Nghiên cứu phân lập, xác Định cấu trúc và Đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất từ một số loài eupatorium của việt nam

Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất từ một số loài Eupatorium của Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Tô Phương Linh

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT TỪ MỘT SỐ

LOÀI EUPATORIUM CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2022

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Tô Phương Linh

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC HỢP CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI

EUPATORIUM CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 8440112.02

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phan Minh Giang

PGS.TS Vũ Ngọc Toán

Hà Nội - 2022

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phan Minh Giang và PGS TS Vũ Ngọc Toán đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự dìu dắt nhiệt tình, tận tụy của các thầy cô trong Khoa Hóa học, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội trong suốt thời gian tôi học tập

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các học viên cao học, nghiên cứu sinh và các bạn sinh viên trong Phòng thí nghiệm Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện Luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2022 Học viên cao học

Tô Phương Linh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU i

DANH MỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ ii

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC iii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về họ Cúc (Asteraceae) 3

1.2 Chi Eupatorium 4

1.3 Đặc điểm thực vật, phân bố và công dụng loài Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng.) 6

1.4 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Eupatorium 7

1.4.1 Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng.) 7

1.4.2 Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) 12

1.4.3 Yên bạch nhật (Eupatorium japonicum Thunb.) 15

1.4.4 Bả dột (Eupatorium triplinerve Vahl.) 16

1.4.5 Eupatorium clematideum Griseb (syn Eupatorium catarium Veldkamp)17 1.4.6 Yên bạch lá kim (Eupatorium capillifolium Lam Small.) 18

1.5 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học của chi Eupatorium 18

1.5.1 Hoạt tính gây độc tế bào 18

1.5.2 Hoạt tính kháng nấm, diệt côn trùng và kháng khuẩn 18

1.5.3 Hoạt tính chống viêm 19

1.5.4 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và acetylcholinesterase 19

1.5.5 Một số hoạt tính khác 20

1.5.6 Hoạt tính sinh học của loài Eupatorium adenophorum 20

Chương 2 THỰC NGHIỆM 24

2.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng 24

2.1.1 Hóa chất, dụng cụ 24

2.1.2 Thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp điều chế phần chiết nước 24

2.2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 25

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ 28

2.3 Nguyên liệu thực vật 29

2.3.1 Điều chế phần chiết nước từ lá cây Eupatorium adenophorum 30

2.3.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng các phân đoạn AAW 30

2.3.3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn AAW60 30

2.3.4 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn AAW100 32

2.4 Hằng số vật lí và dữ liệu phổ của các hợp chất được phân lập 34

2.5 Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 37

2.6 Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym acetylcholine esterase (AChE) 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Nguyên liệu thực vật 40

3.2 Điều chế phần chiết nước từ lá cây Cỏ lào đỏ 40

3.3 Phân tách phần chiết nước 42

3.3.1 Phân lập các hợp chất 94-103 42

3.3.2 Xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập 43

3.4 Hoạt tính ức chế enzym -glucosidase 54

3.5 Hoạt tính ức chế enzym acetylcholine esterase 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 66

PHẦN PHỤ LỤC 67

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU

TLC (Thin-layer Choromatography): Sắc kí lớp mỏng

CC (Column Choromatography): Sắc kí cột

FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh

Mini-C (Mini-Column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế

NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13

DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer): Phổ DEPT

δ: Độ dịch chuyển hóa học (ppm)

IC50 (half maximal inhibitory concentration): Nồng độ ức chế tối đa một nửa

MIC (minimum inhibitory concentration): Nồng độ ức chế tối thiểu

MBC (minimum bactericidal concentration): Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

AChE: Acetylcholinesterase

ESI-MS (Electron Inoniziation-Mass Spectroscopy): Phổ khối phun sương mù điện

tử

COSY (Homonuclear Correlated Spectroscopy): Phổ COSY

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Phổ tương tác trực tiếp H-C HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation): Phổ tương tác hạt nhân qua nhiều liên kết

NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser

DANH MỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Hình 1.1: Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng.) 6

Sơ đồ 1: Sơ đồ phân tách các hợp chất từ phân đoạn AAW60 33

Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế phần chiết nước (AAW) 41

Hình 3.1 Cấu trúc các hợp chất 94-103 43

Hình 3.2 Các tương tác HMBC chính của hợp chất 98a 47

Hình 3.3 Các tương tác HMBC chính của hợp chất 100 49

Hình 3.4 Các tương tác COSY và HMBC chính của hợp chất 103 53

Hình 3.5 Các tương tác NOESY chính của hợp chất 103 54

Bảng 3.1: Hoạt tính ức chế -glucosidase của hai chất 100 và 101 55

Bảng 3.2: Hoạt tính ức chế AChE của hai chất 100 và 101 57

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Trang

Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của của hợp chất 4-hydroxybenzoic acid (94) 68

Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR của của hợp chất methyl 3,4-dihydroxybenzoate (95) 69

Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của của hợp chất isovanillic acid (96) 70

Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của của hợp chất 5-O-glucopyranosylthymol (97) 71

Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR của của hợp chất 5-O-glucopyranosylthymol (97) 72

Phụ lục 6: Phổ HSQC của của hợp chất 5-O-glucopyranosylthymol (97) 73

Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR của của hợp chất o-coumaric acid (98a) và p-coumaric acid (98b) 75

Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR của của hợp chất o-coumaric acid (98a) và p-coumaric acid (98b) 76

Phụ lục 9: Phổ HMBC của của hợp chất o-coumaric acid (98a) và p-coumaric acid (98b) 77

Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR của của hợp chất 2-O-β-D-glucopyranosylcinamic acid (99) 79

Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR của của hợp chất gossypetin 5-O-(6″-(E)-caffeoyl)- -D-glucopyranoside (100) 81

Phụ lục 12: Phổ 13C-NMR của của hợp chất gossypetin 5-O-(6″-(E)-caffeoyl)- -D-glucopyranoside (100) 82

Phụ lục 13: Phổ ESI-MS (+) của của hợp chất gossypetin 5-O-(6″-(E)-caffeoyl)- -D-glucopyranoside (100) 83

Phụ lục 14: Phổ ESI-MS (-) của hợp chất quercetagetin 7-O--D-glucopyranoside (101) 84

Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR của của hợp chất quercetagetin 7-O--D-glucopyranoside (101) 86

Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR của của hợp chất β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside (102a) và stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside (102b) 88

Phụ lục 17: Phổ HR-ESI-MS của của hợp chất 4α,12-epoxy-7β-hydroxycadinan-2-one (103) 89

Phụ lục 18: Phổ 1H-NMR của của hợp chất 4α,12-epoxy-7β-hydroxycadinan-2-one (103) 91

Phụ lục 19: Phổ 13C-NMR của của hợp chất 4α,12-epoxy-7β-hydroxycadinan-2-one

có nền y học cổ truyền lâu đời Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 85% - 90% dân số trên thế giới sử dụng các loại dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên để chữa bệnh Tác dụng điều trị thường được xác định dựa trên các hợp chất có hoạt tính sinh học, do đó việc nhận dạng được các hợp chất này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng Ở nước ta, có khoảng 3.200 loài có giá trị làm thuốc, tuy nhiên phần lớn các loài này hiện còn chưa được nghiên cứu một cách đầy

đủ ở Việt Nam, nhất là về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học gây ra hạn chế trong việc tận dụng nguồn tài nguyên quý giá này trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và nông nghiệp

