83 Trang 6 DANH MỤC Kí HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Cỏc phương phỏp sắc ký: CC :Sắc ký cột Column Chromatography TLC : Sắc ký lớp mỏng Thin-layer Chromatography Cỏc phương phỏp phổ: MS : Phổ k
TỔNG QUAN
Vài nét v ề họ Symplocaceae
Họ Symplocaceae (họ Dung) thuộc bộ Ericales (bộ Thạch nam) chỉ có 1 chi
Symplocos với khoảng 320 loài, có nguồn gốc châu Á, Trung Mỹ và Nam Mỹ
Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trừ châu Phi, châu Âu và Tây Á, hiện tại Việt Nam có khoảng 35 loài thuộc họ này Các loài thường là cây gỗ hoặc cây bụi, với lá đơn, dày, có khía răng cưa, mọc cách và thiếu lá kèm, thường có màu vàng nhạt và khi khô chuyển sang xanh vàng Hoa mọc thành cụm với các hoa nhỏ, có 1 lá hoa và 2 lá hoa con mọc đối nhau hoặc ở đỉnh cuống hoa Cánh hoa hợp sinh tại gốc, bầy nhụy nhỏ, đài từ 5 đến 2 hợp, tràng có 5 đến 4 cánh trắng, sớm rụng Nhị đính thành bó hoặc thành ống, đính trên ống tràng, bầu dưới Quả là loại hạch, thường có hình bầu dục hoặc hình thoi với vết tích đài chụm lớn ở đỉnh.
Chi Symplocos và cây Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don
Luận văn thạc sĩ khoa học
Chi Symplocos bao gồm khoảng 320 loài, trong đó Việt Nam có khoảng 35 loài, nổi bật như Dung đất (Symplocos racemosa), cây Dung lá táo (S chinensis) và Dung đắng (S cochinchinensis).
Cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don), còn được biết đến với các tên gọi dân gian như cây Dung dẻo, Dung trứng, Dung đuôi, Nhỏ la, và Mat no (Mọi), là một loại cây có nhiều tên khoa học tương đương.
Symplocos caudata Wall.ex G Don, S botryantha Franh, S tonkinensis
Dung lụa là cây bụi hoặc cây gỗ cao tới 8m, với thân cây đường kính 25cm và gỗ có màu vàng Nhánh non của cây không có lông, trong khi lá có phiến hơi dai, dài từ 7 đến 8cm, có mùi dầu và màu lục khi khô Cuống lá dài khoảng 5mm Chùm hoa dài từ 1,5 đến 2cm, hoa có cuống với lá đài có lông ở mép, tràng hoa dài 3mm và khoảng 40 nhị Bầu hoa có 3 ô, và quả của cây có hình xoan bầu dục, dài từ 6 đến 10mm với vỏ mỏng và chứa một hạt bên trong Dung lụa ra hoa và kết quả gần như quanh năm.
Cây Dung lụa mọc rải rác trong rừng thưa, rừng thứ sinh ở độ cao 1.200 đến 1.700m ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Lào,
Cây phân bố rải rác từ Bắc vào Nam tại Việt Nam, chủ yếu mọc ở các khu vực như Quảng Nam, Đà Nẵng, Kontum, Gia Lai, Đắc Lắc và Lâm Đồng, theo thông tin từ Trung tâm dữ liệu thực vật Việt Nam.
Hình 1 : Một vài hình ảnh cây Dung lụa ( Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don)
Luận văn thạc sĩ khoa học
Theo nghiên cứu toàn cầu, đã có 28 công trình công bố về thành phần hóa học của chi Symplocos.
Đã có 90 hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc, bao gồm các lớp hóa học như flavonoid, lignan, phenolic, steroid, alkaloid và iridoid Đặc biệt, lớp chất triterpenoid là nổi bật nhất trong số này.
