phương pháp chiết xuất và phân lập alkaloid báo cáo hết môn dược liệu

Hiện nay, các phương pháp để chiết suất alkaloid dựa trên các đặc tính là hòa tan trong dung môi hữu cơ, nhưng không hòa tan trong nước và có xu hướng ngược lại với muối của chúng.Hầu hế

NGÔ HÀ MINH ANH TRẦN LAN CHI NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG PHẠM THỊ MINH HIỀN NGUYỄN HOÀNG PHƯƠNG THẢO K27DUOC01

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP ALKALOID

BÁO CÁO HẾT MÔN DƯỢC LIỆU

Thầy hướng dẫn: TS NGUYỄN THÀNH TRIẾT

Thành phố Hồ Chí Minh – 2024

Mục Lục:

CHƯƠNG 1: NGUYÊN TẮC CHUNG 3

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT 5

2.1 ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID BAY HƠI 5

2.1.1 Phương pháp chiết bằng Cất keo hơi nước (chiết alkaloid dạng muối) 5

2.1.2.Thăng hoa 6

2.2 ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID KHÔNG BAY HƠI 7

2.2.1 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm (Chiết xuất alkaloid dạng base) 7

2.2.2 Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước (Chiết alkaloid dạng muối) 12

2.2.3.Chiết bằng cồn (Chiết alkaloid dạng muối) 12

2.3 ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP 14

2.3.1 Chiết bằng cất kéo hơi nước 14

2.3.2 Chiết bằng dung môi hữu cơ 14

2.3.3 Chiết bằng dung dịch nước acid cồn 14

CHƯƠNG 3 TINH CHẾ - PHÂN LẬP ALKALOID 15

3.1 KẾT TINH PHÂN ĐOẠN: 15

3.2 KỸ THUẬT GRADIENT pH: 15

3.3 KỸ THUẬT SẮC KÝ: 16

3.3.1.Sắc ký giấy (Paper chromatography) 16

3.3.2 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC): 16

3.3.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion: 17

3.3.4 Phương pháp sắc ký cột: 18

3.3.5 Sắc ký lớp điều chế: 19

3.4 LOẠI TẠP: 19

3.5 PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN DẠNG ALKALOID 20

CHƯƠNG 4 TỔNG KẾT 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

CHƯƠNG 1: NGUYÊN TẮC CHUNG

Alkaloid, loại base hữu cơ yếu có chứa nitơ hữu cơ tự nhiên, có tác dụng sinh lý đadạng và quan trọng đối với con người và các động vật khác, có thể được tìm thấy ởcác bộ phận khác nhau của thực vật Các alcaloid nổi tiếng bao gồm morphine,strychnine, quinine, ephedrine và nicotine

Hình 1.1 Một số cấu trúc thường gặp trong alkaloid

Vì các alkaloid có cấu trúc đa dạng nên không có cách nào loại bỏ chúng khỏinguyên liệu thô tự nhiên Hiện nay, các phương pháp để chiết suất alkaloid dựa trêncác đặc tính là hòa tan trong dung môi hữu cơ, nhưng không hòa tan trong nước và

có xu hướng ngược lại với muối của chúng

Hầu hết thực vật đều có nhiều alkaloid Đầu tiên, hỗn hợp của chúng được chiếtxuất, sau đó, các alkaloid riêng lẻ được tách ra Cây được nghiền kỹ trước khi chiếtxuất Hầu hết các alcaloid hiện diện trong thực vật sống ở dạng muối của acid hữu

cơ trong cây Các alkaloid chiết được cũng có thể giữ nguyên muối hoặc chuyểnthành base

Các phương pháp chung để phân lập alkaloid phần lớn phụ thuộc vào một số cácyếu tố, ví dụ: tính chất kiềm của hầu hết các alkaloid, khả năng và sự dễ dàng hìnhthành của muối alkaloid với axit và khả năng hòa tan tương đối của muối alkaloidthu được trong dung môi hữu cơ phân cực, ví dụ: ethanol, chloroform, isopropanolhoặc trong môi trường nước.

