiên cứu phương pháp Định lượng một số hợp chất phenolic trong lá Đu Đủ (carica papaya)

Nghiên cứu phương pháp Định lượng một số hợp chất phenolic trong lá Đu Đủ (carica papaya) Nghiên cứu phương pháp Định lượng một số hợp chất phenolic trong lá Đu Đủ (carica papaya)

NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT

PHENOLIC TRONG LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT

PHENOLIC TRONG LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya)

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH MÃ SỐ: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VĂN TÀI PGS.TS TẠ THỊ THẢO

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Tạ Thị Thảo, Bộ môn Hóa phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Văn Tài, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng sau đại học và các thầy giáo, cô giáo Khoa Hóa học - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nội dung học tập và thực hiện đề tài thuận lợi

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, lãnh đạo Khoa cùng toàn thể các cán bộ Khoa Hóa thực nghiệm

đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên tôi trong hai năm học tập và trong quá trình làm luận văn

Hà Nội, ngày 13 tháng 11 năm 2023

Học viên

Nguyễn Thị Dung

1.1 Tổng quan cây Đu đủ (Carica papaya) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật của Đu đủ (Carica papaya) 3

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

1.1.3 Công dụng 5

1.1.4 Tác dụng sinh học và dược lý của lá Đu đủ 5

1.1.5 Giới thiệu chung về thành phần hóa học của Đu đủ (Carica papaya) 9

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp QAMS 20

1.4.2 Cách tiến hành phân tích theo phương pháp QAMS 20

1.4.3 Một số nghiên cứu ứng dụng của phương pháp QAMS trong phân tích dược liệu 22

1.5 Phương pháp mặt mục tiêu (response surface methodology – RSM) tìm điều kiện tối ưu quá trình thí nghiệm 24

1.5.1 Nguyên tắc phương pháp 24

1.5.2 Một số ứng dụng của mô hình RSM trong tìm điều kiện tối ưu quá trình xử lý mẫu dược liệu 26

2.2 Chất chuẩn, hóa chất, thiết bị 29

2.2.1 Hóa chất, chất chuẩn 29

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 30

2.3 Chuẩn bị pha dung dịch chuẩn, dung môi pha động 31

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn 31

2.3.2 Chuẩn bị hỗn hợp muối chiết 31

2.3.3 Chuẩn bị hỗn hợp chất phân bố QuERChERS 31

2.3.4 Chuẩn bị dung dịch acid acetic 0,05% 31

2.3.5 Chuẩn bị dung môi pha động 31

2.4 Nội dung nghiên cứu 31

2.5 Phương pháp nghiên cứu 32

2.5.1 Tối ưu hóa hệ thống phân tích sắc ký 33

2.5.2 Phương pháp phân tích định lượng đa thành phần thông qua một chất đánh dấu (QAMS) 42

3 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin 43

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 43

3.1.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 46

3.1.3 Nghiên cứu tìm quy trình xử lý mẫu phù hợp 48

3.1.4 Qui trình phân tích đồng thời manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin trong lá Đu đủ bằng phương pháp HPLC/PAD 54

3.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích định lượng đồng thời manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin trong dược liệu lá Đu đủ 55

3.2.1 Độ đặc hiệu (tính chọn lọc) 55

3.2.2 Tính thích hợp của hệ thống 57

3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 59

Độ lặp lại trong ngày và khác ngày 59

3.2.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo (ĐKĐBĐ) 68

3.3 Phân tích định lượng đa thành phần bằng phương pháp QAMS trong định lượng flavonoid của lá Đu đủ 68

3.3.1 Xác định giá trị hệ số chuyển đổi tương đối 68

3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hệ số hiệu chỉnh RCF 70

3.3.3 Phân tích mẫu thực tế 73

KẾT LUẬN 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

PHỤ LỤC 83

MỤC LỤC BẢNG

Bảng 1.1.Một số hợp chất flavonoid chính trong lá cây Đu đủ 13

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp QAMS trên các nền mẫu khác nhau 23

Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hưởng (biến độc lập) và mức nồng độ dùng trong mô hình thực nghiệm CCD 36

Bảng 2.2 Các điều kiện thí nghiệm theo mô hình thực nghiệm CCD 37

Bảng 3.1 Chương trình rửa giải pha động 44

Bảng 3.2 Các thông số của hệ gradient 3 46

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin 47

Bảng 3.4 Thứ tự và kết quả thí nghiệm tiến hành theo mô hình 50

Bảng 3.5 Phân tích phương sai các hệ số hồi qui (mã hóa) 51

Bảng 3.6 Bảng hệ số hồi qui (dạng mã hóa) của phương trình hồi qui 52

Bảng 3.7 Hệ số hồi qui (mã hóa) sau khi loại bỏ yếu tố ảnh hưởng 52

Bảng 3.8 Phân tích phương sai các hệ số hồi qui (mã hóa) của phương trình sau khi loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng không đáng kể 53

Bảng 3.9 Tính thích hợp hệ thống sắc ký khi pân tích manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin 58

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát LOD, LOQ của phương pháp 59

Bảng 3.11.Kết quả phân tích độ lặp lại trong ngày và khác ngày đối với định lượng đồng thời manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin trong lá Đu đủ 60

Bảng 3.12 Kết quả phân tích độ lặp lại trong ngày và khác ngày 62

Bảng 3.13 Kết quả phân tích độ đúng của phương pháp 64

Bảng 3.14 Kết quả ĐKĐBĐ của manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin 68

Bảng 3.15 Giá trị hệ số chuyển đổi tương đối Fx của flavonoid lá Đu đủ 69

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến hệ số hiệu chỉnh RCF 70

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của cột khác nhau đến hệ số hiệu chỉnh RCF 71

Bảng 3.19 Sai số của phương pháp QAMS so với EMS trên mẫu lá Đu đủ của các khu vực khác nhau 73

Hình 1.5 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu của phương pháp QAMS 22

Hình 2.1 Ảnh chụp mẫu lá Đu đủ khô 29

Hình 2.2 Lược đồ khảo sát xây dựng quy trình phân tích 33

Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC đối với các chương trình pha động thử nghiệm 45

Hình 3.2 Đường chuẩn của manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin 48

Hình 3.3 Sắc ký đồ của các mẫu được xử lý và không xử lý qua QuEChERS 49

Hình 3.4 Các đường đồng mức biểu diễn giá trị hàm lượng flavonoid theo thời gian chiết và lượng dung môi chiết 54

Hình 3.5 Qui trình phân tích định lượng manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin trong lá Đu đủ 55

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC-PDA đánh giá tính đặc hiệu đối với manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin 56

Hình 3.7 Phổ UV của manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin trong mẫu thử và mẫu chuẩn 57

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên tiếng anh hoặc

tên khoa học Tên tiếng việt

AOAC Association of Official

CME Conventional maceration

extraction Chiết ngâm thông thường DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide

ESM The external standard method

Phương pháp chuẩn ngoại hay phương pháp sử dụng đường chuẩn thông thường, định lượng các chất sử dụng các chất chuẩn

riêng

GCB Graphite carbon black Than đen hoạt tính

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC High performance thin layer Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Tên viết tắt Tên tiếng anh hoặc

tên khoa học Tên tiếng việt

Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối

detector Quang phổ tử ngoại HPLC-PDA

High performance liquid chromatography with the photo

MAE Microwave-assisted extraction Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng

MDL Method detection limit Giới hạn phát hiện của phương

Tên viết tắt Tên tiếng anh hoặc

tên khoa học Tên tiếng việt

PSA Primary secondary amines Các amin bậc 1 và bậc 2

QuEChERS Quick, easy, cheap, effective,

rugged and safe

Kỹ thuật chiết nhanh, dễ tiến hành,

rẻ, hiệu quả, ổn định và an toàn

QAMS Quantitative analysis of multi

components by Single marker

Phân tích định lượng đa thành phần thông qua một chất đánh dấu

R Correlation coefficient Hệ số tương quan

RCF The relative correction factor Hệ số hiệu chỉnh RCF

RSM Response surface methodology Phương pháp mặt mục tiêu SFE Supercritical-fluid extraction Chiết siêu tới hạn

UAE Ultrasound assisted extraction Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu

Ở Việt Nam, cây Đu đủ (Carica papaya) được trồng ở hầu hết các tỉnh miền

Bắc, miền Trung và miền Nam Các tỉnh trồng nhiều Đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên,

Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên… Diện tích trồng

Đu đủ của cả nước ước khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lượng khoảng 200 –

350 nghìn tấn quả Trong y học, lá cây Đu đủ được nghiên cứu sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán…và gần đây là tăng sản sinh tiểu cầu ở bệnh nhân sốt xuất huyết Đây là nguồn nguyên liệu rất lớn để lấy lá phục vụ làm thuốc, thực phẩm chức năng và chăm sóc sức khỏe cộng đồng đặc biệt là sử dụng cho những bệnh nhân mắc sốt xuất huyết Tuy nhiên, chúng vẫn chưa được khai thác,

sử dụng đúng mức và cũng chưa có một phương pháp tiêu chuẩn nào được sử dụng

để đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu này

Theo những nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây Đu đủ cho thấy flavonoid là một trong những thành phần có tác dụng chính Một số hoạt chất flavonoid quan trọng trong lá Đu đủ được biết đến như manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin Bốn hoạt chất này đã được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư, ức chế virus HIV-1 và quan trọng nhất là chúng có tác dụng làm tăng sản sinh số lượng tiểu cầu cho bệnh nhân sốt xuất huyết [37,49, 61,64]

Ở Việt Nam, hiện đã có một số nghiên cứu về phương pháp phân tích hàm lượng bốn hoạt chất này của lá cây Đu đủ Tuy nhiên, những nghiên cứu về phân tích này

khác nhau để định lượng các hoạt chất khác nhau Để khắc phục những vấn đề trên,

phân tích định lượng đa thành phần thông qua một chất đánh dấu (quantitative

analysis of multicomponents by single marker- QAMS) đã được đề xuất và chấp nhận

như một phương pháp mới để định lượng đa thành phần Nhằm nghiên cứu áp dụng

để đơn giản hóa quá trình phân tích bốn hợp chất nhóm flavonoid trên trong lá Đu

đủ, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng một

số hợp chất phenolic trong lá Đu đủ (Carica papaya L.)” với các mục tiêu chính:

1 Xây dựng được qui trình định lượng đồng thời một số flavonoid trong lá cây Đu

đủ (Carica papaya L., Caricaceae) bằng hai phương pháp: i) phân tích từng chất

sử dụng từng chất chuẩn tương ứng (EMS) và ii) phân tích định lượng đa thành phần thông qua một chất đánh dấu (QAMS)

2 Áp dụng phương QAMS xây dựng được để xác lượng hàm lượng một số flavonoid này trong một số mẫu lá Đu đủ tại một số vùng khác nhau của Việt Nam

và so sánh kết quả với phương pháp EMS

1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan cây Đu đủ (Carica papaya)

1.1.1 Đặc điểm thực vật của Đu đủ (Carica papaya)

Đu đủ (danh pháp khoa học: Carica papaya) là một cây thuộc họ Đu đủ, là một

loại cây ăn quả trồng khá phổ biến ở các nước nhiệt đới cũng như Việt Nam và từ lâu được coi như là một vị thuốc

Tên gọi khác: Phiên qua thụ, Phiên mộc, Mác rẩu, Mác vá, Cà lào (Tày), Má hống (Thái)

Tên tiếng Anh: Papaya (US), Papaw /Pawpaw (UK)

Tên tiếng Pháp: Papayer

Tên khoa học: Carica papaya L

Đu đủ được phân loại như sau [5]:

Giới (regnum) Thực vật (Plantae)

Thực vật có hoa (Angiospermae) Thực vật 2 lá mầm thực sự (Eudicots) Nhánh hoa hồng (Rosids)

Bộ (ordo) Cải (Brassicales)

Họ (familia) Đu đủ (Caricaceae/Papayaceae)

Chi (genus) Carica

Loài (species) Carica papaya L

Mô tả thực vật

Đu đủ là cây nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2-4 m, thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do cuống lá rụng để lại Lá Đu đủ to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống rất dài, xẻ 5-7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn Hoa Đu đủ có màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá; hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc; cụm hoa đực dài, phân nhánh thành chùy xim, đài hợp có 5 răng ngắn, tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành 2 vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa đực dài, phân nhánh thanh

vòng trên ống tràng, nhụy tiêu giảm; cụm hoa cái có 2-3 hoa, đài và tràng gồm những

bộ phận hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu 1 ô, nhiều lá noãn Quả Đu đủ mọng to, hình trứng ngược hoặc thuân dài, khi chín màu vàng đỏ; hạt nhiều màu đen [5, 59]

Hình 1.1 Một số hình ảnh về cây Đu đủ (Carica papaya)

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Chi Đu đủ (Carica) có một loài duy nhất là Đu đủ (Carica papaya L.) thuộc Họ

Đu đủ (Caricaceae hay Papayaceae) Loài này có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của Châu Mỹ nhưng hiện nay nó là loài cây ăn quả nhiệt đới được trồng rộng rải ở Miền Nam Hoa Kỳ (Florida và US Virgin Island), Mexico, các nước Trung Mỹ, các nước Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á, Châu Đại Dương và tiểu bang Hawaii của Mỹ [12]

Ở Việt Nam có hai giống Đu đủ nội địa truyền thống là giống Đu đủ thịt đỏ và

a Cây mang quả và hình dạng lá Đu

đủ

b Quả Đu đủ và hạt

c Hoa Đu đủ đực d Hoa Đu đủ cái

giống Đu đủ thịt vàng Hiện nay có nhiều giống mới được lai tạo và nhập nội chủ yếu

là các giống Đu đủ lai F1 với năng suất, sản lượng và chất lượng quả cao với nhiều màu sắc của thị quả khác nhau như đỏ, vàng, tím…

Cây Đu đủ (Carica papaya L.) được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc, miền

Trung và miền Nam Các tỉnh trồng nhiều Đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,… Diện tích trồng Đu đủ của cả nước ước khoảng 10.000 – 17.000 ha với sản lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả [10]

1.1.3 Công dụng

Trong Y học cổ truyền Việt Nam, cây Đu đủ có rất nhiều công dụng như lá Đu

đủ tươi được dùng dạng đắp để chữa đau đầu, trị mụn nhọt, tiêu sưng tấy; sắc nước

lá tươi dùng để chữa ung thư; ước sắc lá Đu đủ khô có tác dụng sát khuẩn, dùng rửa vết thương, lở loét; nhựa mủ từ lá và quả Đu đủ dùng bôi chữa chai chân, hột cơm, nốt tàn nhan, hắc lào mới phát, eczema, vảy nến …[1], [5]

Trong y học dân gian Ấn Độ, lá Đu đủ được dùng đắp trị đau thần kinh và giảm phát triển dạng phù voi Y học cổ truyền Indonesia dùng dịch ép lá Đu đủ uống chữa sốt rét và những bệnh sốt khác; lá Đu đủ cũng có trong bài thuốc sắc uống chữa lao [19]

