83 Trang 6 DANH MỤC Kí HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Cỏc phương phỏp sắc ký: CC :Sắc ký cột Column Chromatography TLC : Sắc ký lớp mỏng Thin-layer Chromatography Cỏc phương phỏp phổ: MS : Phổ k
TỔNG QUAN
Vài nét v ề họ Symplocaceae
Họ Symplocaceae (họ Dung) thuộc bộ Ericales (bộ Thạch nam) chỉ có 1 chi
Symplocos với khoảng 320 loài, có nguồn gốc châu Á, Trung Mỹ và Nam Mỹ
Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trừ châu Phi, châu Âu và Tây Á, Việt Nam hiện có khoảng 35 loài thuộc họ này Các loài thường là cây gỗ hoặc cây bụi, với lá đơn, dày, có khía răng cưa, mọc cách, thiếu lá kèm, thường có màu vàng nhạt và khi khô chuyển sang xanh vàng Hoa mọc thành cụm với các hoa nhỏ, có 1 lá hoa và 2 lá hoa con mọc đối nhau hoặc ở đỉnh cuống hoa Cánh hoa hợp sinh tại gốc, với nhụy nhỏ, đài từ 5 – 2 hợp, tràng có 5 – 4 cánh trắng, sớm rụng Nhị đính thành bó hoặc ống, đính trên ống tràng, bầu dưới Quả là loại quả hạch, thường hình bầu dục hoặc hình thoi, có vết tích đài chụm lớn ở đỉnh.
Chi Symplocos và cây Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Chi Symplocos bao gồm khoảng 320 loài thực vật, trong đó có khoảng 35 loài phân bố tại Việt Nam Một số loài tiêu biểu như Dung đất (Symplocos racemosa), cây Dung lá táo (S chinensis) và Dung đắng (S cochinchinensis).
Cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don), còn được biết đến với các tên gọi dân gian như cây Dung dẻo, Dung trứng, Dung đuôi, Nhỏ la, và Mat no (Mọi), là một loài cây có nhiều tên khoa học tương đương khác.
Symplocos caudata Wall.ex G Don, S botryantha Franh, S tonkinensis
Dung lụa là cây bụi hoặc cây gỗ cao tới 8m, với thân có đường kính 25cm và gỗ màu vàng Nhánh non của cây không có lông Lá của dung lụa có phiến hơi dai, không lông, dài từ 7 đến 8cm, có mùi dầu và khi khô sẽ chuyển sang màu lục; cuống lá dài khoảng 5mm Hoa của cây mọc thành chùm, dài từ 1,5 đến 2cm, có cuống, với lá đài có lông ở mép Tràng hoa dài khoảng 3mm, chứa khoảng 40 nhị và bầu hoa có 3 ô Quả của dung lụa có hình bầu dục, dài từ 6 đến 10mm, có vỏ mỏng và chứa một hạt bên trong Cây ra hoa và kết quả gần như quanh năm.
Cây Dung lụa mọc rải rác trong rừng thưa, rừng thứ sinh ở độ cao 1.200 đến 1.700m ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Lào,
Cây phân bố rải rác từ Bắc vào Nam tại Việt Nam, đặc biệt phổ biến ở các khu vực như Quảng Nam – Đà Nẵng, Kontum, Gia Lai, Đắc Lắc và Lâm Đồng, theo thông tin từ Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam.
Hình 1 : Một vài hình ảnh cây Dung lụa ( Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don)
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học toàn cầu, đã có 28 công trình công bố về thành phần hóa học của chi Symplocos.
Trong nghiên cứu, đã có 90 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc, bao gồm các lớp hóa học như flavonoid, lignan, phenolic, steroid, alkaloid và iridoid Đặc biệt, lớp chất triterpenoid được nhấn mạnh là nổi bật nhất trong số các hợp chất này.