1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học chi Symplocos và cây Dung lụa
(Symplocos sumuntia Buch.-Ham Ex D Don)
Triterpenoid là nhóm hợp chất chính trong chi Symplocos, nổi bật với hoạt tính sinh học quan trọng, nhưng chỉ một số ít có giá trị trong y học và dược học Nghiên cứu gần đây cho thấy triterpenoid có khả năng chống khối u và chống HIV Tuy nhiên, các sàng lọc sơ bộ cho thấy các hợp chất này chỉ thể hiện hoạt tính yếu, cần có thêm nghiên cứu để khẳng định hiệu quả của chúng.
Năm 2004, Pierre và cộng sự đã công bố một nghiên cứu quan trọng, trong đó họ đã phân lập thành công 34 triterpenoid từ các loài thuộc chi Symplocos, bao gồm các dẫn xuất có khung lupane, oleanane và ursane Đặc biệt, nghiên cứu này đã phát hiện ra 9 chất mới trong số các hợp chất được phân lập.
9) oleanolic axit 3-O-glucuronide bidesmosidic từ vỏ thân S glomerata và 2 saponin đã biết là salsoloside C (10) và copteroside E (11) Các chất được xác định cấu trúc bằng phương pháp quang phổ
Luận văn thạc sĩ khoa học
Năm 2004, Tang và cộng sự đã phân lập được 6 triterpenoid saponin từ phần chiết n-BuOH của rễ cây S chinensis, được đặt tên là symplocososides A – F Trong số các hợp chất này, symplocososide A là một trong những thành phần quan trọng.
(12), C (14) và F (17) có tính chống lại một số dòng tế bào ung thư (KB) [35]
Bên cạnh đó 5 dẫn xuất oleanane (18 – 22), 9 dẫn xuất ursane (23 – 31), và
3 dẫn xuất khung lupane (32 – 34) cũng được tìm thấy từ các loài trong chi
Luận văn thạc sĩ khoa học
18 OH Oglc HOCH 2 Me COOGlc OH
Luận văn thạc sĩ khoa học
23 α-OH β-Oglc HOCH 2 Me COOGlc OH
24 H β-OH Me Me Me OH
25 β-OH β-OH H HOCH 2 COOH OH
27 α-OH β-OH HOCH 2 Me COOH OH
28 α-OH β-OH HOCH 2 Me COOH OH
Flavonoid là các hợp chất polyphenol có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học đa dạng Chúng tồn tại phổ biến trong nhiều bộ phận của cây, đặc biệt là trong các loại trái cây và rau củ.
Luận văn thạc sĩ khoa học tế bào thực vật quang hợp Các flavonoid không được tổng hợp ở người và động vật
Năm 1989, Dhaon và cộng sự đã phân lập được 6 dẫn xuất flavan (35-40),
5 dihydrochalcone glucoside (41-45) và 8 flavonol (46-53) từ các loài của chi
Symplocos Cùng với đó là công trình nghiên cứu đã công bố của các nhà khoa học theo trích dẫn [26, 34, 40, 41, 46, 50, 52, 53, 54]
45 OH Oglc OH OH OH
Luận văn thạc sĩ khoa học
Một dibenzylbutane lignan (54), hai dibenzyltyrolactone lignans (55-56), được biết đến từ cây S setchuensis và S lancifolia Sáu ditetrahydrofuran lignans (57-62), hai benzofurans lignans (63-64), và 8-O-4’-neolignan (65), được phân lập từ chi Symplocos.[19, 22, 23, 24,26, 59]
Luận văn thạc sĩ khoa học
Vào năm 2003-2004, nhóm nghiên cứu của tác giả Ahmad và cộng sự đã phân lập thành công 7 phenolic glycoside mới cùng với 1 phenolic glycoside đã được biết đến từ cây S racemora Những hợp chất này cho thấy khả năng ức chế hiệu quả nọc rắn độc, tác động lên phosphodiesterase I và nucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase của con người.
Những dẫn xuất phenol khác (74 – 81) được phân lập từ S lancifolia, S racemosa, và S.caudata [23, 25, 26]
Luận văn thạc sĩ khoa học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Vào năm 1983, Frotan và các cộng sự đã phân lập thành công α-spinasterol (82) từ cây S spicata, hợp chất này cho thấy khả năng kháng viêm tốt khi được thử nghiệm trên chuột.