Các loài trong chi Mần tưới (Eupatorium L.) thuộc họ Cúc (Asteraceae) được

người dân sử dụng phổ biến trong một số bài thuốc dân gian để chữa một số bệnh như giảm sưng, đau do mụn nhọt, hoạt huyết, điều kinh, giải nhiệt… ở Việt Nam và

trên thế giới Một số loài Eupatorium có ở Việt Nam đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới bao gồm Cỏ lào (E odorata L.), Mần tưới (E fortunei), Yên bạch Nhật (E japonicum Thunb.), Bả dột (E triplinerve Vahl.) [3]

Cây Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng., syn Ageratina adenophora (Spreng.) King & Robinson) thuộc chi Mần tưới (Eupatorium L.), họ

Cúc (Asteraceae) là một loài cây xâm lấn, hiếm bị tấn công bởi vi khuẩn, vi nấm và côn trùng, cho thấy có sự tồn tại của một hệ chất chuyển hóa thứ cấp tạo thành cơ chế bảo vệ và xâm lấn của loài thực vật này Là đối tượng được chú ý trong các nghiên cứu về thành phần hóa học liên quan đến hoạt tính sinh học và sinh thái học

E adenophorum đã được nghiên cứu ở nhiều nước tuy nhiên các nghiên cứu tương

tự chưa được thực hiện trên đối tượng của Việt Nam Ngoài ra các nghiên cứu về

hóa học cũng chỉ được thực hiện chủ yếu với các phần chiết hữu cơ, các hợp chất được chiết tách vào pha nước chưa được nghiên cứu trên thế giới Hai loài

Eupatorium clematideum Griseb (syn Eupatorium catarium J.F Veldkamp, Praxelis clematidea (Griseb.) R.M.King & H.Rob.) và Yên bạch lá kim

(Eupatorium capillifolium Lam Small.) chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam và

trên thế giới Hai loài này cũng được đưa vào sàng lọc về hóa học để chọn lựa được mẫu cho nghiên cứu sâu về các thành phần hoạt chất

Mục tiêu của nghiên cứu này là sử dụng các phương pháp chiết, phân tách sắc ký để phân lập được các hợp chất từ các phần chiết của hai loài Eupatorium clematideum Griseb và Yên bạch lá kim (Eupatorium capillifolium Lam Small.) và phần chiết nước từ loài Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng.) và xác định

cấu trúc của các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp phổ Qua nghiên cứu sàng lọc các phần chiết từ E clematideum Griseb và Yên bạch lá kim (E capillifolium) chỉ dẫn đến việc phân lập được một vài hợp chất ent-kaurane

diterpene và taraxasterane triterpene và một số hợp chất khác (flavonoid, acid béo)

do lượng mẫu thực vật thu được nhỏ, do đó sau sàng lọc hóa học nghiên cứu tập

trung chủ yếu vào phần chiết nước từ loài Cỏ lào đỏ (E adenophorum)

Các nội dung chính của nghiên cứu này là:

- Điều chế phần chiết nước từ lá cây Cỏ lào đỏ

- Sử dụng các kĩ thuật sắc kí phân tích, điều chế, tinh chế để phân lập được các hợp chất từ phần chiết nước

- Sử dụng các phương pháp phổ (MS, NMR) để xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập

- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học (ức chế enzym α-glucosidase và

acetylcholine esterase) của các hợp chất được phân lập

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về họ Cúc (Asteraceae)

Họ Cúc (Compositae hay Asteraceae) là một trong những họ lớn nhất của ngành Mộc lan (Magnophyta, Thực vật hạt kín - Angiospermae) Họ Cúc có khoảng

1550 chi với 23000 loài [56], đóng vai trò quan trọng trong hệ thực vật thế giới cũng như hệ thực vật Việt Nam

Đặc điểm hình thái

Họ Cúc gồm nhiều chi, nhiều loài, sống ở khắp nơi và trong các môi trường khác nhau, là họ ở vị trí tiến hóa cao nhất, do đó rất đa dạng và phức tạp Phần lớn các cây trong họ đều là cây thân cỏ hàng năm hoặc lâu năm, kích thước nhỏ bé, chủ yếu là cây bụi, ít cây gỗ lớn, một số loài leo trườn hoặc là cây thủy sinh

Lá: phiến lá ít nguyên, thường khía răng hay chia thùy Hình thái lá rất đa

dạng và hiện tượng dị hình rất phổ biến nên không thể chỉ căn cứ vào hình thái lá để phân biệt giữa các chi Ở nước ta có các dạng lá: lá đơn nguyên, có thùy, phân thùy,

xẻ thùy và lá kép

Hoa: luôn tập hợp thành cụm hoa đầu hoặc rổ, các cụm hoa đầu có thể nằm

đơn độc hoặc thành chùm, là hoa lưỡng tính nhưng nhiều khi do bộ nhị, bộ nhụy không phát triển, trên cụm hoa có hoa cái, hoa đực hay hoa vô tính

Đài hoa: có cấu tạo rất khác nhau, không có dạng lá và số lượng không cố

định trên mỗi hoa Đa số biến thành mào lông (chùm lông ở đỉnh quả) hoặc mất hẳn

ở một số chi

Bộ nhị: gồm 5 nhị bằng nhau, có chỉ nhị luôn đính vào ống tràng và rời nhau,

còn bao phấn đính với nhau thành một ống và mở dọc theo kẽ nứt phía trong (trừ một số ít trường hợp có bao phấn rời, gốc bao phấn có tai, gốc bao phân cụt…)

Bộ nhụy: gồm 2 noãn luôn dính lại làm thành bầu dưới 1 ô, trong chứa noãn

đảo, đính ở đáy Vòi nhụy 1, gốc vòi có triền tuyến mật Đầu vòi nhụy 2 luôn xẻ 2 thùy sâu, phía trong có các núm để tiếp nhận hạt phấn Hình dạng núm nhụy ổn định, là dấu hiệu khác biệt giữa các chi nên được dùng làm tiêu chuẩn để phân biệt các tông và các chi của họ Cúc

Quả: là quả bế, chỉ có 1 hạt Vỏ hạt mỏng, phôi lớn và thẳng, không có nội

nhũ Sự đa dạng của quả và mào lông trên đỉnh quả mà họ Cúc có nhiều cá thể, phát tán xa và rộng khắp

Phân bố và sinh thái

Họ Cúc ở Việt Nam có biên độ sinh thái loài rộng, có thể bắt gặp các đại diện của chúng ở nhiều nơi Nhưng dưới tác động của tự nhiên, sự phân bố của các chi

và loài trong họ Cúc theo đai địa hình được thống kê lại:

Đai địa hình núi thấp: (600 - 1600) m 55 chi 132 loài Đai địa hình núi trung bình: (1600 - 2600) m 56 chi 145 loài

Sự phân bố thực vật họ Cúc tập trung tiêu biểu ở khu vực có điều kiện khí hậu á nhiệt đới và ôn đới

Giá trị sử dụng

Trong tổng số 374 loài, thì có 181 loài đã biết giá trị sử dụng:

- Cây dùng làm thuốc: hoang dại có 85 loài, nhập trồng 16 loài

- Cây trồng làm cảnh: 30 loài

- Cây làm rau ăn: 31 loài mọc tự nhiên, 4 loài trồng

- Cây làm thuốc trừ sâu: 3 loài

- Cây cho dầu béo và tinh dầu: 12 loài

1.2 Chi Eupatorium

Thuộc tông Eupatorieae, có 1200 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

châu Mĩ, châu Á, châu Phi và được biết đến như nguồn phong phú cung cấp các hợp chất flavonoid và terpenoid có hoạt tính sinh học