1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học chi Symplocos và cây Dung lụa
(Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don)
Triterpenoid là nhóm chất thuộc lớp terpenoid với công thức phân tử C30H48, bao gồm 6 đơn vị isopren (C5H8) và 6 nối đôi cô lập Các triterpen có cấu trúc mạch thẳng hoặc mạch vòng liên quan chặt chẽ đến squalene, một hợp chất đầu tiên được phân lập từ dầu gan cá voi Squalene không chỉ xuất hiện trong dầu gan cá voi mà còn có mặt với lượng nhỏ trong các động vật có vú khác, cho thấy sự phổ biến của nó trong tự nhiên.
Triterpenoid là nhóm hợp chất chính trong chi Symplocos, mang lại hoạt tính sinh học quan trọng, nhưng chỉ một số ít có giá trị cao trong y học và dược học Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng các triterpenoid có khả năng chống khối u và chống HIV, mặc dù trong các sàng lọc ban đầu, các hợp chất này chỉ thể hiện hoạt tính yếu, đòi hỏi cần có thêm nghiên cứu.
Năm 2004, Pierre và cộng sự công bố nghiên cứu phân lập 34 triterpenoid từ các loài thuộc chi Symplocos, bao gồm các dẫn xuất với khung lupane, oleanane và ursane Đặc biệt, trong số này có 9 chất mới được phân lập.
9) oleanolic axit 3-O-glucuronide bidesmosidic từ vỏ thân S glomerata và 2 saponin đã biết là salsoloside C (10) và copteroside E (11) Các chất được xác định cấu trúc bằng phương pháp quang phổ
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Năm 2004, Tang và cộng sự đã phân lập được 6 triterpenoid saponin từ phần chiết n-BuOH của rễ cây S chinensis, được đặt tên là symplocososides A – F Trong số các hợp chất này, symplocososide A nổi bật.
(12), C (14) và F (17) có tính chống lại một số dòng tế bào ung thư (KB) [35]
Bên cạnh đó 5 dẫn xuất oleanane (18 – 22), 9 dẫn xuất ursane (23 – 31), và
3 dẫn xuất khung lupane (32 – 34) cũng được tìm thấy từ các loài trong chi
LVTHS Khoa học nghiên cứu
18 OH Oglc HOCH 2 Me COOGlc OH
LVTHS Khoa học nghiên cứu
23 α-OH β-Oglc HOCH 2 Me COOGlc OH
24 H β-OH Me Me Me OH
25 β-OH β-OH H HOCH 2 COOH OH
27 α-OH β-OH HOCH 2 Me COOH OH
28 α-OH β-OH HOCH 2 Me COOH OH
Flavonoid là các hợp chất polyphenol có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học đa dạng Chúng hiện diện ở hầu hết các bộ phận của cây, đặc biệt là trong các loại thực vật khác nhau.
LVTHS Khoa học nghiên cứu tế bào thực vật quang hợp Các flavonoid không được tổng hợp ở người và động vật
Năm 1989, Dhaon và cộng sự đã phân lập được 6 dẫn xuất flavan (35-40),
5 dihydrochalcone glucoside (41-45) và 8 flavonol (46-53) từ các loài của chi
Symplocos Cùng với đó là công trình nghiên cứu đã công bố của các nhà khoa học theo trích dẫn [26, 34, 40, 41, 46, 50, 52, 53, 54]
45 OH Oglc OH OH OH
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Một dibenzylbutane lignan (54), hai dibenzyltyrolactone lignans (55-56), được biết đến từ cây S setchuensis và S lancifolia Sáu ditetrahydrofuran lignans (57-62), hai benzofurans lignans (63-64), và 8-O-4’-neolignan (65), được phân lập từ chi Symplocos.[19, 22, 23, 24,26, 59]
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Vào khoảng năm 2003 – 2004, nhóm nghiên cứu do tác giả Ahmad dẫn đầu đã phân lập thành công 7 phenolic glycoside mới và 1 phenolic glycoside đã biết từ cây S racemora Những hợp chất này cho thấy khả năng ức chế đáng kể đối với nọc rắn độc, cụ thể là phosphodiesterase I và nucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase của con người.
