Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu xác định dư lượng hoá chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ

TỔNG QUAN

HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật

Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được chuyển nghĩa từ thuật ngữ tiếng Anh

Khái niệm "thuốc trừ sâu" thường được hiểu là thuốc trừ côn trùng gây hại, nhưng hiện nay nó đã được mở rộng để bao gồm nhiều loại hóa chất khác được sử dụng trong trồng trọt, bao gồm cả thuốc điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá và thuốc trừ cỏ.

Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) định nghĩa HCBVTV là bất kỳ hợp chất hay hỗn hợp được sử dụng để ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm cả vật chủ trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật HCBVTV còn được dùng để kiểm soát các bộ phận không mong muốn của thực vật hoặc động vật gây hại, cũng như tác động đến các quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển và mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ Ngoài ra, HCBVTV còn được sử dụng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm, đồng thời bảo vệ sản phẩm cây trồng trước và sau thu hoạch để tránh hỏng hóc trong quá trình bảo quản và vận chuyển.

1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật

Có nhiều cách phân loại HCBVTV khác nhau như phân loại theo mối nguy, theo công dụng hay theo cấu tạo hóa học

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) phân loại HCBVTV dựa trên các nghiên cứu về nguy cơ độc hại, trong đó đặc biệt chú trọng đến độ độc cấp tính khi tiếp xúc qua đường uống và đường ngoài da thông qua các thí nghiệm trên chuột.

Giá trị LD 50 trên chuột được sử dụng để phân loại độc tính của một chất, dựa trên liều lượng gây chết cho một nửa số cá thể trong nghiên cứu LD 50 được xác định thông qua hai phương pháp chính là đường uống và đường dùng ngoài da, giúp đánh giá mức độ độc hại của chất đó LD 50 là viết tắt của Median lethal dose, hay Liều chết trung bình, là liều lượng chất độc gây tử vong cho 50% số cá thể trong nghiên cứu.

Theo cách phân loại này, HCBVTV được chia thành 5 nhóm [133] (bảng 1.1)

Luận án tiến sĩ Dược học

Bảng 1.1 Phân loại HCBVTV theo mối nguy

Nhóm M ứ c độ độ c LD 50 trên chu ộ t (mg/kg cân nặng) Đườ ng u ố ng Đườ ng ngoài da

U Không có mối nguy độc cấp > 5000

1.1.2.2 Phân lo ạ i theo công d ụ ng

Dựa vào công dụng của HCBVTV, người ta có thể phân loại như sau [7]:

 Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại: được gọi theo nhóm sinh vật gây hại như:

- Hóa chất trừ sâu (insecticides)

- Hóa chất trừ nấm (fungicides)

- Hóa chất trừ cỏ (herbicides)

- Hóa chất trừ chuột (rodenticides)

- Hóa chất trừ ốc sên (molluscicides)

- Hóa chất trừ nhện (acaricides)

- Hóa chất trừ vi khuẩn (bactericides)…

Hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR) là các chất được sử dụng để kiểm soát và điều chỉnh sự phát triển của thực vật, bao gồm cả việc kích thích, làm chậm hoặc ức chế quá trình tăng trưởng Những hóa chất này đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh lý của thực vật, từ đó giúp cây trồng phát triển khỏe mạnh và đạt năng suất cao hơn.

 Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hái

Dựa trên cách phân loại này, Alan Wood đã giới thiệu một trang điện tử trực tuyến giới thiệu bộ sưu tập đầy đủ các loại HCBVTV được sử dụng, cung cấp một nguồn thông tin toàn diện và tiện lợi cho người dùng.

1.1.2.3 Phân lo ạ i theo c ấ u t ạ o hóa h ọ c Đây là cách phân loại được sử dụng phổ biến trong việc triển khai xây dựng các phương pháp phân tích, vì các HCBVTV có cấu tạo tương tự thường có tính chất giống nhau do đó phương pháp chiết và phân tích cũng giống nhau Hơn nữa, từng nhóm HCBVTV tác động đến sinh vật và con người theo các nguyên lý tương tự nhau Theo cách phân loại này một số nhóm HCBVTV chính như sau [7][108][130]:

- HCBVTV nhóm clor hữu cơ;

- HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ;

- HCBVTV có nguồn gốc thực vật;

1.1.3 Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật chính

HCBVTV nhóm clor hữu cơ là các hợp chất hữu cơ được tạo ra khi thay thế các nguyên tử hydro của phân tử hydrocarbon và các dẫn xuất hydrocarbon bằng các nguyên tử clor, thường bao gồm các dẫn xuất clor của các hợp chất hữu cơ như diphenyl ethan, cyclodien, benzen, hexan Trong phân tử của các hợp chất này, có thể tồn tại vòng benzen hoặc dị vòng chứa các dị tố như O, N, hay S.

Về mặt cấu tạo, HCBVTV nhóm clor hữu cơ được xếp vào 4 nhóm nhỏ [130]:

- Nhóm diphenyl aliphatic: DDT, dicofon, methoxychlor…

- Nhóm hợp chất benzen: lindan, hexaclorocyclohexan (HCH), pentaclorophenol…

- Nhóm hợp chất cyclodien: endrin, dieldrin, heptachlor, aldrin, endosulfan sulfat…

- Nhóm hợp chất polycloroterpen: toxaphen, polyclorocamphen…

Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm clor hữu cơ:

Lindan (-HCH) Endrin Endosulfan sulfat

Các hợp chất bảo vệ thực vật nhóm clor hữu cơ thường có phổ tác dụng rộng, an toàn với cây trồng ở liều thông dụng, nhưng lại có độc tính cao với các loài động vật máu nóng Ngoài ra, chúng có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật, gây độc mạn tính và tồn dư lâu dài trong môi trường do tính bền vững cao.

Cơ chế gây độc của các hợp chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) nhóm clor hữu cơ phụ thuộc vào dạng cấu tạo của chúng Đối với DDT và các HCBVTV có cấu trúc tương tự, chúng có tác dụng ức chế các kênh vận chuyển Na+ qua màng tế bào thần kinh, dẫn đến tê liệt và có thể tử vong Trong khi đó, một số loại HCBVTV có cấu trúc dị vòng hoặc vòng chứa nhiều clor như aldrin, dieldrin, heptachlor, endrin tác động thông qua việc gắn với các vùng pícrotoxinin của acid γ-aminobutyric, gây ức chế ion Cl- vào trong tế bào thần kinh và kích thích thần kinh.

Các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) clor hữu cơ từng được biết đến với khả năng diệt trừ mạnh mẽ đối với nhiều loại sâu hại, tuy nhiên, do lo ngại về ô nhiễm môi trường và dư lượng HCBVTV trong nông sản, cũng như tính độc cao đối với con người và các loài động vật, đa số các loại HCBVTV clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng trong thời gian gần đây.

HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ chủ yếu là các hợp chất của phospho hóa trị

5, chúng là các ester hoặc amid của acid phosphoric hoặc dẫn xuất của acid phosphoric Công thức cấu tạo chung của các hợp chất phosphor hữu cơ như sau [23]:

R1, R2, R3 có thể là nhóm alkyl, aryl, amin hoặc các hợp chất thơm, dị vòng, mang đến sự đa dạng cho các hợp chất phosphor hữu cơ Ngoài ra, các nguyên tử oxy (O) trong cấu trúc có thể được thay thế bằng lưu huỳnh (S) hoặc nitơ (N) để tạo ra các dẫn xuất thiophosphat và amidat, cũng thuộc nhóm phosphor hữu cơ.

Phosphorus compounds can be categorized into various subgroups based on the substitution of oxygen atoms with sulfur, nitrogen, and ester or amide groups, resulting in phosphat, phosphorothionat, phosphorothiolat, phosphorothionothiolat, phosphorodithiolat, phosphoroamidat, phosphoroamidothionat, and phosphoroamidothiolat compounds.