Eupatorium là một chi lớn, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, một

số loài ở châu Phi và châu Á Cụ thể, ở Nhật Bản (1965) đã ghi nhận được 5 loài

Eupatorium bao gồm E chinense, E lindleyanum, E fortunei, E variabile, E yakushimense Thực vật chí Hong Kong ghi nhận được 4 loài thuộc chi Eupatorium bao gồm E odoratum, E lindleyanum, E chinese, E japonicum [50] Năm 2011, Chen Y khi nghiên cứu hệ thực vật Trung Quốc ghi nhận được 14 loài: E amabile,

E cannabinum, E chinense, E fortunei, E formosanum, E japonicum, E heterophyllum, E hualienense, E lindleyanum, E luchuense, E nanchuanense, E omeiense, E tashiroi, E shimadae [48]

Bên cạnh đó, Địa lý thực vật của chi cũng được tiến hành nghiên cứu chi tiết Năm 1998, Watanabe K và cộng sự nghiên cứu về phát sinh chủng loại và địa lý

phát sinh của chi Eupatorium bao gồm 23 loài ở Đông Nam của Bắc Mỹ, 25 loài ở

Đông Á và 1 loài ở châu Âu Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về chi Mần

tưới (Eupatorium) đầu tiên phải kể đến công trình của Loureiro D J khi nghiên cứu

hệ thực vật miền nam Việt Nam (1970) đã mô tả 2 loài E purpureum và E sinuatum Sau đó, Gagnepain F (1922) khi nghiên cứu hệ thực vật Đông Dương, đã

mô tả 6 loài trong chi Mần tưới (Eupatorium) là E odoratum L., E ayapana Vent.,

E staechadosmum Hance., E reevesii Wall., E nodiflorum, E quternum DC [48,

50]

Năm 2003, Nguyễn Tiến Bân đã ghi nhận 10 loài trong chi Mần tưới

(Eupatorium) bao gồm E cannabium L., E capillifolium (Lamk.) Small, E chinense L., E coelestinum L., E fortunei Turcz., E heterophyllum DC., E japonicum Thunb., E lindleyyanum DC., E odoratum L., E triplinerve Vahl [1] Năm 2003, Phạm Hoàng Hộ bổ sung thêm 2 loài E quaternum DC và E reesesii Wall, đồng thời mô tả 12 loài Eupatorium này [5]

Công dụng dân gian của một số loài thuộc chi Eupatorium ở Việt Nam Cây Hương thảo (E fortunei) dùng trừ bọ gà, mạt gà, bọ chét, rệp, mọt, chấy,

rận, chữa kinh nguyệt không đều, các chứng đau bụng huyết ứ, sau đẻ máu hôi

không sạch, chữa mụn nhọt, chốc lở, chấn thương Cây Yên bạch Nhật (E japonicum) thường dùng trị ho do phong hàn, đau lưng do hàn thấp, kinh nguyệt

không đều, dùng dạng thuốc sắc, tán bột uống hoặc giã đắp ngoài Cây Trạch lan

Trung Quốc (E chinense) thường được dùng trị bệnh bạch hầu, viêm hạch, cảm

mạo, sốt cao, viêm phổi, viêm khí quản, thấp khớp, mụn nhọt, rắn cắn [2]

1.3 Đặc điểm thực vật, phân bố và công dụng loài Cỏ lào đỏ (Eupatorium

adenophorum Spreng.)

Tên khoa học: Eupatorium adenophorum Spreng

Tên đồng nghĩa: Ageratina adenophora (Spreng.) R.M.King & H.Rob Phân lớp thực vật

Eupatorium adenophorum Spreng là cây thân thảo lâu năm, chiều cao có tối

đa 1,5 m, thân cây có màu đỏ tía, mọc thẳng, có lông nhung Lá mọc đối, hình trứng đến hình tam giác, dài 7-10 cm, rộng 4-7 cm, đầu lá thuôn nhọn, gốc lá tù hoặc hình nêm Phiến lá có nhiều lông ở cả 2 mặt, mang 3 gân chính nổi bật, mép lá khía tai bèo, cuống lá dài 4-5cm, các lá nhỏ dần cho tới cụm hoa Cụm hoa kép dạng ngù, đầu cụm dài khoảng 6,5 mm, đường kính 6 mm, cuống hoa dài 8-14 mm, có nhiều lông dày đặc, tổng bao hình trụ dài 3-4 mm, có khoảng 25 lá bắc xếp thành 3 hàng Mỗi cụm hoa mang trung bình 70-80 hoa màu trắng Quả bế màu đỏ nâu đến đen, dài 1,5 mm, không có lông

Hình 1.1: Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng.)

Phân bố và sinh thái

Eupatorium adenophorum, thường được gọi là cỏ dại crofton hoặc snakeroot

dính, là một loài thực vật có hoa trong họ daisy có nguồn gốc từ Mexico và Trung

Mỹ Ban đầu được người dân trồng và coi như một cây cảnh, nhưng đây là một loài cây ngoại lai xâm hại đất nông nghiệp và đất hoang trên toàn thế giới Nó là độc hại đối với ngựa, gây lên các bệnh hô hấp khi ngựa ăn phải [39]

Khả năng phát tán, thân cây có thể nảy mầm rễ và phát triển khi tiếp xúc với đất Các hạt giống cũng được đưa đi bởi gió hoặc nước Hạt cũng có thể được phát tán nhờ sự dịch chuyển của động vật và con người [39]

Công dụng trong y học cổ truyền

Eupatorium adenophorum đã được sử dụng từ xa xưa trong nền y học cổ

truyền thế giới Ở một số vùng kém phát triển, người dân sử dụng nó như một chất

có khả năng giảm đau, hạ sốt, kháng khuẩn, làm đông máu Ở Trung Quốc, E adenophorum từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền để việc điều trị các vết

thương, tiểu đường, nhiễm khuẩn, kiết lỵ,… Người dân bản địa vùng Himalaya sử dụng cao chiết từ lá cây Cỏ lào đỏ để cầm máu cho các vết thương [15] Ở Nigeria,

lá của cây được dùng để điều trị bệnh tiểu đường và hạ sốt [9] Sử dụng dịch chiết

từ lá cây có thể chữa bệnh kiết lỵ, lở miệng và lở loét ngoài da [10] Người Naga ở Manipur theo truyền thống lấy nước ép của lá tươi hoặc bột khô để hạ nhiệt độ cơ thể [46] Nước ép lá cây còn được dùng để điều trị các bệnh về dạ dày, gan, túi mật, tiểu đường, ung thư và chứng suy nhược cơ thể [7]

1.4 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Eupatorium

1.4.1 Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng.)