Năm 2005, Abbasi cùng cộng sự đã phân lập được một số ethyl glucoside [83,
Hai hợp chất từ cây S rasemosa đã được xác định cấu trúc thông qua các phương pháp phân tích 2D-NMR như COSY, HMQC và HMBC Các glucoside này cho thấy khả năng ức chế enzyme lipoxygenase và urease, mở ra tiềm năng ứng dụng trong y học.
Vào năm 2001, Junko và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về chất harman được chiết xuất từ cây S setchuensis, cho thấy chất này có khả năng ức chế sự nhân đôi của virus HIV trong tế bào bạch cầu H9 khi sử dụng với liều lượng thích hợp.
PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Quá trình chi ết thực vật
Việc chọn lựa dung môi cho quá trình chiết là rất quan trọng; dung môi cần có khả năng hòa tan các chất nghiên cứu, dễ dàng loại bỏ, không phản ứng với chất nghiên cứu, đồng thời phải an toàn và khó bốc cháy.
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực, vượt trội hơn so với hydrocarbon Các dung môi thuộc nhóm rượu này có khả năng thấm qua màng tế bào tốt hơn, dẫn đến việc chiết xuất các thành phần trong tế bào một cách hiệu quả hơn.
Chloroform có khả năng phân cực thấp, giúp rửa các chất nằm ngoài tế bào Các ancol có khả năng hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cũng như các hợp chất phân cực trung bình và thấp Do đó, khi chiết xuất bằng ancol, các chất này sẽ được hòa tan đồng thời Dung môi cồn trong nước, đặc biệt là dung dịch methanol, thường được sử dụng vì có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cất quay dưới áp suất giảm, với nhiệt độ không vượt quá 30 đến 40 độ C Đối với một số hóa chất chịu nhiệt, quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn.
Có hai phương pháp chiết xuất, trong đó phương pháp sử dụng bình chiết Soxhlet là phổ biến Đây là kỹ thuật chiết nóng, trong đó dung môi được đun sôi và hồi lưu với chất rắn trong một khoảng thời gian nhất định, sau đó thu hồi dung môi Phương pháp này cho phép chiết xuất nhiều lần liên tục, giúp tiết kiệm dung môi hiệu quả.
Luận văn thạc sĩ khoa học
Ngâm chất rắn vào dung môi trong một khoảng thời gian và sau đó chiết dung môi ra (chiết nguội) là phương pháp phổ biến nhất trong chiết xuất thực vật Phương pháp này không yêu cầu nhiều thiết bị và kỹ thuật phức tạp Quá trình chiết xuất có thể được xác định kết thúc bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Để kiểm tra sự xuất hiện của các alkaloid, có thể sử dụng phương pháp tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như Dragendorff và Mayer.
Khi các lacton của sesquiterpen và glucozit trợ tim phản ứng với aniline axetat, điều này cho thấy sự hiện diện của hydrat cacbon Từ đó, chúng ta có thể xác định thời điểm kết thúc quá trình chiết xuất.
Tùy thuộc vào mục đích sử dụng, việc lựa chọn dung môi phù hợp là rất quan trọng để chiết xuất chất hiệu quả Quy trình chiết cần được thực hiện một cách hợp lý nhằm đạt được hiệu suất tối ưu.
T ổng quan chung về phương pháp sắc ký
2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh
Khi tiếp xúc với pha tĩnh trong hệ sắc ký, các thành phần của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh dựa trên tính chất như tính bị hấp phụ và tính tan Mỗi chất có ái lực khác nhau với hai pha này, dẫn đến sự khác biệt trong tốc độ di chuyển của chúng Trong quá trình pha động di chuyển qua các lớp pha tĩnh, quá trình hấp phụ và phản hấp phụ sẽ diễn ra liên tục, khiến các chất có ái lực lớn với pha tĩnh di chuyển chậm hơn trong hệ thống sắc ký.