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphat [130]

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothionat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothiolat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothionothiolat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorodithiolat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidothionat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidothiolat

Các hợp chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) nhóm phosphor hữu cơ có đặc điểm chung là phổ tác dụng rộng, an toàn với cây trồng và diệt được nhiều loại sâu hại Đặc biệt, chúng có tác dụng diệt côn trùng nhanh chóng và có độc tính cao với động vật máu nóng Tuy nhiên, HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ thường không tích lũy lâu dài trong cơ thể động vật và môi trường, thường được thải trừ nhanh qua nước tiểu và có thời gian tồn dư ngắn.

HCBVTV phosphor hữu cơ là một chất có thể gây hại cho cả côn trùng và con người bằng cách ngăn cản sự tạo thành men cholinestase (ChE), dẫn đến hoạt động thần kinh kém, yếu cơ, choáng váng và tử vong Khi chất này ức chế men ChE, nó gây ra sự tích tụ acetylcholin, dẫn đến rối loạn dẫn truyền cholinergic và ức chế dẫn truyền xung thần kinh đến các tế bào cơ, tuyến, não và hạch Nhiễm độc cấp tính có thể gây ra các triệu chứng như nôn, co thắt ruột, nhức đầu, mệt mỏi, chóng mặt, co giật, suy hô hấp, hôn mê và tử vong.

Các HCBVTV nhóm phospho hữu cơ được sử dụng phổ biến từ những năm

TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

1.2.1 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trên thế giới

Trên thế giới, việc sử dụng HCBVTV trong lịch sử có thể được chia làm 4 giai đoạn [7][23]:

Giai đoạn đầu tiên trong sử dụng thuốc diệt cỏ (trước năm 1940) chủ yếu tập trung vào các hợp chất vô cơ như đồng, lưu huỳnh, arsen và thủy ngân Những chất này không chỉ có độc tính cao mà còn tồn tại lâu trong môi trường, gây ảnh hưởng tiêu cực đến hệ sinh thái.

Giai đoạn thứ hai của lịch sử phát triển hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) diễn ra từ năm 1940 đến 1960, bắt nguồn từ việc phát minh ra thuốc trừ sâu DDT của Paul Muller, người đã giành giải Nobel hóa học năm 1939 DDT ban đầu được coi là một loại "thần dược" cho nông nghiệp, nhưng sau đó, việc sử dụng các hợp chất clor hữu cơ như DDT, 2,4,5-T và 2,3,7,8-TCDD làm chất độc hóa học trong chiến tranh đã để lại những hậu quả nghiêm trọng cho nhân loại Mặc dù một số HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ và carbamat đã được phát triển trong giai đoạn này, nhưng chúng vẫn chưa thể thay thế vị trí của các hợp chất nhóm clor hữu cơ.

 Giai đoạn 3 (từ 1960 đến 1980): Năm 1962, tác phẩm Silent Spring của Rachel

Các hợp chất clor hữu cơ đã được cảnh báo về ảnh hưởng nghiêm trọng đối với sức khỏe con người và môi trường, dẫn đến việc US FDA cấm sử dụng chúng làm hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) từ năm 1973 Để thay thế, các hợp chất mới như nhóm phosphor hữu cơ và nhóm pyrethroid đã được phát triển, có độ bền môi trường thấp hơn Đặc biệt, các HCBVTV nhóm pyrethroid thế hệ II ra đời vào đầu những năm 70 của thế kỷ XX đã mở ra khả năng áp dụng các loại HCBVTV có độ chọn lọc cao và thân thiện với môi trường.

Giai đoạn 4 của lịch sử phát triển hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) bắt đầu từ năm 1980 đến nay, đánh dấu sự phát minh ra nhiều loại HCBVTV mới và nguồn gốc sinh học Ngoài việc mang lại hiệu quả cao trong phòng trừ dịch bệnh cho nông nghiệp, tính an toàn của HCBVTV ngày càng được chú trọng Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng trên toàn thế giới, trong khi các chất nhóm phosphor hữu cơ độc hại cũng bị cấm hoặc hạn chế sử dụng Để đảm bảo hiệu quả trên mùa màng, người ta thường kết hợp 2 hoặc nhiều HCBVTV có độc tính thấp hơn, nhằm giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người.

Ngày nay, nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) mới đã được phát triển với ưu điểm nổi bật là có tính chọn lọc cao và ít độc hại hơn so với các loại truyền thống Đặc biệt, các nhóm thuốc bảo vệ thực vật sinh học đang được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ do tính an toàn cao và ít gây hại cho môi trường Mặc dù vậy, vai trò của những thuốc bảo vệ thực vật có bản chất hóa học vẫn chưa thể được thay thế hoàn toàn do hiệu quả cao và khả năng kiểm soát sâu bệnh rộng rãi.

EPA, mỗi năm ở Mỹ sử dụng khoảng 1 tỷ tấn HCBVTV chiếm khoảng 22% lượng HCBVTV được sử dụng trên toàn thế giới [108]

1.2.2 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật ở Việt Nam

Bộ NN&PTNT hàng năm ban hành Thông tư về Danh mục thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) để quy định và quản lý việc sử dụng thuốc BVTV tại Việt Nam Theo Thông tư 21/2013/TT-BNNPTNT, có hơn 1.500 hoạt chất thuốc BVTV được phép sử dụng, trong đó đa số dùng để diệt trừ sâu hại và trừ nấm bệnh Tuy nhiên, một số hoạt chất như carbofuran và methomyl thuộc nhóm carbamat được hạn chế sử dụng, trong khi 21 hoạt chất khác bị cấm sử dụng hoàn toàn, bao gồm các chất thuộc nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và vô cơ như aldrin, DDT, phosphamidon và chì.

Bảng 1.2 Số lượng hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng và cấm sử dụng ở Việt Nam

Danh mục HCBVTV được phép sử dụng [2]

HCBVTV hạn chế sử dụng [2]

Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại

Trừ sâu 745 hoạt chất 2 hoạt chất 21 hoạt chất

Trừ nấm 552 hoạt chất - 6 hoạt chất

Trừ cỏ 217 hoạt chất - 1 hoạt chất

Trừ chuột 10 hoạt chất 1 hoạt chất 1 hoạt chất

Trừ ốc sên 25 hoạt chất - -

Trừ mối 13 hoạt chất 2 hoạt chất -

Hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật 52 hoạt chất - -

Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hái

Hầu hết các thuốc BVTV sử dụng ở Việt Nam đều phải nhập khẩu từ nước ngoài Hàng năm, Việt Nam nhập khẩu trên 70.000 tấn thành phẩm với trị giá 210 -

Thị trường thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tại Việt Nam có giá trị khoảng 500 triệu USD, với hơn 90% sản phẩm được nhập khẩu từ Trung Quốc Tuy nhiên, bên cạnh các loại thuốc BVTV được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép sử dụng, còn có nhiều sản phẩm được sử dụng trái phép trong nông nghiệp thông qua mua bán trao tay Các sản phẩm này chủ yếu có nguồn gốc từ Trung Quốc và được nhập khẩu vào Việt Nam qua các con đường tiểu ngạch, gây lo ngại về chất lượng và an toàn cho người sử dụng.

Theo nghiên cứu của Lê Doãn Diên và cộng sự, sản lượng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) tại Việt Nam đã tăng đáng kể trong giai đoạn từ năm 1998 đến năm 2011 Cụ thể, vào năm 1998, sản lượng HCBVTV sử dụng ở Việt Nam khoảng 38.000 tấn, trong đó thuốc trừ sâu chiếm tỷ trọng lớn nhất với 55% Đến năm 2011, sản lượng HCBVTV đã tăng lên khoảng 112.000 tấn, cho thấy xu hướng sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đang tiếp tục tăng tại Việt Nam.