Những dẫn xuất phenol khác (74 – 81) được phân lập từ S lancifolia, S racemosa, và S.caudata [23, 25, 26]
LVTHS Khoa học nghiên cứu
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Năm 1983, Frotan và cộng sự đã phân lập thành công α-spinasterol (82) từ cây S spicata, hợp chất này cho thấy khả năng kháng viêm tốt thông qua các thử nghiệm trên chuột.
Năm 2005, Abbasi cùng cộng sự đã phân lập được một số ethyl glucoside [83,
Cây S rasemosa chứa hai hợp chất có cấu trúc được xác định thông qua các phương pháp phân tích 2D-NMR như COSY, HMQC và HMBC Hai glucoside này cho thấy khả năng ức chế enzyme lipoxygenase và urease, mở ra tiềm năng ứng dụng trong y học.
Năm 2001, Junko và cộng sự đã nghiên cứu chất harman (87) được chiết xuất từ cây S setchuensis, cho thấy khả năng ức chế sự nhân đôi của virus HIV trong tế bào bạch cầu H9 với liều lượng phù hợp.
PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Quá trình chi ết thực vật
Việc lựa chọn dung môi cho quá trình chiết là rất quan trọng, dung môi cần có khả năng hòa tan các chất nghiên cứu, dễ dàng loại bỏ, không phản ứng với chất nghiên cứu, đồng thời phải đảm bảo tính không độc hại và khó bốc cháy.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi có tính phân cực cao hơn so với hydrocarbon Các dung môi thuộc nhóm rượu này được cho là có khả năng thấm tốt hơn vào màng tế bào, do đó, quá trình chiết xuất bằng những dung môi này có thể thu được một lượng lớn các thành phần bên trong tế bào.
Khả năng phân cực của chloroform thấp, cho phép nó rửa các chất nằm ngoài tế bào Ancol có khả năng hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cũng như các hợp chất phân cực trung bình và thấp Do đó, khi chiết xuất bằng ancol, các chất này sẽ được hòa tan đồng thời Dung môi cồn trong nước, đặc biệt là dung dịch methanol, thường được sử dụng vì có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cất quay dưới áp suất giảm, với nhiệt độ không vượt quá 30 ÷ 40 độ C Đối với một số hóa chất chịu nhiệt, quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
Có hai phương pháp chiết xuất, trong đó phương pháp chiết nóng bằng bình chiết Soxhlet là phổ biến Phương pháp này sử dụng dung môi để chiết xuất chất rắn qua quá trình đun hồi lưu trong một khoảng thời gian nhất định, cho phép chiết xuất nhiều lần liên tục và tiết kiệm dung môi.
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian và sau đó chiết dung môi ra (chiết nguội) là phương pháp phổ biến nhất trong chiết xuất thực vật Phương pháp này không yêu cầu nhiều thiết bị hay kỹ thuật phức tạp Quá trình chiết xuất có thể được xác định kết thúc bằng một số phương pháp khác nhau.
Các alkaloid có thể được phát hiện thông qua việc tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như Dragendorff và Mayer.
Các alkaloid thường có màu sắc đặc trưng, do đó nếu dịch chiết ra không có màu, điều này cho thấy quá trình chiết đã loại bỏ hoàn toàn các chất màu này.
Khi các lacton của sesquiterpen và glucozit trợ tim phản ứng với aniline axetat, chúng có thể chỉ ra sự hiện diện của hydrat cacbon Điều này giúp xác định thời điểm kết thúc quá trình chiết xuất.
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng, việc lựa chọn dung môi phù hợp là rất quan trọng để chiết xuất hiệu quả Quy trình chiết hợp lý sẽ giúp đạt được kết quả tối ưu.
T ổng quan chung về phương pháp sắc ký
2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các thành phần trong hỗn hợp phân bố giữa pha động và pha tĩnh dựa trên tính chất như tính bị hấp phụ và tính tan Mỗi chất có ái lực khác nhau với hai pha này Trong quá trình pha động di chuyển qua hệ sắc ký, quá trình hấp phụ và phản hấp phụ diễn ra liên tục Kết quả là, những chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn trong hệ thống sắc ký.