Luận văn thạc sĩ về khoa học các chất tương tác yếu cho phép tách biệt các chất thông qua quá trình sắc ký nhờ vào đặc điểm này.
2.2.2 Phân loại các phương pháp sắc ký
Sắc ký là một phương pháp phân tích dựa trên sự tương tác giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha động có thể ở trạng thái khí hoặc lỏng, còn pha tĩnh có thể là lỏng hoặc rắn Sắc ký được chia thành hai nhóm chính: sắc ký khí và sắc ký lỏng Trong đó, sắc ký cột là phương pháp phổ biến nhất, sử dụng chất hấp phụ là pha tĩnh, thường là silica gel với kích thước hạt khác nhau, cùng với các loại pha như YMC, ODS, và Dianion Chất hấp phụ này được nhồi vào cột, thường là cột thủy tinh, để tiến hành quá trình phân tách.
Kích thước hạt của chất hấp phụ ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân tách; hạt nhỏ hơn mang lại hiệu quả phân tách cao hơn Tuy nhiên, kích thước hạt nhỏ cũng làm giảm tốc độ chảy Trong trường hợp trọng lực không đủ lớn, hiện tượng tắc cột có thể xảy ra, khiến dung môi không thể chảy qua Để khắc phục tình trạng này, cần áp dụng áp suất, có thể là áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L), L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách – tức là phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể
Tùy thuộc vào lượng và dạng chất, có nhiều phương pháp để đưa chất lên cột Đối với lượng chất lớn và chạy thô, phương pháp phổ biến là tẩm chất lên silica gel, sau đó làm khô cho đến khi tơi hoàn toàn trước khi đưa lên cột Trong trường hợp tách tinh, chất được hòa tan bằng dung môi chạy cột và đưa trực tiếp lên cột với thể tích tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
Luận văn thạc sĩ khoa học
Tốc độ chảy của dung môi đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả tách Tốc độ dòng chảy quá lớn có thể làm giảm hiệu quả tách, trong khi tốc độ chảy quá thấp sẽ kéo dài thời gian và ảnh hưởng đến tiến độ công việc Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là một phương pháp cần được xem xét trong bối cảnh này.
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất dựa trên sự di chuyển của các thành phần trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ Quá trình di chuyển này tạo ra sự phân tách các thành phần dựa trên bản chất của chúng, với mỗi thành phần dừng lại ở vị trí khác nhau Thông thường, silica gel tráng sẵn trên đế nhôm hay đế thủy tinh được sử dụng làm chất hấp phụ trong SKLM Để kiểm tra vết chất, người ta có thể sử dụng thuốc thử hiện màu như hơi amoniac hoặc dung dịch acid sunfuric 10%, hoặc soi bằng đèn UV Phương pháp này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột.
Một hình thức sắc ký lớp mỏng (SKLM) khác được áp dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên là SKLM điều chế, thường được sử dụng để thu nhận chất trực tiếp khi lượng hợp chất mong muốn là ít Phương pháp này thực hiện tương tự như SKLM thông thường; sau khi hoàn tất, tiến hành soi UV để xác định vết chất, sau đó cạo lấy lớp silica gel chứa chất cần điều chế và thực hiện rửa giải để thu nhận chất.
2.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất [3]
Khi phân lập thành công một hợp chất hữu cơ, việc xác định cấu trúc của nó là rất quan trọng Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ cần được xác định một cách chính xác để hiểu rõ tính chất và ứng dụng của chúng.
Luận văn thạc sĩ khoa học định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất Để đạt được độ chính xác cao, cần sử dụng các phương pháp bổ sung như chuyển hóa học và các phương pháp sắc kí so sánh.
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại trong khoảng tần số 10.000 ÷ 100.000 cm -1, chuyển đổi thành năng lượng dao động phân tử Phổ hồng ngoại được hình thành từ sự khác biệt trong dao động của các liên kết trong phân tử khi bị kích thích bởi tia hồng ngoại.