Theo số liệu của Cục Bảo vệ thực vật, đến năm 2011, cả nước có 93 nhà máy, cơ sở sản xuất, gia công, sang chai, đóng gói thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) và 28.750 đại lý, cửa hàng kinh doanh buôn bán thuốc BVTV Kết quả thanh tra, kiểm tra sản xuất, kinh doanh thuốc BVTV từ năm 2007 đến 2010 cho thấy khoảng 14-16% cơ sở, cửa hàng, đại lý được thanh tra, kiểm tra có vi phạm, bao gồm buôn bán thuốc cấm, thuốc ngoài danh mục, thuốc giả, vi phạm về ghi nhãn hàng hóa và vi phạm về điều kiện buôn bán.

1.2.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả Để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong việc sử dụng HCBVTV cho cây trồng nói chung và dược liệu nói riêng, cần phải thực hiện các biện pháp sau [23]:

1) Thực hiện biện pháp phòng trừ tổng hợp đối với mọi loại dịch hại và cây trồng, chỉ dùng biện pháp hóa học khi những biện pháp khác không có hiệu quả

2) Đảm bảo sử dụng HCBVTV theo nguyên tắc 4 đúng

Mỗi loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được sử dụng để diệt trừ một tác nhân gây hại cụ thể, do đó không nên sử dụng cùng một loại thuốc trong nhiều vụ liên tiếp Việc lựa chọn đúng thuốc sẽ giúp tăng hiệu quả diệt trừ sâu bệnh và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người.

- Đúng liều lượng: Cần sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

Việc phun thuốc bảo vệ thực vật cần được thực hiện đúng lúc để đạt hiệu quả cao nhất Thông thường, thời điểm thích hợp là khi dịch hại trên đồng ruộng dễ bị tiêu diệt nhất, chẳng hạn như giai đoạn sâu còn non hoặc không có mưa lớn Ngoài ra, người dân cần ngừng sử dụng thuốc trước khi thu hoạch một thời gian nhất định, tùy thuộc vào từng loại thuốc để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

Để sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) hiệu quả và an toàn, cần pha thuốc đúng cách và phun thuốc sao cho dịch hại tiếp xúc được với hóa chất nhiều nhất Đồng thời, người dân không nên tự ý trộn nhiều loại HCBVTV với nhau để phun trên đồng ruộng, tránh gây ra những hậu quả tiêu cực cho cây trồng và môi trường.

3) Đảm bảo thời gian cách ly (PHI – Pre harvest interval) của từng loại thuốc trên mỗi loại cây trồng

4) Đảm bảo an toàn cất giữ những HCBVTV chưa sử dụng hết

- Những HCBVTV chưa sử dụng hết phải được cất giữ trong phòng riêng biệt, không dột, có khoá cửa chắc chắn, xa nơi ở và chuồng trại gia súc

Để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quá trình phun thuốc, các dụng cụ đong thuốc, bình bơm thuốc và quần áo bảo hộ cần được giặt giũ, rửa sạch sẽ sau mỗi đợt phun thuốc Sau đó, chúng phải được cất giữ trong kho riêng để tránh nhiễm khuẩn và bảo quản tốt.

DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU

1.3.1 Khái niệm về dư lượng và mức dư lượng tối đa

Dư lượng là phần còn lại của hoạt chất và các sản phẩm chuyển hóa có trong thuốc, tồn tại trên cây trồng, nông sản, đất, nước sau một thời gian sử dụng Đây là kết quả của quá trình phân hủy và chuyển hóa thuốc dưới tác động của hệ sống và điều kiện ngoại cảnh, bao gồm cả các thành phần khác có trong thuốc.

Giới hạn dư lượng tối đa (MRL) của hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) là nồng độ cao nhất của dư lượng thuốc có thể chấp nhận được trong một đơn vị sản phẩm nông sản hoặc thực phẩm mà không gây hại cho người sử dụng Ủy ban Codex thuộc FAO và WHO đã thiết lập danh mục giới hạn tối đa của HCBVTV trong thức ăn cho người và gia súc, đồng thời mỗi quốc gia cũng có quy định riêng về MRL của các HCBVTV trong các đối tượng khác nhau.

Việc xác định MRL dựa trên các nghiên cứu về độc tính của hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV), dữ liệu về dư lượng trong sản phẩm được sản xuất theo quy trình thực hành nông nghiệp tốt (GAP) và lượng sản phẩm mà con người sử dụng hàng ngày.

1.3.2 Quy định về mức dư lượng tối đa

Mỗi loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) có giá trị MRL (Giới hạn dư lượng tối đa) khác nhau trên từng nền mẫu Do sự khác biệt về số lượng sản phẩm và cách sử dụng của từng quốc gia, MRL của mỗi nước cũng khác nhau Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) quy định MRL theo tiêu chuẩn Codex, trong đó quy định cụ thể cho mỗi HCBVTV trong từng nền mẫu, được xem là MRL quốc tế.

Bộ Y tế đã ban hành quy định về mức dư lượng tối đa (MRL) của hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong các sản phẩm nông sản như hoa quả, rau củ, thịt cá vào năm 2007 Các tiêu chuẩn này được xây dựng dựa trên tiêu chuẩn Codex do hiện tại chưa có các nghiên cứu cụ thể ở Việt Nam về đánh giá nguy cơ ô nhiễm HCBVTV trong sản phẩm nông nghiệp.

Dược điển Việt Nam IV quy định phương pháp phân tích hàm lượng các chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) tại phụ lục 17.12, trong đó giá trị giới hạn được lấy theo quy định của Dược điển Mỹ, cụ thể là 0,1 mg/kg.

Theo quy định, giới hạn của từng HCBVTV trong sản phẩm có nguồn gốc thực vật được quy định cụ thể như ở Bảng 1.3 Đối với sản phẩm không có MRL, giới hạn phải thấp hơn giới hạn phát hiện của phương pháp quy định bởi EPA Cụ thể, giá trị MRL cho sản phẩm cuối cùng được tính toán dựa trên công thức tính toán, trong đó A đại diện cho ADI - lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được (mg/kg cân nặng), giúp đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

M: Khối lượng cơ thể người (60 kg) B: Liều dùng dược liệu hàng ngày (kg)

Bảng 1.3 Quy định của Dược điển Việt Nam IV về giới hạn HCBVTV

5 Tổng cis – Clordan, trans – Clordan và Oxyclordan 0,05

7 Cypermethrin và các đồng phân 1,0

8 Tổng o,p’ – DDT, p,p’ – DDT, p,p’ – DDE và p,p’ – TDE 1,0

13 Tổng  - Endosulfan,  - Endosulfan và Endosulfan sulfat 3,0

19 Tổng Heptachlor và Heptachlor epoxid 0,05

21 Các đồng phân Hexaclorocyclohexan, trừ đồng phân  0,3

32 Tổng quintozen, pentacloroanalin, methyl pentaclorophenyl sulfid 1,0

Theo quy định hiện hành, chỉ có 32 hợp chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được thiết lập giới hạn cho phép, trong khi vẫn còn rất nhiều HCBVTV chưa có quy định về giới hạn này Điều này gây khó khăn trong việc đánh giá chất lượng sản phẩm dược liệu, chế phẩm từ dược liệu và thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược Để giải quyết vấn đề này, một số quốc gia phát triển như Nhật Bản và Châu Âu sử dụng giá trị giới hạn dư lượng mặc định (MRL mặc định) đối với các HCBVTV chưa thiết lập được MRL, dựa trên mức được coi là an toàn đối với người sử dụng Tuy nhiên, tại Việt Nam, giá trị MRL mặc định vẫn chưa được đưa ra, gây khó khăn trong việc quản lý và đánh giá chất lượng sản phẩm.