Ở Nigiêria, nước sắc lá Đu đủ trị sốt rét cho người và làm thuốc tẩy cho ngựa

Ở Peru, nước hãm lá uống gây hạ huyết áp, làm dễ tiêu Ở Haiti, đắp lá nấu chín trị thấp khớp, chấn thương, bong gân [10, 66]

1.1.4 Tác dụng sinh học và dược lý của lá Đu đủ

Tác dụng chống sự suy giảm tiểu cầu

Gần đây, nhiều nghiên cứu in vitro, in vivo và trên lâm sàng cho thấy lá Đu đủ

có tác dụng tăng tiêu cầu, dùng cho bệnh nhân bị sốt xuất huyết [8, 57, 60] Flavonoid

từ lá Đu đủ thể hiện liên kết với enzyme protease 2B và 3 (NS2B-NS3), một enzyme quan trọng đối với sự nhân lên của virus Dengue, do đó có thể có tiềm năng trong điều trị sốt xuất huyết [60] Quercitin có tác dụng ngăn chặn sự kết tập tiểu cầu do

cầu thỏ [48] Keampferol cũng đã được chứng minh có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và ngăn ngừa hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt động enzym hóa của thrombin và Fxa tương ứng 68 ± 1.6% và 52 ± 2.4% In vivo, kaempferol ngăn ngừa quá trình hình thành huyết khối ở cả mô hình huyết khối cấp tính do collagen/ epinephrine và thrombin và mô hình huyết khối động mạch cảnh do FeCl3 gây ra [35]

Hình 1.2 Một số sản phẩm từ lá Đu đủ

Một số nghiên cứu cho thấy nước ép lá Đu đủ đông khô giàu các hợp chất phenolic như manghaslin, clitorin, rutin, nicotiflorin và carpaine đã làm tăng tổng số bạch cầu và bạch cầu trung tính ở chuột bị nhiễm lập DENV-2 (DMOF015), làm giảm mức GM-CSF, GRO-alpha, IL-1 beta, IL-6, MCP-1 và MIP-1 beta trong huyết tương của chuột bị nhiễm virus và có tác dụng sản xuất các cytokine gây viêm trong quá trình nhiễm virus sốt xuất huyết ở chuột AG129, đã làm tăng nồng độ CCL2/MCP-1 trong huyết tương [42, 43]

Trên thực tế, nhiều nước trên thế giới như Ấn Độ, Philippine, Indonesia,

Pakistan … cũng như ở Việt Nam đã cấp phép cho các sản phẩm chứa cao chiết lá

Đu đủ dùng cho người bệnh sốt xuất huyết

Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Lá Đu đủ có tính kháng khuẩn tốt, Elisa Friska Romasi và cộng sự ngâm chiết

lá Đu đủ với 3 loại dung môi ethanol, ethyl acetate và n-hexan Kết quả cho thấy, cao

chiết bằng ethyl acetat ức chế cả 4 chủng Bacillus stearothermophilus, Listeria

monocytogenes, Pseudomonas sp và Escherichia coli [49] Nghiên cứu của Baskaran

và cộng sự (2012) đã cho thấy dịch chiết ethanol, methanol, ethyl acetat, aceton, chloroform, ete dầu, hexan và dịch chiết nước đều có tác dụng chống lại vi khuẩn và nấm [22]

Chống ung thư

Các cao chiết giàu flavonoid và phenolic từ lá Đu đủ thể hiện tác dụng ức chế

sự phát triển của các dòng ung thư biểu mô tế bào vảy ở miệng người SCC25 [21, 63] Cao chiết giàu flavonoid từ lá Đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng

tế bào Hep-G2 với IC50 56,63 ± 1,25 µg/ml [56]

Dịch chiết nước lá Đu đủ được đánh giá tác dụng kháng khối u và điều hòa miễn dịch Kết quả cho thấy dịch chiết nước lá Đu đủ có tác dụng ức chế đáng kể với các dòng tế bào ung thư, tăng cường biểu hiện của 23 gen điều hòa miễn dịch Dịch nước

ép lá Đu đủ (0,03-0,003 mg/ml) ức chế mạnh các tế bào ung thư tuyến tiền liệt Phân đoạn phân cực trung bình ức chế sự di chuyển và bám dính của các tế bào di căn PC-

3 [29, 49]

Tác dụng giảm đau

Dịch chiết n-hexan, ethyl acetat, ethanol được đánh giá tác dụng giảm đau trên

mô hình chuột bị gây đau do acid acetic Cả ba dịch chiết đều có tác dụng giảm đau đáng kể ở cả ba mức liều 0,175; 0,35 và 0,70 mg/kg khi so sánh với aspirin [20, 66]

Tác dụng kháng ký sinh trùng và giun sán

Dịch chiết lá Đu đủ có hoạt tính kháng ký sinh trùng cao, độc tế bào thấp Các

alkaloid được thử tác dụng in vitro với 4 loại ký sinh trùng Trypanosoma brucei

trên mô hình chuột thực nghiệm bị nhiễm Plasmodium berghei Kết quả cho thấy các

alkaloid, đặc biệt carpain có hoạt tính kháng ký sinh trùng cao [20, 66]

Cao chiết lá Đu đủ cho thấy tác dụng diệt Meloidogyne incognito và

Rotylenchulus reniformis (Mahemood và cộng sự, 1979) [20]

Tác dụng chống đái tháo đường

Dịch chiết chloroform gồm steroid và quinin được đánh giá trên chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozotocin và chuột thường Sau 20 ngày điều trị, có sự giảm

đáng kể glucose, trans-aminase và triglycerid trong huyết thanh Lá Đu đủ có tiềm

năng trong điều trị đái tháo đường [49]

Tác dụng lên hệ tim mạch và hệ thần kinh trung ương

Các alkaloid chính như carpain trong lá Đu đủ được chứng minh có tác dụng lên hệ tim mạch trên chuột Wistar Tăng dần liều carpain làm giảm dần huyết áp tâm thu, tâm trương và huyết áp trên động mạch Atropin sulfat (1 mg/kg) hoặc propranolol hydrochlorid (8 mg/kg) không làm thay đổi tác dụng của carpain Carpain liều 2 mg/kg làm giảm áp lực lên tim, khả năng đột quỵ, ảnh hưởng đến cơ tim [36]

Tác dụng chống viêm

Tác dụng kháng viêm của cao chiết ethanol lá Đu đủ làm giảm tổng khối lượng khối viêm từ 0,58 ± 0,07 g xuống còn 0,22 ± 0,03 g, đồng thời làm giảm đáng kể lượng dịch nhầy của khối viêm [68] Năm 2013, nghiên cứu cao chiết lá Đu đủ bằng nước cho thấy với liều lượng sử dụng 100 và 200 mg/kg trọng lượng cơ thể đã làm giảm nhẹ các khối viêm Đồng thời có tác dụng giảm đau rõ rệt [18]

dương L-penicillamine (6.90 μmol/L) [47]

Hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid từ cao chiết lá Đu đủ được cho là góp phần làm ổn định màng tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc đảo ngược sự phá hủy tiểu cầu ngoại vi, ngăn ngừa tan máu và chảy máu do sốt xuất huyết [57] Như vậy có thể thấy rằng, manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin là bốn hoạt chất flavonoid là những hợp chất có hoạt tính sinh học nổi bật của lá Đu đủ, có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe con người đặc biệt là tác dụng chống suy giảm tiểu cầu cho bệnh nhân sốt xuất huyết Vì vậy, trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi sẽ tiến hành xây dựng một phương pháp định lượng đồng thời bốn hợp chất manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin nhằm đánh giá chất lượng lá cây Đu đủ cũng như các sản phẩm được làm từ lá cây Đu đủ

