Khảo sát phổ đột biến gen egfr trong ung thư phổi kháng erlotinib bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trên mẫu sinh thiết lỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HƯNG LONG KHẢO SÁT PHỔ ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI KHÁNG ERLOTINIB BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRÊN MẪU SINH THIẾT LỎNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HƯNG LONG KHẢO SÁT PHỔ ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI KHÁNG ERLOTINIB BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRÊN MẪU SINH THIẾT LỎNG Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN PHỦ MẠNH SIÊU TS TRƯƠNG THIÊN PHÚ Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 LỜI CẢM ƠN Trước hết, với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn tới: Thầy PGS.TS.BS Trần Phủ Mạnh Siêu - PGĐ Bệnh viện Nguyễn Trãi, phó chủ nhiệm Bộ mơn Xét nghiệm, Khoa Điều dưỡng - Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Dược Tp.HCM Thầy TS.BS Trương Thiên Phú - Trưởng Khoa Vi sinh Bệnh viện Chợ Rẫy Là người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, giúp đỡ động viên suốt q trình tơi học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy GS.TS Trương Đình Kiệt, PGS.TS.BS Đỗ Thị Thanh Thủy, TS Giang Hoa, TS.BS Nguyễn Thị Quỳnh Thơ, BS.CKI Nguyễn Hữu Nguyên bạn Bình, Uyên, Luân, Chí, Trường, Trâm anh, chị Viện Di truyền Y học - người giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi nhiều để tơi hoàn thành luận văn Xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Hồi Nghĩa tận tình dẫn dắt, giúp đỡ mặt kiến thức kỹ làm khoa học suốt thời gian làm luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Ban giám hiệu, phòng đào tạo Sau đại học, thầy, cô Trường Đại học Y Dược Tp.HCM, đặc biệt thầy PGS.TS.BS Vũ Quang Huy thầy, cô Bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều dưỡng - Kỹ thuật Y học truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt trình học tập Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người tạo cho điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Học viên NGUYỄN HƯNG LONG MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ung thư 1.2 Ung thư phổi: thực trạng chẩn đoán 14 1.3 EGFR 20 1.4 cfDNA - Sinh thiết lỏng 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu 32 2.3 Các bước thực 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Phổ đột biến xuất gen EGFR 48 3.2 Phổ đột biến gen EGFR BN ung thư phổi kháng Erlotinib VN theo tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, giải phẫu bệnh 49 CHƯƠNG BÀN LUẬN 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN 68 PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các liệu nêu hồn tồn trung thực Nếu thơng tin khơng thật, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tác giả Nguyễn Hưng Long CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt: UTPKTBN: ung thư phổi không tế bào nhỏ Tiếng Anh: ACC - Adrenocarcinoma: ung thư biểu mô tế bào tuyến ALK - anaplastic lymphoma kinase ATP: Adenosine triphosphat cfDNA - Cell Free DNA: DNA ngoại bào CTC - circulating tumor cell: tế bào khối u tuần hoàn ctDNA - Circulating Tumor DNA: DNA khối u tuần hoàn ddPCR - droplet digital Polymerase chain reaction: PCR vi giọt kỹ thuật số DNA: deoxyribonucleic acid EBUS - endoscopic bronchial ultrasound: siêu âm phế quản nội soi EGF - Epidermal Growth Factor: yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR - Epidermal