Bảng 1.4 Giá trị MRL mặc định của một số nước

Quốc gia MRL mặc định (mg/kg) Tham khảo

Mặc dù giá trị MRL mặc định có sự khác nhau giữa các nước, nhưng hiện nay có xu hướng ngày càng nhiều quốc gia chấp nhận mức 0,01 mg/kg do lo ngại về sự an toàn của sản phẩm đối với sức khỏe người sử dụng Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc thiết lập mức giới hạn dư lượng tối đa để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Mức 0,01 mg/kg là giá trị MRL thấp nhất của tất cả các HCBVTV hiện nay Đây là giá trị MRL mặc định được đa số các phòng thí nghiệm lựa chọn làm mức yêu cầu cho phương pháp phân tích HCBVTV.

1.3.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu

Việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong trồng cây thuốc là rất cần thiết để phòng ngừa và điều trị các bệnh dịch Tuy nhiên, nếu lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách, các HCBVTV có thể tồn dư trong dược liệu và các sản phẩm chế biến từ dược liệu, gây ảnh hưởng đến chất lượng và an toàn của sản phẩm Do đó, cần phải sử dụng HCBVTV một cách hợp lý và tuân thủ các quy định an toàn để đảm bảo chất lượng của dược liệu và sản phẩm.

Ngày 03 tháng 9 năm 2009, Bộ Y tế ban hành thông tư số 14/2009/TT-BYT về việc hướng dẫn triển khai, áp dụng các nguyên tắc tiêu chuẩn “Thực hành tốt trồng trọt và thu hái cây thuốc” theo khuyến cáo của tổ chức Y tế thế giới [5] Theo đó, đối với việc sử dụng HCBVTV, tổ chức Y tế thế giới quy định:

1) Bất kỳ các hoá chất nông nghiệp nào dùng cho mục đích tăng trưởng hoặc diệt trừ dịch hại chỉ được sử dụng khi không có các phương pháp khác Cần sử dụng biên pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp

2) Chỉ được sử dụng các HCBVTV có trong danh mục cho phép và cần phải được sử dụng với lượng nhỏ nhất có tác dụng

3) Việc sử dụng HCBVTV cần được ghi lại về tên, lượng sử dụng, số lần sử dụng và thời gian sử dụng

4) Chỉ có các nhân viên được đào tạo mới được phép sử dụng HCBVTV

5) Thời gian cách ly từ khi sử dụng HCBVTV đến khi thu hoạch cần phải tuân theo đúng hướng dẫn của từng HCBVTV và được sự đồng ý của bên mua

6) Dư lượng HCBVTV trong các sản phẩm dược liệu phải đáp ứng được các yêu cầu của quốc gia trồng và tiêu thụ sản phẩm

7) Không trồng và thu hoạch dược liệu từ những khu vực gần với nơi có hàm lượng HCBVTV cao như gần các nhà máy sản xuất, nước thải có chứa nhiều HCBVTV

8) Thiết bị sử dụng để phun HCBVTV cần được kiểm soát và hiệu chuẩn định kỳ

9) Trong quá trình bảo quản dược liệu, cần tránh xa các nguồn HCBVTV

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

Để xác định dư lượng HCBVTV trong nông sản và dược liệu, có nhiều phương pháp khác nhau Quá trình phân tích HCBVTV thường bao gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn xử lý mẫu và giai đoạn phân tích trên thiết bị Ở giai đoạn xử lý mẫu, các HCBVTV được tách ra khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp, đòi hỏi phải tối ưu hóa quá trình này để chiết xuất tối đa các HCBVTV trên nhiều loại dược liệu khác nhau Sau đó, ở giai đoạn phân tích, một kỹ thuật phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng HCBVTV trong dịch chiết, từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu.

1.4.1 Các phương pháp xử lý mẫu

Phân tích dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong các nền mẫu dược liệu và sản phẩm từ dược liệu thường gặp phải khó khăn do sự khác nhau về thành phần của các loại dược liệu Điều này đòi hỏi các phương pháp phân tích chuyên sâu và chính xác để đảm bảo kết quả đáng tin cậy Việc xác định và định lượng dư lượng HCBVTV trong dược liệu là rất quan trọng để đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

Mục tiêu chính của quá trình xử lý mẫu là tối đa hóa việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học (HCBVTV) đồng thời loại bỏ càng nhiều tạp chất càng tốt Để đạt được điều này, nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được áp dụng, bao gồm chiết bằng dung môi, chiết siêu tới hạn, chiết pha lỏng dưới áp suất, chiết vi sóng, chiết pha rắn, chiết phân tán pha rắn, vi chiết pha rắn và phương pháp QuEChERS.

Chiết bằng dung môi (solvent extraction, SE) là kỹ thuật sử dụng dung môi hữu cơ để tách chất phân tích từ mẫu đã được làm nhỏ Các mẫu rắn thường được đồng nhất trước khi chiết bằng phương pháp nghiền, xay hoặc trộn Quá trình chiết diễn ra khi một phần mẫu được xay hoặc lắc với dung môi hữu cơ, sau đó thêm natri sulfat khan để loại bỏ nước và đạt được kết quả chiết hiệu quả.

Tỷ lệ giữa mẫu và dung môi có thể thay đổi tùy theo từng loại nền mẫu, thường là 50 mL dung môi cho khoảng 5-10 g mẫu Để tăng hiệu quả chiết, có thể sử dụng các tác nhân vật lý hỗ trợ như lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc hoặc sóng siêu âm Đối với các mẫu có nhiều tạp chất, quá trình chiết có thể được kết hợp với các phương pháp làm sạch khác để đạt kết quả tốt nhất.

Trong kỹ thuật chiết bằng dung môi, độ phân cực của dung môi phải phù hợp với chất phân tích là yếu tố quan trọng nhất Để đạt được hiệu quả chiết tốt nhất, thường phải phối hợp các loại dung môi khác nhau để thay đổi độ phân cực, độ nhớt và lực dung môi Một số loại dung môi phổ biến được sử dụng để chiết các hợp chất bioactive từ dược liệu bao gồm acetonitril, n-hexan, ethyl acetat, diethyl ether, dicloromethan và aceton.

Chiết soxhlet là một phương pháp chiết bằng dung môi đặc biệt, cho phép dung môi mới ở nhiệt độ cao liên tục đi qua mẫu để chiết kiệt đối tượng phân tích Quá trình này thường sử dụng hỗn hợp aceton với hexan hoặc ether dầu hỏa làm dung môi chiết Aceton là lựa chọn phổ biến do khả năng đồng tan với nước, điểm sôi thấp và tăng khả năng thấm vào mẫu, giúp giảm nhiệt độ sôi và tăng hiệu quả chiết.

Các phương pháp phân tích HCBVTV được quy định trong các dược điển như Dược điển Việt Nam IV, Dược điển Mỹ XXXVII và Dược điển Trung Quốc 2010 đều dựa trên kỹ thuật chiết dung môi kết hợp với các kỹ thuật làm sạch khác Theo đó, mẫu dược liệu được làm khô và chiết bằng aceton hoặc dicloromethan, sau đó được chuyển đổi về dung môi phù hợp trước khi qua các cột làm sạch để phân tích Các phương pháp này cho phép chiết được một số HCBVTV thuộc các nhóm như clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và pyrethroid, nhưng vẫn còn hạn chế đối với các nhóm HCBVTV khác.

Một ứng dụng đáng chú ý về phương pháp chiết dung môi là nghiên cứu của Granby và cộng sự, trong đó họ sử dụng hỗn hợp dung môi methanol và đệm acetat kết hợp với siêu âm để phân tích các hợp chất bảo vệ thực vật nhóm carbamat và các hợp chất bảo vệ thực vật phân cực trên nền mẫu quả Kết quả cho thấy độ thu hồi đạt được từ 70-120% trong khoảng nồng độ từ 0,02 đến 0,2 mg/kg.