LVTHS Khoa học nghiên cứu các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký
2.2.2 Phân loại các phương pháp sắc ký
Sắc ký pha động là phương pháp phân tích trong đó các lưu thể có thể ở trạng thái khí hoặc lỏng, trong khi pha tĩnh có thể là lỏng hoặc rắn Sắc ký được chia thành hai nhóm chính: sắc ký khí và sắc ký lỏng, dựa vào trạng thái của pha động Ngoài ra, sắc ký còn được phân loại theo cách tiến hành, với phương pháp sắc ký cột là phổ biến nhất Trong phương pháp này, chất hấp phụ, thường là silica gel với kích thước hạt khác nhau, được nhồi vào cột thủy tinh, sử dụng các pha như YMC, ODS, và Dianion.
Kích thước hạt của chất hấp phụ ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân tách: hạt nhỏ giúp tăng cường hiệu quả phân tách, nhưng lại làm giảm tốc độ chảy Trong những tình huống khi trọng lực không đủ mạnh, hiện tượng tắc cột có thể xảy ra, dẫn đến việc dung môi không thể chảy qua Để khắc phục tình trạng này, cần sử dụng áp suất, có thể là áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L), L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách – tức là phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể
Tùy thuộc vào lượng và dạng chất, có nhiều phương pháp để đưa chất lên cột Đối với lượng chất lớn và thô, phương pháp phổ biến là tẩm chất lên silica gel, sau đó làm khô hoàn toàn trước khi đưa lên cột Trong trường hợp tách tinh, chất được hòa tan bằng dung môi chạy cột và đưa trực tiếp lên cột với thể tích tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Tốc độ chảy của dung môi đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả tách Nếu tốc độ dòng chảy quá cao, hiệu quả tách sẽ giảm, trong khi tốc độ chảy quá thấp có thể kéo dài thời gian và ảnh hưởng đến tiến độ công việc Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là một phương pháp quan trọng trong quá trình này.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là một phương pháp phân tích dung dịch trong đó chất phân tích di chuyển trên lớp mỏng chất hấp phụ, thường là silica gel, theo một chiều nhất định Mỗi thành phần trong dung dịch di chuyển với tốc độ khác nhau, dẫn đến việc chúng dừng lại ở các vị trí khác nhau Để thực hiện SKLM, chất tan được chấm lên bản và sấy khô, sau đó triển khai trong một bình kín với hệ dung môi thích hợp Việc kiểm tra vết chất có thể thực hiện bằng thuốc thử hiện màu hoặc ánh sáng UV, trong đó thuốc thử có thể là hơi amoniac hoặc dung dịch acid sunfuric 10% Sau khi nhúng hoặc phun thuốc thử lên bản mỏng, cần hơ trên bếp điện để vết xuất hiện từ từ Phương pháp này rất hữu ích trong việc kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột.
Một hình thức SKLM khác trong nghiên cứu hợp chất tự nhiên là SKLM điều chế, được sử dụng để thu trực tiếp chất khi lượng hợp chất mong muốn ít Phương pháp này thực hiện tương tự như SKLM thông thường; sau khi triển khai, tiến hành soi UV để xác định vết chất, sau đó cạo lớp silica gel chứa chất cần điều chế và rửa giải để thu được chất.
2.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất [3]
Khi phân lập hợp chất hữu cơ, việc xác định cấu trúc của chúng là rất quan trọng Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ cần được xác định chính xác để hiểu rõ tính chất và ứng dụng của chúng.
LVTHS Khoa học nghiên cứu định sử dụng các phương pháp phổ kết hợp để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất Trong một số trường hợp, việc xác định chính xác yêu cầu kết hợp với các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa học và các phương pháp sắc ký so sánh.
