tóm tắt luận án nghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chưa dược liệu

Māc tiêu cÿa luÁn án - Xây dựng đ°ÿc qui trình đ椃⌀nh tính và/ hoặc đ椃⌀nh l°ÿng đồng thơꄀi các thuác kháng histamin chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinnarizin, promethazin tr⌀

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O Bà Y TÀ

VIÞN KIÂM NGHIÞM THUÞC TRUNG ¯¡NG

TRÄN THÚY H¾NH

NHÓM KHÁNG HISTAMIN VÀ ĐIÀU TRÞ TNG H¾ HUY¾T ÁP TRàN TRÁI PHÉP

TRONG CH¾ PH¾M CHþA D¯þC LIàU

Chuyên ngành : KIÞM NGHIÞM THUàC VÀ ĐàC CHÀT

Công trình đ°ÿc hoàn thành t¿i: Vißn Kißm nghißm thuác trung °¡ng Tr°ơꄀng Đ¿i học D°ÿc Hc N⌀i Vißn Kißm nghißm An toàn vß sinh thực phẩm Quác gia Ng°ơꄀi h°ớng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyën Th椃⌀ Kiëu Anh TS Trần Th椃⌀ Hồng Anh Ph¿n bißn 1:&&&&&&&&&&&&&&&&&&

&&&&&&&&&&&&&&&&&& Ph¿n bißn 2:&&&&&&&&&&&&&&&&&&

&&&&&&&&&&&&&&&&&& Ph¿n bißn 3:&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&

Luận án s¿ đ°ÿc b¿o vß tr°ớc H⌀i đồng đánh giá luận án cÁp Vißn họp t¿i: &&&&&&&&&&&&&&&

Vào hồi&&& giơꄀ && ngcy && tháng && năm&&

Có thß tìm hißu luận án t¿i:

Th° vißn Quác gia Vißt Nam Th° vißn Vißn Kißm nghißm thuác trung °¡ng

A GIàI THIÞU LUÀN ÁN 1 Tính cÃp thi¿t cÿa luÁn án

Xu h°ớng chọn sử dāng các s¿n phẩm có nguồn gác tự nhiên đß phòng, hß trÿ vc điëu tr椃⌀ bßnh ngcy ccng đ°ÿc °a chu⌀ng Theo °ớc tính cÿa Tổ chāc Y tÁ thÁ giới (WHO), có đÁn kho¿ng 80% dân sá thÁ giới sử dāng thuác d°ÿc lißu và 170 trong sá 194 quác gia thành viên cÿa WHO có báo cáo vißc sử dāng thuác d°ÿc lißu trong chăm sóc sāc khße Tuy nhiên, m⌀t tỷ lß chÁ phẩm đang l°u hcnh trên th椃⌀ tr°ơꄀng đã b椃⌀ tr⌀n trái phép m⌀t sá lo¿i thuác hóa d°ÿc nhằm c¿i thißn tác dāng và rút ngắn thơꄀi gian điëu tr椃⌀ Theo các nghiên cāu đã công bá thì hầu hÁt các nhóm tác dāng d°ÿc lý cÿa thuác hóa d°ÿc đëu phát hißn có tr⌀n không khai báo trong các chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu

Vißc tr⌀n d°ÿc chÁt không khai báo vào chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu lc bÁt hÿp pháp, gian lận th°¡ng m¿i, ngāy t¿o tác dāng Hậu qu¿ lc gây ra nhiëu tr°ơꄀng hÿp biÁn chāng nghiêm trọng do không kißm soát đ°ÿc liëu l°ÿng vc thơꄀi gian tác dāng cÿa thuác Chính vì vậy, yêu cầu có b⌀ công cā hữu hißu xác đ椃⌀nh các chÁt hóa d°ÿc tr⌀n trái phép trong chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu phāc vā công tác kißm tra, giám sát chÁt l°ÿng s¿n phẩm là rÁt cÁp thiÁt

