Ứng dụng kỹ thuật etest xác định kháng thuốc và kỹ thuật giải trình tự gen phát hiện đột biến kháng levofloxacin của vi khuẩn helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày tá tràng tại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN VĂN KHOA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ETEST XÁC ĐỊNH KHÁNG THUỐC VÀ KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÁNG LEVOFLOXACIN CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG TÂM TIỀN GIANG NĂM 2020 - 2021 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Cần Thơ - 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN VĂN KHOA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ETEST XÁC ĐỊNH KHÁNG THUỐC VÀ KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÁNG LEVOFLOXACIN CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TRUNG TÂM TIỀN GIANG NĂM 2020 - 2021 Chuyên ngành: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN ĐỖ HÙNG Cần Thơ – 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Nguyễn Văn Khoa, học viên cao học trường Đại học Y dược Cần Thơ, xin cam đoan đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Etest xác định kháng thuốc kỹ thuật giải trình tự gen phát đột biến kháng levofloxacin vi khuẩn Helicobacter pylori bệnh nhân viêm dày Bệnh viện Đa khoa Trung tâm Tiền Giang năm 2020 - 2021” cơng trình nghiên cứu cá nhân tơi Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Cần Thơ, ngày 20 tháng năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Khoa LỜI CẢM ƠN Để luận văn thành cơng hơm nay, tất lịng kính trọng nỗi niềm biết ơn chân thành tơi xin kính dâng đến: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Y Dược Cần Thơ chấp thuận tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài - Khoa Điều dưỡng - Kỹ thuật Y học hỗ trợ tận tình thời gian tơi tiến hành nghiên cứu - Đặc biệt, với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc xin gửi đến Thầy PGS.TS Trần Đỗ Hùng Người Thầy đáng kính, khơng ngại gian khó thức đêm trắng để nghiên cứu góp ý, chỉnh sửa đề tài, dìu dắt giúp đỡ tận tình tơi chập chững bước vào đường nghiên cứu khoa học Xin gửi lời biết ơn chân thành với tất lịng kính trọng đến số Quý quan, tập thể, cá nhân giúp đỡ nhiệt tình thời gian tơi thực đề tài: - Giáo Sư - Tiến sĩ Tạ Văn Trầm, Giám Đốc Bệnh viện Đa khoa Trung tâm Tiền Giang Người chấp thuận cho tiến hành nghiên cứu đơn vị - Tập thể phòng Nội Soi Bệnh viện Đa khoa Trung tâm Tiền Giang hộ trợ tận tình cho tơi q trình lấy mẫu - Tập thể khoa Vi Sinh Bệnh viện Đa khoa Trung tâm Tiền Giang giúp đỡ nhiều trình nghiên cứu - Ban Giám Đốc Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật thành phố Cần Thơ, Tiến Sĩ Nguyễn Thị Như Mai tập thể khoa Xét Nghiệm, tạo điều kiện cho mượn sở vật chất, trang thiết bị để thực số giai đoạn nghiên cứu Tơi xin dành tình cảm yêu quý gửi đến: Mẹ, Vợ Con gái Tất hi sinh thầm lặng, vất vả tảo tần, sẻ chia bùi cổ vũ động viên nguồn động lực to lớn tơi an tâm học tập nghiên cứu thời gian qua Kính dâng thành đến Mẹ Vợ tôi! Xin gửi đến tất người lịng biết ơn vơ hạn! Cần Thơ, ngày 20 tháng năm 2021 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Khoa MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục biểu đồ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori 1.2 Bệnh lý viêm dày 1.3 Sự đề kháng kháng sinh 1.4 Xác định đề kháng levofloxacin Helicobacter pylori kỹ thuật Etest 13 1.5 Đặc điểm gen gyrA phương pháp phát đột biến Helicobacter pylori