Growth Factor Receptor: thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì FDA - Food and Drug Administration: Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ FISH - Fluorescent insitu hybridization: lai ghép huỳnh quang chỗ FNA - Fine Needle Aspiration: chọc hút tế bào kim nhỏ MAF - mutant allele fraction: tần suất đột biến NGS - Next Generation Sequencing: giải trình tự hệ NSCLC - Non Small Cell Lung Cancer: ung thư phổi không tế bào nhỏ PET - Positron Emission Tomography: ghi hình cắt lớp positron RECIST - Response Evaluation Criteria In Solid Tumors: tiêu chí đánh giá đáp ứng khối u đặc SCC - Squamous cell carcinoma: ung thư biểu mô tế bào vảy SCLC - Small Cell Lung Cancer: ung thư phổi tế bào nhỏ TKI - Tyrosine Kinase Inhibitor: ức chế men Tyrosine Kinase UN: Không rõ thông tin VATS - Video assisted Thoracic surgery: phẫu thuật nội soi lồng ngực có video hỗ trợ WHO - World Health Organization: Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Ưu nhược điểm sinh thiết mô sinh thiết lỏng 29 Bảng 2.1: Thành phần hoá chất Master Mix sửa đầu mút lần 40 Bảng 2.2: Thành phần hoá chất Master Mix sửa đầu mút lần 40 Bảng 2.3: Thành phần hoá chất Master Mix gắn adaptor đầu 3’ 41 Bảng 2.4: Thành phần hoá chất Master Mix gắn adaptor đầu 5’ 41 Bảng 2.5: Thành phần hoá chất cho phản ứng khuếch đại 42 Bảng 2.6: Thành phần hóa chất cho phản ứng đông khô hỗn hợp thư viện DNA 43 Bảng 2.7: Thành phần hoá chất dung dịch rửa 44 Bảng 3.1: Tần số tỷ lệ đột biến gen EGFR 48 Bảng 3.2: Phân phối loại đột biến gen EGFR 49 Bảng 3.3: Thơng tin lâm sàng phân bố theo tuổi, giới tính, hút thuốc, chẩn đoán, giải phẫu bệnh 51 Bảng 3.4: Phân bố đột biến gen EGFR theo vùng địa lý 53 Bảng 3.5: Sự khác biệt phát đột biến gen EGFR theo tuổi, giới, vùng, hút thuốc 53 Bảng 3.6: Khác biệt loại đột biến phổ biến phân bố theo địa lý 54 Bảng 3.7: Sự khác biệt phát Del 19 theo tuổi, giới, giải phẫu bệnh hút thuốc 54 Bảng 3.8: Sự khác biệt phát L858R theo tuổi, giới, giải phẫu bệnh hút thuốc 55 Bảng 3.9: Sự khác biệt phát T790M theo tuổi, giới, giải phẫu bệnh hút thuốc 56 Bảng 4.1: Phân bố đột biến gen EGFR ung thư phổi 60 Bảng 4.2: Kết phát T790M bệnh nhân NSCLC 61 Bảng 4.3: Số đột biến xuất bệnh nhân EGFR M+ 63 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Gia đình thụ thể EGFR 21 Hình 1.2: Minh họa đường tín hiệu nội bào quan trọng thông qua gen EGFR 23 Hình 1.3: Nguồn gốc ctDNA, cfDNA máu 27 Hình 1.4: Sinh thiết mô sinh thiết lỏng 29 Hình 2.1: Minh họa bước giải trình tự 37 Hình 3.1: Nồng độ tách chiết cfDNA bệnh nhân NSCLC giai đoạn III IV 52 Hình 4.1: Cơ chế kháng EGFR-TKIs 64 68 CHƯƠNG KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, việc sử dụng kỹ thuật giải trình tự hệ 76 mẫu sinh thiết lỏng để xác định phổ đột biến gen EGFR bệnh nhân NSCLC kháng Erlotinib, xác định: loại đột biến T790M, Del19, L858R đột biến phổ biến Ngồi ra, chúng tơi cịn xác định đột biến kháng thuốc gặp khác như: EGFR amplification, S768I, G719X L861Q Tỉ lệ đột biến chung gen EGFR khơng có khác biệt yếu tố: tuổi, giới tính, tình trạng hút thuốc, tình trạng giải phẫu bệnh Sự xuất đột biến Del19 T790M miền Nam nhiều miền Bắc khác biệt có ý nghĩa thống kê TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y Tế (2018) "Quyết định số 4825/QĐ-BYT ngày 06 tháng 08 năm 2018 việc ban hành tài liệu chuyên mơn "Hướng dẫn chẩn đốn điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ"" tr.1-17 Mai Trọng Khoa, Trần Đình Hà, Phạm Cẩm