ChÁ phẩm chāa d°ÿc lißu có thành phần đa d¿ng, phāc t¿p, l°ÿng chÁt phân tích trong mẫu nhß nên ph°¡ng pháp phân tích ph¿i có đ⌀ chọn lọc, đ⌀ nh¿y, đ⌀ chính xác cao Nhóm ph°¡ng pháp sắc ký từ đ¡n gi¿n là sắc ký lớp mßng (TLC), ph°¡ng pháp th°ơꄀng quy là sắc ký lßng hißu năng cao (HPLC) với detector UV đÁn ph°¡ng pháp đ°ÿc coi là qui chiÁu: Sắc ký lßng khái phổ hai lần (LC-MS/MS) - đáp āng đ°ÿc yêu cầu kỹ thuật, cho phép phân tích sá l°ÿng mẫu lớn với thơꄀi gian phân tích phù hÿp s¿ là lựa chọn tái °u Nghiên cāu phát trißn ph°¡ng pháp s¿ là tiën đë quan trọng đß thực hißn phân tích xác đ椃⌀nh sự có mặt các thuác hóa d°ÿc trong các chÁ chāa d°ÿc lißu đang l°u hành trên th椃⌀ tr°ơꄀng

Do vậy, đë tài <Nghiên cāu xác đßnh mßt sß d°ÿc chÃt nhóm kháng histamin và điÁu trß tng huy¿t áp trßn trái phép trong ch¿ phẩm chāa d°ÿc lißu= đ°ÿc thực hißn

2 Māc tiêu cÿa luÁn án

- Xây dựng đ°ÿc qui trình đ椃⌀nh tính và/ hoặc đ椃⌀nh l°ÿng đồng thơꄀi các thuác kháng histamin (chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinnarizin, promethazin) tr⌀n trong chÁ phẩm từ d°ÿc lißu bằng HPTLC, HPLC và LC-MS/MS

- Xây dựng đ°ÿc qui trình đ椃⌀nh tính và/ hoặc đ椃⌀nh l°ÿng đồng thơꄀi các thuác điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) tr⌀n trong chÁ phẩm từ d°ÿc lißu bằng HPTLC, HPLC và LC-MS/MS

- Áp dāng các qui trình đã xây dựng đß đánh giá s¡ b⌀ thực tr¿ng tr⌀n trái phép các nhóm d°ÿc chÁt trên trong m⌀t sá d¿ng chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu có ở Vißt Nam

3 Những đóng góp mái cÿa luÁn án

+ Luận án là nghiên cāu đầu tiên ở Vißt Nam xây dựng đ°ÿc 2 ph°¡ng pháp HPTLC: 1) Đ椃⌀nh tính đồng thơꄀi 5 d°ÿc chÁt kháng histamin (chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinnarizin, promethazin) trên nën mẫu chāa d°ÿc lißu d¿ng cao lßng và cao khô chāa 18 d°ÿc lißu sử dāng trong điëu tr椃⌀, hß trÿ điëu điëu tr椃⌀ c¿m cúm, d椃⌀ āng, mẩn ngāa, vc 2) Đ椃⌀nh tính đồng thơꄀi 4 d°ÿc chÁt điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trên nën mẫu chāa d°ÿc lißu d¿ng cao lßng và cao khô chāa 14 d°ÿc lißu sử dāng trong điëu tr椃⌀, hß trÿ điëu điëu tr椃⌀ cao huyÁt áp Các ph°¡ng pháp nhanh, đ¡n gi¿n, có kh¿ năng scng lọc tát trong phân tích phát hißn các chÁt nghiên cāu trong mẫu chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu l°u hcnh trên th椃⌀ tr°ơꄀng

+ Nghiên cāu đã xây dựng đ°ÿc qui trình: Đ椃⌀nh tính, đ椃⌀nh l°ÿng đồng thơꄀi 5 thuác kháng histamin (chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinnarizin, promethazin) trên nën mẫu chāa d°ÿc lißu d¿ng cao lßng và cao khô chāa 18 d°ÿc lißu sử dāng trong điëu tr椃⌀, hß trÿ điëu điëu tr椃⌀ c¿m cúm, d椃⌀ āng, mẩn ngāa bằng HPLC và LC-MS/MS