Nghiên cứu của Lino và cộng sự đã chỉ ra rằng hiệu suất chiết 15 hợp chất có hoạt tính sinh học nhóm clor hữu cơ trong dược liệu đạt mức tốt nhất khi sử dụng n-hexan làm dung môi chiết So sánh với các hỗn hợp dung môi khác như acetonitril và hexan (1:1) hay nước và acetonitril (1:1), n-hexan cho thấy khả năng chiết vượt trội Kết quả này khẳng định vai trò quan trọng của n-hexan trong quá trình chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu.

Trong quá trình chiết, pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Việc điều chỉnh pH phù hợp có thể làm tăng hiệu suất chiết của các hợp chất khác nhau Ví dụ, nghiên cứu của Yoshioka và cộng sự đã sử dụng pH 10 để chiết các hợp chất có tính acid base từ quả họ cam, trong khi đó, điều chỉnh pH về 6 có thể làm tăng hiệu suất chiết của một số hoạt chất bảo vệ thực vật thế hệ mới như benfuracarb và imidacloprid.

Phương pháp chiết Soxhlet cũng được sử dụng để chiết HCBVTV trong dược liệu, nhưng hiệu quả của nó không cao so với các phương pháp khác như chiết siêu tới hạn (SFE) và vi chiết pha rắn (SPME) Chiết bằng dung môi là một phương pháp đơn giản và hiệu quả, nhưng nó cũng có nhiều nhược điểm như mất thời gian, tốn công sức và sử dụng lượng lớn dung môi gây ảnh hưởng đến môi trường Ngoài ra, phương pháp này chỉ có thể ứng dụng để phân tích một số nhóm HCBVTV nhất định như nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ và pyrethroid.

Chiết siêu tới hạn (SFE) là một phương pháp chiết sử dụng dung môi đặc biệt, đó là dung môi ở trạng thái siêu tới hạn Ở trạng thái này, chất có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn, khiến nó không còn ở thể lỏng nhưng vẫn chưa chuyển thành thể khí.

Hình 1.1 Các trạng thái vật lý theo nhiệt độ vào áp suất

Trong quá trình chiết xuất bằng siêu临界 (SFE), CO2 thường được lựa chọn do có thể dễ dàng đạt được nhiệt độ và áp suất tới hạn ở mức 31 độ C và 73 atm Ngoài ra, CO2 còn có nhiều ưu điểm như giá thành rẻ, bền về mặt hóa học, không độc, không cháy, độ nhớt thấp, độ tinh khiết cao, khả năng khuếch tán cao và dễ loại bỏ khỏi dịch chiết Tuy nhiên, hạn chế của CO2 là kém phân cực, khiến nó không phù hợp để chiết các chất phân cực.

Hình 1.2 Bộ dụng cụ chiết siêu tới hạn

Hình 1.2 mô tả cấu tạo của một bộ dụng cụ SFE Quá trình chiết gồm các bước:

- Mẫu được nạp vào bình chiết

- Dòng CO2 lỏng qua bình ngưng tụ rồi đến bơm nén và bộ gia nhiệt Khi đạt nhiệt độ và áp suất CO 2 trở thành siêu tới hạn

- Dòng CO2 siêu tới hạn vào bình chiết Các chất theo CO2 đến bình tách

- Điều chỉnh nhiệt độ và áp suất thích hợp, CO2 biến thành dạng khí, sản phẩm sẽ lắng xuống, thu riêng

- CO 2 dạng khí có thể được nén lạnh, hóa lỏng và đưa trở lại bình chứa cho các lần phân tích sau

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hoá chất bảo vệ thực vật Đối tượng nghiên cứu gồm 32 HCBVTV và chất chuẩn nội triphenyl phosphat (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Một số HCBVTV được nghiên cứu trong khóa luận [17][124]

TT HCBVTV Công thức phân tử

(khối lượng mol) Cấu trúc hóa học Nhóm

Ghi chú: (*) NA – Không có pKa do không phân ly

Dược liệu được sử dụng để khảo sát và xây dựng phương pháp phân tích là mã đề (Plantago major) và bồ công anh Việt Nam (Pterocypsela indica) Ứng dụng phương pháp này đã được thực hiện để phân tích hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trên một số dược liệu lấy tại các địa điểm khác nhau.

- Xã Nghĩa Trai, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên (7 mẫu ký hiệu DL1-DL7): hoắc hương, hoài sơn, cốt khí, trạch lam, bồ công anh, cúc hoa, mã đề

- Xã Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, Hà Nội (2 mẫu ký hiệu DL8-DL9): mật quỷ, xạ đen

- Phường Ngọc Lâm, quận Long Biên, Hà Nội (5 mẫu ký hiệu DL10-DL14): hẹ, cúc tần, rau má, diếp cá, ngải cứu

- Xã Phúc Lâm, huyện Mỹ Đức, Hà Nội (5 mẫu ký hiệu DL15-DL19): sài đất, vòi voi, chân vịt, đinh lăng, thanh hao hoa vàng

- Xã Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, Hà Nội (3 mẫu ký hiệu DL20-DL22): mướp đắng, tía tô, kinh giới

Dược liệu khô là đối tượng khảo sát và xây dựng phương pháp phân tích hoạt chất sinh học có hoạt tính sinh học (HCBVTV) trong nghiên cứu này, trong đó dây thìa canh (Gymnema sylvestre) và lá giang (Aganonerion polymorphum) là hai dược liệu điển hình Phương pháp này đã được ứng dụng để phân tích HCBVTV trên 30 mẫu dược liệu khô thu thập từ các địa điểm khác nhau, nhằm đánh giá hiệu quả và độ tin cậy của phương pháp.

Xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm, Hà Nội nổi tiếng với 12 loại cây thuốc quý, bao gồm râu ngô, ích mẫu, nhân trần, chó đẻ răng cưa, kim tiền thảo, trinh nữ hoàng cung, bồ công anh, cối xay, ngải cứu, bạch hoa xà và tang ký sinh.

Phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội nổi tiếng với sự đa dạng của các loại thảo mộc quý, bao gồm 14 mẫu ký hiệu từ L01 đến L14 Một số loại thảo mộc tiêu biểu có thể kể đến như đơn đỏ, cỏ ngọt, mã đề, rau má, hoa nhài, khổ sâm, cỏ xước, xấu hổ, bạc hà, nhọ nồi, chè vằng, chè dây, sài hồ nam và trinh nữ hoàng cung Những loại thảo mộc này không chỉ mang lại giá trị y học cao mà còn góp phần tạo nên nét đặc trưng của con phố này.

- Huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định (4 mẫu ký hiệu H01-H04): dây thìa canh, đinh lăng, kinh giới, diệp hạ châu

Một nghiên cứu khoa học đã được thực hiện để khảo sát và xây dựng phương pháp phân tích thành phần thảo dược trong trà túi lọc, lấy mẫu trà mướp đắng làm đối tượng nghiên cứu Kết quả cho thấy phương pháp này có thể được áp dụng hiệu quả trên 140 mẫu khác nhau, bao gồm 3 loại thành phần chính.

54 nhóm mẫu, được lấy tại một số địa phương miền Bắc

- Nhóm sản phẩm dạng viên có thành phần thảo dược: 50 mẫu

- Nhóm sản phẩm dạng túi, trà thảo dược: 50 mẫu

- Nhóm sản phẩm dạng nước ép thảo dược: 40 mẫu

Trà được chế biến từ búp, lá của cây chè xanh (Camellia sinensis) là nguyên liệu chính được sử dụng để khảo sát và xây dựng phương pháp phân tích Để kiểm tra hiệu quả của phương pháp này, nhóm nghiên cứu đã áp dụng để phân tích trên 20 mẫu chè xanh khô được lấy tại các cửa hàng ở Hà Nội.

PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm

- Methanol dùng cho LC-MS của Merck, Đức

- Acetonitril dùng cho LC-MS của Merck, Đức

- Acid acetic (CH 3 COOH) của Merck, Đức

- Magnesi sulfat khan (MgSO4) của Merck, Đức

- Natri acetat khan (CH3COONa) của Merck, Đức

- Dinatri citrat sesquihydrat của Merck, Đức

- Trinatri citrat dihydrat của Merck, Đức

- Chất hấp phụ PSA (primary secondary amines) của Agilent, Mỹ

- Chất hấp phụ GCB (graphite carbon black) của Agilent, Mỹ

Các chất chuẩn HCBVTV và nội chuẩn TPP của hãng Dr Ehrenstorfer và Sigma-Aldrich như ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thông tin về các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu

Chất chuẩn Hãng cung cấp Độ tinh khiết (%) Mã sản phẩm Số lô

Acephat Sigma-Aldrich 96,0±1 45315 6125X Acetamiprid Sigma-Aldrich 98,0±1 33767 8067X Acetochlor Sigma-Aldrich 96,8±1 33379 9314X Aldicarb Dr.Ehrenstorfer 98,5±0,5 10070000 50124

Chất chuẩn Hãng cung cấp Độ tinh khiết (%) Mã sản phẩm Số lô

Pesticide standards from reputable suppliers like Aldrin Dr Ehrenstorfer and Sigma-Aldrich are widely used in research and testing These standards include Atrazin with a purity of 98.8±0.5%, Azoxystrobin at 99.0±0.5%, and Carbaryl with a purity of 98.5±0.5% Other notable standards are Carbendazim at 99.7±0.5%, Carbofuran at 98.5±0.5%, and Carboxin with a purity of 99.9±0.5% Additionally, Chlorothalonil, Chlorpyrifos, Cypermethrin, and Dichlorvos are also available with high purity levels, ranging from 97.0±1% to 99.3±0.5%.

Dimethoat Sigma-Aldrich 99,4±0,5 45449 5334X Edifenphos Sigma-Aldrich 99,9±0,5 45467 7080X Emamectin benzoat

Fenobucarb Dr.Ehrenstorfer 99,0±0,5 13485000 60810 Imidacloprid Sigma-Aldrich 99,9±0,5 37894 9112X Indoxacarb Sigma-Aldrich 93,7±1 33969 8323X Isoprocarb Dr.Ehrenstorfer 99,5±0,5 14450000 80118

Methiocarb Dr.Ehrenstorfer 98,0±0,5 15020500 50606 Methomyl Dr.Ehrenstorfer 99,5±0,5 15030000 40330 Permethrin Dr.Ehrenstorfer 94,0±1 15990000 70307 Profenofos Sigma-Aldrich 98,2±0,5 45632 9044X Propoxur Dr.Ehrenstorfer 99,5±0,5 16500000 30311 Tebuconazol Dr.Ehrenstorfer 98,5±0,5 17178700 10223 Thiamethoxam Sigma-Aldrich 99,7±0,5 37924 9098X Trichlorfon Sigma-Aldrich 97,0±1 45698 8021X TPP (IS) Dr.Ehrenstorfer 99,5±0,5 C178930000 80410

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL, cần cân chính xác khoảng 100,0 mg chất chuẩn của 32 HCBVTV và hòa tan bằng acetonitril có chứa 1% acid acetic Sau đó, cho dung dịch vào các bình định mức 100 mL khác nhau và bổ sung dung môi đến vạch Nồng độ của dung dịch chuẩn gốc được tính toán dựa trên lượng cân thực tế và độ tinh khiết của các chất chuẩn Các dung dịch chuẩn gốc này có thể được bảo quản ở nhiệt độ từ 0-5°C và giữ được trong 1 năm.

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL được chuẩn bị bằng cách lấy chính xác 1 mL dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL của mỗi hoạt chất ban đầu (HCBVTV) và cho vào bình định mức 100 mL, sau đó thêm acetonitril có chứa 1% acid acetic đến vạch Dung dịch này cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 0-5°C và có thể giữ được trong 6 tháng.

Để tạo dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1 μg/mL, hãy lấy chính xác 1 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10 μg/mL và cho vào bình định mức 10 mL, sau đó thêm acetonitril có chứa 1% acid acetic đến vạch Dung dịch này nên được bảo quản trong nhiệt độ từ 0-5°C và có thể giữ được trong 6 tháng.

Để xây dựng đường chuẩn, chúng tôi chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp với các nồng độ 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/mL bằng cách pha từ các dung dịch chuẩn trung gian trong dung môi acetonitril có chứa 1% acid acetic hoặc trong các dịch chiết mẫu trắng Các dung dịch này được pha chế ngay trước khi sử dụng để đảm bảo độ chính xác và ổn định.

Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) được trang bị máy sắc ký lỏng tiên tiến của Shimadzu, bao gồm 2 bơm cao áp LC 20AD-XR, bộ ổn nhiệt cột CTO-20A và bộ tiêm mẫu tự động SIL 20AC-XR Hệ thống này được ghép nối với máy khối phổ ba tứ cực 5500 QQQ của ABSciex, đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao trong phân tích mẫu Ngoài ra, hệ thống sử dụng khí Nitơ từ bộ sinh khí AB-3G của Peak Scientific, giúp tối ưu hóa quá trình phân tích và đảm bảo kết quả đáng tin cậy.

- Hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) gồm máy sắc ký khí GC 7890A và khối phổ MS 7000B của Agilent

- Máy đồng nhất mẫu HR1843, Phillips

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,0001 g) XT22A, Precisa

- Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01 g), Precisa

- Cột sắc ký lỏng XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 àm) và tiền cột tương ứng (20 mm x 3,9 mm; 3,5 àm) của Waters

- Cột sắc ký khí DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) của Agilent

- Micropipet điều chỉnh được thể tớch: 10-100 àL, 100-1000 àL, 1000-5000 àL

- Ống ly tâm Teflon 50 mL, có nắp kín

- Lọ đựng mẫu loại 1,8 mL, màu nâu dùng cho tiêm mẫu GC và LC

- Các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm: cốc, ống đong, phễu, giấy lọc…

GC-MS/MS (Agilent) LC-MS/MS (Shimadzu-ABSciex)

Hình 2.1 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên cứu

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu

Thực hiện khảo sát các HCBVTV đang được sử dụng phổ biến, nhằm xác định đối tượng nghiên cứu chứa nhiều nguy cơ nhiễm HCBVTV nhất

Để thu thập dữ liệu, chúng tôi đã sử dụng các công cụ khảo sát thiết kế sẵn, bao gồm phiếu khảo sát cơ sở cung ứng thực phẩm chức năng và phiếu khảo sát việc sử dụng thực phẩm chức năng trong trồng cây thuốc Những công cụ này được thiết kế để thu thập thông tin chi tiết và chính xác về các vấn đề liên quan đến thực phẩm chức năng, từ đó giúp chúng tôi phân tích và đánh giá hiệu quả của thực phẩm chức năng trong trồng cây thuốc.

Các địa phương được lựa chọn để thực hiện khảo sát bao gồm Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Thái Nguyên, Phú Thọ và Hà Giang, những nơi có các vùng trồng cây thuốc hoặc kinh doanh dược liệu phổ biến, giúp đánh giá thực tế và thu thập dữ liệu chính xác.

Quá trình khảo sát được kết hợp với lấy mẫu tại các địa phương, trong đó mẫu dược liệu được thu thập với trọng lượng tối thiểu 1 kg và mẫu thực phẩm chức năng (TPCN) được lấy với số lượng tối thiểu 1 đơn vị đóng gói Sau khi thu thập, các mẫu sẽ được chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ từ 2-4 độ C trước khi tiến hành phân tích.

