Sàng Lọc Và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Polysaccharide Ngoại Bào Sinh Tổng Hợp Bởi Vi Khuẩn Lactobacillus.pdf

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMKHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- ---&&&&& ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN SÀNG LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE NGOẠI BÀO SINH TỔNG HỢP BỞI VI KHUẨN LAC

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- -&&&&&

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN

SÀNG LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE NGOẠI BÀO SINH TỔNG

HỢP BỞI VI KHUẨN LACTOBACILLUS

Hà Nội – Tháng 03/2023

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- -&&&&&

ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN

SÀNG LỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA POLYSACCHARIDE NGOẠI BÀO SINH TỔNG HỢP BỞI VI

Giáo viên hướng dẫn : TS Quách Ngọc Tùng

PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh Địa điểm thực hiện : Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hà Nội – Tháng 03/2023

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN THỰC HIỆN KHÓA LUẬN

Điện thoại: 0976541391 Email: doanhtai0207@gmail.com

2 Địa chỉ liên hệ: 32A, ngõ Quỳnh, Bạch Mai, Hai Bà Trưng, Hà Nội

3 Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm.

5 Giáo viên hướng dẫn 1: TS Quách Ngọc Tùng

Giáo viên hướng dẫn 2: PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh.

6 Địa điểm thực tập:

Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật

Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Giáo viên hướng dẫn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus 3

2.2 Tổng quan về polysaccharide ngoại bào từ vi khuẩn Lactobacillus 3

2.2.1 Khái niệm 3

2.2.2 Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa 4

2.3 Hoạt tính sinh học từ polysaccharide ngoại bào 5

2.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa 5

2.3.2 Hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh 6

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7

3.1 Vật liệu nghiên cứu 7

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 7

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 7

3.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị 7

3.1.2.2 Hóa chất 7

3.1.2.3 Môi trường 7

3.1.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 7

3.2 Nội dung nghiên cứu 7

3.3 Phương pháp nghiên cứu 8

3.3.1 Phân lập và giữ giống các chủng Lactobacillus 8

3.3.2 Thu hồi EPS 8

3.3.3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hoá 9

3.3.3.1 Khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH 9

3.3.3.2 Khả năng loại bỏ gốc hydroxyl (OH-) 9

3.3.4 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định 9

3.3.5 Phân loại bằng giải trình tự gen 16S rRNA 10

PHẦN IV KẾT QUẢ DỰ KIẾN 11

4.1 Phân lập và thu hồi EPS từ vi khuẩn lactic 11

4.2 Sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của EPS thu nhận từ các chủng vi khuẩn 11

4.2.1 Đánh giá hoạt tính trung hoà gốc tự do DPPH 11

4.2.2 Đánh giá hoạt tính trung hoà gốc tự do hydroxyl 11

ii

4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 11

4.4 Phân loại chủng vi khuẩn thể hiện hoạt tính sinh học tiềm năng 11

PHẦN V KẾ HOẠCH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 12

TÀI LIỆU THAM KHẢO 13

iii

La Lactococcus

Lb Lactobacillus

iv

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng polymer tự nhiên trong nhiều lĩnhvực tăng lên đã thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển nghiên cứu, thu nhận polysaccharidengoại bào (exopolysaccharide, EPS) từ các nguồn tự nhiên, đặc biệt từ vi khuẩn Vikhuẩn có thể tổng hợp nhiều loại EPS nhằm bảo vệ tế bào khỏi những tác động bất lợinhư nhiệt độ, pH, chất gây độc, điều kiện oxy hoá (Sutherland I.W., Bacterial

exopolysaccharides Adv Microb Physiol 8: 143-213, el at (1972) ) Do đa dạng về

cấu trúc và hoạt tính sinh học, EPS ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghệthực phẩm, mỹ phẩm, y dược Trong lĩnh vực thực phẩm, EPS có thể được sử dụnglàm tăng quá trình đông đặc, ổn định kết cấu, nhũ hoá và tạo gel, từ đó giảm thiểu cácchất phụ gia độc hại Gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPSnhư khả năng chống sự oxy hóa của thực phẩm giàu lipid, chống ung thư, làm giảmcholesterol, tăng hoạt động của vi khuẩn probiotic cũng được nghiên cứu phổ biến(Zhang L., Liu C., el at (2013) )

xuất các sản phẩm lên men chua truyền thống như nem chua, dưa muối chua… Các vi

Safe, GRAS) với con người và vật nuôi Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các

trường khắc nhiệt như hệ tiêu hoá người và động vật Nhiều nghiên cứu đã chứngminh EPS từ các chủng LAB có cấu trúc đa dạng, an toàn đối với con người và độngvật, dễ phân huỷ và đặc biệt hoạt tính sinh học ứng dụng trong y-dược và công nghệ