Đ椃⌀nh tính, đ椃⌀nh l°ÿng đồng thơꄀi 4 d°ÿc chÁt điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trên nën mẫu chāa d°ÿc lißu d¿ng cao lßng và cao khô chāa 14 d°ÿc lißu sử dāng trong điëu tr椃⌀, hß trÿ điëu điëu tr椃⌀ cao huyÁt áp bằng HPLC và LC-MS/MS

Các ph°¡ng pháp có đ⌀ chọn lọc cao, đ⌀ đúng, đ⌀ chính xác đ¿m b¿o, đ⌀ nh¿y phù hÿp Các qui trình phân tích ncy đã đ°ÿc đánh giá t¿i phòng thí nghißm đ⌀c lập đúng chāc năng vc đ¿t chuẩn mực ISO IEC 17025 nên các qui trình này có thß āng dāng phát hißn và xác đ椃⌀nh hcm l°ÿng các chÁt nghiên cāu trong mẫu chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu l°u hcnh trên th椃⌀ tr°ơꄀng phāc vā công tác kißm tra, giám sát chÁt l°ÿng

+ Luận án đã āng dāng các qui trình đã xây dựng đß trong phân tích các mẫu thực đang l°u hcnh trên th椃⌀ tr°ơꄀng, kÁt qu¿ đã chāng minh tính khoa học và kh¿ thi cÿa ph°¡ng pháp/ qui trình trong thực tiën kißm nghißm Trong nghiên cāu, đã phát hißn 12/55 mẫu chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu sử dāng điëu tr椃⌀, hß trÿ điëu điëu tr椃⌀ c¿m cúm, d椃⌀ āng, mẩn ngāa d°¡ng tính với các chÁt nghiên cāu thu⌀c nhóm thuác kháng histamin; nh°ng ch°a phát hißn đ°ÿc mẫu d°¡ng tính với 4 d°ÿc chÁt điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trong 56 mẫu chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu sử dāng điëu tr椃⌀, hß trÿ điëu điëu tr椃⌀ cao huyÁt áp Do đó, cần ph¿i tăng c°ơꄀng qu¿n lý và kißm tra chÁt l°ÿng đái với các chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu l°u hcnh trên th椃⌀ tr°ơꄀng và nâng cao nhận thāc cÿa ng°ơꄀi tiêu dùng đß đ¿m b¿o an toàn cho khi sử dāng các chÁ phẩm này

+ Đã xây dựng đ°ÿc công thāc thành phần và bào chÁ ra 2 nën mẫu chāa d°ÿc lißu d¿ng lßng và d¿ng rắn dựa trên các bài thuác cổ truyën, các nghiên cāu khoa học, các chÁ phẩm có th椃⌀ phần lớn trên th椃⌀ tr°ơꄀng có tác dāng điëu tr椃⌀ hoặc hß trÿ điëu tr椃⌀ bßnh d椃⌀ āng, mẩn ngāa, c¿m cúm hoặc cao huyÁt áp Hoàn toàn có thß sử dāng 2 nën mẫu này trong xây dựng và thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp phân tích cho các d°ÿc chÁt có tác dāng d°ÿc lý t°¡ng tự

4 Bß cāc cÿa luÁn án

Luận án gồm 146 trang, 44 b¿ng, 44 hình, 97 tài lißu tham kh¿o Bá cāc gồm: Đặt vÁn đë (3 trang); tổng quan (29 trang); nguyên lißu, trang thiÁt b椃⌀, n⌀i dung vc ph°¡ng pháp nghiên cāu (15 trang); kÁt qu¿ nghiên cāu (78 trang); bàn luận (17 trang); kÁt luận và kiÁn ngh椃⌀ (2 trang); tài lißu tham kh¿o (8 trang); phā lāc (145 trang); danh māc các công trình đã công bá liên quan đÁn luận án (1 trang)