1.1.5 Giới thiệu chung về thành phần hóa học của Đu đủ (Carica papaya)

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng lá của cây Đu đủ chứa nhiều các alkaloid như carpain, pseudocarpain, dehydrocarpain I và II, choline, carposide và flavonoid như quercetin, kaempferol, rutin, clitorin [27], [38], [60]

a Tình hình nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học của lá Đu đủ (Carica papaya)

Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất, phân lập và xác định được alkaloid carpaine trong lá Đu đủ [11] Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng là 57,05% và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [6]

Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexan của lá Đu đủ Bao gồm, β- sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol Trong đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)- diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá Đu đủ [4]

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết MeOH từ lá Đu

đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, butanol)

apocynol A, carpaine, pseudocarpaine Trong đó carpainone là hợp chất mới và 2 chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được chiết ra từ lá Đu đủ, tuy nhiên hối lượng của 2 chất nhỏ nhất phân lập được từ 20 kg lá Đu đủ khô chỉ là 6 mg và 6,7

mg [3]

Gần đây, Nguyễn Thị Hà đã phân lập được 4 flavonoid từ lá đu đủ ở Việt Nam bao gồm quercetin-3-O-(2’’, 6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranosid (manghaslin), kaempferol -3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranosid (clitorin), quercetin-3-O-rutinosid (rutin), kaempferol-3-O-rutinosid (nicotiflorin) [31]

b Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Đu đủ (Carica papaya) ngoài nước

Alkaloid

Năm 1965, Coke và Rice đã công bố cấu trúc của carpain, sau đó Govindachari cũng đã phân lập và xác định được cấu trúc của carpain và pseudocarpain [30] Hàm lượng carpain được xác định bằng phương pháp phân tích HPLC trong lá Đu đủ ở Indonesia dao động trong khoảng từ 0,02% đến 0,31% Trong khi đó, lá Đu đủ thu hái tại Ấn Độ có hàm lượng carpain là 0,15% Tại Việt Nam, lá Đu đủ có hàm lượng carpain đạt khoảng 0,2% [7] Carparin cũng được định lượng bằng phương pháp sắc

ký khí khối phổ (GC/MS) và cho thấy đây là một alkaloid chính trong Đu đủ (64,9% trong tổng số thành phần) [37] Năm 1979, Chung – Shih Tang đã phân lập được dehydrocarpain I và dehydrocarpain II từ lá Đu đủ [62] Hai hợp chất prunasin và sambunigrin được phân lập trong dịch chiết lá Đu đủ năm 2002 [59] Sau đó, Elin S Olafsdottir và cộng sự (2002) cũng phân lập được prunasin trong lá Đu đủ với hàm lượng nhỏ, khoảng 0,005% so với khối lượng lá khô [49]

Flavonoid

Năm 2012, Adlin Afzan và cộng sự đã nhận dạng được 12 hợp chất có trong lá

Đu đủ bằng phương pháp UPLC-TripleTOF-ESI-MS, bao gồm: Carpain, acid malic, acid quinic và 5 dẫn xuất của acid malic là: caffeoyl malat, ρ-coumaroyl malat (isomer 1), ρ-coumaroyl malat (isomer 2), feruloyl malat (isomer 1), feruloyl malat

(isomer 2) và 4 flavonol glycosid là: quercetin-3-O-(2’’, 6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranosid (manghaslin), kaempferol -3-O-(2’’,6’’-di-O-rhamnopyranosyl) glucopyranosid (clitorin), quercetin-3-O-rutinosid (rutin), kaempferol-3-O-rutinosid (nicotiflorin) [15] Bốn flavonoid này cũng được Tasqiah Julianti và cộng sự phân lập từ 20 g cao chiết MeOH lá Đu đủ với hàm lượng manghaslin (2,1 mg), clitorin (4,4 mg), rutin (22,2 mg) và nicotiflorin (12,6 mg) [34] Năm 2016, Agung Nugroho

phân lập được bảy flavonoid từ lá của C Papaya trong đó có 3 hợp chất mới được

phân lập gồm quercetin-3-O-(2G - rhamnosylrutinosid), kaempferol-3-(2G- rhamnosylrutinosid) và myricetin-3O-rhamnosid [46]

Sau đó, Sheethal S Kumar và cộng sự đã xác định được 11 hợp chất flavonoid

trong chiết xuất butanolic phân lập từ lá Carica papaya L bằng cách sử dụng

UPLC-Q-ToF-MS/MS bao gồm các hợp chất luteolin, astragalin, methoxyphenyl)-3,5,7- trihydroxy - 6 – metoxy - 2,3dihydro - 4H - chromen - 4 - one

2-(3,4-Dihydroxy-5-và quercetin dimer là những hợp chất được phân lập mới trong lá Đu đủ [39]

Các hợp chất phenolic khác

Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ GC-MS với chế độ SIM để phân tích các hợp chất phenol trong lá Đu đủ gồm

các thành phần với hàm lượng như sau: mg/g (lá khô): acid caffeic: 0,25; acid p -

coumaric: 0,33; acid protocatechuic: 0,11; kaempferol: 0,03; quercetin: 0,04 và dimethoxycoumarin: 0,14 [23]

5,7-Các tác giả cũng đã đánh giá hàm lượng tổng flavonoid, hàm lượng polyphenol tổng số cũng như hàm lượng của một số hợp chất như myricetin, acid caffeic, acid trans-ferulic và kaempferol bằng phương pháp HPTLC Kết quả cho thấy, cao chiết nước lá Đu đủ chứa hàm lượng flavonoid tổng số là 16,74 ± 0,50 mg QE/g và hàm lượng polyphenol tổng số là 29,54 ± 0,02 mg GAE/g Hàm lượng các hợp chất myricetin, acid caffeic, acid trans-ferulic và kaempferol với hàm lượng lần lượt là 280,16 ± 5,99, 370,18 ± 6,27, 1110,86 ± 2,97 và 160,53 ± 2,48 (g/g) [19]

1.1.6 Tổng quan về flavonoid

Flavonoid (hoặc bioflavonoid) là một loại chất chuyển hóa trung gian của thực vật Flavonoid có màu vàng, xanh, tím đỏ và một số khác không có màu Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon có thể gây nhầm lẫn Flavonoid là nhóm hoạt chất chính có trong lá Đu đủ Các flavonoid có trong dược liệu này là chủ yếu thuộc nhóm flavonol Ngoài ra còn có các flavonoid nhóm flavanon, flavon [1], [2]

Hình 1.3 Hình ảnh khung cấu trúc nhóm flavonol

Tính chất quang phổ của flavonoid

Trên phổ UV của flavonoid chia ra 2 dải hấp thụ, dải I nằm trong vùng 290 nm trở lên, dải II nằm trong vùng 290 nm trở xuống

Hình 1.4 Phổ UV của các hợp chất phenolic

Trong dải I, flavon có đỉnh hấp thu cực đại trong vùng 310 – 350 nm, flavonol

có 3-OH đã thế trong vùng 330 – 360 nm, flavonol có 3-OH tự do thì hấp thụ vùng

350 – 385 nm

Trong dải II, cả flavon, flavonol đều có đỉnh hấp thụ trong vùng 250 – 280 nm Isoflavon do gốc phenyl đính ở C-3, không còn hiệu ứng liên hợp với nhóm carbonyl nên chỉ có dải hấp thụ chính ở 250 -270 nm