Lactobacillus đã thu hút sự chú ý của ngành công nghiệp sữa vì chúng được sản xuất

trực tiếp trong quá trình lên men sữa, cải thiện một số thuộc tính của thực phẩm nhưđặc tính nhũ hóa, giảm tổng hợp và tăng độ rắn Ngoài ra, EPS từ vi khuẩn có thểmang lại một số lợi ích cho sức khỏe con người như các hoạt động điều hòa miễn dịch,chống khối u và chống oxy hóa, khả năng giảm cholesterol trong máu và các đặc tínhtiền sinh học Cho đến nay, một số nghiên cứu đã tập trung khám phá các tiềm năngcông nghệ sinh học như hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của các EPS thu

từ Lactobacillus là điều cần thiết để mở rộng việc sử dụng nó trong sản xuất thựcphẩm, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ Chính vì những tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng

sinh học của polysaccharide ngoại bào sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus.

Nghiên cứu này mở ra triển vọng khai thác EPS có hoạt tính sinh học mới từ vi khuẩn

Lactobacillus bản địa và định hướng ứng dụng EPS trong lĩnh vực công nghệ thực

phẩm và dược phẩm

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Sàng lọc và đánh giá được hoạt tính sinh học của EPS từ vi khuẩn

Lactobacillus phân lập từ một số thức ăn lên men truyền thống

1.2.2 Yêu cầu

thống như nem chua và dưa muối

- Sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của EPS thu nhận từ các chủng vi khuẩnphân lập

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của EPS thô thu nhận từ các chủng

- Phân loại một chủng vi khuẩn thể hiện hoạt tính sinh học tiềm năng nhất

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus

Lactobacillus là những vi khuẩn Gram dương, hình que, catalase âm tính, sống

trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí nghiêm ngặt, không có khả năng tạo bào tử Lacticacid được xem như là sản phẩm cuối cùng trong quá trình lên men carbohydrate của

Lactobacillus Lactobacillus từ lâu đã được sử dụng như các chủng vi khuẩn khởi đầucho quá trình lên men của nhiều loại thực phẩm và đồ uống nhờ vai trò của chúngtrong việc tạo hương vị, phát triển mùi thơm và làm chậm sự hư hỏng Đây cũng chính

là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất được dùng như một phương pháp bảo quản

thực phẩm (De Vuyst L & Vandamme E J, el at, (1994).) Ngày nay, Lactobacillus

được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm từ sữa (như pho mát, sữa chua, kefir và bơsữa), trong sản xuất bánh mì, các sản phẩm thịt, bảo quản rau quả Bên cạnh đó, LABcũng có nhiều tác động có lợi đến sức khỏe người sử dụng Việc khai thác và sử dụng

sót của vi khuẩn trong thực phẩm cũng như trong đường ruột đối tượng sử dụng nhằmcung cấp chế độ ăn phù hợp để cải thiện sức khỏe con người và vật nuôi (Halász A, el

at, 2009)

Chi Lactobacillus gồm những vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic, không sinhbào tử, lên men hiếu khí và kỵ khí Chúng có thể lên men đồng hình hoặc dị hình,catalase âm tính, có khả năng đồng hoá glucose, cellobiose, galactose, lactose, maltose

và sucrose và không đồng hoá mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xylose.Hoạt lực lên men tốt nhất của Lactobacillus ở vùng pH dao động từ 5,5 - 6,0 Đa sốLactobacillus rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môitrường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide,protein, vitamin (B1, B2, B6, PP, các acid pantotenic và acid folic),… Lactobacillus cóhoạt tính protease, chúng phân hủy được protein của sữa thành peptide và acid amin.Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-35°C Các loài ưa nhiệt

có nhiệt độ tối ưu là 40-45°C, trong khi đó loài ưa lạnh có thể phát triển được ở nhiệt

độ tương đối thấp (khoảng 5°C hoặc thấp hơn) Khi gia nhiệt tới 60-80°C hầu hếtchúng bị chết sau 10-30 phút Lactobacillus ngoài khả năng lên men lactic, chúng còn

có khả năng sản sinh ra các chất kháng khuẩn gọi là bacteriocin và được ứng dụngnhiều trong y học cũng như trong bảo quản thực phẩm Chi Lactobacillus có khoảng

250 loài và trong đó một số loài Lactobacillus phổ biến có thể kể đến như:

Lactobacillus paracasei (Zheng et al., 2020).