Năm 2013, khi nghiên cứu các thành phần trong cây Eupatorium adenophorum, Zhang M và cộng sự đã phân lập được các hợp chất 5-O-trans-o-

coumaroylquinic acid methyl ester (1), chlorogenic acid methyl ester (2), macranthoin F (3) và macranthoin G (4), trong đó các hợp chất 2, 3, và 4 lần đầu

tiên được phân lập Tất cả các hợp chất đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn in vitro

đối với 5 chủng vi khuẩn khảo nghiệm, đặc biệt là chất 3 và 4 cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn đối với Salmonella enterica với giá trị MIC lần lượt là 7,4 và 14,7 μM

Hợp chất (1) còn cho thấy hoạt tính kháng nấm in vitro chống lại sự nảy mầm của

bào tử Magnaporthe grisea với giá trị IC50 là 542,3 µM [65]

Năm 2018, từ các phần chiết của rễ loài E adenophorum, Zheng G và các

cộng sự đã phân lập được 10 hợp chất bao gồm 7-hydroxydehydrotremetone (5),

7,10,11-trihydroxydehydrotremetone (6), 10-oxo-7-hydroxynordehydrotremetone (7), 5β-glucosyl-7-demethoxy-encecalin (8), 8-hydroxy-8β-glucosyl-2-carene (9),

encecalin (10), 4-hydroxybenzoic acid (11), emodin (12), epifriedelanol (13) và stigmasterol (14) Các hợp chất được đem thử hoạt tính chống nấm trong đó hợp chất 5 cho thấy hoạt tính ức chế đáng kể trên tất cả các chủng nấm thử nghiệm với

đường kính vùng vô khuẩn trong khoảng 13,90±1,05 mm tới 17,28±0,46 mm ở 50 mg/đĩa, cho thấy hợp chất này có thể hoạt động như một chất bảo vệ trong phần rễ

của E adenophorum [67]

Năm 2018, Lou B và các cộng sự đã phân lập được một monoterpene mới là

2α-methoxy-3β-methyl-6-O-acetylmethyl-2,3-dihydrobenzofuran (15) và một

sesquiterpene mới là

1,6-dihydroxy-1-isopropyl-4,7-dimethyl-3,4-dihydronaphthalen-2(1H)-one (16) cùng với 4 hợp chất khác là eupatorenone (17), 3-hydroxymuurola-4,7(11)-dien-8-one (18), 9-oxogeraphorone (19) và (4R,5S)-4-

hydroxy-5-isopropyl-2-methyl-2-cyclohexenone (20) từ dịch chiết ethyl acetate của

rễ cây E adenophorum Trong đó, các hợp chất 15, 17 và 18 thể hiện khả năng ngăn

chặn sự phát triển của vi khuẩn in vitro chống lại 3 loại vi khuẩn Gram-(+) với các giá trị MIC nằm trong khoảng 12,5 đến 50 µg/mL [35]

Năm 2021, từ dịch chiết petroleum ether của E adenophorum, Liang X và

các cộng sự đã phân lập được 3 sesquiterpene mới là eupatorinonen A-C (21-23) và một số hợp chất khác bao gồm 9-oxo-10,11-dehydroageraphorone (24), muurol-4- en-3,8-dione (25), 9-hydroxyageraphorone (26), amorph-4-en-3,8-dione (27), (-)- isochaminic acid (28), 1-[8-hydroxy-2,2-dimethyl-2(H)-chromen-6-yl]ethan-1-one (29) Các hợp chất (21), (23), (25) có thể tăng khả năng hấp thu glucose trong các tế

bào L6 lần lượt là 1,42, 1,21 và 1,60 lần [33]

Năm 2021, Zhang M và các cộng sự đã phân lập được 3 dẫn xuất thymol

mới: 7-formyl-9-isobutyryloxy-8-hydroxythymol (30), 7,9-di-isobutyryloxy-8,10-

dehydrothymol (31), 2α-methoxy-3β-methyl-6-methylol-2,3-dihydrobenzofuran (32), cùng với một số hợp chất như 2α-methoxy-3β-methyl-6-O-(acetylmethyl)-2,3-

dihydrobenzofuran (33), 7,8,9-trihydroxythymol (34), 7,9-diisobutyryloxy-8- ethoxythymol (35), 7-acetoxy-9-isobutyryloxy-8-methoxythymol (36) và 7,9-di-

isobutyryloxy-8-methoxythymol (37) từ loài E adenophorum Các hợp chất đã cho

thấy hoạt tính kháng khuẩn in vitro một cách chọn lọc đối với ba chủng vi khuẩn

Gram-(+) và hai chủng vi khuẩn Gram-(-) Hợp chất 30 và 34 còn thể hiện khả năng

gây độc tế bào in vitro chống lại ba dòng tế bào gây u ở người như MCF-7,

NCL-H460 và HeLa với các giá trị IC50 nằm trong khoảng từ 7,45 đến 28,63 nM cho thấy

tiềm năng của E adenophorum trở thành một nguồn các hợp chất thiên nhiên có

hoạt tính sinh học có giá trị trong các ứng dụng y học [66]

1.4.2 Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.)

Năm 2013, từ dịch chiết methanol của loài E fortunei, Chen Y và các cộng

sự đã phân lập được 1 hợp chất triterpene mới 3β-hydroxy-30-norurs-21-en-20-one

(38) và một số hợp chất khác bao gồm 2 sesquiterpene eudesmane: 4(14)-en-1,7-diol (39) và 6α-epieudesm-4(14)-en-6-ol (40), 4 monoterpene:

1β,7α-eudesm-(1S,2S,4R,5S)-2,5-dihydroxy-p-menthane (41),

(1R,2S,4S,5R)-2,5-dihydroxy-p-menthane (42), (1S,2R,4S,5S)-2,5-dihydroxy-p-(1R,2S,4S,5R)-2,5-dihydroxy-p-menthane (43), glucopyranoside (44) và p-cymene-7-yl-β-D-glucopyranoside (45) [17]

thymol-3-O-β-D-Năm 2014, Wang Y và cộng sự đã tìm ra 2 dẫn xuất thymol mới,

9-angeloyloxythymol (46) và 8-hydroxyl-9-angeloyxythymol (47) và 5 dẫn xuất

thymol đã biết, bao gồm 5α-hydroxy-2-oxo-p-menth-6-ene (48), eupatobenzofuran (49), 9-O-angeloyl-8,10-dehydrothymol (50) và 9-hydroxythymol (51) từ dịch chiết

methanol của loài E fortunei Các hợp chất này đã được thử nghiệm khả năng ức

chế sự sản sinh nitric oxide (NO) gây ra bởi lypopolysaccharide (LPS) trong các tế bào BV-2 ở chuột [63]

Năm 2019, khi nghiên cứu thành phần dịch chiết MeOH lá và cành của loài

Mần tưới (E fortunei) được thu hái ở miền Bắc Việt Nam, Giang P và các cộng sự

đã phân lập được 5 dẫn xuất thymol bao gồm

9-O-angeloxy-10-hydroxy-8-methoxythymol (53), 10-acetoxy-9-chloro-8,9-dehydrothymol (54), 9-acetoxy-8,10

epoxythymol-3-O-isobutyrate (55), 8,10-epoxy-9-hydroxythymol-3-O-tiglate (56)

và 9-acetoxy-8,10-epoxythymol-3-O-angelate (57) và các hợp chất khác bao gồm taraxasteryl acetate (58), o-coumaric acid (59), trans-melilotoside (60), (–)-loliolide

(61) và coumarin (62) [44]

Năm 2021, 5 hợp chất mới là eupatodibenzofuran A (63), eupatodibenzofuran B (64), 6-acetyl-8-methoxy-2,2-dimethylchroman-4-one (65), eupatofortune (66) và eupatodithiecin (67) đã được Chang C và các cộng sự phân

lập từ loài E fortunei Hợp chất (63) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với các

dòng tế bào ung thư phổi A549 và tế bào ung thư vú MCF-7 với các giá trị IC50 lần

lượt là 5,95±0,89 và 5,55±0,23µM [14]

1.4.3 Yên bạch nhật (Eupatorium japonicum Thunb.)

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Eupatorium japonicum còn

khá hạn chế Năm 1980, Nakajima S khi nghiên cứu dịch chiết lá đã phân lập được

hợp chất euponin (68) Hợp chất này có khả năng ức chế sinh trưởng của trứng và

ấu trùng loài Drosophila melanogaster [38]

Năm 2021, Giang P và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần dịch chiết