Phương, Nguyễn Văn Kình, Nguyễn Quốc Tuấn, Nguyễn Tiến Lung, et al (2016) xét nghiệm đột biến EGFR bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Trung tâm Y học hạt nhân & Ung bướu – Bệnh viện Bạch Mai, http://ungthubachmai.com.vn/gen-tr-liu/item/3176-xét-nghiệm-đột-biếnegfr-trên-bệnh-nhân-ung-thư-phổi-không-tế-bào-nhỏ-tại-trung-tâm-y-họchạt-nhân ung-bướu-–-bệnh-viện-bạch-mai.html, access on may-27th2019 Nguyễn Văn Kình, Nguyễn Văn Tuấn (2015) Sinh học phân tử ung thư áp dụng cho lâm sàng, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.43-105 TIẾNG ANH Beaver JA, Jelovac D, Balukrishna S, Cochran R, Croessmann S, Zabransky DJ, et al (2014) "Detection of cancer DNA in plasma of patients with earlystage breast cancer" Clin Cancer Res, 20 (10), 2643-2650 Bertotti A, Sassi F (2015) "Molecular Pathways: Sensitivity and Resistance to Anti-EGFR Antibodies" Clin Cancer Res, 21 (15), 3377-83 Bianco R, Gelardi T, Damiano V, Ciardiello F, Tortora G (2007) "Rational bases for the development of EGFR inhibitors for cancer treatment" Int J Biochem Cell Biol, 39 (7-8), 1416-31 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A (2018) "Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries" CA Cancer J Clin, 68 (6), 394-424 Catarino R, Coelho A, Araujo A, Gomes M, Nogueira A, Lopes C, et al (2012) "Circulating DNA: diagnostic tool and predictive marker for overall survival of NSCLC patients" PLoS One, (6), e38559 Couraud S, Vaca-Paniagua F, Villar S, Oliver J, Schuster T, Blanche H, et al (2014) "Noninvasive Diagnosis of Actionable Mutations by Deep Sequencing of Circulating Free DNA in Lung Cancer from Never-Smokers: A Proof-of-Concept Study from BioCAST/IFCT-1002" Clinical Cancer Research, 20 (17), 4613-4624 10 Cristofanilli M, Braun S (2010) "Circulating Tumor Cells Revisited" JAMA, 303 (11), pp.1092-1093 11 David Czeiger M, PhD, Gad Shaked, MD, Hadar Eini, MSc, Ilan Vered, Olga Belochitski, MD, Avital Avriel, MD, Samuel Ariad, MD, and Amos Douvdevani, PhD, (2011) "Measurement of Circulating Cell-Free DNA Levels by a New Simple Fluorescent Test in Patients With Primary Colorectal Cancer" American Journal of Clinical Pathology, 135 (2), pp.264-270 12 Del Re M, Crucitta S, Gianfilippo G, Passaro A, Petrini I, Restante G, et al (2019) "Understanding the Mechanisms of Resistance in EGFR-Positive NSCLC: From Tissue to Liquid Biopsy to Guide Treatment Strategy" Int J Mol Sci, 20 (16) 13 Diaz LA, Jr., Bardelli A (2014) "Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA" J Clin Oncol, 32 (6), 579-86 14 Diehl F, Schmidt K, Choti MA, Romans K, Goodman S, Li M, et al (2008) "Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics" Nat Med, 14 (9), 98590 15 Esposito A, Criscitiello C, Trapani D, Curigliano G (2017) "The Emerging Role of "Liquid Biopsies," Circulating Tumor Cells, and Circulating CellFree Tumor DNA in Lung Cancer Diagnosis and Identification of Resistance Mutations" Curr Oncol Rep, 19 (1), 16 Fernandez-Cuesta L, Perdomo S, Avogbe PH, Leblay N, Delhomme TM, Gaborieau V, et al (2016) "Identification of Circulating Tumor DNA for the Early Detection of Small-cell Lung Cancer" EBioMedicine, 10, 117-23 17 Forshew T, Murtaza M, Parkinson C, Gale D, Tsui DW, Kaper F, et al (2012) "Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA" Sci Transl Med, (136), 136ra68 18 Freidin MB, Freydina DV, Leung M, Montero Fernandez A, Nicholson AG, Lim E (2015) "Circulating tumor DNA outperforms circulating