Tần số và độ dài sóng hấp thụ của các chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của nguyên tử, kiểu liên kết và cấu trúc hình học của chúng Mỗi kiểu liên kết đặc trưng bởi một vùng bước sóng riêng biệt, cho phép xác định các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất thông qua phổ hồng ngoại Ví dụ, dao động hóa trị của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl nằm trong khoảng 3300 ÷ 3450 cm -1, trong khi nhóm cacbonyl có tần số hấp thụ từ 1700 ÷ 1750 cm -1.
2.2.5 Phổ tử ngoại UV-VIS [7]
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và khả kiến của hợp chất hữu cơ phụ thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử, dẫn đến việc chuyển dịch các điện tử từ orbitan cơ bản lên các orbitan năng lượng cao hơn Tuy nhiên, chỉ một số cấu trúc trong hợp chất hữu cơ mới có khả năng hấp thụ này, do đó ứng dụng phổ UV chủ yếu giới hạn ở các hợp chất có hệ thống nối đôi liên hợp.
Phương pháp phổ khối (MS) hoạt động dựa trên nguyên tắc phân mảnh ion của phân tử khi bị bắn phá bởi chùm ion bên ngoài Qua phổ MS, các đỉnh ion mảnh xuất hiện cho phép xác định cơ chế phân mảnh của các phân tử chất.
Luận văn thạc sĩ khoa học tập trung vào việc phân tích và tái cấu trúc hợp chất thông qua các phương pháp phổ khối lượng Hiện nay, có nhiều loại phổ khối lượng khác nhau, mỗi loại đều có những ứng dụng và ưu điểm riêng, giúp nâng cao hiệu quả trong việc nghiên cứu và xác định cấu trúc hóa học.
Đo điểm chảy
Điểm chảy là một tiêu chuẩn vật lý quan trọng đối với chất rắn kết tinh, giúp đo lường mức độ tinh khiết của hợp chất.
Luận văn thạc sĩ khoa học cho thấy rằng hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh với chênh lệch nhiệt độ không quá 2-3 độ C có thể được coi là sản phẩm kết tinh tinh khiết.
Các phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học cây Dung lụa
Sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và RP18 F254 của Merck-Đức Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 và 366 nm, hoặc thông qua việc sử dụng dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng và sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi xuất hiện màu.
Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (Silicagel 240÷430 mesh, Merck) hoặc pha đảo (ODS-60-14/63, YMC-RP18, Fujisilica- Nhật Bản)
2.5.2: Xác định tính chất vật lý và cấu trúc hóa học các hợp chất Điểm nóng chảy được xác định bằng máy Mel-Temp 3.0 (Thermo Scientific) của Viện Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hoá sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phổ NMR được ghi bằng máy BRUKER AVANCE 500 MHz của Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): 1 H-, 13 C-NMR, DEPT
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR): HSQC, HMBC
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: DMSO-d 6 , CD 3 OD, CDCl 3
Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu thử
Luận văn thạc sĩ khoa học
Các phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.6.1 Phương pháp thử hoạt tính giảm đau [17, 39, 47, 49] a, Vật liệu
M ẫu nghiên cứu: mẫu cao chiết tổng từ bột cành, lá cây Dung lụa
Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm axit acetic, nước muối sinh lý 0.9% và nước cất Đối tượng thí nghiệm là chuột BALB/c khỏe mạnh, không mắc bệnh, không phân biệt giới tính, có khối lượng từ 20-22g, được nuôi tại khu vực nuôi động vật.
Viện Công nghệ sinh học
D ụng cụ thí nghiệm : pipet, cân, dụng cụ cho uống, thước kẹp và các thiết bị phụ trợ khác b, Phương pháp
Phương pháp xác định hoạt tính giảm đau được thực hiện theo nghiên cứu của Shah S M et al (2015), trong đó động vật được chia thành các lô gồm 6 con mỗi lô Các chuột được tiêm dung dịch acetic acid (10 ml/kg, 0,6%) vào xoang bụng sau khi uống dịch chiết nghiên cứu với liều lượng 250 và 500 mg/kg, hoặc uống nước cất hoặc Aspirin (100 mg/kg) Cơn đau quặn được đếm sau 5 phút tiêm acetic acid và tiếp tục trong 20 phút Phần trăm ức chế được xác định bằng cách so sánh kết quả của nhóm uống dịch chiết với nhóm đối chứng.