kỹ thuật giải trình tự gen 14 1.6 Một số nghiên cứu đột biến đề kháng levofloxacin yếu tố liên quan 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3 Đạo đức nghiên cứu 36 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 Đặc điểm chung, lâm sàng nội soi mẫu nghiên cứu 37 3.2 Các số tỷ lệ đề kháng levofloxacin 41 3.3 Các số tỷ lệ đột biến Helicobacter pylori mẫu đề kháng levofloxacin 43 3.4 Một số yếu tố liên quan đến đề kháng đột biến 45 Chương BÀN LUẬN 53 4.1 Phân tích đặc điểm chung, lâm sàng nội soi bệnh nhân viêm dày có Helicobacter pylori quần thể nghiên cứu 53 4.2 Phân tích số đặc điểm tỷ lệ đề kháng levofloxacin 57 4.3 Phân tích số đặc điểm tỷ lệ đột biến 59 4.4 Phân tích số yếu tố liên quan đến đề kháng đột biến vi khuẩn Helicobacter pylori với kháng sinh levofloxacin 63 KẾT LUẬN 70 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Phương pháp pha loãng Agar ADM Agar Dilution Method AMX Amoxicilin AST Antibiotic susceptibility testing BHI Brain Heart Infusion CagA Cytotoxin Associated Gene A CE Capillary Electrophoresis CFU Colony forming unit CI Confidence Interval DDM Disk Diffusion Method ddNTP DEPC DNA dNTP EOF Dideoxyribonucleotide triphosphate Diethyl pyrocarbonate Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide triphosphate Electroosmotic Flow ETEST Epsilometer Test FLQ Fluoroquinolones GyrA Enzyme gyrase subunit A HBA Hinton Blood Agar LVX Levofloxacin MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu PAI Pathogenicity Island Vùng khả gây bệnh Thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh Mơi trường tim óc hầm Độc tố tế bào liên quan đến gen A Điện di mao quản Đơn vị hình thành khuẩn lạc Khoảng tin cậy Phương pháp khuếch tán đĩa Dòng điện thẩm thấu Môi trường thạch máu mueller hinton PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi gen PPI Proton Pump Inhibitors Ức chế bơm proton QRDR Quinolone Resistance Determining Region Vùng phát đề kháng Quinolon RNA Ribonucleic acid UV-VIS Ultraviolet – visible spectrophotometry Quang phổ tử ngoại – nhìn thấy VacA Vacuolating Cytotoxin Gene A Cytotoxin không bào gen A DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tỷ lệ đề kháng levofloxacin khu vực châu Á 11 Bảng 1.2: Tỷ lệ dạng đột biến đề kháng levofloxacin 18 Bảng 2.1: Các biến số đặc điểm chung lâm sàng mẫu nghiên cứu.….23 Bảng 2.2: Sinh phẩm dùng phương pháp tách DNA 28 Bảng 2.3: Sinh phẩm dùng phương pháp PCR 28 Bảng 2.4: Sinh phẩm dùng tinh DNA 28 Bảng 2.5: Quy trình thực phản ứng PCR 30 Bảng 2.6: Thay đổi nucleotid mẫu đột biến 34 Bảng 3.1: Đặc điểm bệnh nhân dương tính với Helicobacter pylori……… 37 Bảng 3.2: Tỷ lệ dạng tổn thương nội soi 40 Bảng 3.3: Tỷ lệ xuất vị trí tổn thương nội soi 40 Bảng 3.4: Kết Clotest mẫu dương tính với Helicobacter pylori 41 Bảng 3.5: Tỷ lệ đề kháng levofloxacin 41 Bảng 3.6 Nồng độ ức chế tối thiểu mẫu đề kháng levofloxacin 42 Bảng 3.7 Nồng độ ức chế tối thiểu mẫu đột biến 42 Bảng 3.8: Tỷ lệ đề kháng levofloxacin tương ứng với nhóm nồng độ ức chế tối thiểu 43 Bảng 3.9: Tỷ lệ đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 43 Bảng 3.10: Tỷ lệ đột biến đơn kép mẫu nghiên cứu 44 Bảng 3.11: Tần suất xuất dạng đột biến 44 Bảng 3.12: Liên quan nhóm tuổi đề kháng levofloxacin 45 Bảng 3.13: Liên quan giới tính đề kháng levofloxacin 45 Bảng 3.14: Liên quan tiền sử hút thuốc đề kháng levofloxacin 46 Bảng 3.15: Liên quan tiền sử uống rượu đề kháng levofloxacin 46 Bảng 3.16: Liên quan tiền sử điều trị Helicobacter