định lượng một số thành phần hoạt chất cơ bản và bƣớc đầu đánh giá hoạt tính sinh học có trong dịch chiết nấm linh chi ganoderma lucidum thu hái ở huyện a lưới thừa thiên huế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN TRƯỜNG Y DƯỢC NGUYỄN PHƯỚC HUYỀN TRANG ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CƠ BẢN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT NẤM LINH CHI GANOD

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN TRƯỜNG Y DƯỢC

NGUYỄN PHƯỚC HUYỀN TRANG

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CƠ BẢN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT NẤM LINH CHI

(GANODERMA LUCIDUM) THU HÁI Ở HUYỆN

A LƯỚI (THỪA THIÊN HUẾ)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN TRƯỜNG Y DƯỢC

ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CƠ BẢN VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CÓ TRONG DỊCH CHIẾT NẤM LINH CHI

(GANODERMA LUCIDUM) THU HÁI Ở HUYỆN

A LƯỚI (THỪA THIÊN HUẾ)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH H C Ọ

GVHD : PGS TS NGUY N HUY THU N Ễ Ầ

SVTH : NGUYỄN PHƯỚC HUY N TRANG Ề

L p : K25CSH ớ

MSSV : 25207104528

ĐÀ NẴNG, 2023

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này không ch có sự cố gắng, nổ lực ỉ của chính b n thân, mà còn cả ần đến sự động viên và giúp đỡ nhi t tình c a th y cô, ệ ủ ầ gia đình và bạn bè Đặc biệt là sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô giáo bộ môn

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo trường Đại học Duy Tân cùng quý th y cô t i Trung tâm Sinh h c Phân T , Trung tâm Hóa h c ầ ạ ọ ử ọ tiên ti n, các thế ầy cô khoa Dược và các th y cô giáo b môn công ngh sinh h c ầ ộ ệ ọ đã luôn t o mạ ọi điều ki n, ng h và h tr chúng em trong su t quá trình h c t p và ệ ủ ộ ỗ ợ ố ọ ậ nghiên c u ứ

Đặc biệt, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đế PSG TS Nguy n n ễ

Huy Thuần, Trung tâm Sinh h c Phân tọ ử, Trường Y Dược, Đại h c Duy Tân, là ọ người đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện khóa luận này Thầy đã tận tình hướng dẫn và luôn t o mạ ọi điều ki n, truyệ ền đạt ki n th c quý báu, ng h em trong quá ế ứ ủ ộ trình nghiên cứu Đó là hành trang quý báu cho sự nh n th c và hi u bi t c a em ậ ứ ể ế ủ ngày hôm nay Sự giúp đỡ ủ c a th y cô chính là nguầ ồn động viên tinh th n r t lầ ấ ớn để em theo đuổi và hoàn thành đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn đến cô TS Dương Thị Thuấn, th y ầ TS Nguy n ễ

Thành Trung đã hỗ trợ, bổ sung và góp ý để em hoàn thành tốt bài nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn thầ TS Hà H i Anhy ả , cô DS T Th Thanhạ ị , th y ầ

CN Trần Minh Đức, cô ThS Ph m Th Y n Nhiạ ị ế và th y ầ TS Lê Văn Thuậ đã n

tạo điều kiện cho em sử dụng trang thiết bị và hóa chất để tiến hành thí nghiệm Em xin bày t l i cỏ ờ ảm ơn sâu sắc đến ch tr lý nghiên c u ị ợ ứ Phạm Thị Anh

Thư và anh Ngô Gia Huy đã hướng dẫn, trao đổi các vấn đề ả x y ra trong quá trình tiến hành th c nghi m và h trự ệ ỗ ợ nhiệt tình để em hoàn thi n t t bài khóa lu n này ệ ố ậ

Cảm ơn em Nguyễn Duy Khương – sinh viên K26 đã nhiệt tình giúp đỡ và tham gia trao đổi về các vấn đề trong quá trình thí nghiệm

ii

Em xin chân thành cảm ơn thầ TS H Thanh Tâmy ồ giúp em đọc l i toàn b ạ ộ nội dung c a bài luủ ận văn và chỉ ra sai sót, giúp em hoàn thi n tệ ốt hơn bài ận văn lu của mình

Cuối cùng, m t tình c m sâu s c nh t t tộ ả ắ ấ ừ ận đáy lòng, em xin gửi đến gia đình, những người luôn là nguồn động viên to lớn nhất cho em, luôn tạo mọi điều kiện để cho em được học tập và nghiên cứu trong suốt những năm vừa qua Bước đầu tham gia vào vi c nghiên c u không tránh kh i nh ng sai sót, em kính mong nhệ ứ ỏ ữ ận được sự góp ý c a quý thủ ầy cô để đề tài của em được hoàn thiện hơn Với lòng biết ơn sâu s c, xin chân thành cắ ảm ơn tấ ả ự giúp đỡt c s quý báu của đó.