2.6.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm [30, 39, 47] a, Vật liệu
M ẫu nghiên cứu: mẫu cao chiết tổng từ bột cành, lá cây Dung lụa
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm Carrageenin (Sigma) và Acetyl salicylic acid (ASA) Đối tượng thí nghiệm là chuột thuần chủng dòng BALB/c khỏe mạnh, không mắc bệnh, với khối lượng từ 22-24g, đảm bảo tiêu chuẩn cho các thí nghiệm.
D ụng cụ thí nghiệm : Kim uống, thước kẹp
Luận văn thạc sĩ khoa học b, Phương pháp
*Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm
Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm được tiến hành theo phương pháp của Shah S M et al., (2015)
Bố trí thí nghiệm: 24 chuột chia 4 lô (6 con/lô).
- Lô 1: uống nước 0,2-0,3 ml/con
- Lô 2: uống Acetic salicylic acid (ASA) liều 100mg/kg
- Lô 3: uống mẫu liều 250 mg/kg
- Lô 4: uống mẫu liều 500 mg/kg
Pha hóa chất và mẫu nghiên cứu: Carrageenin pha trong nước muối ở nồng độ 1%
Để tiến hành thí nghiệm, tiêm Carrageenin 1% vào mô đệm chân chuột trước khi cho uống mẫu hoặc thuốc 1 giờ Sau đó, đo độ dày của khối viêm sưng tại các thời điểm 0.5, 1, 2, 3, 4 và 5 giờ sau khi gây viêm.
Phương pháp xác định interleukin được thực hiện thông qua bộ kit ELISA (Abcam), tuân theo hướng dẫn chi tiết của nhà sản xuất và sử dụng đầy đủ các thành phần có trong bộ kit.
Thêm 100 µl mẫu thử huyết thanh chuột (pha loãng 100 lần) vào các giếng thử nghiệm của đĩa ELISA trong bộ kit, cùng với 100 µl môi trường DMEM làm đối chứng âm Sau đó, ủ bản ở nhiệt độ 37 độ C trong 90 phút.
*Loại bỏ dịch nổi và thờm100 àl khỏng thể IL gắn biotin vào cỏc giếng thớ nghiệm Ủ đĩa ELISA thí nghiệm ở 37 o C trong 60 phút
*Rửa bản 5 lần bằng PBS 0.01M, thờm100 àl Avidin- Peroxidase Complex vào các giếng thí nghiệm Ủ bản ở 37 o C trong 30 phút
*Rửa bản 5 lần bằng PBS 0.01M, thờm 90 àl cơ chất TMB vào cỏc giếng thớ nghiệm Ủ bản ở 37 o C, tránh ánh sáng trong 20-25 phút Dừng phản ứng bằng
Luận văn thạc sĩ khoa học
*Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader ở bước sóng
Đối tượng nghiên cứu
Cây Dung lụa (Symplocos sumuntia Buch.-Ham ex D Don) được thu hái tại vùng núi Tam Đảo, Vĩnh Phúc vào tháng 3 năm 2013 Việc xác định tên khoa học của mẫu cây này được thực hiện bởi PGS TS Trần Huy Thái từ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tiêu bản cây mang ký hiệu BK-B02 và hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Hoá Hữu cơ, trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Mẫu cành và lá cây Dung lụa được hong khô ở ngoài không khí, rồi sấy khô ở 40 o C, sau đó được xay thành bột mịn
Luận văn thạc sĩ khoa học
THỰC NGHIỆM
Điều chế các phần chiết từ cây Dung lụa
Phương pháp chiết đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập các hợp chất thuộc các lớp chất mong muốn Để điều chế các phần chiết giàu, cần áp dụng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi có độ phân cực tăng dần.