Việc chiết xuất alcaloid dựa vào tính chất chung sau:

Alkaloid nói chung là những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối củaacid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; nên phải tán nhỏ dượcliệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng nhữngkiềm trung bình hoặc kiềm mạnh

Hầu hết các alkaloid base không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môihữu cơ ít phân cực (hydrocacbon thơm, chloroform, ether) Trái lại, các muốialkaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung môi ít phân cực.Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại bay hơi hoặc không bay hơi

mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp.

Hình 1.2 Sơ đồ chiết suất alkaloid

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT

Các alkaloid trong tự nhiên là ở dạng alkaloid tự do hoặc muối Việc chiết xuất cácalkaloid dựa trên đặc tính cơ bản và kiểu hòa tan của chúng Việc chiết xuất thườngđược thực hiện bằng một trong các phương pháp chung sau đây:

2.1 ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID BAY HƠI

Đối với những alcaloid bay hơi được như coniin (trong cây Conium maculatum),nicotin (trong cây thuốc lá), spactein (trong cây Cytisus scoparius)… cất kéo đượcbằng hơi nước hoặc thăng hoa

Tuy nhiên phương pháp này không phù hợp với các alkaloid có trọng lượng phân tửcao

2.1.1 Phương pháp chiết bằng Cất keo hơi nước (chiết alkaloid dạng muối)

Sau khi sấy khô dược liệu, tán nhỏ, cho kiềm vào để đẩy alkaloid dạng muối radạng base rồi lấy alkaloid ra khỏi dược liệu theo phương pháp cất kéo bằng hơinước, người ta thường hứng dịch cất được vào trong dung dịch acid và từ đó thuđược muối alkaloid

Chưng cất bằng hơi nước: Phương pháp này được sử dụng đặc biệt cho các alkaloidlỏng dễ bay hơi như coniine, sparteine và nicotin

Tuy nhiên phương pháp này không phù hợp với các alkaloid có trọng lượng phân tửcao

Hình 2.1 Alkaloid được chiết qua bộ dụng cụ chưng chất hơi nước

2.2 ĐỐI VỚI NHỮNG ALKALOID KHÔNG BAY HƠI

2.2.1 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm (Chiết xuất alkaloid dạng base)

Chiết xuất bằng dung môi không trộn lẫn với nước.Trên thực tế, phương pháp chiếtbằng dung môi không trộn lẫn với nước được sử dụng rộng rãi nhất dung môi đểchiết alkaloid

- Bước 1: kiềm hoá dược liệu

Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm trong nước

Thường dùng amoni hydroxyd, cũng có thể dùng carbonat kiềm nhưng chỉ thíchhợp với alkaloid có tính base mạnh Vôi, NaOH chỉ dùng khi cần thiết để đẩy cácbase mạnh, đặc biệt đối với những alcaloid tồn tại trong cây ở dạng kết hợp vớitanin; hoặc dùng để biến các alcaloid có nhóm chức phenol thành phenat tan trongnước, không tan trong các dung môi hữu cơ Người ta sử dụng tính chất này để lấyriêng morphin trong phương pháp định lượng morphin trong nhựa thuốc phiện

Hình 2.3 Dược liệu được làm ẩm bằng kiềm thích hợp và vừa đủ ẩm

- Bước 2: chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp

Chiết bột dược liệu sau khi đã kiềm hoá như trên bằng dung môi hữu cơ không phâncực thích hợp, dung môi này hoà tan các alcaloid base vừa được giải phóng Ởphòng thí nghiệm thường dùng benzen, cloroform, ether + cloroform Trong sảnxuất công nghiệp người ta phải chú ý dùng dung môi rẻ tiền, ít độc, khó cháy Cóthể chiết nguội trong bình ngấm kiệt hoặc chiết nóng trong các dụng cụ kiểu Sốc-lết(Soxhlet) hoặc Kumagawa