MeOH lá của loài Yên bạch Nhật (E japonicum) ở Việt Nam và phân lập được các

hợp chất phytosterol, terpenoid, phenolic acid, flavonoid, alcohol béo và acid béo, trong số đó các hợp chất eupatoriopicrin (70), 1-hydroxy-8-(4,5- dihydroxytigloyloxy)eudesma-4(15),11(13)-dien-6,12-olide (71) đã được thử

nghiệm hoạt tính chống ung thư và chống viêm Kết quả cho thấy khả năng ức chế

sự tổng hợp NO và sự phát triển của các dòng tế bào ung thư người HepG2 và MCF-7 [22]

1.4.4 Bả dột (Eupatorium triplinerve Vahl.)

Năm 2012, Enos T và cộng sự đã phân lập được 7-methoxycoumarin (71) từ

dịch chiết MeOH của lá loài Eupatorium triplinerve Hợp chất này có hoạt tính ức

chế sự hình thành sắc tố melanin ở da ở tế bào B16 bằng cách tác động lên hoạt tính của enzym tyrosinase [8]

Năm 2015, Sugumar N cùng cộng sự đã phân tích được 30 hợp chất trong

tinh dầu các phần trên mặt đất của loài E triplinerve, trong số đó methoxybenzene (72) chiếm 74,3% và β-selinene (73) chiếm 8,6% là các thành

2-tert-butyl-1,4-phần chính Đồng thời, các tác giả cũng nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu trên cho thấy sự ức chế vi khuẩn Gram (+), Gram (-) ở mức độ trung bình

và kháng nấm mạnh [53]

Năm 2020, Huong D và cộng sự đã nghiên cứu dịch chiết lá MeOH của loài

Bả dột và đã phân lập được 10 hợp chất trong đó các chất thymoquinol

5-O-β-D-glucopyranoside (74), (E)-4-hydroxy-2-methoxycinnamic acid (75), thyrsifloside (76), (E)-4-methoxymelilotoside (77) và kaempferol 3,7-di-O-β-D-glucopyranoside

(78) lần đầu tiên được phân lập từ loài này tại Việt Nam Ngoài ra trong thử nghiệm

in vitro về khả năng ức chế enzym α-glucosidase, một số hợp chất phân lập được

cho thấy triển vọng ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường [20]

1.4.5 Eupatorium clematideum Griseb (syn Eupatorium catarium Veldkamp)

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Eupatorium clematideum

Griseb rất hạn chế Shiming D và các cộng sự đã lần đầu tiên phân lập được 5 hợp

chất flavonoid từ loài này bao gồm 5,6,7,4′-tetramethoxyflavone (79), 5,6,4′-trimethoxyflavone (80), 4′-hydroxy-5,6,7-trimethoxyflavone (81), 5,4′- dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone (82) và 5,7,4′-trihydroxy-6-methoxyflavone (83)

7-hydroxy-[49] Năm 2014, Wang L và các cộng sự đã báo cáo về thành phần tinh dầu của lá

cây E clematideum bao gồm caryophyllene (15,22%) (84), germacrene D (8,48%)

(85), (-)-spathulenol (8,26%) (86), isoledene (8,19%) (87) [62]

1.4.6 Yên bạch lá kim (Eupatorium capillifolium Lam Small.)

Khi nghiên cứu về thành phần hóa học trong tinh dầu của loài Eupatorium capillifolium, Tabanca N và các cộng sự đã đưa ra các thành phần chính bao gồm

thymol methyl ether (methyl thymol) (36,3%) (88), 2,5-dimethoxy-p-cymene

(20,8%) (89) và myrcene (15,7%) (90) Các thành phần này còn được báo cáo có tác

dụng đuổi muỗi Aedes aegypti - loài muỗi gây ra các bệnh sốt vàng da, sốt xuất

huyết [55]

1.5 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học của chi Eupatorium

1.5.1 Hoạt tính gây độc tế bào

Nhiều hợp chất của chi Eupatorium đã được thử nghiệm gây độc tế bào Acacetin phân lập từ loài E odoratum và E sternbergianum cho thấy hoạt tính

kháng tế bào ung thư phổi ở người (NCI-H187) với giá trị IC50 là 24,6 µM [54];

trong khi luteolin từ loài E odoratum và E lindleyanum thể hiện độc tính với tế bào

ung thư vú người (BC) với giá trị IC50 là 38,4 µM Một số sesquiterpene lactone

được phân lập từ hoa và rễ của E betonicaeforme thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

ung thư máu người HL-60 cao với giá trị IC50 từ 3,9 đến 9,9 µM [54]

1.5.2 Hoạt tính kháng nấm, diệt côn trùng và kháng khuẩn

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các cadinane sesquiterpe từ E adenophorum

góp phần vào hoạt tính kháng nấm chống lại các loại nấm gây bệnh Hợp chất diepicadin-4-ene-3,8-dione từ loài này thể hiện giá trị ED50 với Sclerotium rolfsii

1,7-và Rhizoctonia solani tương ứng là 181,60±0,58 µg/mL 1,7-và 189,74±1,03 µg/mL

Tinh dầu từ loài E adenophorum cũng đã được báo cáo về hoạt tính kháng các loài

vi khuẩn Arthrobacter protophormiae, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Rhodococcus rhodochrous và Staphylococcus aureus với các giá trị MBC lần lượt

là 200; 100; 100; 12,5 và 200 µg/mL Chất isosakuranetin được phân lập từ tinh dầu của loài E capillifolium thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis với giá trị MIC 174,8 µM [29]

1.5.3 Hoạt tính chống viêm

Dịch chiết MeOH của E adenophorum được dùng theo đường tĩnh mạch và

dùng tại chỗ tại nơi xảy ra phản ứng quá mẫn gây bởi fluorodinitrobenzene Vai trò

chống viêm của E adenophorum được cho là kết quả của việc ức chế tạo gốc .OH [59] Ba hợp chất kháng viêm hispidulin, jaceosidin và nepetin đã được phân lập được từ dịch chiết CH2Cl2 của loài E arnottianum, có khả năng làm giảm chứng phù nề tai ở chuột hiệu quả [19]

1.5.4 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase và acetylcholinesterase

Nghiên cứu khả năng ức chế enzym α-glucosidase của các thành phần hóa

học trong thực vật có thể đưa ra giải pháp trong điều trị bệnh đái tháo đường tuýp II Tuy nhiên, hoạt tính sinh học này chưa được nghiên cứu nhiều ở các loài thuộc chi

Eupatorium Trong một nghiên cứu năm 2020, Huong D và các cộng sự đã nghiên cứu thử nghiệm in vitro khả năng ức chế α-glucosidase của một số hợp chất phân lập được từ dịch chiết MeOH lá cây E triplinerve Kết quả cho thấy các hợp chất

ayapanin (91), ayapin (92) và (E)-4-hydroxy-2-methoxycinnamic acid (75) ức chế

tương ứng 40%, 46% và 81% hoạt tính enzym ở nồng độ 256 g/mL Giá trị IC50

thấp nhất được xác định là của hợp chất 75, IC50 58,65±1,20 µg/mL (302 M) so với chất đối chứng acarbose IC50 197,33±2,51 µg/mL (306 M) [20]

Acetylcholinesterase (AChE) là một enzym đích quan trọng trong điều trị bệnh Alzheimer Dược liệu là một nguồn các hợp chất có khả năng ức chế hoạt