tumor cells for KRAS mutation detection in thoracic malignancies" Clin Chem, 61 (10), 1299-304 19 Gabriella Sozzi DC, MariaElena Leon , Rosalia Cirincione , Luca Roz , Cathy RatcliffeElena Roz , Nicola Cirenei , Massimo Bellomi , Giuseppe Pelosi , Marco A Pierotti , Ugo Pastorino, (2003) "Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer" Lung Cancer, 41, S86–S87 20 Glenn TC (2011) "Field guide to next-generation DNA sequencers" Mol Ecol Resour, 11 (5), 759-69 21 Gregory P Kalemkerian, Navneet Narula, Erin B Kennedy, William A Biermann, Jessica Donington, Natasha B Leighl, et al (2018) "Molecular TestingGuideline for the Selection of PatientsWith Lung Cancer for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors: American Society of Clinical Oncology Endorsement Pathologists/International of the College Association for the of Study American of Lung Cancer/Association for Molecular Pathology Clinical Practice Guideline Update" American Society of Clinical Oncology, Vol36 (9), 911-919 22 Heitzer E, Auer M, Hoffmann EM, Pichler M, Gasch C, Ulz P, et al (2013) "Establishment of tumor-specific copy number alterations from plasma DNA of patients with cancer" Int J Cancer, 133 (2), 346-56 23 Heitzer E, Ulz P, Geigl JB (2015) "Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer" Clin Chem, 61 (1), 112-23 24 Ilie M, Hofman P (2016) "Pros: Can tissue biopsy be replaced by liquid biopsy?" Transl Lung Cancer Res, (4), 420-3 25 International Agency for Research on Cancer (2014) World Cancer Report 2014, WHO, 350-361 26 Jiang P, Chan CW, Chan KC, Cheng SH, Wong J, Wong VW, et al (2015) "Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients" Proc Natl Acad Sci U S A, 112 (11), E1317-25 27 Johann DJ, Jr., Steliga M, Shin IJ, Yoon D, Arnaoutakis K, Hutchins L, et al (2018) "Liquid biopsy and its role in an advanced clinical trial for lung cancer" Exp Biol Med (Maywood), 243 (3), 262-271 28 Kennedy SR, Schmitt MW, Fox EJ, Kohrn BF, Salk JJ, Ahn EH, et al (2014) "Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing" Nat Protoc, (11), 2586-606 29 Kukita Y, Matoba R, Uchida J, Hamakawa T, Doki Y, Imamura F, et al (2015) "High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients" DNA Res, 22 (4), 269-77 30 Kurdyukov S, Bullock M (2016) "DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method" Biology (Basel), (1), pp.1-21 31 Lanman RB MS, Zill OA,, Sebisanovic D LR, Blau S, et al (2015) "Analytical and Clinical Validation of a Digital Sequencing Panel for Quantitative, Highly Accurate Evaluation of Cell-Free Circulating Tumor DNA " PLoS ONE 10 (10), pp.1-27 32 Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ (1977) "Free DNA in the Serum of Cancer Patients and the Effect of Therapy" CANCER RESEARCH, 37, pp.646-650 33 Lim M, Kim CJ, Sunkara V, Kim MH, Cho YK (2018) "Liquid Biopsy in Lung Cancer: Clinical Applications of Circulating Biomarkers (CTCs and ctDNA)" Micromachines (Basel), (3), pp.1-18 34 Lindeman NI, Cagle PT, Aisner DL, Arcila ME, Beasley MB, Bernicker EH, et al (2018) "Updated Molecular Testing Guideline for the Selection of Lung Cancer Patients for Treatment With Targeted Tyrosine Kinase Inhibitors: Guideline From the College of American Pathologists, the International Association for the Study of Lung Cancer, and the Association for Molecular Pathology" Arch Pathol Lab Med, 142 (3), 321-346 35 Minari R, Mazzaschi G, Bordi P, Gnetti L, Alberti G, Altimari A, et