Hình 2.4 Dược liệu được chiết bằng dung môi thích hợp

- Bước 3: cất thu hồi dung môi, chuyển alcoloid dạng kiềm sang dạng muối tantrong nước

Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dungdịch acid loãng (2 - 5%), (thường dùng acid hydrocloric, acid sulfuric, đôi khi dùngacid acetic hoặc acid formic) Các alcaloid được chuyển sang dạng muối tan trong

nước; còn mỡ, sắc tố, sterol ở lại dung môi hữu cơ Trong phòng thí nghiệm người

ta lắc trong bình gạn, trong công nghiệp phải có thiết bị thích hợp

- Bước 4: kiềm hoá để chuyển alcaloid về dạng base:

Gộp các dịch chiết muối alcaloid lại rồi kiềm hoá để chuyển alcaloid sang dạngbase, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alcaloid base Việcchiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hoặc các dụng cụ chiết chất lỏngtheo kiểu bình ngấm kiệt Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alcaloid base,người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cấtthu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được cắn alcaloid thô

Hình 2.5 Lắc phân bố để thu được alkaloid tinh khiết

Hình 2.6 Quy trình chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm

Đặc tính hóa học của base alkaloid: Sử dụng chất kiềm mạnh, ví dụ NaOH hoặcKOH nên tránh càng xa càng tốt vì thực tế là một số alkaloid nhất định bị thủy phânkhi tiếp xúc kéo dài với bazơ mạnh

Ví dụ: Thủy phân este-alkaloid, ví dụ:cocain, hyoscyamine

Hình 2.7 Một số alkaloid có cấu trúc ester dễ thị thủy phân bởi kiềm mạnh

Các alkaloid phenolic, ví dụ, cephaelin, morphin Các alkaloid này thường được hòatan trong khi tiếp xúc với chất kiềm mạnh và do đó thuốc thử có tính kiềm nhẹ hơn,

ví dụ: dung dịch amoniac loãng là cần thiết cho sự giải phóng base yếu của alkaloid

Sự hiện diện của các chất béo: Nghiêm cấm sử dụng chất kiềm mạnh trong trườnghợp chất béo chứa trong nguyên liệu chứa alkaloid vì hình thành các sản phẩm xàphòng hóa gây nhũ tương Trong những trường hợp như vậy, tốt nhất nên loại chấtbéo của dược liệu trước khi tiến hành giải phóng các alkaloid tự do Các chất thựcvật giàu dầu và chất béo, chẳng hạn như: hạt, nhân, những chất không chứa kiềm

được loại bỏ hoàn toàn bằng cách chiết bằng phương pháp dùng dung môi khôngphân cực thích hợp như n-hexane, ete dầu hỏa,

Hình 2.8 Hiện tượng nhũ khi có tạp chất béo

Dung dịch amoni hydroxit là một trong những dung dịch kiềm chọn lọc nhất được

sử dụng thường xuyên nhất để giải phóng các alkaloid từ nguồn thực vật Đầu tiên,

nó có độ kiềm thích hợp để giải phóng hầu hết các alkaloid thông thường, và thứhai là tính chất dễ bay hơi của nó để có thể loại bỏ nó bằng cách làm bay hơi dungmôi Như nó có có xu hướng được chiết bằng ete dung môi từ dung dịch nước, do

đó, nó gần như cần thiết để loại bỏ nó bằng cách bay hơi và rửa sạch sau đó nhiềulần

Cloroform được coi là dung môi không hòa tan trong nước lựa chọn nhất cho phổrộng các alkaloid có trong giới thực vật và chiết xuất chúng với mức độ dễ dàngkhác nhau

Lưu ý: Cloroform không thích hợp để chiết các alcaloid bậc bốn, ví dụ:tubocurarine

2.2.2 Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước (Chiết alkaloid dạng muối)

- Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất

- Chiết bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất Các alcaloid trong dược liệu sẽchuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên

- Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửadịch chiết đậm đặc còn lại Trong môi trường acid, ether thường hoà tan một số tạpchất chứ không hoà tan các alcaloid, các chất màu và các chất không mong muốnkhác được loại bỏ bằng cách lắc với cloroform hoặc các dung môi hữu cơ khác

- Sau khi tách lớp ether, kiềm hoá dung dịch nước rồi lấy alcaloid base được giảiphóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp (dung môi này phải không trộn lẫnvới dung dịch nước) thường dùng cloroform, ether, benzen Cất thu hồi dung môihữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cắn alcaloid thô

Hình 2.9 Quy trình chiết alkaloid bằng nước acid2.2.3.Chiết bằng cồn (Chiết alkaloid dạng muối)

Có một số alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở môitrường trung tính do đó sau khi tán nhỏ dược liệu ở kích thước thích hợp đem thấm

ẩm và chiết bằng cồn etylic cho tới kiệt alcaloid Quá trình tiếp theo được thực hiện

tương tự như ở trên Trong quá trình chiết xuất người ta dùng thuốc thử tạo tủa đểkiểm tra xem các alcaloid đã lấy kiệt chưa.

Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối với phần lớn các alcaloidtrong dược liệu, nhưng có một số alcaloid ở dạng base lại tan nhiều trong nước(ephedrin, colchicin ) hoặc ở dạng muối ít tan trong nước (berberin nitrat ), tantrong dung môi hữu cơ (reserpin hydroclorid tan trong cloroform) thì người ta phải

có cách chiết riêng cho thích hợp

Hình 2.10 Quy trình chiết alkaloid bằng cồn

2.3 ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Chiết bằng cất kéo hơi nước

Ưu điểm: alkaloid thu được khá tinh khiết

Nhược điểm: Không áp dụng phổ biến

2.3.2 Chiết bằng dung môi hữu cơ

-Ưu điểm: Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch,

dễ tinh chế loại các tạp đi kèm theo Các dung môi hữu cơ không phân cực thường

là các dung môi có khả năng chiết chọn lọc đối với alkaloid ở dạng base

-Nhược điểm: Dung môi hữu cơ thường là các dung môi đắt tiền Khi sửa dụng cácdung môi này để chiết đòi hỏi các thiết bị phức tạp đầu tư cho thiết bị lớn Khôngdùng được với dược liệu tươi Hiệu suất chiết dựa vào quá trình kiềm hóa

2.3.3 Chiết bằng dung dịch nước acid cồn

-Ưu điểm: Dung môi rẻ tiền

Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít

-Nhược điểm: Dịch chiết rút ra lẫn nhiều tạp chất, khó tinh chế do đó mất mát nhiềutrong khâu tinh chế làm cho hiệu suất chiết thấp Đối với các dược liệu chứa nhiềuchất nhầy, việc sử dụng nước làm dung môi chiết gặp khó khăn trong khâu rút dịchchiết

CHƯƠNG 3 TINH CHẾ - PHÂN LẬP ALKALOID

Sau khi chiết xuất ít khi thu được một alkaloid tinh khiết mà thường là một hỗn hợpcác alkaloid còn lẫn tạp chất

Nếu chỉ có một alkaloid thô thì có thể tinh chế bằng cách chuyển nó nhiều lần từdung môi hữu cơ sang dung môi nước và ngược lại, cuối cùng bốc hơi dung môi tađược một alcaloid tinh khiết

Nếu là hỗn hợp nhiều alkaloid, để tinh chế và phân lập riêng từng alkaloid trước đâythường dùng phương pháp kết tinh phân đoạn bằng các dung môi, ngày nay đối vớicác alkaloid khó tách có thể sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ hoặc phươngpháp trao đổi ion, sắc ký cột (giảm hoạt, tẩm đệm phosphat), sắc ký lớp điều chế, sửdụng các kỹ thuật phân tách mới nhất, chẳng hạn, sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC),sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

3.1 KẾT TINH PHÂN ĐOẠN:

Kết tinh trực tiếp từ dung môi: Đây là phương pháp phân lập đơn giản trong đó cácalkaloid kết tinh trực tiếp bằng quá trình phân đoạn và có thể không hữu ích trongtrường hợp hỗn hợp phức tạp