2.2 Tổng quan về polysaccharide ngoại bào từ vi khuẩn Lactobacillus

2.2.2 Đặc điểm phân loại và một số đặc tính lý hóa

Căn cứ vào thành phần monosaccharide và đặc biệt là cơ chế sinh tổng hợp, cácEPS từ LAB được chia thành hai nhóm lớn là các heteropolysaccharide (HePS) và cáchomopolysaccharide (HoPS) (Patel S., Majumder A & Goyal A, el at, 2012).Quá trình sinh tổng hợp EPS bởi các chủng vi khuẩn thuộc LAB có thể xảy ra ởbên trong hoặc ở bên ngoài tế bào Đây là một quá trình phức tạp với nhiều phản ứngsinh hóa được xúc tác bởi enzyme (Patel S., Majumder A & Goyal A, el at, 2012)

Nhóm thứ nhất: homopolysaccharide (HoPS)

(Nguồn: Badel et al., 2011)

Hình 2.1 Cấu trúc dạng mạch thẳng (a) và mạch nhánh (b) của HoPS

Nhóm thứ hai: heteropolysaccharide (HePS)

Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệmonosaccharide và cấu trúc phân tử của các đơn vị lặp đi lặp lại cũng như đặc điểmcấu tạo và khối lượng phân tử của polyme (Hình 2.2)

(Nguồn: Badel et al., 2011)

Hình 2.2 Cấu trúc của dạng mạch thẳng và mạch nhánh của HePS

Khác biệt với các HoPS, các HePS có sự đa dạng về thành phần, tỷ lệmonosaccharide, khối lượng phân tử và cấu trúc phân tử Cụ thể, HePS có thành phầncấu tạo bao gồm nhiều loại đường Glucose, mannose và galactose là các loại đường

thường xuất hiện hơn trong thành phần HePS so với rhamnose, N-acetylglucosamine,N-acetylgalactosamine và các monosacchride khác (Ruas-Madiedo et al., 2002) Cácloại đường hiếm như fucose, rhamnose và axit uronic có thể hiện diện và cung cấp choEPS các đặc tính sinh học bổ sung cao hơn so với các monomer đường phổ biến(Rajoka, et al., 2020) Ngoài ra, thành phần và tỷ lệ các monosaccharide trong EPSquyết định đặc tính sinh học của EPS.

So với quá trình sinh tổng hợp HoPS, quá trình sinh tổng hợp HePS phức tạphơn nhiều Sự sinh tổng hợp HoPS xảy ra ngoài tế bào, trong khi đó quá trình sinhtổng hợp HePS xảy ra trong tế bào Đó là một chuỗi phức tạp của các phản ứng liênquan đến hệ enzym nội bào của LAB và thường trải qua ba giai đoạn: sự hấp thu cơchất; sự chuyển hóa đường trung gian; quá trình tổng hợp EPS (Kumar el at, 2007)

2.3 Hoạt tính sinh học từ polysaccharide ngoại bào

2.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Ngày nay, xã hội phát triển kéo theo sự phát sinh nhiều tác nhân ảnh hưởng lớnđến sức khoẻ con người như: môi trường ô nhiễm, các chất có hại trong mỹ phẩm,thực phẩm, căng thẳng thần kinh,…Đây là những tác nhân chính tạo ra sự hình thànhcác gốc tự do chứa oxy (reactive oxygen species, ROS) Ở mức độ vừa phải hoặc thấp,ROS tham gia kích hoạt phản ứng phân bào, tăng cường hệ miễn dịch và bảo vệ tế bào.Việc sản sinh quá mức ROS dẫn đến nguy cơ gây ra các bệnh nguy hiểm như đột quỵ,ung thư, bệnh động mạch vành, tổn thương gan và các bệnh suy giảm miễn dịch.Trong những thập kỷ qua, các chất chống oxy hoá tổng hợp (butylated hydroxytoluene,butylated hydroxyanisole, propyl gallate) được sử dụng rộng rãi trong công nghiệpthực phẩm và dược phẩm Tuy nhiên, một số chất bị rút khỏi thị trường do những tácdụng phụ liên quan đến tổn thương gan và ung thư Vì vậy, sử dụng các sản phẩm tựnhiên để cân bằng hàm lượng ROS trong cơ thể và giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh là rấtcần thiết

Hoạt tính sinh học quan trọng của EPS này được đặc trưng bởi khả năng loại bỏcác gốc tự do Imran và cộng sự (2016) đã báo cáo hiệu quả loại bỏ gốc tự do của EPSthu nhận từ L plantarum NTMI05 (96,62%) và L plantarum NTMI20 (91,86%)(Imran 2016) Hoạt động chống oxy hóa có thể là do sự hiện diện của hydroxylgroup

và các nhóm chức khác trong EPS đã tương tác chuyển điện tích để khử các gốc tự do(Shen el at, 2013) Một nghiên cứu khác cũng báo cáo rằng 2 mg/mL EPS tách chiết từ

L plantarum RJF4 EPS thể hiện hoạt động loại bỏ gốc DPPH tới 23,63% ( Dilna el at,2015) Khả năng loại bỏ gốc tự do 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), gốchydroxyl và chuỗi các gốc oxide của EPS sinh tổng hợp bởi hai chủng Bifidobacteriumbifidum WBIN03 (B-EPS) và Lactobacillus plantarum R315 (L-EPS) hay sự ức chếquá trình oxy hóa lipid cũng được đánh giá Kết quả cho thấy, cả 2 loại EPS đều có

khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH và các chuỗi phản ứng ROS rất tốt ở nồng độ cao.