B NÞI DUNG LUÀN ÁN

CH¯¡NG 1 TỔNG QUAN

Phần tổng quan trình bày các n⌀i dung: - Khái quát chung vë tình hình thuác hóa d°ÿc tr⌀n trái phép trong chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu trên thÁ giới và Vißt Nam;

- CÁu trúc, tính chÁt lý hóa, tác dāng d°ÿc lý, tác dāng phā cÿa 9 d°ÿc chÁt nghiên cāu (Tổng quan vë đái t°ÿng nghiên cāu);

- Tổng quan các ph°¡ng pháp nghiên cāu gồm HPTLC, HPLC và LC-MS/MS Đồng thơꄀi, tóm tắt các công bá āng dāng các ph°¡ng pháp này trong phát hißn d°ÿc chÁt nhóm điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp và kháng histamin tr⌀n trái phép trong chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu

- Khái quát vë các d°ÿc lißu và chÁ phẩm từ d°ÿc lißu điëu tr椃⌀ và hß trÿ điëu tr椃⌀ d椃⌀ āng, mẩn ngāa, cao huyÁt áp đß lcm c¡ sở chÁ t¿o nën mẫu nghiên cāu (Tổng quan vë nën mẫu nghiên cāu)

* Hầu hÁt các nghiên cāu phân tích đồng thơꄀi nhiëu d°ÿc chÁt điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp hay kháng histamin đã công bá đëu lc các nghiên cāu cÿa các nhà khoa học quác tÁ, sử dāng các ph°¡ng pháp sắc ký với kỹ thuật phân tích hißn đ¿i nh° Q-TOF, LC-MS/MS vc đ°ÿc xây dựng dựa trên nën mẫu cÿa 1 s¿n phẩm cā thß Từ tổng quan, đ°a ra đ椃⌀nh h°ớng nghiên cāu là kÁ thừa các kÁt qu¿ đã đ°ÿc công bá, kh¿o sát tái āu hóa các qui trình phân tích trong điëu kißn thực tÁ, mở r⌀ng đái t°ÿng áp dāng, xây dựng và phát trißn m⌀t hß tháng các ph°¡ng pháp từ sàng lọc nhanh bằng ph°¡ng pháp đ¡n gi¿n (TLC) đÁn đ椃⌀nh l°ÿng các chÁt phát hißn đ°ÿc bằng ph°¡ng pháp chính xác h¡n sau khi đã đ°ÿc sàng lọc (HPLC; LC-MS/MS)

CH¯¡NG 2 NGUYÊN LIÞU, TRANG THI¾T BÞ, NÞI DUNG

VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĀU 2.1 Nguyên lißu, trang thi¿t bß

2.1.2 Trang thiết bị

Hß tháng sắc ký lßng khái phổ Agilent 6460 Triple Quad MS/MS, Mỹ Hß tháng HPLC Shimazu 20AD với detector UV-PDA, Nhật Hß tháng HPLC Waters Alliance e2695 detector PDA, Mỹ Hß tháng sắc ký lớp mßng hißu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thuỵ Sỹ)

LC-Các trang thiÁt b椃⌀, dāng cā khác cÿa phòng thí nghißm t¿i Vißn Kißm nghißm thuác Trung ¯¡ng, Tr°ơꄀng Đ¿i học D°ÿc Hà N⌀i; Vißn Kißm nghißm An toàn vß sinh thực phẩm Quác gia

2.2 Đßi t°ÿng nghiên cāu

- Mẫu thử: 111 mẫu thuác d°ÿc lißu, thực phẩm b¿o vß sāc khße

(TPBVSK) gồm: 56 chÁ phẩm điëu tr椃⌀ hoặc hß trÿ điëu tr椃⌀ bßnh cao huyÁt áp (HA); 55 chÁ phẩm điëu tr椃⌀ hoặc hß trÿ điëu tr椃⌀ các bßnh d椃⌀ āng (DU), mẩn ngāa, c¿m cúm đang l°u hcnh t¿i Vißt Nam