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu

Chu ẩ n b ị m ẫ u s ơ b ộ : Toàn bộ mẫu được xay nhỏ (đối với mẫu rắn), lắc trộn đều (đối với mẫu lỏng)

Quy trình xử lý mẫu được thực hiện dựa trên phương pháp QuEChERS, trong đó hóa chất bị nhiễm (HCBVTV) được chiết xuất bằng acetonitril đã được ổn định pH bằng đệm acetat và tách khỏi nước có trong mẫu bằng phân bố lỏng lỏng nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4) Sau đó, dịch chiết được làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) sử dụng chất hấp phụ PSA, GCB và MgSO4 để loại bỏ các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác Cuối cùng, dịch chiết được tách bằng sắc ký và phân tích bằng kỹ thuật khối phổ hai lần để xác định chính xác thành phần và nồng độ của HCBVTV trong mẫu.

Các bước xử lý mẫu:

- Cân một lượng mẫu phù hợp (mẫu tươi, mẫu lỏng: 15 g; mẫu khô: 3 g) vào ống ly tâm 50 mL

- Đối với mẫu khô, bổ sung thêm 15 mL nước, lắc đều bằng tay và lắc xoáy trong 1 phút

- Thêm 15 mL dung môi chiết (được khảo sát để tối ưu), lắc đều bằng tay và lắc xoáy trong 1 phút

- Thêm 6 g MgSO 4 , 1,5 g NaCl và 1,5 g CH 3 COOH (được khảo sát để tối ưu), lắc đều bằng tay và lắc xoáy trong 1 phút

- Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút

Để bắt đầu quá trình, hãy lấy 1 mL dịch ly tâm (lớp trên) và cho vào ống ly tâm 2 mL đã chứa sẵn 150 mg MgSO4, 40 mg PSA và 7,5 mg GCB Sau đó, lắc xoáy hỗn hợp trong 1 phút để đảm bảo các chất được trộn đều Lưu ý rằng có thể lấy lượng dịch ly tâm lớn hơn, nhưng cần điều chỉnh lượng chất hấp phụ phù hợp để đạt được kết quả tối ưu.

- Ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút

- Hút 0,5 mL dịch chiết và phân tích bằng LC-MS/MS hoặc GC-MS/MS

2.3.3 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ

Trong nghiên cứu này, hai kỹ thuật LC-MS/MS và GC-MS/MS được sử dụng để phân tích các HCBVTV với các điều kiện như dưới đây

- Cột sắc ký XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 àm) và tiền cột tương ứng

(20 mm x 3,9 mm; 3,5 àm) của Waters

- Pha động gồm hai kênh A (acid acetic 0,1% trong nước) và B (methanol) với chế độ gradient

- Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

Các điều kiện khối phổ được thiết lập với nguồn ion hóa ESI ở chế độ ion dương (+), cho phép tối ưu hóa các giá trị ion phân tử, ion sản phẩm và năng lượng bắn phá Để đạt được kết quả chính xác, dung dịch HCBVTV 100 ng/mL được tiêm trực tiếp vào máy MS, từ đó lựa chọn và tối ưu hóa các thông số này.

 Máy sắc ký khí GC 7890A của Agilent với các điều kiện phân tích như sau:

- Cột sắc ký DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) của Agilent

- Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 250 o C

- Chế độ tiêm mẫu: không chia dòng (splitless)

- Khí mang heli, tốc độ dòng 0,8 mL/phút

- Chương trình nhiệt độ: 60 o C (giữ trong 2 phút), tăng 20 o C /phút lên 180 o C (0 phút), sau đó tăng 4 o C /phút lên 260 o C (giữ trong 2 phút)

- Nhiệt độ bộ phận kết nối sắc ký khí và khối phổ: 280 o C

 Bộ tiêm mẫu tự động CTC-Pal:

- Thể tớch tiờm mẫu 1 àL

 Khối phổ MS 7000B của Agilent

- Nguồn ion hoá: EI 70 eV

- Thời gian cắt dung môi: 5 phút

- Các giá trị ion phân tử, ion sản phẩm và năng lượng bắn phá được lựa chọn và tối ưu đối với từng HCBVTV

2.3.4.1 Tính ch ọ n l ọ c Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp, thực hiện phân tích và so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

Tính chọn lọc của phương pháp còn được khẳng định thông qua số điểm xác nhận (IP) và tỷ lệ các ion, được tính toán dựa trên quy định EC/657/2002 của Châu Âu, giúp đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả phân tích.

Số điểm xác nhận là tổng điểm ion phân tử và ion sản phẩm, được tính dựa trên kỹ thuật LC-MS/MS và GC-MS/MS Theo đó, mỗi ion phân tử được tính 1 điểm và mỗi ion sản phẩm được tính 1,5 điểm Để đạt được số điểm xác nhận tối thiểu, mỗi HCBVTV cần tối thiểu 1 ion phân tử và 2 ion sản phẩm, tương đương với tổng số điểm xác nhận tối thiểu là 4 điểm.

Tỷ lệ ion là tỷ lệ phần trăm của ion sản phẩm có tín hiệu thấp hơn, chia cho ion sản phẩm có tín hiệu cao hơn của cùng một hợp chất cơ bản vật thể tự nhiên (HCBVTV) Để đảm bảo độ chính xác, tỷ lệ ion của mỗi HCBVTV phát hiện trên mẫu cần phải đáp ứng yêu cầu cụ thể, được quy định trong bảng tham chiếu tương ứng.

Bảng 2.3 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion

Tỷ lệ ion (%) Sai lệch cho phép (%)

2.3.4.2 Gi ớ i h ạ n phát hi ệ n, gi ớ i h ạ n đị nh l ượ ng

Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N - Signal to noise ratio) Khi phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp, vẫn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Tỷ lệ S/N được xác định dựa trên phần mềm của thiết bị, giúp đánh giá chính xác giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp phân tích.

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.3.4.3 Kho ả ng tuy ế n tính và đườ ng chu ẩ n Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích píc thu được vào nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính

Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực là một bước quan trọng trong quá trình phân tích, giúp loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả Để thực hiện bước này, cần trải qua các bước xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu, bao gồm xác định nền mẫu, chuẩn bị mẫu, đo đạc và phân tích dữ liệu, từ đó tạo ra đường chuẩn chính xác và đáng tin cậy.

Để đảm bảo độ chính xác của nghiên cứu, việc lựa chọn nền mẫu trắng phù hợp với đối tượng thử là vô cùng quan trọng Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học đã quyết định lựa chọn các nền mẫu trắng từ dược liệu thiên nhiên như mã đề, bồ công anh, trà mướp đắng, dây thìa canh và chè khô Sự lựa chọn này giúp đảm bảo rằng kết quả nghiên cứu sẽ phản ánh chính xác đặc tính của các dược liệu này.

- Phân tích mẫu trắng để thu được dịch chiết các mẫu trắng

- Pha dãy chuẩn trên nền dịch chiết mẫu trắng

- Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu của từng HCBVTV và tín hiệu của nội chuẩn theo nồng độ HCBVTV tương ứng

Các đường chuẩn được đánh giá dựa trên hai tiêu chí:

- Hệ số tương quan tuyến tính, R 2 ≥ 0,99

- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn, ∆ i ≤ 15%, (∆ i ≤ 20% tại LOQ) Độ chệch được tính theo công thức sau:

Ci(tt) là nồng độ tính được theo đường chuẩn của điểm chuẩn thứ “i”, tính theo ng/mL

C i(lt) là nồng độ lý thuyết (nồng độ pha dung dịch chuẩn) của điểm chuẩn thứ “i”, tính theo ng/mL

2.3.4.4 Độ l ặ p l ạ i và độ thu h ồ i Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau (n=6) và tính toán kết quả theo các công thức:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo hệ số biến thiên CV(%):

N xi x s trong đó: x i : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “i” x : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