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại trong khoảng tần số 10.000 ÷ 100.000 cm -1, chuyển hóa thành năng lượng dao động phân tử Phổ hồng ngoại được hình thành từ sự khác biệt trong dao động của các liên kết trong phân tử khi chịu tác động của tia hồng ngoại.
Tần số và độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của nguyên tử, các liên kết và cấu trúc hình học của chúng Mỗi loại liên kết có một vùng bước sóng đặc trưng riêng Nhờ vào phổ hồng ngoại, chúng ta có thể xác định các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, chẳng hạn như dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl nằm trong khoảng 3300 ÷ 3450 cm -1, và của nhóm cacbonyl trong khoảng 1700 ÷ 1750 cm -1.
2.2.5 Phổ tử ngoại UV-VIS [7]
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và khả kiến của hợp chất hữu cơ phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử, dẫn đến sự chuyển dịch điện tử từ orbitan cơ bản lên các orbitan năng lượng cao hơn Tuy nhiên, chỉ một số cấu trúc nhất định trong hợp chất hữu cơ mới có khả năng hấp thụ này, làm hạn chế ứng dụng của phổ UV chủ yếu ở các hợp chất có hệ thống nối đôi liên hợp.
Phương pháp phổ khối (MS) dựa trên nguyên tắc phân mảnh ion của các phân tử khi bị bắn phá bởi chùm ion bên ngoài Phổ MS cung cấp các đỉnh ion mảnh, từ đó cho phép xác định cơ chế phân mảnh của các phân tử chất.
LVTHS Khoa học nghiên cứu và tái tạo cấu trúc của hợp chất, sử dụng nhiều loại phổ khối lượng khác nhau Dưới đây là các phương pháp chính được áp dụng trong lĩnh vực này.
Phổ khối lượng va chạm điện tử (EI-MS) được xác định dựa trên quá trình phân mảnh ion khi chịu tác động của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, trong đó năng lượng phổ biến nhất là 70 eV.
Đo điểm chảy
LVTHS nghiên cứu hai loại tinh thể được hình thành qua hai lần kết tinh với chênh lệch nhiệt độ không quá 2-3 độ C, cho thấy sản phẩm kết tinh đạt độ tinh khiết cao.
Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học cây Dung lụa
Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254 (Merck-Đức) Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 366 nm Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng và sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silicagel 240÷430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (ODS-60-14/63, YMC-RP18, Fujisilica- Nhật Bản)
2.5.2: Xác định tính chất vật lý và cấu trúc hóa học các hợp chất Điểm nóng chảy được xác định bằng máy Mel-Temp 3.0 (Thermo Scientific) của Viện Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hoá sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phổ NMR được ghi bằng máy BRUKER AVANCE 500 MHz của Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1 H-, 13 C-NMR, DEPT
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR): HSQC, HMBC
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: DMSO-d 6 , CD 3 OD, CDCl 3
Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Các phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.6.1 Phương pháp thử hoạt tính giảm đau [17, 39, 47, 49] a, Vật liệu
M ẫu nghiên cứu: mẫu cao chiết tổng từ bột cành, lá cây Dung lụa
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm axit acetic, nước muối sinh lý 0.9% và nước cất Đối tượng thí nghiệm là chuột BALB/c khỏe mạnh, không mắc bệnh, không phân biệt giới tính, có trọng lượng từ 20-22g, được nuôi tại khu vực nuôi động vật.
Viện Công nghệ sinh học
D ụng cụ thí nghiệm : pipet, cân, dụng cụ cho uống, thước kẹp và các thiết bị phụ trợ khác b, Phương pháp
Phương pháp xác định hoạt tính giảm đau theo Shah S M et al (2015) được thực hiện bằng cách chia động vật thành các lô 6 con/lô Tất cả chuột được tiêm dung dịch acetic acid (10 ml/kg, 0,6%) vào xoang bụng 30 phút sau khi uống dịch chiết nghiên cứu (250 và 500 mg/kg), nước cất hoặc Aspirin (100 mg/kg) Số cơn đau quặn được đếm sau 5 phút tiêm acetic acid và trong 20 phút tiếp theo Phần trăm ức chế được tính toán bằng cách so sánh kết quả giữa nhóm uống dịch chiết và nhóm đối chứng.