- Mẫu n

dựa trên các bài thuác cổ truyën điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp d¿ng rắn HA.N1 và d¿ng lßng HA.N2; 2 nën mẫu có thành phần (bao gồm 18 lo¿i d°ÿc lißu) dựa trên các bài thuác cổ truyën cháng d椃⌀ āng, mẩn ngāa, c¿m cúm d¿ng rắn DU.N1 và d¿ng lßng DU.N2

- Mẫu tự tạo: Mẫu nën có thêm các chÁt chuẩn nghiên cāu với tỉ

lß nhÁt đ椃⌀nh

2.3 Nßi dung và ph°¢ng pháp nghiên cāu

- Xây dựng thành phần và bào chÁ nën mẫu áp dāng trong xây dựng và thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp phân tích

- Xây dựng và thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp HPTLC đ椃⌀nh tính; ph°¡ng pháp HPLC và LC-MS/MS đ椃⌀nh tính vc đ椃⌀nh l°ÿng đồng thơꄀi các d°ÿc chÁt điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) tr⌀n trong chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu

- Xây dựng và thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp HPTLC đ椃⌀nh tính; ph°¡ng pháp HPLC và LC-MS/MS đ椃⌀nh tính vc đ椃⌀nh l°ÿng đồng thơꄀi các d°ÿc chÁt kháng histamin (clorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, cinarizin, promethazin) tr⌀n trong chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu

- Đánh giá ph°¡ng pháp phân tích t¿i phòng thí nghißm đ⌀c lập - Áp dāng các qui trình đã xây dựng đß kißm tra phát hißn các d°ÿc chÁt nghiên cāu trong m⌀t sá chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu đang l°u hành t¿i Vißt Nam

2.3.1 Xây dựng và bào chế n

Thành phần nën mẫu đông d°ÿc dùng đß xây dựng và thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp phân tích đ°ÿc xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyën ph°¡ng Đông, các bci thuác kinh đißn, <Danh māc thuác cổ truyën, v椃⌀ thuác cổ truyën, thuác d°ÿc lißu thiÁt yÁu= đ°ÿc ban hành kèm theo Thông t° sá 19/2018/TT-BYT vc <Danh māc thuác đông y, thuác từ d°ÿc lißu và v椃⌀ thuác y học cổ truyën= ban hcnh kèm theo Văn b¿n hÿp nhÁt sá 13/VBHN-BYT; các nghiên cāu khoa học vë d°ÿc lißu có tác dāng điëu tr椃⌀ më đay, mẩn ngāa, d椃⌀ āng, điëu tr椃⌀ tăng huyÁt áp, lÿi tißu đã công bá và các chÁ phẩm chāa d°ÿc lißu có th椃⌀ phần lớn đang l°u hcnh trên th椃⌀ tr°ơꄀng

Các d°ÿc lißu trong mßi thành phần công thāc đ°ÿc bào chÁ thành d¿ng cao khô (Nën d¿ng rắn: Mẫu nën N1) và cao lßng (d¿ng lßng: Mẫu nën N2) theo h°ớng dẫn trong D°ÿc đißn Vißt Nam (DĐVN)

2.3.2.1 Chuẩn bị các dung dịch: Chuẩn b椃⌀ các dung d椃⌀ch chuẩn trong

dung môi pha mẫu từ các chÁt chuẩn

2.3.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Sử dāng b¿n mßng

Silica gel 60 F254, pha đ⌀ng tùy thu⌀c vào từng nhóm ho¿t chÁt Kh¿o sát và lựa chọn điëu kißn tách riêng các chÁt, vÁt gọn, rõ nét, phổ trùng với phổ chuẩn đß đ椃⌀nh tính