động của enzym AChE - enzym thủy phân acetylcholine và dẫn đến ức chế dẫn

truyền xung thần kinh Dịch chiết hữu cơ của loài Eupatorium viscidum đã được

báo cáo có khả năng ức chế enzym AChE với giá trị IC50 479,2 g/mL [13] Trong nghiên cứu năm 2020, Li M và các cộng sự đã phân lập được 15 flavonoid từ loài

Eupatorium adenophorum sau đó đánh giá hoạt tính ức chế enzym của các chất phân lập được với AChE (được phân lập từ Caenorhabditis elegans và Spodoptera litura) Kết quả thử nghiệm cho thấy AChE bị ức chế bởi tất cả các flavonoid phân lập được tùy thuộc vào liều lượng Hợp chất quercetagetin-7-O-(6-O-caffeoyl-β-D-

glucopyranoside) (93) có tác dụng ức chế AChE tốt nhất với các giá trị IC50 là 12,54

và 12,58 µg/mL (tương ứng với AChE phân lập từ C elegans và S litura) [30]

1.5.5 Một số hoạt tính khác

Ngoài các hoạt tính đã được đề cập ở trên, đã có nhiều báo cáo chứng minh

các hoạt tính khác của chi Eupatorium Cụ thể đó là hoạt tính chống oxy hóa: loại

bỏ gốc tự do DPPH, gốc superoxide [64]; chống dị ứng: dịch chiết EtOH từ loài E cannabinum được báo cáo có tác dụng trong điều trị viêm mũi dị ứng [45]; điều hòa miễn dịch: chiết xuất từ lá của loài E adenophorum cho hiệu quả cao trong việc

điều hòa miễn dịch chống lại virus H5N1 trong thí nghiệm trên chuột [25]

1.5.6 Hoạt tính sinh học của loài Eupatorium adenophorum

Loài Eupatorium adenophorum Spreng đã được biết đến là một loài thực vật

được sử dụng trong nền y học cổ truyền Đã có nhiều báo cáo về việc sử dụng các

bộ phận và toàn bộ cây E adenophorum để làm thuốc ở nhiều nước trên thế giới Công dụng trong y học của cây E adenophorum được giải thích là do các hoạt tính chống viêm, chống oxi hóa, kháng nấm, kháng khuẩn và một số hoạt tính khác [59]

Hoạt tính kháng viêm

Dịch chiết EtOH của lá E adenophorum có hoạt tính kháng viêm thông qua

ức chế biểu hiện các gen IL1β, COX-2, bất hoạt các tiểu phần oxy hoạt động (ROS) như gốc hydroxyl (.OH) Do vậy nó được sử dụng để ngăn chặn hiệu quả phản ứng

viêm ở bàn chân qua đường tiêm Việc sử dụng trực tiếp lá E adenophorum được

báo cáo làm giảm nhanh chóng tình trạng viêm sưng ở bàn chân Việc tiêm tĩnh

mạch chiết xuất từ lá E adenophorum làm tăng số lượng tế bào CD4 T trong lá lách

và yếu tố hoại tử TNF-α, một cytokine tiền viêm được thiết lập trong huyết thanh của chuột [46]

Hoạt tính giảm đau

Dịch chiết MeOH của lá E adenophorum cho thấy hoạt tính giảm đau đáng

kể so với các loại thuốc giảm đau cơ bản chứa sodium diclofenac và pentazocine trong thử nghiệm làm đau bằng acetic acid trên chuột [28]

Hoạt tính hạ sốt

Dịch chiết MeOH của lá cây được báo cáo có tác dụng hạ sốt (chứng sốt gây

ra bởi nấm men) ở chuột với liều 300-400 mg/kg trong khi liều dùng thuốc tiêu chuẩn paracetamol là 150 mg/kg Tác dụng hạ sốt này được cho rằng do hoạt tính

sinh học của các thành phần triterpenoid hay β-sitosterol có trong lá cây [43]

Hoạt tính chống oxy hóa

Tác dụng ức chế hiệu quả quá trình tạo gốc tự do hydroxyl .OH của dịch

chiết EtOH lá cây E adenophorum đã được báo cáo Dẫn xuất quinic acid phân lập

từ cây bao gồm 5-O-trans-o-coumaroylquinic acid methyl ester, chlorogenic acid

methyl ester, macranthoin F và macranthoin G đã được thử nghiệm và cho thấy hiệu quả trong việc quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) Hoạt tính quét

gốc DPPH được cho rằng tương đương với các chất chuẩn ascorbic acid, 4-hydroxytoluene (BHT), gallic acid [42] Tinh dầu E adenophorum được thử nghiệm khả năng quét gốc DPPH và β-carotene cho thấy hoạt tính chống oxi hóa

tert-butyl-mạnh với giá trị IC50 tương ứng là 8,3 và 4,2 µg/mL, cho thấy tinh dầu của loài này

có tính chất chống oxi hóa mạnh [34] Tuy nhiên, một nghiên cứu khác trên chuột cho thấy việc uống dịch chiết lá cây sẽ gây ra mất cân bằng oxi hóa, giảm hoạt động

của một số enzym chống lại sự oxi hóa như superoxide dismutase (SOD), catalase

(CAT) và làm giảm glutathione (GSH) từ đó cho thấy việc sử dụng các chất chiết

xuất từ lá cây E adenophorum với liều không thích hợp sẽ gây độc cho động vật

bậc cao [58]

Hoạt tính chữa lành vết thương

Dịch chiết EtOH của E adenophorum được bào chế dưới dạng gel được

công bố có khả năng chữa lành các vết thương hở hiệu quả tương đương với các loại gel truyền thống Hiệu quả làm liền vết thương là đáng kể với khả năng co vết thương đạt 90,98% và giảm 36,16% thời gian hình thành mô mới [27]

Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính chống lại vi khuẩn từ dịch chiết các bộ phận và tinh dầu của E adenophorum được nghiên cứu và có hiệu quả trên rất nhiều loại vi khuẩn như Proteus spp., Salmonella spp., Staphylococcus spp., Bacillus subtilis, B thurengiensis, B cereus, Enterobacter aerogenes, Salmonella paratyphi, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, E coli, S aureus, Staphylococcus spp., Citrobacter spp.,…[39] Khả năng này được gán cho các hợp chất có hoạt tính mạnh phân lập được từ E adenophorum như 5-O-trans-o-coumaroylquinic acid methyl ester, chlorogenic acid

methyl ester, macranthoin F và macranthoin G [41]

Hoạt tính chống nấm

Các chiết xuất từ thân và lá của E adenophorum được báo cáo có tác dụng

ức chế các chủng nấm bao gồm Fusarium moniliformae, F eroliferum, F immuratum và F oxysporum [57] Dịch chiết ether dầu mỏ của lá E adenophorum cho khả năng kháng nấm Aspergilus niger, Aspergilus candidus và Candida albicans Các chất cadinane bao gồm cadinan-3-ene-2,7-dione, 7-hydroxycadinan-

3-ene-2-one, 5,6-dihydroxycadinan-3-ene-2,7-dione, cadinan-3,6-diene-2,7-dione

và 2-acetyl-cadinan-3,6-diene-7-one được phân lập từ E adenophorum được xác

định là quyết định cho khả năng kháng nấm của cây

Cụ thể, các hoạt tính sinh học có thể ứng dụng trong dược học của các hợp

chất chiết tách được từ E adenophorum được tổng hợp lại trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết xuất từ E adenophorum