2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm [30, 39, 47] a, Vật liệu
M ẫu nghiên cứu: mẫu cao chiết tổng từ bột cành, lá cây Dung lụa
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm Carrageenin (Sigma) và Acetyl salicylic acid (ASA) Mẫu động vật được chọn là chuột thuần chủng dòng BALB/c, đảm bảo sức khỏe tốt, không mắc bệnh và đạt tiêu chuẩn thí nghiệm với khối lượng từ 22-24g.
D ụng cụ thí nghiệm : Kim uống, thước kẹp
LVTHS Khoa học nghiên cứu b, Phương pháp
*Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm
Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm được tiến hành theo phương pháp của Shah S M et al., (2015)
Bố trí thí nghiệm: 24 chuột chia 4 lô (6 con/lô).
- Lô 1: uống nước 0,2-0,3 ml/con
- Lô 2: uống Acetic salicylic acid (ASA) liều 100mg/kg
- Lô 3: uống mẫu liều 250 mg/kg
- Lô 4: uống mẫu liều 500 mg/kg
Pha hóa chất và mẫu nghiên cứu: Carrageenin pha trong nước muối ở nồng độ 1%
Để tiến hành thí nghiệm, tiêm Carrageenin 1% vào mô đệm chân chuột một giờ trước khi cho uống mẫu hoặc thuốc Sau đó, đo độ dày của khối viêm sưng tại các thời điểm 0.5, 1, 2, 3, 4 và 5 giờ sau khi gây viêm.
Phương pháp xác định interleukin được thực hiện bằng cách sử dụng bộ kit ELISA (Abcam), tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất và các thành phần đi kèm trong bộ kit.
Thêm 100 µl mẫu thử (huyết thanh chuột thí nghiệm, pha loãng 100 lần) vào các giếng thí nghiệm của đĩa ELISA (trong bộ kit) và 100 µl môi trường DMEM làm đối chứng âm Ủ bản ở 37 độ C trong 90 phút.
*Loại bỏ dịch nổi và thờm100 àl khỏng thể IL gắn biotin vào cỏc giếng thớ nghiệm Ủ đĩa ELISA thí nghiệm ở 37 o C trong 60 phút
*Rửa bản 5 lần bằng PBS 0.01M, thờm100 àl Avidin- Peroxidase Complex vào các giếng thí nghiệm Ủ bản ở 37 o C trong 30 phút
*Rửa bản 5 lần bằng PBS 0.01M, thờm 90 àl cơ chất TMB vào cỏc giếng thớ nghiệm Ủ bản ở 37 o C, tránh ánh sáng trong 20-25 phút Dừng phản ứng bằng
LVTHS Khoa học nghiên cứu
*Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader ở bước sóng
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham ex D Don) được thu hái tại vùng núi Tam Đảo, Vĩnh Phúc vào tháng 3 năm 2013 Việc xác định tên khoa học được thực hiện bởi PGS TS Trần Huy Thái từ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tiêu bản mang ký hiệu BK-B02 và hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Hoá Hữu cơ, trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Mẫu cành và lá cây Dung lụa được hong khô ở ngoài không khí, rồi sấy khô ở 40 o C, sau đó được xay thành bột mịn
LVTHS Khoa học nghiên cứu
THỰC NGHIỆM
Điều chế các phần chiết từ cây Dung lụa
Phương pháp chiết đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập các hợp chất thuộc các lớp chất mong muốn Để thu được các phần chiết giàu, cần áp dụng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Bột cành lá cây Dung lụa (4kg) được ngâm trong 10 lít methanol trong bình thủy tinh 20 lít, sử dụng máy siêu âm ở 40°C trong 30 phút, sau đó lắng và gạn lọc 3 lần để thu dịch chiết Phần bã tiếp tục ngâm với 10 lít methanol và lặp lại quy trình 3 lần Các dịch chiết methanol được gộp lại và cô quay dưới áp suất giảm, thu được 300 g cặn chiết tổng Cặn này được thêm 2 lít nước và chiết với 1,5 lít n-hexane, lặp lại 3 lần, sau đó gạn lọc và cô quay để loại bỏ dung môi Cuối cùng, cặn còn lại được chiết với 1,5 lít EtOAc, lặp lại 3 lần, gộp dịch chiết, rồi lọc và cô quay để thu được phần chiết EtOAc (63,70 g – ký hiệu E) và phần dịch nước.