2.3.2.3 Xử lý mẫu: Kh¿o sát các dung môi chiÁt khác nhau, lựa chọn

dung môi chiÁt cho hißu suÁt cao, ổn đ椃⌀nh

2.3.2.4 Thẩm định phương pháp: TiÁn hành thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp

trên mẫu tự t¿o chāa các chÁt nghiên cāu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016, ICH: Đ⌀ chọn lọc (Đ⌀ đặc hißu) và LOD

2.3.3 Xây dựng qui trình định tính, định lượng bằng HPLC

2.3.3.1 Chuẩn bị các dung dịch: Chuẩn b椃⌀ các dung d椃⌀ch chuẩn trong

dung môi pha mẫu từ các chÁt chuẩn

2.3.3.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Sử dāng c⌀t tách C18

(250  4,6 mm; 5 µm) pha đ⌀ng tùy thu⌀c vào từng nhóm ho¿t chÁt Lựa chọn điëu kißn tách riêng các chÁt, pic gọn, cân đái, phổ trùng với phổ chuẩn

2.3.3.3 Xử lý mẫu: Kh¿o sát các dung môi chiÁt khác nhau, lựa chọn

dung môi chiÁt cho hißu suÁt cao, ổn đ椃⌀nh, gi¿m nhiëu cÿa nën mẫu

2.3.3.4 Thẩm định phương pháp: TiÁn hành thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp

trên mẫu tự t¿o chāa các chÁt nghiên cāu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016, ICH: Đ⌀ đặc hißu, kho¿ng tuyÁn tính, LOD vc LOQ, đ⌀ đúng, đ⌀ chính xác (trong ngày và khác ngày)

2.3.4 Xây dựng qui trình định tính, định lượng bằng LC-MS/MS

2.3.4.1 Chuẩn bị các dung dịch: Chuẩn b椃⌀ các dung d椃⌀ch chuẩn trong

dung môi pha mẫu từ các chÁt chuẩn

2.3.4.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích:

- Điëu kißn khái phổ: Kh¿o sát điëu kißn khái phổ (MS) dựa trên tính năng Optimizer cÿa thiÁt b椃⌀ đß lựa chọn chÁ đ⌀ ion hóa, năng l°ÿng bắn phá, điëu kißn phân m¿nh ion mẹ và các ion con

- Kh¿o sát và lựa chọn c⌀t sắc ký, pha đ⌀ng, tác đ⌀ dòng đß có thß tách và phát hißn các chÁt nghiên cāu ở nồng đ⌀ ppb, sắc đồ rõ ràng, thơꄀi gian phân tích không quá dài

2.3.4.3 Xử lý mẫu: Đánh giá kh¿ năng chiÁt các chÁt bằng các dung

môi chiÁt khác nhau, lựa chọn dung môi chiÁt cho hißu suÁt cao, ổn đ椃⌀nh

2.3.4.4 Thẩm định phương pháp: TiÁn hành thẩm đ椃⌀nh ph°¡ng pháp

trên mẫu tự t¿o chāa các chÁt nghiên cāu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016, ICH: Đ⌀ đặc hißu, kho¿ng tuyÁn tính, LOD vc LOQ, đ⌀ đúng, đ⌀ chính xác (trong ngày và khác ngày)

2.3.5 þng dụng các phương pháp xây dựng phân tích mẫu thực

2.3.5.1 Xử lý mẫu: Mẫu thử đ°ÿc đồng nhÁt mẫu, cân và xử lý nh°

qui trình xử lý mẫu đã xây dựng đái với mßi nhóm chÁt

2.3.5.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Chuẩn b椃⌀ dãy dung d椃⌀ch chuẩn

hoặc dung d椃⌀ch chuẩn đái với mßi nhóm d°ÿc chÁt và mßi ph°¡ng pháp;