3.2 KỸ THUẬT GRADIENT pH:

Có sự khác biệt về mức độ base của các alkaloid khác nhau trong cùng một loại câyDựa trên đặc tính này, hỗn hợp alkaloid thô được hòa tan trong dung dịch acidtartaric 2% và được chiết bằng benzen sao cho phần thứ nhất chứa các alkaloidtrung tính và/hoặc có tính base rất yếu

Giá trị pH của dung dịch nước được tăng dần 0,5 lần đến pH 9 và quá trình chiếtđược thực hiện ở mỗi pH khác nhau bằng dung môi hữu cơ

Bằng cách này, các alkaloid có tính bazơ khác nhau được chiết và các alkaloid cótính base mạnh được chiết ở cuối

3.3 KỸ THUẬT SẮC KÝ:

Sắc ký là phương pháp lý tưởng để tách một số lượng lớn các alkaloid.Việc tách cácalkaloid được thực hiện bằng cách sử dụng pha tĩnh và pha động của các dung môihữu cơ khác nhau

Các kỹ thuật sắc ký khác nhau được sử dụng để tách các ancaloit riêng lẻ khỏi hỗnhợp

3.3.1.Sắc ký giấy (Paper chromatography)

Kỹ thuật này đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất trong số các kỹ thuật sắc

ký khác vì khả năng ứng dụng của nó để phân lập, nhận dạng và đôi khi xác địnhđịnh lượng tất cả các loại sản phẩm tự nhiên Đây là kỹ thuật phân vùng cũng như

kỹ thuật hấp thụ, trong đó pha động là riêng lẻ hoặc hỗn hợp các dung môi hữu cơ

và pha tĩnh là bề mặt ưa nước của giấy

Việc lựa chọn dung môi dùng để chạy sắc ký phụ thuộc vào bản chất của alkaloid

3.3.2 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC):

TLC là một công cụ quan trọng được sử dụng rộng rãi để nhận dạng, tách và xácđịnh độ tinh khiết của alkaloid phân lập

Mặc dù phương pháp TLC được sử dụng trong phân tích định tính nhưng nó cũng

có tầm quan trọng lớn trong phân tích định lượng

Việc tách TLC của các alkaloid có thể được thực hiện trên silica gel, alumina, bộtxenlulo hoặc kieselguhr Silica gel là pha tĩnh hoạt động mạnh nhất và đạt được khảnăng phân tách tốt ngay cả khi sử dụng một vài miligam chất

Phương pháp này cũng được sử dụng để tách chuẩn bị các alkaloid

Hình 3.1 Phân tách Alkaloid bằng Sắc ký lớp mỏng3.3.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion:

Phương pháp trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dungdịch muối alkaloid và các ion đã bị hấp phụ trên chất mang (nhựa trao đổi ion).Các nhựa trao đổi ion (ionit) được dùng là các cationit (những cao phân tử rắn mangnhóm acid có khả năng hấp phụ các cation) và các anionit ( những cao phân tử rắnmang nhóm base có khả năng hấp phụ các anion) Các nhựa trao đổi ion này khôngtan trong nước và các dung môi hữu cơ,

Muối alkaloid hòa tan trong nước tạo ra các cation lớn:

B.HCl ↔ [BH]+ + ClQuá trình trao đổi của dung dịch muối alkaloid với nhựa trao đổi ion xảy ra nhưsau:

-a Nếu sử dụng cationit:

Cat-.H- + [BH]+Cl- ↔ Cat-.[BH]+ + H+ + ClNhựa cationit hấp phụ alcaloid tạo ra dạng muối alcaloid, alcaloid này sẽ đượcđẩy ra khi có dung dịch kiềm hoặc amoniac, theo phương trình sau:

-Cat-.[BH]+ + [NH4]+OH- ↔ Cat-.[NH4]+ + B + H2O