TT Tên hợp chất Bộ phận của cây Hoạt tính tham khảo Tài liệu

1 Chlorogenic acid

Lá

Chống viêm, kháng khuẩn, giảm cân

[18, 37, 60]

khuẩn, giảm cân

3 Cryptochlorogenic acid Chống viêm, kháng

khuẩn, giảm cân

Kháng khuẩn, chống oxi hóa

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng

2.1.1 Hóa chất, dụng cụ

Dung môi n-hexane và acetone (Hàn Quốc), dichloromethane (Thái Lan),

ethyl acetate (Đài Loan), methanol (Indonesia) là loại dùng cho sắc ký cột và được làm khô bằng Na2SO4 trước khi sử dụng H2SO4 95-97 % và FeCl3 khan là hóa chất thí nghiệm tinh khiết (Trung Quốc)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck, Đức) Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng

DC-254 nm hoặc dùng thuốc thử hiện màu vanillin/H2SO4 đặc (1% w/v) hoặc FeCl3/EtOH (5% w/v), hơ nóng ở 120 oC cho đến khi hiện màu

Sắc ký cột (CC) được thực hiện trên cột sắc ký thủy tinh (Sigma-Aldrich,

Hoa Kỳ) với chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 63-200 μm, 40-63 μm, 15-40 μm (Merck)

và chất hấp phụ pha đảo Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemicals, Nhật Bản)

2.1.2 Thiết bị

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) được ghi trên thiết

bị Bruker Avance 500 MHz (Hoa Kỳ) với chất chuẩn nội TMS (tetramethylsilane) Các dung môi ghi đo là CD3OD và DMSO-d6

Phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử (ESI-MS) được ghi trên thiết bị Agilent LC-MS Ion Trap Phổ khối lượng ion hóa phun bụi điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) được ghi trên thiết bị Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL instrument (Whatham, MA, USA)

Độ quay cực riêng được đo trên thiết bị Jasco P-2200 digital polarimeter

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều chế phần chiết nước

Nguyên liệu thực vật được ngâm chiết 3 lần với methanol ở nhiệt độ phòng Dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH tương ứng Phần chiết này sau đó được chiết với các dung môi theo độ phân cực

tăng dần n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate cho các phần chiết tương ứng

2.2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng các phương pháp tách chiết, các phương pháp chiết hai pha rắn - lỏng, hai pha lỏng-lỏng, các phương pháp sắc kí phân tích như sắc kí lớp mỏng (TLC), các phương pháp sắc kí điều chế như sắc kí cột thường (CC), sắc kí cột nhanh (FC), sắc kí cột tinh chế (Mini-C), sắc kí cột pha đảo (RP-CC, Diaion HP-20) và các phương pháp kết tinh chọn lọc

a) Phương pháp chiết hai pha lỏng

Phương pháp này dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn vào nhau (một pha nước và một pha hữu cơ) Các hợp chất hữu

cơ sẽ được chuyển từ pha nước sang pha hữu cơ, còn các chất nền phân cực sẽ ở lại

ở trong pha nước Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước, nhiệt độ,

b) Sắc kí lớp mỏng (TLC)

Sắc kí lớp mỏng trên silica gel là phương pháp thích hợp cho phân tích các hợp chất hữu cơ Vì sự phân tích TLC trên silica gel là quá trình hấp phụ các hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân tách sắc kí cột Để định tính các hợp chất, các giá trị Rƒ và màu sắc của các vệt chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả Dựa vào sắc kí đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp

Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silica gel là 0,2

DC-mm

Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng

Hòa tan mẫu thử trong dung môi thích hợp (nồng độ 1 mg/mL), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng (10 µL)

Dung môi triển khai

Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và chưng cất lại trước khi

sử dụng Các hệ dung môi được trộn theo tỷ lệ phù hợp với từng mẫu phân tích Sau khi pha phải lắc kĩ cho các dung môi trong hệ trộn đều nhau rồi cho vào bình triển khai sắc kí thủy tinh đáy bằng, có nút nhám kín đến chiều cao 0,5 cm Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng

Triển khai bản mỏng

Bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp với tuyến xuất phát của dung môi, dung môi có chiều cao 1 cm trong bình sắc kí

Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình triển khai sắc

kí, đậy kín nắp, để yên và quan sát Khi quan sát thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành phát hiện vệt chất trên bản mỏng

Sắc kí cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi Cột sắc

kí được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều cao tùy theo lượng mẫu cần phân tách Chất hấp phụ dùng cho CC là silica gel (Merck,

Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạ 63-200 µm và 40-63 µm

Dung môi hữu cơ dùng cho sắc kí cột được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong bình kín trước khi sử dụng

Nhồi cột sắc kí: Phương pháp nhồi cột ướt

Một lượng silica gel ứng với cột sắc kí có đường kính thích hợp, có chiều

cao là 30 cm đươc khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ n-hexane

khan Bột nhão này được đuổi hết bọt khí và được nhồi vào cột sắc kí Có thể dùng

bơm nén hoặc trọng lực dung môi n-hexane đi qua cột nhiều lần đến khi lớp silica

gel hoàn toàn ổn định

Đưa mẫu lên cột sắc kí: Phương pháp tẩm mẫu trên silica gel

Mẫu được hòa tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp

Trộn dung dịch thu được với silica gel (cỡ hạt 40-63 µm) với tỷ lệ là 1 g chất/1,2 g

đến 1,5 g silica gel Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel Bột này được đưa lên cột sắc kí phía trên lớp chất hấp phụ silica gel

Triển khai sắc kí cột

Mở khóa dưới cột sắc kí để cho dung dịch chảy ra khỏi cột sắc kí, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm Cho từ từ mẫu tẩm trên silica gel lên cột Khi đứa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc kí tạo thành mặt phẳng ngang Rắc một lớp cá lên phía trên để trán các chất bột hòa tan ngược

Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát thăm dò TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích 150 mL,

50 mL và 20 mL (CC, FC) Với cột sắc kí tinh chế (Mini-C) các phân đoạn được thu theo thể tích 3-5 mL

Khảo sắt sắc kí các phân đoạn

Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc kí đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn

d) Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này chủ yếu được dùng để phân lập và tinh chế chất rắn Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh lại là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất và tạp chất trong dung môi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau

e) Phương pháp TLC điều chế

Phương pháp này dùng để phân lập các chất trực tiếp trên bản mỏng Đầu tiên, khảo sát mẫu thử trên TLC để tìm được hệ dung môi triển khai bản mỏng cho

Rƒ các chất khác biệt nhau Sau đó, dùng capilla đưa dung dịch mẫu lên bản mỏng

có chiều rộng 3-5 cm, triển khai dung môi, dựa vào Rƒ khác nhau của các chất, cắt từng phần riêng biệt nhau Cạo lớp silica gel trên bản mỏng và rửa giải bằng acetone hoặc methanol sẽ thu được chất cần phân tách Phương pháp này chỉ áp dụng cho lượng mẫu ít và gặp khó khăn khi tách trên cột sắc kí

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Hiện nay các phương pháp phổ là các phương pháp hiện đại và hữu hiệu nhất

để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ đặc biệt là các phương pháp cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR) và phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng dùng để đo khối lượng phân tử Phân tử được bắn phá bằng nguồn năng lượng lớn tạo ion phân tử hoặc mảnh ion Khối lượng của ion phân tử cho biết khối lượng phân tử của hợp chất, khối lượng của các phân mảnh cho biết thông tin về cấu trúc của hợp chất Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất nghiên cứu dưới sự bắn phá của một chùm các ion

từ bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác nhau và dựa vào đó người ta

có thể xác định được cơ chế phân mảnh và từ đó dựng lại được cấu trúc hóa học của các hợp chất

Hiện nay có rất nhiều các loại phổ khối lượng và các phương pháp phổ biến vẫn được dùng là:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy): dựa vào sự

phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm electron bắn phá có năng lượng khác nhau, thông thường là 70 ev