Bột cành lá cây Dung lụa (4kg) được ngâm trong 10 lít methanol trong bình thủy tinh 20 lít, sử dụng máy siêu âm ở 40°C trong 30 phút, sau đó lắng và gạn lọc 3 lần để thu dịch chiết Phần bã tiếp tục ngâm với 10 lít methanol và lặp lại quy trình 3 lần Các dịch chiết methanol được gộp lại và cô quay dưới áp suất giảm, thu được 300 g cặn chiết tổng Cặn này được chiết với 2 lít nước và 1,5 lít n-hexane (lặp lại 3 lần), sau đó gạn lọc và cô quay để loại bỏ dung môi Phần cặn còn lại tiếp tục chiết với 1,5 lít EtOAc (lặp lại 3 lần), gộp dịch chiết và lọc để thu dịch chiết phân đoạn EtOAc (63,70 g – ký hiệu E) và phần dịch nước.
Quy trình chiết phân đoạn mẫu thực vật được thể hiện ở sơ đồ dưới đây.
Luận văn thạc sĩ khoa học
Sơ đồ 1: Quy trình chiết mẫu thực vật
Chi ết bằng 1,5l EtOAc x 3 lần
Cặn dịch chiết pha nước
Cặn dịch chiết pha nước D EtOAc ịch chiết
C ất loại dung môi dưới áp suất giảm
Bột cành lá Dung lụa (4kg)
Ngâm chi ết với 10l MeOH, siêu âm 30’ ở 40 0 C, l ặp l ại 3 lần Thu dịch chiết
Cặn dịch chiết pha nước
Hòa tan c ặn chiết bằng 2l nước cất
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phân l ập các chất từ các phần chiết
3.2.1 Phân tách phần chiết EtOAc
Kết quả khảo sát sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau cho thấy hệ n-hexane/acetone và dichloromethane/methanol là lựa chọn tối ưu để phân tách phần chiết EtOAc (E) trên chất hấp phụ Do đó, tôi đã chọn hai hệ dung môi này làm dung môi rửa giải cho sắc ký cột, với n-hexane/acetone (gradient, 0/100 – 100/0, v/v) và dichloromethane/methanol (gradient, 10/1-1/10, v/v) được thực hiện lần lượt.
(Tên các phần chiết E x.y được đặt theo quy tắc: x- số lần phân tách; y- phân đoạn nhỏ trong lần phân tách x)
Tiến hành phân tách cặn EtOAc (63,70 g) trên cột sắc ký silica gel (Merch, cỡ hạt 40-63 àm) với hệ dung mụi rửa giải n-hexane/acetone (gradient,
0/100-100/0, v/v) và hệ dichloromethane/methanol (gradient, 10/1-1/10, v/v) thu được 10 phân đoạn từ E 1.1 đến E 1.10
Phân đoạn E 1.4 (2,36 g) được tách trên cột sắc ký silica gel với dung môi dichloromethane/EtOAc tỷ lệ 25/1, tạo ra các phân đoạn E 2.1 đến E 2.12 Từ phân đoạn E 2.6, thu được tinh thể dạng bột và sau khi rửa bằng dichloromethane, thu được chất tinh khiết ký hiệu SS-1 (31 mg).
Quy trình phân tách phần chiết EtOAc được trình bày ở sơ đồ 2
3.2.2: Phân tách ph ần chiết E 1.5 (12,8 g)
Phân đoạn E 1.5 (12,8 g) được phân tách trên cột silica gel pha thường bằng hệ dung môi n-hexane/acetone với tỷ lệ thể tích 4/1 và 1/1, thu được các phân đoạn E 3.1 đến E 3.6 Phân đoạn E 3.5 (3,3g) sau đó được xử lý tiếp trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexane/dichlorometan/EtOAc có tỷ lệ thể tích 2/6/1, tạo ra các phân đoạn mới.
Luận văn thạc sĩ khoa học
Phân đoạn E 4.2 được tách trên cột sắc ký pha thường sử dụng hệ dung môi n-hexane/Dichloromethane/EtOAc với tỷ lệ thể tích 2/16/0,5 (v/v/v), thu được chất sạch SS-3 với khối lượng 885,8 mg.