Quy trình chiết phân đoạn mẫu thực vật được thể hiện ở sơ đồ dưới đây.
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Sơ đồ 1: Quy trình chiết mẫu thực vật
Chi ết bằng 1,5l EtOAc x 3 lần
Cặn dịch chiết pha nước
Cặn dịch chiết pha nước D EtOAc ịch chiết
C ất loại dung môi dưới áp suất giảm
Bột cành lá Dung lụa (4kg)
Ngâm chi ết với 10l MeOH, siêu âm 30’ ở 40 0 C, l ặp l ại 3 lần Thu dịch chiết
Cặn dịch chiết pha nước
Hòa tan c ặn chiết bằng 2l nước cất
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Phân l ập các chất từ các phần chiết
3.2.1 Phân tách phần chiết EtOAc
Kết quả khảo sát sắc ký bản mỏng cho thấy hệ dung môi n-hexane/acetone và dichloromethane/methanol là lựa chọn tối ưu để phân tách phần chiết EtOAc trên chất hấp phụ Do đó, tôi đã quyết định sử dụng hai hệ dung môi này cho quá trình rửa giải trong sắc ký cột, với n-hexane/acetone (gradient, 0/100 – 100/0, v/v) và dichloromethane/methanol (gradient, 10/1-1/10, v/v) được thực hiện liên tiếp.
(Tên các phần chiết E x.y được đặt theo quy tắc: x- số lần phân tách; y- phân đoạn nhỏ trong lần phân tách x)
Tiến hành phân tách cặn EtOAc (63,70 g) trên cột sắc ký silica gel (Merch, cỡ hạt 40-63 àm) với hệ dung mụi rửa giải n-hexane/acetone (gradient,
0/100-100/0, v/v) và hệ dichloromethane/methanol (gradient, 10/1-1/10, v/v) thu được 10 phân đoạn từ E 1.1 đến E 1.10
Phân đoạn E 1.4 (2,36 g) được tách trên cột sắc ký silica gel với dung môi dichloromethane/EtOAc tỷ lệ 25/1, tạo ra các phân đoạn E 2.1 đến E 2.12 Từ phân đoạn E 2.6, thu được tinh thể dạng bột, sau khi rửa bằng dichloromethane, thu được chất tinh khiết SS-1 (31 mg).
Quy trình phân tách phần chiết EtOAc được trình bày ở sơ đồ 2
3.2.2: Phân tách ph ần chiết E 1.5 (12,8 g)
Phân đoạn E 1.5 (12,8 g) được tách trên cột silica gel pha thường bằng hệ dung môi n-hexane/acetone với tỷ lệ (4/1) và (1/1, v/v), tạo ra các phân đoạn E 3.1 đến E 3.6 Tiếp theo, phân đoạn E 3.5 (3,3 g) được xử lý trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexane/dichlorometan/EtOAc theo tỷ lệ 2/6/1, cho ra các phân đoạn từ E.
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Sử dụng phương pháp sắc ký cột trên chất hấp phụ silica gel với kích thước hạt 40-63 µm, kết hợp hệ dung môi n-hexane/dichlorometan/EtOAc theo tỷ lệ thể tích 1/4/3, chúng tôi đã thu được chất tinh khiết được ký hiệu là SS-2 thông qua phương pháp kết tinh phân đoạn.