2.3.5.3 Tiến hành sắc ký: Sắc ký mẫu thử, mẫu chuẩn theo ph°¡ng

pháp đã xây dựng

2.3.5.4 Đánh giá kết quả về định tính: - Phương pháp HPTLC: Quan sát d°ới ánh sáng tử ngo¿i 366 nm

và/ hoặc 254 nm, so sánh Rf và màu sắc cÿa vÁt trên sắc ký đồ (SKĐ) mẫu thử với mẫu chuẩn làm song song NÁu phát hißn vÁt có Rf trùng với Rf cÿa chÁt chuẩn, quét phổ các vÁt t°¡ng āng, chồng phổ với phổ

chÁt chuẩn xác đ椃⌀nh hß sá match đß khẳng đ椃⌀nh kÁt qu¿ (hß sá match > 0,99)

- Phương pháp HPLC: So sánh thơꄀi gian l°u, hß sá chồng phổ cÿa

pic trong mẫu thử so với mẫu chuẩn đß cho kÁt luận đúng hoặc nghi ngơꄀ sự có mặt cÿa các chÁt phân tích trong mẫu thử

- Phương pháp LC-MS/MS: So sánh thơꄀi gian l°u, m¿nh mẹ, hai

m¿nh ion con, tỷ lß c°ơꄀng đ⌀ hai m¿nh ion con đ椃⌀nh tính vc đ椃⌀nh l°ÿng cÿa mẫu thử so với mẫu chuẩn đß cho kÁt luận đúng (pass) hoặc nghi ngơꄀ (fail) sự có mặt cÿa các chÁt phân tích trong mẫu thử

2.3.5.5 Đánh giá kết quả về định lượng

Tính nồng đ⌀ các chÁt phân tích (nÁu có) trong dung d椃⌀ch mẫu thực dựa vco ph°¡ng trình hồi qui tuyÁn tính t°¡ng āng cÿa các chÁt

phân tích đ°ÿc thiÁt lập trong cùng ngày phân tích Từ nồng đ⌀ các

chÁt phân tích (nÁu có) trong d椃⌀ch chiÁt mẫu thử, tính hcm l°ÿng chÁt phân tích trong mẫu thực ban đầu dựa vào khái l°ÿng cân và hß sá pha loãng sau quá trình xử lý mẫu

2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Các kÁt qu¿ thu đ°ÿc trong quá trình nghiên cāu đ°ÿc phân tích và xử lý bằng phần mëm có sẵn trong thiÁt b椃⌀ HPTLC, HPLC và LC-MS/MS, thu đ°ÿc các thông sá dùng trong đ椃⌀nh tính, đ椃⌀nh l°ÿng nh° thơꄀi gian l°u, dißn tích pic, phổ UV, m¿nh phổ

Sử dāng các các phép tháng kê trong phân tích bằng Microsoft Office Excel

CH¯¡NG 3 K¾T QUÀ NGHIÊN CĀU 3.1 Xây dựng và bào ch¿ nÁn m¿u

điëu chÁ từ d°ÿc lißu có tác dāng tr椃⌀ chāng d椃⌀ āng, c¿m cúm, mẩn ngāa là DU.N1 và DU.N2

3.2 Xây dựng và thẩm đßnh ph°¢ng pháp phân tích các chÃt nhóm điÁu trß tng huy¿t áp trßn trong ch¿ phẩm chāa d°ÿc lißu

3.2.1 Phương pháp HPTLC

- Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Từ kÁt qu¿ kh¿o sát, đã lựa

chọn đ°ÿc điëu kißn sắc ký là b¿n mßng Silica gel 60 F254; thß tích chÁm 10 µL; hß dung môi (ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac) (1,5:9:3:0,3); b°ớc sóng phát hißn: 254 nm với NIF, FUR; 366 nm với AML và FEL cho kÁt qu¿ tách tát c¿ 4 chÁt phân tích trên c¿ 2 nën HA.N1 và HA.N2

- Xử lý mẫu: Mẫu thử đ°ÿc xử lý bằng cách cân chính xác kho¿ng 0,50

g đái với mẫu rắn hoặc 1,00 g mẫu lßng vào áng falcon Thêm chính xác 10,0 mL methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp d椃⌀ch trong đ°ÿc lọc qua màng lọc có kích cỡ lß lọc 0,45 µm