Quá trình phân tách phân đoạn E 1.5 được trình bày ở sơ đồ 3
Luận văn thạc sĩ khoa học
Sơ đồ 2: Quy trình phân tách phần chiết EtOAc của Dung lụa
D ạng bột, màu tr ắng
Luận văn thạc sĩ khoa học
Sơ đồ 3: Quy trình phân tách phân đoạn E 1.5
D ạng bột màu tr ắng
Luận văn thạc sĩ khoa học
3.2.3 : Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được a, Hợp chất SS-1: betulinic acid
Dạng bột màu trắng, không hiện màu dưới bước sóng UV 254 nm và 365 nm Khối lượng thu được là 31 mg và đạt độ tinh khiết cao
Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất SS-1:
1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD), δ H (ppm): 0,77 (3H, s); 0,88 (3H, s); 0,97(3H, s); 0,99 (3H, s); 1,03 (3H, s); 1,72(3H, s); 3,15 (1H, d, J=2,0, 2,6 Hz, H-3); 4,61 (1H, br s, H-29a); 4,73 (1H, br s, H-29b)
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD), δ C (ppm): 40,09 (C-1); 26,90 (C-2); 79,68 (C-3); 39,96 (C-4); 56,89 (C-5); 19,45 (C-6); 35,61(C-7); 41,94 (C-8); 52,01 (C- 9); 38,42 (C-10), 22,10 (C-11); 28,05 (C-12); 39,69 (C-13); 43,59 (C-14); 30,85 (C-15); 33,35 (C-16); 57,50 (C-17); 49,51 (C-18); 48,49 (C-19); 151,99 (C-20); 31,72 (C-21); 38,14 (C-22); 28,61 (C-23); 16,10 (C-24); 16,65 (C-25); 16,73 (C- 26); 15,11 (C-27); 180,05 (C-28); 110,16 (C-29); 19,56 (C-30) b, Hợp chất SS-2: maslinic acid
Dạng chất bột màu trắng, không hiện màu dưới bước sóng UV 254 nm và
365 nm Điểm nóng chảy 248 – 250 0 C Khối lượng thu được là 46 mg và đạt độ tinh khiết cao
Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất SS-2:
1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD), δ H (ppm): 0,69(3H, s); 0,70 (3H, s); 0,87(3H, s); 0,89(3H, s); 0,90 (3H, s); 0,92 (3H, s); 1,09(3H, s)
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD), δ C (ppm): 46,91 (C-1); 67,38 (C-2); 82,37 (C-3); 39,00 (C-4); 54,87 (C-5); 18,16 (C-6); 32,22 (C-7); 39,05 (C-8); 47,18 (C-9); 38,42 (C-10), 23,11 (C-11); 121,86 (C-12); 144,02 (C-13); 41,47 (C-14); 27,27 (C-15); 22,70 (C-16); 45,58 (C-17); 40,92 (C-18); 45,80 (C-19); 30,79
Luận văn thạc sĩ khoa học
Chất SS-3 là một dạng keo màu vàng nâu, khi tiếp xúc với sóng UV 254nm sẽ hiện màu tím, và chuyển sang màu vàng cam khi nhúng vào thuốc thử Cerin sulfate Khối lượng thu được của chất này là 885,8 mg.
Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất SS-3:
1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD), δ H (ppm): 6,64 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5), 6,61 (1H, d, J=2,0, H-6), 2,91 (1H, m, H-7,7’), 2,49 (1H, m, H-8,8’), 3,88 (1H, m, H-9a), 4,13 (1H, m, H-9b), 6,46 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), 6,55 (1H, d, J = 2,0, H-6’), 3,88 (3H, m, 3-OCH 3 ), 3,81 (3H, m, 3’-OCH 3 ) và 3,86 (3H, m, 4-OCH 3 )
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD), δ C (ppm): 130,45 (C-1); 111,55 (C-2);
Luận văn thạc sĩ khoa học