pylori đề kháng levofloxacin 47 Bảng 3.17: Liên quan nhóm tuổi đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 47 Bảng 3.18: Liên quan giới tính đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 48 Bảng 3.19: Liên quan tiền sử hút thuốc đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 48 Bảng 3.20: Liên quan tiền sử uống rượu đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 49 Bảng 3.21: Liên quan nhóm nồng độ ức chế tối thiểu đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 49 Bảng 3.22: Liên quan tiền sử điều trị Helicobacter pylori đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 50 Bảng 3.23: Phân tích đa biến số yếu tố liên quan đến đề kháng levofloxacin 51 Bảng 3.24: Phân tích đa biến số yếu tố liên quan đến đột biến mẫu đề kháng levofloxacin 52 MSBN:…… MSBV:…… 1.9 Bệnh nhân có tiền sử hút thuốc 1: Có  2: Khơng  1.10, Bệnh nhân có tiền sử uống rượu, bia 1: Có  2: Khơng  CHUN MƠN 2.1 Triệu chứng lâm sàng Các triệu chứng lâm sàng Đau bụng thượng vị Có  Khơng  Cảm giác nóng rát - xót thượng vị Có  Khơng  Đầy hơi, khó tiêu Có  Khơng  Buồn nơn Có  Khơng  Nơn ói Có  Khơng  Ợ Có  Khơng  Ợ chua Có  Khơng  Đau lưng Có  Khơng  Viêm xung huyết Có  Khơng  Viêm xuất huyết Có  Khơng  Viêm trợt Có  Khơng  Viêm trợt phẳng Có  Khơng  Viêm phì đại Có  Khơng  Viêm teo Có  Khơng  Viêm trào ngược Có  Khơng  Viêm hang vị đơn Có  Khơng  Vị trí tổn thương Viêm thân vị đơn Có  Khơng  Có  Khơng  2.2 Cận lâm sàng 2.2.1 Hình ảnh vị trí tổn thương nội soi Tổn thương Viêm hang vị thân vị MSBN:…… MSBV:…… 2.2.2 Các dạng đột biến đề kháng levofloxacin T87I Có  Khơng  N87K Có  Khơng  D91N Có  Khơng  D91G Có  Khơng  Nhạy  Kháng  Khác:……………………… 2.2.3 Nồng độ ức chế tối thiểu cuả Levofloxacin MIC định tính Levofloxacin MIC định lượng Levofloxacin 2.2.4 Xét nghệm Clotest Nồng độ MIC (µg/mL) Âm tính  Dương tính  Người thu thập Nguyễn Văn Khoa Phụ lục 2: MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình 1: Lọ đựng mẫu sinh thiết (trái) kết xét nghiệm Clotest (phải) (1): Clotest âm tính; (2), (3), (4) Clotest dương tính Hình 2: Hộp đựng Etest cách gắp khỏi vỏ bảo vệ Hình 3: Cấu tạo hai mặt Etest (A) Mặt trước, (B) mặt sau , a: đầu trên, b: đầu Etest (BioMerieux, Catalogue, 2012) Hình 4: Hộp đựng túi Genbag (trái) túi Genbag (phải) Hình 5: Ảnh ni cấy bọc Genbag có khóa khí có túi genBag tạo mơi trường vi khí Hình 6: Ảnh chụp từ kính hiển vi nhuộm gram soi thấy Helicobacter pylori Hình 7: Học viên tiến hành thao tác tách DNA hệ thống máy tự động tủ an tồn sinh học cấp II Hình 8: Hệ thống máy tách DNA tự động Smart LabAssist 32 Hình 9: Học viên gắn strip vào khe chuẩn bị chạy tách chiết mẫu Hình 10: Các strip (đánh dấu đỏ) plate (đánh dấu xanh) gắn vị trí vào hệ thống tách chiết tự động Hình 11: Hệ thống máy giải trình tự gen ABI 3500 Genetic Analyze ... pylori thực đề tài: ? ?Ứng dụng kỹ thuật Etest xác định kháng thuốc kỹ thuật giải trình tự gen phát đột biến kháng levofloxacin vi khuẩn Helicobacter pylori bệnh nhân vi? ?m dày Bệnh vi? ??n Đa khoa Trung... tài Xác định tỷ lệ đề kháng levofloxacin vi khuẩn Helicobacter pylori bệnh nhân vi? ?m dày kỹ thuật Etest Xác định tỷ lệ đột biến vi khuẩn Helicobacter pylori mẫu đề kháng levofloxacin bệnh nhân vi? ?m... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN VĂN KHOA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ETEST XÁC ĐỊNH KHÁNG THUỐC VÀ KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN KHÁNG LEVOFLOXACIN CỦA VI KHUẨN