Bốn hợp chất flavonoid trong lá cây Đu đủ trong nghiên cứu này: Thông tin

chung về bốn hợp chất flavonoid trong lá cây Đu đủ được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Bốn hợp chất flavonoid trong lá Đu đủ của nghiên cứu này

(2,6-α-L-glucopyranoside))

STT Tên chất Công thức cấu tạo Thông tin chất

1.2 Các kỹ thuật chiết xuất và xử lý mẫu trong quá trình phân tích các hợp

chất phenolic từ dược liệu

Phân tích các hợp chất phenolic trong các nền mẫu dược liệu và sản phẩm từ dược liệu thường gặp phải khó khăn do sự khác nhau về thành phần của các loại dược liệu Vì thế, mục tiêu của quá trình xử lý mẫu ngoài việc chiết được tối đa các hợp chất phenolic, còn phải làm giảm được càng nhiều tạp chất càng tốt Có nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được sử dụng bao gồm chiết bằng dung môi, chiết có sự hỗ trợ của vi sóng, chiết siêu âm, chiết siêu tới hạn và QuEChERS

Các phương pháp chiết dược liệu sử dụng dung môi được quy định nhiều trong Dược điển Việt Nam IV, mẫu dược liệu được làm khô, được ngâm chiết bằng dung môi phù hợp sau đó được tinh chế làm sạch qua sắc ký cột, hay được xử lý acid hóa

để chiết được các flavonoid phù hợp Các flavonoid trong lá Đu đủ được chiết xuất chủ yếu qua dung môi ethanol, methanol hoặc hỗn hợp dung môi ethanol và nước, hỗn hợp methanol và nước theo các tỷ lệ khác nhau được đun hồi lưu Theo TCCS nguyên liệu lá Đu đủ của Viện Dược liệu, cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu lá

Đu đủ (qua rây 1-2 mm) vào bình 250 mL có gắn sinh hàn hồi lưu, thêm 78 mL dung môi chiết (MeOH : HCl: H2O = 25 : 4 : 10), đun hồi lưu trên bếp cách thuỷ trong 135 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc vào bình định mức 100 mL Thêm 20 mL MeOH vào bình 250 mL và siêu âm trong 30 phút, lọc chuyển vào bình định mức

100 mL, rửa và định mức đến vạch bằng MeOH Lọc dịch chiết qua màng lọc kích

cỡ 0,45 µm để phân tích [8, 9]

Hiệu suất chiết flavonoid từ lá Đu đủ được đánh giá bằng 3 phương pháp chiết phương pháp ngâm thông thường (CME), có sự hỗ trợ của vi sóng (MAE), siêu âm (UAE) Quá trình chiết ngâm thông thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách trộn 50 g bột lá Đu đủ khô với 80% ethanol trong nước (200 mL × 3) trong bình nón kín Phương pháp chiết siêu âm và chiết vi sóng đều được thực hiện với 50 gam bột lá Đu đủ và 200 mL dung dịch ethanol 80% Quá trình chiết siêu âm được thực hiện trong bể siêu âm với nhiệt độ duy trì không đổi 25°C ± 5°C Trong khi đó quá trình chiết vi sóng được đặt trong thiết bị vi sóng với nhiệt độ chiết được đặt ở 60°C

và thời gian chiết trong 20 phút với công suất bức xạ ở công suất 800 W Hiệu suất chiết cho thấy chiết xuất từ MAE (29,99 mg/g) tốt nhất, tiếp theo là UAE (24,75 mg/g) và hàm lượng thấp nhất là từ CME [13] Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của See Khai Chew (2022), hiệu suất chiết rutin từ lá Đu đủ bằng phương pháp chiết MAE cao hơn so với UAE và điều kiện chiết tối ưu là nồng độ hỗn hợp ethanol

là 51,5%, thời gian chiết là 70,5 phút, kích thước hạt là 355 µm và tỷ lệ rắn/lỏng là 1:108,6 (g/mL) [26]

Chiết siêu tới hạn (Supercritical-fluid extraction, SFE) là phương pháp chiết bằng dung môi đặc biệt là dung môi ở trạng thái siêu tới hạn Trong SFE, CO2 thường được sử dụng vì có thể dễ dàng đạt được nhiệt độ và áp suất tới hạn Một số tác giả

đã phát triển phương pháp SFE để chiết xuất phenolic từ lá sử dụng dung môi CO2 Trong một nghiên cứu gần đây, các thông số chiết xuất tối ưu được xác định như sau: nhiệt độ 57,47 °C, áp suất 26,62 MPa, tốc độ dòng dung môi 5,43 mL/phút và tỷ lệ đồng dung môi là 4,98% với hiệu suất chiết xuất dự đoán là 0,0806 g [24]

QuEChERS là một phương pháp chiết pha rắn được áp dụng trong nhiều loại nền mẫu khác nhau Như tên gọi của nó QuEChERS viết tắt của quick, easy, cheap, effective, rugged và safe, chuẩn bị mẫu theo QuEChERS có nhiều thuận lợi so với các phương pháp truyền thống Phương pháp QuEChERS dựa trên nguyên tắc chiết một lần bằng dung môi đã được ổn định pH và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng lỏng nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4) Quá trình làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn được dùng để loại các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ phối hợp chất hấp phụ PSA và MgSO4 C18 và GCB được sử dụng khi cần thiết để lần lượt loại các chất béo và clorophyl Dịch chiết được tách và phân tích trên

hệ thống sắc ký Phương pháp QuEChERS đã được báo cáo để chiết xuất các hợp

chất berberine, phenolic và chất chống oxy hóa của thân cây B.integerrima và so sánh

với phương pháp ngâm, kết quả cho thấy mặc dù độ thu hồi trung bình của berberine hiệu quả hơn trong quá trình ngâm so với phương pháp QuEChERS nhưng phương pháp QuEChERS trong ethanol có tác dụng tích cực trong việc chiết các hợp chất

tiến có hiệu suất chiết các hợp chất phenolic tốt hơn so với việc chiết các hợp chất berberine [58]

Một nghiên cứu khác về phương pháp QuEChERS cải tiến để xác định các hợp

chất phenolic trong rau cải (Brassica juncea) QuEChERS acetat kết hợp với 25 mg

đất tảo cát (DE) và 5,0 mg than chì hoạt tính (GCB) đã cung cấp các điều kiện tốt nhất để chuẩn bị mẫu [44]

1.3 Các phương pháp phân tích các thành phần hóa học của lá Đu đủ (Carica

papaya)

Lá Đu đủ là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp vì trong nó có chứa không chỉ một chất, một hỗn hợp các chất có tính chất khác nhau mà thường chứa một nhóm chất có tính chất tương đối giống nhau (flavonoid, alkaloid, coumarin,…) Các chất trong cùng một nhóm có khung cơ bản giống nhau, chỉ khác nhau về nhóm thế dẫn đến không có sự khác nhau nhiều về tính chất hóa học cũng như tính chất vật

lý Chính vì vậy, việc sử dụng các phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu lá Đu

đủ Người ta có thể định lượng một chất hoặc nhiều chất đồng thời nếu lựa chọn được điều kiện sắc ký phù hợp Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp sắc ký hay được

sử dụng để phân tích dược liệu là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản và hiện đại hơn là các kỹ thuật ghép nối với hệ thống HPLC hoặc GC đã được sử dụng để phân tích các nhóm chất như HPLC-MS/MS, GC/MS, HPLC-APCI/MS