Sự ức chế quá trình oxy hóa lipid cũng được ghi nhận Với các khả năng này, cả haiEPS tổng hợp được đều có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm như là cáctác nhân chống oxy hóa tự nhiên (Levander el at 2002) Với đặc tính sinh học này, EPSsinh tổng hợp từ LAB xứng đáng là nguồn nguyên liệu mới, tự nhiên, an toàn tronglĩnh vực y-dược phẩm

2.3.2 Hoạt tính ức chế vi sinh vật gây bệnh

Theo số liệu năm 2020, đã có 97 triệu người mắc bệnh gây bởi vi sinh vật

đó có hơn 2 triệu người tử vong Tại Việt Nam, vấn đề kháng thuốc kháng sinh đangngày càng nghiêm trọng khi nhiều vi khuẩn đa kháng thuốc kháng sinh đã xuất hiện

mà nguyên nhân chính là do lạm dụng kháng sinh Nhiều nghiên cứu gần đây đã chothấy tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng cao và ngày càng có nhiều

bệnh tiêu chảy có khả năng kháng được 3 loại kháng sinh bao gồm cephalosporins,

kháng beta-lactam làm giảm hiệu qủa sử dụng thuốc kháng sinh chống tiêu chảy Vìvậy, việc tìm ra các loại sản phẩm tự nhiên mới có hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh

là một cuộc đua không ngừng nghỉ của các nhà khoa học và các công ty dược phẩmtrên thế giới

Việc sử dụng các thực phẩm chứa EPS hoặc các vi khuẩn có khả năng tổng hợpnên các EPS mang lại rất nhiều lợi ích khác nhau Một trong những đặc tính nổi bậtcủa EPS là khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh EPS sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

Lactobacillus rhamnosus phân lập từ sữa mẹ thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Salmonella enterica serovar Typhimurium và Escherichia coli (Riaz Rajoka, M S.,

Lactobacillus gasseri sinh HeEPS kháng một số vi khuẩn gây bệnh như Listeria

Itsaranuwat, P., Galiwango, E., Tamiello-Rosa, C., Abdullah, H., et al (2020b) Gần

đây, EPS từ Lactobacillus spp thể hiện vòng kháng khuẩn > 10 mm đối với S enterica ATCC 43972 và Micrococcus luteus Ca6 thử nghiệm (Trabelsi, I., Ktari, N., Ben

Slima, S., Triki, M., Bardaa, S., Mnif, H., et al (2017) )

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

muối thu thập tại Hà Giang

Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 11778, Staphylococcus

epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 và Escherichia coli ATCC 11105nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của Trung tâm Giống và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật,Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

3.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị

Tủ nuôi (Biotek, Mỹ), máy ly tâm (Eppendorf, Đức), lò vi sóng (Sam Sung,Hàn Quốc), máy lắc ổn nhiệt (CPT inc, Hàn Quốc), máy PCR (Applied biosystems,Mỹ), máy đo OD (S-300 nano, Optima, Nhật Bản), box cấy (Hàn Quốc), nồi khử trùng(Sturdy, Đài Loan), tủ sấy (JP Selecta, Tây Ban Nha), cân phân tích (Shinki-GS, NhậtBản), máy đo PH (Total Meter, Trung Quốc) và một số thiết bị nghiên cứu khác Ngoài

ra còn sử dụng một số dụng cụ thông dụng của phòng thí nghiệm (Eppendorf (1,5ml),fancol (15 ml, 50 ml), ống đong (500 ml, 1000 ml), cốc đong thủy tinh, đĩa Petri,micropipet, đèn cồn, que cấy, bình thủy tinh, )

3.1.2.2 Hóa chất

TCA (Trichloroacetic acid) (hãng Merck, Đức), NaOH (Trung Quốc), HCl(Trung Quốc), Ethanol (Trung Quốc), Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)(BioLabs, Mỹ), Sodium dodecyl sulfate (SDS), Phenol (Trung Quốc), Isoamylalcohol(Trung Quốc), Glycerol (Trung Quốc), Chloroform (Trung Quốc), Agarose (Merck,Đức); Thạch (Việt Nam)

3.1.2.3 Môi trường

3.1.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinhhọc – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian: Từ tháng 02/2023 đến tháng 09/2023

3.2 Nội dung nghiên cứu