Phân đoạn E 4.2 đã được tách biệt trên cột sắc ký pha thường bằng hệ dung môi n-hexane/Dichloromethane/EtOAc với tỷ lệ thể tích 2/16/0,5 (v/v/v), từ đó thu được chất sạch SS-3 với khối lượng 885,8 mg.
Quá trình phân tách phân đoạn E 1.5 được trình bày ở sơ đồ 3
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Sơ đồ 2: Quy trình phân tách phần chiết EtOAc của Dung lụa
D ạng bột, màu tr ắng
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Sơ đồ 3: Quy trình phân tách phân đoạn E 1.5
D ạng bột màu tr ắng
LVTHS Khoa học nghiên cứu
3.2.3 : Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được a, Hợp chất SS-1: betulinic acid
Dạng bột màu trắng, không hiện màu dưới bước sóng UV 254 nm và 365 nm Khối lượng thu được là 31 mg và đạt độ tinh khiết cao
Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất SS-1:
1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD), δ H (ppm): 0,77 (3H, s); 0,88 (3H, s); 0,97(3H, s); 0,99 (3H, s); 1,03 (3H, s); 1,72(3H, s); 3,15 (1H, d, J=2,0, 2,6 Hz, H-3); 4,61 (1H, br s, H-29a); 4,73 (1H, br s, H-29b)
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD), δ C (ppm): 40,09 (C-1); 26,90 (C-2); 79,68 (C-3); 39,96 (C-4); 56,89 (C-5); 19,45 (C-6); 35,61(C-7); 41,94 (C-8); 52,01 (C- 9); 38,42 (C-10), 22,10 (C-11); 28,05 (C-12); 39,69 (C-13); 43,59 (C-14); 30,85 (C-15); 33,35 (C-16); 57,50 (C-17); 49,51 (C-18); 48,49 (C-19); 151,99 (C-20); 31,72 (C-21); 38,14 (C-22); 28,61 (C-23); 16,10 (C-24); 16,65 (C-25); 16,73 (C- 26); 15,11 (C-27); 180,05 (C-28); 110,16 (C-29); 19,56 (C-30) b, Hợp chất SS-2: maslinic acid
Dạng chất bột màu trắng, không hiện màu dưới bước sóng UV 254 nm và
365 nm Điểm nóng chảy 248 – 250 0 C Khối lượng thu được là 46 mg và đạt độ tinh khiết cao
Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất SS-2:
1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD), δ H (ppm): 0,69(3H, s); 0,70 (3H, s); 0,87(3H, s); 0,89(3H, s); 0,90 (3H, s); 0,92 (3H, s); 1,09(3H, s)
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD), δ C (ppm): 46,91 (C-1); 67,38 (C-2); 82,37 (C-3); 39,00 (C-4); 54,87 (C-5); 18,16 (C-6); 32,22 (C-7); 39,05 (C-8); 47,18 (C-9); 38,42 (C-10), 23,11 (C-11); 121,86 (C-12); 144,02 (C-13); 41,47 (C-14); 27,27 (C-15); 22,70 (C-16); 45,58 (C-17); 40,92 (C-18); 45,80 (C-19); 30,79
LVTHS Khoa học nghiên cứu
Chất SS-3 là một dạng keo màu vàng nâu, có khả năng chuyển sang màu tím khi tiếp xúc với sóng UV 254nm và hiện màu vàng cam khi được thử nghiệm với thuốc thử Cerin sulfate Khối lượng thu được của chất này là 885,8 mg.
Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất SS-3:
1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD), δ H (ppm): 6,64 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5), 6,61 (1H, d, J=2,0, H-6), 2,91 (1H, m, H-7,7’), 2,49 (1H, m, H-8,8’), 3,88 (1H, m, H-9a), 4,13 (1H, m, H-9b), 6,46 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,55 (1H, d, J = 2,0, H-6’), 3,88 (3H, m, 3-OCH 3 ), 3,81 (3H, m, 3’-OCH 3 ) và 3,86 (3H, m, 4-OCH 3 )
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD), δ C (ppm): 130,45 (C-1); 111,55 (C-2);
LVTHS Khoa học nghiên cứu