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2023 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Phước Huy n Trang ề

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của cá nhân tôi và được sự hướng dẫn của

PGS TS Nguy n Huy Thuễ ần Các n i dung nghiên cộ ứu trong đề tài “Định lượng một s thành ph n ho t chố ầ ạ ất cơ bản và bước đầu đánh giá hoạt tính sinh học có trong d ch chi t n m Linh chi (ị ế ấ Ganoderma lucidum) thu hái huy n A Lở ệ ưới (Th a ừ Thiên Huế)” của tôi là trung th c và không trùng l p vự ặ ới các đề tài khác Nh ng s ữ ố liệu trong các b ng bi u ph c v cho vi c phân tích, nhả ể ụ ụ ệ ận xét, đánh giá được cá nhân thu th p t các ngu n khác nhau có ghi rõ ngu n g c N u phát hi n có b t k ậ ừ ồ ồ ố ế ệ ấ ỳ sự gian l n nào tôi xin hoàn toàn chậ ịu trách nhi m v n i dung bài ti u lu n c a ệ ề ộ ể ậ ủ mình

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Phước Huy n Trangề

1.2 Tổng quan v n m Linh chi 6ề ấ 1.2.1 Gi i thi u v n m Linh chiớ ệ ề ấ 6

1.2.2 Phân bố 7

1.2.3 Đặ điểc m sinh học 7

1.2.4 Thành ph n hóa h c và các h p ch t có trong n m Linh chiầ ọ ợ ấ ấ 9

1.2.5 Các tác d ng quan tr ng c a nụ ọ ủ ấm Linh chi trong y dược học 14

1.3 Các sản ph m t n m Linh chi 15ẩ ừ ấ 1.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên c u 18ứ 2.2 Nguyên v t li u và thi t b 18ậ ệ ế ị 2.2.1 Nguyên li u và hóa chệ ất 18

2.2.2 Thi t bế ị 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Quy trình thu cao chiết nước từ ấ n m Linh chi 19

2.3.2 Khảo sát hàm lượng m t s h p ch t có trong c n d ch chiộ ố ợ ấ ắ ị ết 20

v

2.3.3 Khảo sát m t s ho t tính sinh hộ ố ạ ọc có trong cắn dịch chiết 24

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Thu cao chiết nướ ừ ấc t n m Linh chi 31

3.2 Kết qu khả ảo sát hàm lượng m t s ho t ch t có trong c n d ch chi t ộ ố ạ ấ ắ ị ế

3.3.2 Làm gi m lả ực khử ủ c a iron (III) chloride 40

3.3.3 Khả năng ức chế sinh trưởng c a vi sinh vủ ật 42

KẾT LU N VÀ KIẬ ẾN NGHỊ 44

TÀI LI U THAM KHỆ ẢO 45

DANH M C CÔNG TRÌNH C A TÁC GIỤ Ủ Ả 52

PHỤ LỤC 53

vi

DANH MỤC CÁC KÍ HI U, CH VI T TỆ Ữ Ế ẮT

ABTS : 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) AIDS : Acquired immune deficiency syndrome