Phân tích bằng phương pháp HPLC-UV

Agung Nugroho và cộng sự (năm 2017) đã phân lập được 07 flavonoid từ dịch chiết lá Đu đủ bao gồm quercetin 3-(2G-rhamnosylrutinoside), kaempferol 3-(2G-rhamnosylrutinoside), quercetin 3-rutinoside, myricetin 3-rhamnoside, kaempferol 3-rutinoside, quercetin và kaemferol từ các phân đoạn chiết khác nhau và phân tích định lượng trên hệ thống HPLC với hệ pha động: dung môi A (dung dịch acid acetic 0,1%, v/v) và dung môi B (acetonitrile với acid acetic 0,1%, v/v), chương trình rửa giải gradient của các pha động (A:B, v/v) được cài đặt là (A:B, v/v): 0 phút là 85:15;

035 phút là 35:65; 35 40 phút là 35:65; 4042 là 0:100; 4246 phút là 0:100,

46 49 phút là 85:15; 4955: 85:15; tốc độ dòng và nhiệt độ cột được đặt liên tục

ở mức tương ứng là 1,0 mL/phút và 40°C, bước sóng phát hiện được cố định ở 254

nm và được theo dõi trong 40 phút đối với mỗi mẫu [47]

Hệ thống HPLC Shimadzu LC-2030C Plus được sử dụng để xác định 23 hợp chất phenolic trong các mẫu lá Đu đủ và lá Ổi, được trang bị detector mảng điốt (DAD) và bước sóng phát hiện được cài đặt từ 230 nm đến 360 nm Cột pha đảo, Poroshell 120 EC-C18 (4,6 mm × 100 mm, 2,7 μm) ở nhiệt độ 40°C, tốc độ dòng ở 0,5 mL/phút và không đổi trong suốt quá trình phân tích Thể tích tiêm là 20 µL Pha động nhị phân bao gồm dung dịch acid acetic 1,0% (v/v) (dung môi A) và metanol (dung môi B) Quá trình rửa giải khỏi cột đạt được với độ dốc sau: 0–40 phút dung môi B tăng từ 10% lên 85%; 40−41 phút dung môi B giảm từ 85% xuống 10% và sau đó giữ nguyên (rửa giải đẳng cấp với 10% dung môi B) cho đến 50 phút, để đạt được sự cân bằng cột [45]

Một nghiên cứu khác xác định hiệu suất chiết polyphenol, flavonoid từ lá cây

Đu đủ bằng các phương pháp chiết xuất khác nhau cho thấy phương pháp chiết có sự

hỗ trợ của vi sóng (MAE) (29,99 mg/g) có hiệu quả hơn phương chiết có hỗ trợ siêu

âm (UAE) (24,75 mg/g) và phương pháp ngâm thông thường có hiệu quả thấp nhất Dịch chiết được phân tích trên hệ thống HPLC sử dụng cột Eclipse DBC 18 (5 μm, 4,6 × 250 mm id) dung môi pha động dung dịch acid acetic 0,05% và acetonitril theo

tỷ lệ 90:10 (v/v), chế độ rửa giải đẳng dòng được sử dụng làm pha động với tốc độ dòng 1 mL/phút, detector (DAD) phát hiện ở bước sóng 280 và 320 nm [13]

Phân tích bằng phương pháp GC-MS

Những nghiên cứu ứng dụng phương pháp GC-MS thường để xác định các

hợp chất phytochemical trong chiết xuất ethanolic của lá Đu đủ, sử dụng cột HP-5ms 5% phenyl, 95% methyl siloxane (30 m x 250 µm, 0,25 µm), chương trình nhiệt độ

lò cột được cài đặt 40oC giữ trong 5 phút sau đó tăng lên 10oC/phút đến 300oC trong

20 phút, tốc độ dòng khí mang Helium là 1 mL/phút và chế độ tiêm xung Splitless

sử dụng nhiệt độ nguồn ion 230oC, với tốc độ quét 1562 (N2) và dải khối 44-750 m/z Kết quả cho thấy sự hiện diện của hơn ba mươi chất phytochemical trong chiết xuất

ethanolic của lá Đu đủ [14], [17]

Trong nghiên cứu khác, GC-MS được ứng dụng để xác nhận sự có mặt của 21 hợp chất bao gồm axit undecylenic (40,33%), axit oleic (30,21%), axit n-hexadecanoic (7,55%), 9-octadecanal (7,09%) và 9,17-octadecadienal, (Z)- (5,98%) trong chiết xuất methanol của hạt Đu đủ; trong khi axit oleic (31,58%), 9,12-octadecadienoyl clorua, (Z,Z)- (13,18%), axit undecylenic (12,60%), axit hexadecanoic (7,83%), 10-undecenal (7,44 %) , axit octadecanoic (5,68 %), 10-undecenoyl clorua (4,55%) và axit hexadecanoic, este 2,3-dihydroxpropyl (4,08%) được tìm thấy trong dịch chiết nước của hạt Đu đủ [16]

Phân tích bằng phương pháp HPLC-MS

Nhiều nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC-MS để phân tích thành phần hóa học của Đu đủ [47], [28], [13] Nghiên cứu của Yenny Puspitasari (2017) đã xác định các hợp chất carpaine trong chiết xuất lá Đu đủ bằng LC-MS/MS sử dụng cột Hypersild Gold, dung môi pha động là dung dịch acid formic 0,1% và 0,1% acid formic trong acetonitril với tốc độ dòng chảy 0,3 mL/phút Nguồn ESI được sử dụng

ở chế độ ion dương với phương pháp SRM Các hợp chất carpaine mục tiêu được quan sát thấy ở các mảnh ion 479 m/z và ở 240 m/z [47] Một nghiên cứu khác cũng xác định hàm lượng carpain trong lá Đu đủ ứng dụng phương pháp LC/MS/PDA sử dụng cột Sunfire -C18 RP (4,6 x 150 mm, 5µm) và hệ dung môi pha động acid formic 0,1% (kênh A) và acetonitrile (kênh B) Quá trình rửa giải theo chương trình gradient (tỷ lệ dung môi A%/B%) như sau: 0 – 2 phút là 80/20, từ 2 – 20 phút là 0/100, từ 20

– 30 phút là 0- 100 và từ 30 – 35 phút là 80-20 [28]

Như vậy có thể thấy: Các nghiên cứu phân tích hàm lượng flavonoid trong lá

Đu đủ chủ yếu là manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin Chứng tỏ 4 hoạt chất trên là những hoạt chất chính, có hàm lượng lớn trong lá Đu đủ

1.4 Phương pháp phân tích định lượng đa thành phần thông qua một chất đánh dấu (QAMS)

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp QAMS

Theo định luật Lambert- beer, trong khoảng nồng độ xác định, độ hấp thụ quang của chất phân tích tỷ lệ tuyến tính với nồng độ (hoặc khối lượng) mẫu và mối quan

hệ của chúng có thể được mô tả bằng phương trình: W= f.A (trong đó W là nồng độ mẫu, A là diện tích pic phản ứng của chất phân tích và f là hệ số hiệu chỉnh Giá trị của f là hằng số liên quan đến chất được phát hiện và độ nhạy của máy dò Giả sử có một số thành phần cùng tồn tại trong mẫu dược liệu, mỗi thành phần hóa học có thể được mô tả theo phương trình (1)

Wi/Ai = fi(i = 1, 2, 3 k, n) (1) Trong đó:

Ai là diện tích pic của chất phân tích (trong sắc ký)