- Thẩm định qui trknh: KÁt qu¿ cho thÁy ph°¡ng pháo có đ⌀ đặc hißu

cao với Rf cÿa FUR, AML, NIF, FEL lần l°ÿt 0,10; 0,29; 0,47; 0,55 Phổ UV-VIS cÿa các vÁt sắc ký thu đ°ÿc cho hß sá phù hÿp đëu đ¿t > 0,99 Giới h¿n phát hißn (LOD) cÿa các chÁt từ 0,10 - 0,20 µg/vÁt t°¡ng āng 0,10 - 0,40 mg/g mẫu

Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện ở bước sóng 254 nm (a); 366 nm (b); Kết quả chồng phổ hấp thụ tại

vị trí tương ứng với vết của FUR trên sắc ký đồ mẫu nền HA.N1

thêm chuẩn và chuẩn (c)

3.2.2 Ph°¡ng pháp HPLC

- Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký: Từ kết quả kh¿o sát đã lựa

chọn đ°ÿc điëu kißn sắc ký là c⌀t tách Waters Xbridge C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm); pha đ⌀ng gồm: Kênh A (Dung d椃⌀ch acid phosphoric 0,1%) và kênh B (Acetonitril) với ch°¡ng trình gradient: 0 → 10 phút: 30% B; 10 → 20 phút: 30 → 60% B; 20 → 32 phút: 60% B; 32 → 33 phút: 60 → 30% B; 33 → 38 phút: 30% B; tác đ⌀ dòng: 1,0 mL/phút; thß tích tiêm mẫu: 10 µL; b°ớc sóng phát hißn: 238 nm Các chÁt phân tích đ°ÿc tách riêng bißt, pic gọn, cân xāng

- Xử lý mẫu: Điëu kißn xử lý mẫu đ°ÿc lựa chọn cho hißu suÁt chiÁt

cao, ổn đ椃⌀nh Cā thß nh° sau: Cân chính xác kho¿ng 1,00 g mẫu vào áng falcon Thêm kho¿ng 20 mL methanol Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút ở nhißt đ⌀ phòng Chuyßn toàn b⌀ hßn hÿp vco bình đ椃⌀nh māc 25 mL, tráng áng 2 lần, mßi lần với kho¿ng 2 mL methanol, tập trung d椃⌀ch rửa vco bình đ椃⌀nh māc, thêm methanol tới v¿ch Lắc đëu Chuyßn kho¿ng 10 mL hßn hÿp vào áng ly tâm, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp d椃⌀ch trong đ°ÿc lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Thẩm định phương pháp phân tích: KÁt qu¿ cho thÁy ph°¡ng pháp

có đ⌀ chọn lọc cao với RT cÿa FUR, AML, NIF, FEL lần l°ÿt là 10,344; 16,019; 19,077; 26,300 phút Ph°¡ng pháp đã xây dựng có giới h¿n phát hißn (LOD) và giới h¿n đ椃⌀nh l°ÿng (LOQ) lần l°ÿt là 7,5 µg/g và 62,5 µg/g ở c¿ 2 nën mẫu,các chÁt nghiên cāu có t°¡ng quan chặt ch¿ giữa tín hißu thu đ°ÿc và nồng đ⌀ chÁt phân tích (R2 > 0,99), đ⌀ chính xác vc đ⌀ thu hồi đáp āng yêu cầu AOAC 2016

(a) (b)

Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC xác định LOQ các chất nh漃Ām điều trị tăng huyết áp trên nền mẫu HA.N1 (a); mẫu nền HA.N2 (b)

3.2.3 Ph°¡ng pháp LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Sử dāng tính năng optimizer cÿa thiÁt

b椃⌀ xác đ椃⌀nh đ°ÿc điëu kißn MS đß phân tích 4 chÁt nghiên cāu lc nguồn ion hóa ESI (+); m¿nh khái lựa chọn (ion mẹ→ ion đ椃⌀nh l°ÿng*/ion