E coli DH5 : Escherichia coli DH5

G lucidum : Ganoderma lucidum

LB Broth : Luria Bertani Broth

MMP-1 : Matrix metalloproteinase NST : Nhi m s c th ễ ắ ể

PC3 : Prostate cancer cell line

vii

2.3 Dãy chu n dung d ch glucose các nẩ ị ở ồng độ (0,1 - 0,8 mg/mL) 21

2.4 Dãy chu n dung d ch oleanolic acid các nẩ ị ở ồng độ (0,03 0,5 –

2.7 Dãy chu n dung d ch DC các nẩ ị ở ồng độ (0,5 - 2,0 mg/mL) 26

3.1 So sánh hàm lượng polysaccharide t ng sổ ố ở ộ ố dượ m t s c li u ệ 33

3.2 So sánh hàm lượng saponin tổng số ở một số dược liệu 35

3.3 Kết quá so sánh hàm lượng phenolic tổng số ở m t sộ ố dược

3.4 Phần trăm hấp thụ gốc tự do DPPH của cắn dịch chiết 39

3.5 So sánh kh ả năng chống oxy hóa m t sở ộ ố loài dược liệu 40

3.6 So sánh kh ả năng chống oxy hóa m t sở ộ ố loài dược liệu 41

3.7 Khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật của dịch chiết nấm

4.1 Giá trị mật độ quang h c (ODọ 490 nm) c a glucose ủ 53

4.2 Giá trị mật độ quang (OD490 nm) c a c n d ch chi t ủ ắ ị ế 53

4.3 Giá trị mật độ quang h c (ODọ 560 nm) c a oleanolic acid ủ 53

4.4 Giá trị mật độ quang h c (ODọ 560 nm) của cắn d ch chi t ị ế 53

ix

4.5 Giá trị mật độ quang h c (ODọ 765 nm) c a gallic acid ủ 54

4.6 Giá trị mật độ quang học (OD765 nm) của cắn d ch chi t ị ế 54

4.7 Giá trị mật độ quang h c (ODọ 517 nm) c a ascorbic acid ủ 54

4.8 Giá trị mật độ quang h c (ODọ 517 nm) của cắn d ch chi t ị ế 54

4.9 Giá trị mật độ quang h c (ODọ 700 nm) c a m u ủ ẫ ĐC và cắn DC 55

1.4 Hình ảnh tổng quan dưới kính hi n vi c a n m Linh chi ể ủ ấ 9

1.5 Khung cấu trúc cơ bản của polysaccharide trong nấm 11

1.6 Cấu trúc hóa h c c a lanosterol và ba trong s nhi u ọ ủ ố ề

1.7 Cấu trúc c a Ganoderic acid A và Ganoderic acid DM ủ 13

2.5 Phản ng làm gi m l c kh iron (III) chloride ứ ả ự ử 27

3.1 A Dịch chi t n m Linh chi; B Cao chi t Linh chi ế ấ ế 31

3.12 Đồ ị th phương trình đường chuẩn của ascorbic acid 38

3.13 Phản ng t o màu gi a mứ ạ ữ ẫu đối ch ng âm và m u DC ứ ẫ 39

3.14 Biểu đồ tương quan giữa nồng độ dịch chiết và % hấp thụ

3.15 Thí nghiệm làm gi m lả ực khử iron (III) chloride 40

3.16 Biểu đồ thể hiện giá trị mật độ quang (OD700 nm) 41

3.17 Khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật của dịch chiết

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là đất nước thu c vùng khí h u nhiộ ậ ệt đới gió mùa, lượng mưa dồi dào và độ ẩm cao Đây là điều kiện thuận lợi cho các loại sinh vật phát triển, tạo ra hệ th c v t rự ậ ất phong phú và đa dạng bao g m ồ các loại thực vật bậc cao, nấm ăn và nấm dược liệu Đến nay, mặc dù chưa có sự thống kê đầy đủ ề ự đa dạ v s ng thành phần các loài n m Vi t Nam, tuy nhiên, các d n li u khoa hấ ở ệ ẫ ệ ọc đã được công b ố cho thấy Vi t Nam có nhi u lo i n m quý hi m [1] ệ ề ạ ấ ế

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) còn g i là Tiên th o, nọ ả ấm Trường thảo, Vạn niên nhung, thu c h n m Lim ộ ọ ấ G lucidum hường sinh trưởt ng ở nơi rừng núi cao, đặc biệt là những khu rừng có nhiều cây lá rộng, chúng được xem là một loại dược liệu quý, cây thuốc quan trọng tại các nước Đông Nam Á [2] Trong những năm gần đây, các nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước đã công bố nhiều kết quả nghiên c u v thành ph n hóa h c chính trong n m Linh chi có các ho t tính sinh ứ ề ầ ọ ấ ạ học đáng chú ý như điều trị và h trỗ ợ điều tr nhi u b nh tị ề ệ ật liên quan đến s c kh e ứ ỏ của con người: b nh tim, cao huy t áp, bệ ế ệnh gan, ung thư, tiểu đường [54]

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về nấm Linh chi nhưng chúng tôi nhận thấy nấm tr ng ồ ở các vùng địa lý khác nhau (mọc tự nhiên hoặc nuôi trồng) có thể có sự khác nhau v thành ph n ho t ch t và ho t tính sinh h c ề ầ ạ ấ ạ ọ