Wi là nồng độ của chất phân tích

Để thu được hệ số hiệu chỉnh tương đối (RCF), giả sử chọn “k” làm chất tham chiếu bên trong, “i” là một trong các thành phần được nghiên cứu khác, RCF giữa các thành phần “k” và “i” được thiết lập thông qua phương trình (2)

fki = fk/ fi = (Wk.Ai) /(Wi.Ak) (i = 1, 2, 3 k, n) (2) Với kết quả của fki, việc định lượng các chất được khảo sát khác trong mẫu dược liệu có thể được thực hiện theo phương trình sau (3)

Wi = (Wk.Ai)/(Ak.fki) (3)

Do đó, việc phân tích định lượng các thành phần khác có thể được thực hiện bằng cách phát hiện hàm lượng của một chất đánh dấu và sau đó tính toán hàm lượng của nhiều thành phần thông qua được hệ số hiệu chỉnh tương đối

1.4.2 Cách tiến hành phân tích theo phương pháp QAMS

Trong phương pháp đường chuẩn thông thường (ESM), hàm lượng hoặc nồng

độ của tất cả các các chất chuẩn tham chiếu tương ứng với chất phân tích cần được xác định còn trong phương pháp QAMS, chỉ cần xác định hàm lượng hoặc nống độ của một chất đánh dấu Do đó, QAMS không chỉ có thể làm giảm đáng kể thời gian phát hiện và chi phí của thí nghiệm mà còn cải thiện tính khả thi của phương pháp và

hơn Với nghiên cứu sâu hơn về QAMS, phương pháp nghiên cứu đã được xây dựng

và quá trình nghiên cứu QAMS trên dược liệu được chia thành ba phần

Các bước xây dựng phương pháp QAMS

Bước 1: tối ưu hóa và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bao gồm lựa chọn pha động phù hợp, tối ưu hóa các điểu kiện phân tích chế độ rửa giải và bước sóng phát hiện Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, độ chính xác của phương pháp bao gồm độ lặp lại, độ ổn định và độ thu hồi của phương pháp cho từng hợp chất được nghiên cứu để tính hàm lượng của từng hợp chất được nghiên cứu bằng ESM

Bước 2: Lựa chọn chất đánh dấu và tính toán hệ số chuyển đổi Chất đánh dấu được lựa chọn phải có trong thành phần chính của dược liệu, có đặc tính hóa học ổn định, dễ kiếm, có sẵn và không tốn kém Bước tiếp theo là tính toán hệ số chuyển đổi RCF

Bước 3: Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp QAMS, xác định tất cả các yếu

tố ảnh hưởng đến đến giá trị RCF Các yếu tố chính ảnh hưởng đến RCF có thể gồm các phòng thí nghiệm khác nhau, hệ thống thiết bị sắc ký, cột sắc ký, người thực hiện

và mẫu Việc xác nhận và đánh giá phương pháp QAMS thông qua tính toán độ lệch chuẩn tương đối (RSD%; nói chung, khi RSD < 5%, kết quả cho thấy các lỗi có ảnh hưởng nhỏ đến RCF)

Bước 4: Đánh giá và xác minh tính khả thi của QAMS để xác định nhiều hợp chất trong dược liệu Tính toán hàm lượng chất đánh dấu và sau đó tính toán các nồng

độ chất khác sử dụng hệ số chuyển đổi RCF và so sánh với nồng độ xác định đưuọc bằng phương pháp ESM Nếu độ chệch tương đối giữa 2 phương pháp nhỏ hơn 5% thì có thể sử dụng phương pháp QAMS để phân tích Trình tự các bước tiến hành trong phương pháp QAMS có thể được tóm tắt như trong Hình 1.8

Hình 1.5 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu của phương pháp QAMS

1.4.3 Một số nghiên cứu ứng dụng của phương pháp QAMS trong phân tích dược liệu

Có thể nói hiện nay, phương pháp QAMS đã trở thành một phương pháp được

ưu tiên trong phân tích đa thành phần của dược liệu, thực phẩm, hoặc ngũ cốc, thực vật Một số nghiên cứu trên nền mẫu dược liệu hay thực vật được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp QAMS trên các nền mẫu khác nhau

Mẫu dược liệu/

Chlorogenic acid (1); neochlorogenic Acid (2);

4-caffeoylquinic acid (3); caffeic acid (4);

isochlorogenic acid B (5); isochlorogenic acid A (6);

Chiết xuất trà xanh Epigallocatechin gallate (1); gallic acid (2);

gallocatechin (3); epigallocatechin (4); caffeine (5);

catechin (6); epicatechin (7); gallocatechin gallate (8); epicatechingallate (9); catechin gallate (10)

Epigallocatechin gallate

f1/2 = 0,54; f1/3 = 6,79; f1/4

= 7,37; f1/5 = 0,55; f1/6 = 1,81; f1/7 = 1,87; f1/8 = 0,88;

Sodium danshensu (1); protocatechuic aldehyde (2);

rosmarinic acid (3); lithospermicacid (4); salvianolic acid B (5)

Sodium danshensu

f2/1 = 7,559; f3/1 = 2,901;

f4/1 = 1,825; f5/1 = 1,746

[41]

1.5 Phương pháp mặt mục tiêu (response surface methodology – RSM) tìm điều kiện tối ưu quá trình thí nghiệm

1.5.1 Nguyên tắc phương pháp

Phương pháp mặt mục tiêu (response surface methodology - RSM) là tập hợp các kĩ thuật toán học và thống kê sử dụng để mô hình hoá và phân tích số liệu thực nghiệm trong trường hợp hàm mục tiêu chịu ảnh hưởng của nhiều biến độc lập và có tính phi tuyến tính Trong phương pháp này, mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và biến độc lập chưa xác định trước, vì vậy bước đầu tiên của phương pháp là xác định mối quan hệ gần đúng giữa hàm mục tiêu (kết quả thí nghiệm) và các biến (yếu tố ánh hưởng) Sau khi có mô hình gần đúng, có thể tìm điều kiện tối ưu theo phương pháp đạo hàm hoặc phương pháp đường dốc nhất

Trong phương pháp RSM, hai loại mô hình hàm mục tiêu phổ biến là mô hình Box - Behnken và mô hình phức hợp tâm (central composit design) Tuy nhiên, mô hình Box - Bennken là mô hình bậc một với 3 mức thí nghiệm thấp, giữa và cao nên

ít được ứng dụng trong phân tích

Để mô hình tính toán có cực trị thì ít nhất phải là mô hình bậc hai trở lên trong

đó phổ biến nhất là xây dựng mô hình bậc hai và bậc 3 từ thực nghiệm

- Bậc 2 và bậc 3 đầy đủ (bậc hay còn gọi là mức thực nghiệm)

+ Bậc 2 đầy đủ: số hạng của phương trình hồi qui là: 2n

Trong đó: n là số yếu tố ảnh hưởng

2 là số mức được chọn đối với yếu tố

+ Bậc 3 đầy đủ: số các số hạng của phương trình hồi qui là: 3n

- Bậc 2 và bậc 3 rút gọn

+ Bậc 2 rút gọn: số các số hạng của phương trình hồi qui là: 2n-q

Trong đó: q là mức rút gọn

+ Bậc 3 rút gọn: số các số hạng của phương trình hồi qui là: 3n-q

Sau khi có phương trình hồi qui mô tả hàm mục tiêu, dựa vào hàm này để tìm điều kiện tối ưu bằng cách quay để loại ảnh hưởng tương hỗ của các biến sau đó lấy

đạo hàm theo từng biến và cho bằng 0 để tìm ra cực trị của hàm hoặc tối ưu hóa theo phương pháp đường dốc nhất