- Phổ ESI-MS (ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ khối

lượng ion hóa phun bụi điện Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS Do vậy dữ liệu phổ thu được chủ yếu là peak ion phân

tử (ở dạng [M+H]+ hoặc [M–H]–) và các peak đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết

có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR, Nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp quang phổ dựa trên mức năng lượng của các spin hạt nhân trong các nguyên tử định hướng theo một từ trường của một nam châm vĩnh cửu Do tương tác của các spin này với một điện từ trường bổ sung, các hạt nhân chuyển lên một mức năng lượng cao hơn Tín hiệu sinh ra do sự thay đổi vị trí từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mức năng lượng thấp hơn được ghi lại và cường

độ của tín hiệu tỷ lệ với mức chênh lệch năng lượng giữa các trạng thái

Trong nghiên cứu cấu trúc các hợp chất thiên nhiên, các phổ NMR phổ biến nhất là phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) Trong phổ 1H-NMR ngoài cường độ tín hiệu, hai thông

số quan trọng là độ dịch chuyển hóa học (δ) và hằng số tương tác (J) Phổ 13C-NMR cho biết thông tin về số lượng nguyên tử carbon trong chất cũng như tính chất đối xứng khi so sánh với công thức phân tử Ngoài ra còn phổ DEPT cho biết các nhóm CH3, CH2, CH hay C, từ đó cho phép dự đoán cấu trúc của hợp chất nghiên cứu Các phổ NMR cho phép xác định số lượng và các dạng hạt nhân có trong phân tử chất mẫu, các mảnh cấu trúc riêng biệt chứa các nguyên tử C, H, O, N… và cách thức chúng liên kết với nhau

Khi đo phổ NMR, để có tín hiệu tốt thì mẫu cần được pha loãng trong dung môi ít ảnh hưởng đến tín hiệu của chất Khi đó để đo phổ 1H-NMR thì cần dung môi không chứa hydro như CCl4, CS2 hoặc dùng dung môi đã được deuteri hóa Độ dịch

chuyển (δ) được biểu thị theo ppm Tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội cho

phổ NMR

2.3 Nguyên liệu thực vật

Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu là lá cây Cỏ lào đỏ (Eupatorium adenophorum Spreng.) được thu thập tại Sapa, tỉnh Lào Cai vào tháng 9 năm 2016

Mẫu thực vật (số tiêu bản EA-09-16) được TS Nguyễn Thị Kim Thanh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội thu thập và giám định thực vật

2.3.1 Điều chế phần chiết nước từ lá cây Eupatorium adenophorum

Mẫu lá được làm sạch, sấy khô ở 40-50 oC, sau đó mẫu lá khô được nghiền thành bột mịn

Bột lá khô (1,34 kg) được ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, quy trình chiết được lặp lại 3 lần Các dịch chiết MeOH được lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay Büchi RType (KRvr 65/45) Phần

chiết MeOH nhận được được chiết hai pha lỏng giữa nước và các dung môi

n-hexane và dichloromethane cho các dịch chiết hữu cơ tương ứng (AAH) (124,2 g)

và dichloromethane (AAD) (57,5 g) Dịch chiết nước (AAW) được cất loại bớt

nước dưới áp suất giảm, sau đó được được phân tách qua cột Diaion HP-20 với hệ dung môi gradient MeOH-H2O 20, 40, 60 và 100% (v/v) thu được 4 phân đoạn

tương ứng AAW20, AAW40, AAW60 và AAW100

Quá trình điều chế phần chiết nước được trình bày trong Sơ đồ 3.1

2.3.2 Phân tích sắc kí lớp mỏng các phân đoạn AAW

Phân tích sắc kí lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng được tráng sẵn silica gel Merck DC-Alufolien 60 F254 có chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm Các

hệ dung môi triển khai là CH2Cl2-MeOH hoặc EtOAc-MeOH

Các thuốc thử hiện màu là dung dịch vanillin/H2SO4 đặc 1% (w/v) hoặc dung dịch FeCl3/EtOH 5 % (w/v) Bản mỏng sau khi phun thuốc thử được hơ nóng ở 100-120 ºC cho đến khi hiện vệt màu

2.3.3 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn AAW60

Phân đoạn AAW60(13,1 g) được hòa tan trong một lượng vừa đủ MeOH, thêm silica gel và khuấy đều cho bay hết dung môi, làm khô hỗn hợp cho đến khi

thu được một bột tơi màu nâu đen Đưa mẫu AAW60 đã tẩm silica gel lên cột sắc kí

nhồi silica gel

Phân đoạn AAW60 được phân tách sắc kí CC (cột thủy tinh 3 × 30 cm, silica

gel, 63-200 µm) với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2-MeOH 9:1, 6:1, 1:1;

acetone-MeOH 6:1, 3:1, 1:1 (v/v) thu được 11 phân đoạn AAW60.1-AAW60.11,

được gộp lại dựa trên kết quả phân tích TLC

Phân tách sắc kí phân đoạn AAW60.2 (CC, silica gel, 40-63 µm) với hệ

dung môi gradient n-hexane-EtOAc 3:1, 1:1, 1:3 và rửa kết tủa với CH2Cl2 hoặc

hỗn hợp CH2Cl2-EtOAc thu được các hợp chất 94 (27,5 mg), 95 (3 mg), 96 (17,3

mg) và 103 (2,0 mg)

Phân tách sắc kí phân đoạn AAW60.4 (CC, silica gel, 40-63 µm) với hệ

dung môi gradient n-hexane-acetone 50:1, 12:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1 thu được các hợp

chất 96 (3,1 mg) và 97 (258,7 mg)

Phân đoạn AAW60.5 được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột CC (silica

gel Merck, 40-63 µm) với hệ dung môi gradient dichloromethane-ethyl acetate 1:9,

1:15, sau đó ethyl acetate-acetone 6:1, 3:1, 1:1 và dội cột bằng MeOH được 60 phân đoạn trong ống nghiệm 20 mL Dựa trên các phân tích TLC các phân đoạn trên

được gộp thành 6 phân đoạn từ AAW60.5.1 đến AAW60.5.6 Từ phân đoạn AAW60.5.5 xuất hiện chất kết tinh dạng bột màu trắng vô định hình 98 (5,0 mg)

Phân tách sắc kí phân đoạn AAW60.6 bằng phương pháp sắc kí cột CC

(silica gel Merck, 40-63 µm) với hệ dung môi gradient ethyl acetate-acetone 9:1,

6:1, 3:1, 1:1 và dội cột bằng MeOH thu được 81 phân đoạn Dựa trên các phân tích

TLC các phân đoạn trên được gộp thành các phân đoạn từ AAW60.6.1 đến AAW60.6.5 Phân đoạn AAW60.6.2 được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột

Mini-C (silica gel Merck, 15-40 µm) với các hệ dung môi dichloromethane-acetone

9:1, 6:1, 3:1 thu được 38 phân đoạn; các phân đoạn xuất hiện kết tinh màu trắng

được rửa bằng ethyl acetate thu được chất bột màu trắng vô định hình 99 (10 mg)

Tinh chế sắc kí các phân đoạn nhận được (Mini-C, silica gel, 15-40 µm) với hệ

dung môi gradient EtOAc-MeOH 40:1, 30:1 cũng thu được hợp chất 99 (6,3 mg)

Phân đoạn AAW60.7 được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột CC (silica

gel Merck, 40-63 µm) với các hệ dung môi gradient dichloromethane-methanol 6:1,