Do đó, chúng tôi nghiên cứu sơ bộ về định lượng các thành phần và bước đầu đánh giá một số hoạt tính sinh học từ dịch chiết nấm Linh chi (G lucidum), với đề tài: “Định lượng một số thành phần hoạt chất cơ bản và bước đầu đánh giá

hoạt tính sinh h c có trong dọ ịch chi t n m Linh chi (ế ấ Ganoderma lucidum) thu hái huyở ện A Lưới (Th a Thiên Huừ ế)” nh m cung c p thêm d li u khoa h c v ằ ấ ữ ệ ọ ề hoạt tính sinh h c quý c a n m Linh chi Vi t Nam và góp ph n m rọ ủ ấ ở ệ ầ ở ộng ti m ề năng sử dụng loại dược liệu này

2

Đề tài này g m ba mồ ục tiêu sau:

1 Xây d ng quy trình thu nh n c n d ch chiự ậ ắ ị ết nước nấm Linh chi

2 Khảo sát hàm lượng một số hoạt chất có trong cắn dịch chiết và so sánh với các k t qu ế ả đã công bố

3 Đánh giá một số hoạt tính sinh học của dịch chiết như: hoạt tính kháng khuẩn, ch ng oxy hóa ố

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về nấm

Giới n m bao g m các sinh v t nhân th c, không có di p l c, không có s ấ ồ ậ ự ệ ụ ự phân hóa thành r , thân, lá, không có hoa, ph n l n không ch a cellulose trong ễ ầ ớ ứ thành t bào và s ng dế ố ị dưỡng N m có m t sấ ộ ố phương thứ dinh dưỡc ng bao g m ồ hoại sinh, ký sinh hay c ng sinh [2] ộ

Tế bào n m phát tri n và phân nhánh t o thành s i n m, s i n m ti p t c phát ấ ể ạ ợ ấ ợ ấ ế ụ triển và phân nhánh t o thành h n m phát tri n ch ng chạ ệ ấ ể ằ ịt trên b m t ề ặ môi trường Trong s i nợ ấm có vách ngăn ngăn cách các tế bào n m v i nhau Nh ng s i n m ấ ớ ữ ợ ấ này hình thành khu n lẩ ạc có thể nhìn th y b ng mấ ằ ắt thường

Cấu t o chung c a t bào nạ ủ ế ấm tương tự như tế bào động v t, có màng t bào, ậ ế bào tương, các bào quan, nhân, tuy nhiên nấm có thành tế bào [2][55]

1.1.2.1 Thành t bào ế

Thành t bào (cell wall): có c u t o nhi u l p, 90% là polysaccharide g m các ế ấ ạ ề ớ ồ loại hexose và hexosamine polymers như chitin, glucan, mannan, v.v., 10% là các protein và glycoprotein Thành t bào làm nhi m vế ệ ụ đảm b o hình dả ạng, độ ứ c ng, sự v ng ch c và b o v t bào n m ch ng l i áp l c th m th u Ngoài ra thành t ữ ắ ả ệ ế ấ ố ạ ự ẩ ấ ế bào có tính kháng nguyên [2]

1.1.2.2 Màng t bào ế

Màng t bào: c u t o hai l p, thành ph n có phospholipids và sterols ế ấ ạ ớ ầ (ergosterol, zymosterol) Màng có chức năng bảo vệ bào tương, điều hoà hoạt động bài ti t và h p thu nh ng ch t hoà tan, tế ấ ữ ấ ạo điều ki n thu n l i cho vi c t ng h p bao ệ ậ ợ ệ ổ ợ vỏ, thành t bào [2] ế

- Mẫu dịch chi t (2,0 mg/mL): Cân chính xác 0,2 gam cao chi t cho vào ế ế bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều c Ti ến hành

- Bước 1: M u th : L y 1,5 mL glucose các nẫ ử ấ ở ồng độ (0,1 - 0,8 mg/mL) + 1 ml phenol 5% đã pha ở trên + 3 mL acid sulfuric đậm đặc + M u tr ng: L y 1,5 mL ẫ ắ ấ nước c t + 1mL dung d ch phenol 5% ấ ị đã pha

ở trên + 3 mL acid sulfuric đậm đặc - Bước 2: Trộn đều và trong t i 30 phút ủ ố

- Bước 3: Đo mật độ quang h c ọ ở bước sóng 490 nm K t quế ả đo quang được thực hiện 3 lần và lấy giá tr trung bình ị

- Bước 4: Tương tự ế ti n hành v i m u DC: L y 1,5 mL d ch chi t n ng ớ ẫ ấ ị ế ở ồ độ 2 mg/mL + 1mL phenol 5% + 3 mL acid sulfuric đậm đặc [5] - Hàm lượng polysaccharide tổng số được tính theo công th c: ứ

Trong đó: G: hàm lượng polysaccharide (%)