Trong phương pháp này mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và biến độc lập chưa xác định trước Vì vậy bước đầu tiên của phương pháp là xác định mối quan hệ gần đúng giữa hàm mục tiêu (kết quả thí nghiệm) và các biến (yếu tố ảnh hưởng) Sau khi

có mô hình gần đúng có thể tìm điều kiện tối ưu theo phương pháp đạo hàm hoặc phương pháp đường dốc nhất Để mô hình tính toán có cực trị thì ít nhất phải là mô hình bậc hai trở lên trong đó phổ biến nhất là xây dựng mô hình bậc hai và bậc 3 từ thực nghiệm

Để tìm điều kiện tối ưu của phương pháp phân tích bằng cách áp dụng RSM, có thể tóm tắt ngắn gọn các bước tiến hành như sau:

 Bước 1: Xác định các yếu tố ảnh hưởng chính và tìm điều kiện biên (hay khoanh

vùng các giá trị) của các yếu tố ảnh hưởng

 Bước 2: Chọn mô hình thực nghiệm và chuyển giá trị thực về giá trị mã hóa

Muốn tối ưu hóa các điều kiện phân tích thì đại lượng (tín hiệu phân tích, hiệu suất chiết chất phân tích ra khỏi mẫu, độ lệch chuẩn tương đối, độ phân giải…) phải có giá trị cực trị Do vậy mô hình bậc hai là phù hợp

 Bước 3: Lập ma trận thực nghiệm và làm thí nghiệm theo ma trận

Có thể sử dụng các phần mềm thống kê để thiết lập ma trận thực nghiệm bậc hai theo mô hình Box- Benhken hoặc mô hình phức hợp tâm

 Bước 4: Xử lý thống kê số liệu thực nghiệm

Các phần mềm thống kê hiện nay cho phép nhập các số liệu dưới dạng giá trị thực Các hệ số ảnh hưởng b của các biến trong phương trình hồi qui được biểu diễn như sau: y = X*b + e

Trong đó y là vec tơ của m kết quả thí nghiệm, X là ma trận qui hoạch thực nghiệm của các biến có kích thước mxn, b là vecto cột có n hàng (tương ứng

với n hệ số trong phương trình bậc hai), e là ma trận phần dư (residual)- phần

sai khác giữa kết quả tính theo mô hình và kết quả thực nghiệm

 Bước 5: Đánh giá tính phù hợp của mô hình

Tính phù hợp của mô hình được kiểm tra bằng ANOVA trên cơ sở đánh giá sự thay đổi kết quả thí nghiệm khi thay đổi các mức của các yếu tố khảo sát so với phương sai gây ra khi làm lại các thí nghiệm tại điểm tâm

1.5.2 Một số ứng dụng của mô hình RSM trong tìm điều kiện tối ưu quá trình

xử lý mẫu dược liệu

Mô hình RSM được ứng dung trong nghiên cứu tìm điều kiện chiết tối ưu để

chiết các hợp chất flavonoid trong Cỏ rắn Sabah (Clinacanthus nutans) Các thông số

chiết xuất tối ưu để thu hồi tối ưu hàm lượng phenolic bao gồm: tần số siêu âm (X1:

25 - 40 kHz), nhiệt độ (X2: 40 - 80 °C) và tỷ lệ rắn-dung môi (X3: 10 - 30 mL/g) đối với việc thu hồi flavonoid vitexin (Y1) và orientin (Y2) với thiết kế phức hợp xoay trung tâm (CCRD) đã được sử dụng Thông số tối ưu đạt được dựa trên sự kết hợp của các thông số chiết như sau: X1 = 25 kHz, X2 = 40°C và X3 = 15 g/mL Nồng độ hợp chất chiết xuất (orientin và vitexin) từ các thông số tối ưu đã tạo ra hàm lượng phenolic cao [43]

Trong nghiên cứu chiết xuất rutin từ lá của Đu đủ bằng cách sử dụng chiết vi sóng (MAE), chiết siêu âm (UAE), chiết siêu âm vi sóng tuần tự (MUAE) và phương pháp chiết vi sóng siêu âm tuần tự (UMAE) Ảnh hưởng của các thông số khai thác đến năng suất rutin đã được phân tích và so sánh bằng phương pháp bề mặt mục tiêu (RSM) sử dụng phần mềm Design Expert ® phiên bản 11, Minneapolis đã được sử dụng để thiết kế thử nghiệm Bốn yếu tố (thời gian chiết vi sóng, tỷ lệ chất rắn – dung môi, nồng độ ethanol/nước, kích thước hạt), ba cấp độ (-1, 0, 1), BBD với năm điểm trung tâm được tạo ra cho MAE và UAE Năm yếu tố (thời gian chiết vi sóng, thời gian chiết siêu âm, tỷ lệ chất rắn – dung môi, nồng độ ethanol/nước, kích thước hạt)

ba cấp độ (-1, 0, 1), BBD với tám điểm trung tâm được tạo cho UMAE và MUAE Trong điều kiện tối ưu hóa, MUAE và UMAE cho hiệu suất thu hồi rutin cao nhất lần lượt là 18,46 ± 0,64 mg/g và 18,43 ± 0,81 mg/g [25] Một nghiên cứu khác về

chiết xuất hợp chất phenolic từ lá Đu đủ bằng kỹ thuật chiết hỗ trợ vi sóng (MAE)

thời gian chiếu xạ, 2–8 phút; công suất vi sóng, 300–600 W; nồng độ dung môi, 40–70%v/v; tỷ lệ chất rắn/dung môi, 1:10–1:16 g/mL; và nhiệt độ, 50–80°C sử dụng thiết

kế phức hợp tâm mặt (FCCCD) Ba mươi lần chạy thử nghiệm ngẫu nhiên bao gồm sáu điểm trung tâm đã thu được thông qua FCCCD Kết quả cho thấy điều kiện MAE tốt nhất là: thời gian chiếu xạ ở 3 phút; công suất vi sóng 420 W; tỷ lệ thức ăn trên dung môi là 1: 12 g/mL; và nồng độ dung môi 56% ethanol/nước để đạt 102,59 mg GAE/g d.w tổng hàm lượng phenolic [55]

Khảo sát điều kiện tối ưu để xác định hàm lượng benzyl glucosinolate từ hạt Đu

đủ ứng dụng phương pháp bề mặt mục tiêu (RSM) với các yếu tố ảnh hưởng được

khảo sát bao gồm nồng độ ethanol chiết, tỷ lệ rắn-lỏng, thời gian chiết xuất và nhiệt

độ chiết xuất đến năng suất chiết xuất của benzyl glucosinolate Kết quả được phân tích bởi phần mềm Design Expert 8.0.6 Các điều kiện chiết xuất tối ưu của benzyl glucosinolate như sau: nồng độ ethanol 73%, tỷ lệ rắn-lỏng 1: 13 g/mL, thời gian chiết 70 phút, nhiệt độ chiết 83 °C, trong 3 lần Trong những điều kiện này, hàm lượng benzyl glucosinolate đạt 1,675%, có sự khác biệt nhỏ so với giá trị tối ưu lý

Các flavonoid có hoạt tính quan trọng và có mặt chủ yếu trong lá Đu đủ là manghaslin, clitorin, rutin và nicotiflorin Chứng tỏ bốn hoạt chất trên là những hoạt chất chính, có hàm lượng lớn trong lá Đu đủ Do vậy, bốn hoạt chất này được lựa chọn là bốn hoạt chất chính để xây dựng phương pháp định lượng QAMS

Phần tổng quan nghiên cứu cho thấy phương pháp phổ biến để phân tích các chất trong lá Đu đủ là phương pháp sắc ký và nhiều nhất là sử dụng phương pháp sắc