al (2020) "Detection of EGFR-Activating and T790M Mutations Using Liquid Biopsy in Patients With EGFR-Mutated Non-Small-Cell Lung Cancer Whose Disease Has Progressed During Treatment With First- and SecondGeneration Tyrosine Kinase Inhibitors: A Multicenter Real-Life Retrospective Study" Clin Lung Cancer, 36 Minciacchi VR, Zijlstra A, Rubin MA, Di Vizio D (2017) "Extracellular vesicles for liquid biopsy in prostate cancer: where are we and where are we headed?" Prostate Cancer Prostatic Dis, 20 (3), 251-258 37 Morgensztern D, Campo MJ, Dahlberg SE, Doebele RC, Garon E, Gerber DE, et al (2015) "Molecularly targeted therapies in non-small-cell lung cancer annual update 2014" J Thorac Oncol, 10 (1 Suppl 1), S1-63 38 Nagano T, Tachihara M, Nishimura Y (2018) "Mechanism of Resistance to Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinase Inhibitors and a Potential Treatment Strategy" Cells, (11), 212 39 Narayan A, Carriero NJ, Gettinger SN, Kluytenaar J, Kozak KR, Yock TI, et al (2012) "Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing" Cancer Res, 72 (14), 3492-8 40 National Cancer Institute (2015) What is cancer, WHO, https://www.cancer.gov/about-cancer/understanding/what-is-cancer, access on may-27th-2019 41 Novello S, Barlesi F, Califano R, Cufer T, Ekman S, Levra MG, et al (2016) "Metastatic non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up" Ann Oncol, 27 (suppl 5), v1-v27 42 Ohashi K, Maruvka YE, Michor F, Pao W (2013) "Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistant disease" J Clin Oncol, 31 (8), 1070-80 43 Ohira T, Sakai K, Matsubayashi J, Kajiwara N, Kakihana M, Hagiwara M, et al (2016) "Tumor volume determines the feasibility of cell-free DNA sequencing for mutation detection in non-small cell lung cancer" Cancer Sci, 107 (11), 1660-1666 44 Rachiglio AM, Fenizia F, Piccirillo MC, Galetta D, Crino L, Vincenzi B, et al (2019) "The Presence of Concomitant Mutations Affects the Activity of EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors in EGFR-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Patients" Cancers (Basel), 11 (3) 45 Rosell R, Moran T, Queralt C (2009) "Screening for Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Lung Cancer" The New England Journal of Medicine, 361, pp.958-967 46 Rosell R, Carcereny E, Gervais R, Vergnenegre A, Massuti B, Felip E, et al (2012) "Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase trial" The Lancet Oncology, 13 (3), 239-246 47 Sabine Jahr HH, Sabine Englisch, Dieter Hardt, Frank O Fackelmayer, RolfDieter Hesch, and Rolf Knipper, (2001) "DNA Fragments in the Blood Plasma of Cancer Patients Quantitations and Evidence for Their Origin from Apoptotic and Necrotic Cells" CANCER RESEARCH, 61, pp.1659– 1665, February 15, 2001 48 Santoni-Rugiu E, Melchior LC, Urbanska EM, Jakobsen JN, Stricker K, Grauslund M, et al (2019) "Intrinsic resistance to EGFR-Tyrosine Kinase Inhibitors in EGFR-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer: Differences and Similarities with Acquired Resistance" Cancers (Basel), 11 (7) 49 Schwarzenbach H, Stoehlmacher J, Pantel K, Goekkurt E (2008) "Detection and monitoring of cell-free DNA in blood of patients with colorectal cancer" Ann N Y Acad Sci, 1137, 190-6 50 Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, Digumarthy S, Turke AB, Fidias P, et al (2011) "Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors" Sci Transl Med, (75), 75ra26 51 Sequist