C : n1 ồng độ polysaccharide ch a trong m u (mg/mL) ứ ẫ C: nồng độ ẫ m u b t cao chi t (mg/mL) [5] ộ ế

2.3.2.2 Khảo sát hàm lượng saponin t ng sổ ố

Hàm lượng saponin tổng số được khảo sát theo phương pháp vanillin-sulfuric acid theo Anh Le và cộng s (2018) [40] ự

a Nguyên t c ắ

Trong điều kiện acid, quá trình aldol hóa xảy ra giữa các sapogenin thu được bằng th y phân saponin trong d ch chi t và nhóm aldehyde trong vanillin Các ủ ị ế sapogenin steroid có ho c không có liên kặ ết đôi ở C-5, các sapogenin triterpenoid,

22

sterol có nhóm OH v trí C-3 c a chúng ph n ng vở ị ủ ả ứ ới vanillin trong môi trường axit để ạ t o ra phức hợp màu tím đỏcó độ hấp th cựụ c đại 473 n 560 nm [41] ở đế

b Chuẩn bị các dung dịch th ử

- Dung d ch vanillin 8%: Cân chính xác 8 gam ị vanillin cho vào bình định mức 100 mL, thêm etanol vừa đủ 100 mL, lắc đều

- Dung d ch acid sulfuric 72%: L y 25 ị ấ ml nước c t cho vào bình ấ định mức 100 mL, thêm t t ừ ừ acid sulfuric đậm đặc vừa đủ 100 mL, lắc đều - Dung d ch oleanolic acid (1,5 mg/mL): Cân chính xác 0,15 gam ị

oleanolic acid cho vào bình định mức 100 mL, thêm methanol vừa đủ 100 mL, lắc đều

- Chuẩn bị dãy chu n dung dẩ ịch oleanolic acid như Bảng 2.4

Bảng 2.4 Dãy chu n dung dẩ ịch oleanolic acid các nở ồng độ (0,03 - 0,5 mg/mL)

VOleanolic acid (mL) 0,21 0,42 0,83 1,67 3,33 VMeOH (mL) 9,79 0,58 9,17 8,33 6,67

- Mẫu dịch chi t (5,0 mg/mL): Cân chính xác 0,5 gam cao chi t cho vào ế ế bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều c Ti ến hành

- Bước 1: M u th : l y 0,75 mL oleanolic acid các nẫ ử ấ ở ồng độ (0,03 -0,5 mg/mL) + 0,75 mL vanillin 8% + 3 mL acid sulfuric 72%

- Bước 4: Đo mật độ quang h c ọ ở bước sóng 560 nm K t quế ả đo quang được thực hiện 3 lần và lấy giá tr trung bình ị

- Bước 5: Tương tự ế ti n hành v i m u DC: L y 0,75 mL d ch chi t các ớ ẫ ấ ị ế ở nồng 5 mg/mL + 0,75 mL vanillin 8% + 3 mL acid sulfuric 72%

2.3.2.3 Kháo sát hàm lượng phenolic t ng s ổ ố

Hàm lượng phenolic tổng số được khảo sát bằng thuốc thử Folin – Ciocalteu theo N Siddiqui và cộng sự (2017) [42].

a Nguyên t c ắ

Các h p ch t phenolic có trong d ch chi t n m ợ ấ ị ế ấ được định lượng bằng phương pháp đo màu khi dùng với thuốc thử Folin - Ciocalteu Thuốc thử Folin - Ciocalteu là h n h p hai acid: acid phosphotungstic (Hỗ ợ 3PW12O40) và acid phosphomolybdic (H PMo312O40), h n hỗ ợp acid này ph n ng vả ứ ới các hợp ch t có nhóm hydroxy ấ phenol trong thành ph n hóa hầ ọc để ạ t o thành các phức có màu xanh lam đặc trưng Sử dụng phương pháp quang phổ để xác định được hàm lượng phenolic toàn phần có trong dịch chi t [43] ế

b Chuẩn bị dung dịch th ử

- Dung d ch natri cacbonat 7,5%: Cân chính xác 7,5 gam natri cacbonat ị cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều - Dung d ch gallic acid (0,5 mg/mL): Cân chính xác 0,05 gam gallic acid ị cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều - Chuẩn bị dãy chu n dung dẩ ịch gallic acid như ảng 2.5 B

Bảng 2.5 Dãy chu n dung dẩ ịch gallic acid các nở ồng độ (0,05 – 0,25 mg/mL)

Nồng độ (mg/mL) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Vgallic acid (mL) 1 2 3 4 5 V nước c t ấ(mL) 9 8 7 6 5