LV, Yang JC, Yamamoto N, O'Byrne K, Hirsh V, Mok T, et al (2013) "Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations" J Clin Oncol, 31 (27), 3327-34 52 Shaodong Hong, Fangfang Gao, Sha Fu, Yan Wang, Wenfeng Fang, Yan Huang, et al (2018) "Concomitant Genetic Alterations With Response to Treatment and Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitors in Patients With EGFR-Mutant Advanced Non–Small Cell Lung Cancer" JAMA Oncology, (5), 739–742 53 Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA (2007) "Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer" Nat Rev Cancer, (3), 169-81 54 Sigismund S, Avanzato D, Lanzetti L (2018) "Emerging functions of the EGFR in cancer" Mol Oncol, 12 (1), 3-20 55 Takeuchi S, Yano S (2014) "Clinical significance of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors: sensitivity and resistance" Respir Investig, 52 (6), 348-56 56 Tony S Mok, Yi-Long Wu, Sumitra Thongprasert, Chih-Hsin Yang, Da-Tong Chu, Nagahiro Saijo (2009) "Gefitinib or Carboplatin–Paclitaxel in Pulmonary Adenocarcinoma" The New England Journal of Medicine, vol 36 (10), 947-957 57 Uchida J, Kato K, Kukita Y, Kumagai T, Nishino K, Daga H, et al (2015) "Diagnostic Accuracy of Noninvasive Genotyping of EGFR in Lung Cancer Patients by Deep Sequencing of Plasma Cell-Free DNA" Clin Chem, 61 (9), 1191-6 58 Vaida Gedvilaitė, Diana Schveigert, Saulius Cicėnas (2017) "Cell-free DNA in non-small cell lung cancer" Acta Medica Lituanica, 24 (2), pp.138-144 59 Vera Kloten NR, Nadina Ortiz Brüchle, Janina Gasthaus, Nils, Freudenmacher FS, Jolein Mijnes, Julian Eschenbruch, Marcel Binnebösel, Ruth Knüchel and Edgar Dahl (2017) "Liquid biopsy in colon cancer: comparison of different circulating DNA extraction systems following absolute quantification of KRAS mutations using Intplex allele-specific PCR" Oncotarget, (49), pp.86253-86263 60 Vu HA, Xinh PT, Ha HT, Hanh NT, Bach ND, Thao DT, et al (2016) "Spectrum of EGFR gene mutations in Vietnamese patients with non-small cell lung cancer" Asia Pac J Clin Oncol, 12 (1), 86-90 61 Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al (2017) "Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA" Nat Rev Cancer, 17 (4), 223-238 62 Wang H, Jiang J, Mostert B, Sieuwerts A, Martens JW, Sleijfer S, et al (2013) "Allele-specific, non-extendable primer blocker PCR (AS-NEPB-PCR) for DNA mutation detection in cancer" J Mol Diagn, 15 (1), 62-9 63 Wang H, Huang J, Yu X, Han S, Yan X, Sun S, et al (2014) "Different efficacy of EGFR tyrosine kinase inhibitors and prognosis in patients with subtypes of EGFR-mutated advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis" J Cancer Res Clin Oncol, 140 (11), 1901-9 64 Wei B, Zhao C, Li J, Zhao J, Ren P, Yang K, et al (2019) "Combined plasma and tissue genotyping of EGFR T790M benefits NSCLC patients: a realworld clinical example" Mol Oncol, 13 (5), 1226-1234 65 Westover D, Zugazagoitia J, Cho BC, Lovly CM, Paz-Ares L (2018) "Mechanisms of acquired resistance to first- and second-generation EGFR tyrosine kinase inhibitors" Ann Oncol, 29 (suppl_1), i10-i19 66 Yarden Y (2001) "The EGFR family and its ligands in human cancer, signalling mechanisms and therapeutic opportunities" European Journal of Cancer, 37, pp,3-8 67 Yun CH, Mengwasser KE, Toms AV, Woo MS, Greulich H, Wong KK, et al (2008) "The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinity for ATP" Proc Natl Acad Sci U S A, 105 (6), 20705 PHỤ LỤC