N : Số lần thử nghiệm s: Độ lệch chuẩn

- Độ thu hồi (R%) được tính theo công thức

62 trong đó: Cm+c : Nồng độ HCBVTV trong mẫu thêm chuẩn

C m : Nồng độ HCBVTV trong mẫu

Cc : Nồng độ HCBVTV thêm (theo lý thuyết)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT

3.1.1 Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật

Việc khảo sát nguồn cung HCBVTV được thực hiện tại các cơ sở kinh doanh HCBVTV trong năm 2013 tại các địa phương sau:

- Quận Thanh Xuân, thành phố Hà Nội: 5 cơ sở

- Huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên: 3 cơ sở

- Huyện Gia Lộc, tỉnh Hải Dương: 3 cơ sở

- Huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định: 2 cơ sở

- Huyện Thanh Thủy, tỉnh Phú Thọ: 2 cơ sở

- Xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên: 2 cơ sở

- Huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang: 2 cơ sở

Tổng cộng đã khảo sát 19 cơ sở kinh doanh HCBVTV, nhằm hướng đến hai mục tiêu chính:

- Thứ nhất, khảo sát kiến thức và thực hành việc kinh doanh HCBVTV

- Thứ hai, khảo sát những HCBVTV đang được buôn bán phổ biến hiện nay

3.1.1.1 Ki ế n th ứ c và th ự c hành kinh doanh HCBVTV

 Đăng ký buôn bán thuốc bảo vệ thực vật

Trong số 19 cơ sở, có 15 cơ sở có giấy đăng ký buôn bán thuốc bảo vệ thực vật

Có 4 cơ sở kinh doanh không có giấy phép, bao gồm 2 cơ sở tại Xuân Lộc, Thanh Thuỷ, Phú Thọ do gia đình tự kinh doanh, 1 cơ sở tại Đồng Văn, Hà Giang chỉ bán cho người dân tộc H'Mong và 1 cơ sở tại Nghĩa Trai, Khoái Châu, Hưng Yên cũng do gia đình tự kinh doanh.

Kết quả khảo sát cho thấy đa số nhân viên kinh doanh của cơ sở buôn bán HCBVTV không được đào tạo chuyên ngành về HCBVTV hoặc không có chứng chỉ đào tạo ngắn hạn về lĩnh vực này Điều đáng chú ý là 63% số người được hỏi cho rằng họ có kiến thức về HCBVTV thông qua quá trình đào tạo tại chỗ, thông tin từ đơn vị cung cấp và tự tìm hiểu.

Hình 3.1 Hiểu biết về HCBVTV của nhân viên kinh doanh

 Hiểu biết về các danh mục HCBVTV

Kết quả khảo sát về hiểu biết của nhân viên kinh doanh về các danh mục hàng cấm, hạn chế bán và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (HCBVTV) ở Việt Nam cho thấy vẫn còn nhiều hạn chế Mặc dù danh mục HCBVTV được ban hành hàng năm, nhưng nhiều cơ sở và nhân viên kinh doanh vẫn chưa tiếp cận được do thiếu thông tin tại nơi bán Một số đơn vị đã biết về các danh mục này, nhưng không cập nhật bản mới nhất, thay vào đó vẫn sử dụng các danh mục đã ban hành từ 4-5 năm trước.

Hình 3.2 Hiểu biết của nhân viên kinh doanh về danh mục HCBVTV

Nguồn cung cấp hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) chủ yếu được các đơn vị mua lại từ các công ty kinh doanh trong nước Theo khảo sát 19 đơn vị, chỉ có 1 đơn vị tự pha chế một số sản phẩm đơn giản, trong khi phần lớn còn lại phụ thuộc vào nguồn cung cấp từ các công ty kinh doanh.

- Phương thức tiêu thụ chính là bán tại cửa hàng

- 100% các cơ sở được hỏi đều cho biết có hướng dẫn sử dụng cho người mua

3.1.1.2 Các HCBVTV đượ c buôn bán ph ổ bi ế n

Trên cơ sở các phiếu hỏi, các loại HCBVTV được thống kê, phân loại và sắp xếp theo thứ tự được kinh doanh phổ biến (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Các HCBVTV được tiêu thụ phổ biến tại các địa phương khảo sát

TT Tên thuốc Tên hoạt chất Công dụng Phân loại HCBVTV Số cơ sở kinh doanh

1 Conphai Imidacloprid Trừ sâu Neonicotinoid 13

2 Tasieu Emamectin Trừ sâu Macrocyclic lacton 12

5 Reasgant Abamectin Trừ sâu Macrocyclic lacton 10

6 Sherpa Cypermethrin Trừ sâu Pyrethroid 10

7 Sieufatox Abamectin, emamectin Trừ sâu Macrocyclic lacton 10

8 Ascend Acetamiprid Trừ sâu Neonicotinoid 9

9 Carbatox Chlorpyrifos Trừ sâu Phosphor hữu cơ 8

10 Cyrux Cypermethrin Trừ sâu Pyrethroid 8

11 Yamida Imidacloprid Trừ sâu Neonicotinoid 7

12 Actara Thiamethoxam Trừ sâu Neonicotinoid 6

13 Agita Thiamethoxam Trừ sâu Neonicotinoid 6

14 Antaco Acetochlor Trừ cỏ Amid 6

15 Apfara Thiamethoxam Trừ sâu Neonicotinoid 6

Trừ sâu Neonicotinoid Điều hoà sinh trưởng côn trùng

18 Oman Emamectin Trừ sâu Macrocyclic lacton 6

19 Subside Chlorpyrifos Trừ sâu Phosphor hữu cơ 6

20 Agromectin Abamectin Trừ sâu Macrocyclic lacton 5

21 Anvado Imidacloprid Trừ sâu Neonicotinoid 5

22 Bestox Cypermethrin Trừ sâu Pyrethroid 5

23 Cavil Carbendazim Trừ nấm Benzimidazol 5

24 Diptecide Trichlorfon Trừ sâu Phosphor hữu cơ 5

25 Jiami Imidacloprid Trừ sâu Neonicotinoid 5

26 Kẽm phosphid Kẽm phosphid Trừ chuột Vô cơ 5

27 Lannat Methomyl Trừ sâu Carbamat 5

28 Moneys Azoxystrobin Trừ nấm Kháng sinh 5

Trừ sâu Phosphor hữu cơ

31 Permecide Permethrin Trừ sâu Pyrethroid 5

32 Sapen - Alpha Cypermethrin Trừ sâu Pyrethroid 5

34 Wamtox Cypermethrin Trừ sâu Pyrethroid 5

36 Ammate Indoxacarb Trừ sâu Oxadiazin 4

37 Arin Carbendazim Trừ nấm Benzimidazol 4

38 Bemad Emamectin Trừ sâu Macrocyclic lacton 4

39 Bian Dimethoat Trừ sâu Phosphor hữu cơ 4

40 Carbenzim Carbendazim Trừ nấm Benzimidazol 4

41 Địch bách trùng Trichlorfon Trừ sâu Phosphor hữu cơ 4

43 Limectin Abamectin Trừ sâu Macrocyclic lacton 4

44 Mipcide Isoprocarb Trừ sâu Carbamat 4

45 Selecron Profenofos Trừ sâu Phosphor hữu cơ 4

46 Tungperin Permethrin Trừ sâu Pyrethroid 4

47 Vicarben Carbendazim Trừ nấm Benzimidazol 4

48 Agrosan Edifenphos Trừ sâu Phosphor hữu cơ 3

50 Folicur Tebuconazol Trừ nấm Conazol 3

51 Hopsan Fenobucarb Trừ sâu Phosphor hữu cơ 3

52 Maraton Chlorpyrifos Trừ sâu Phosphor hữu cơ 3

53 Mizin Atrazin Trừ cỏ Triazin 3

54 Oshin Dinotefuran Trừ sâu Neonicotinoid 3

56 Amateur Indoxacarb Trừ sâu Oxadiazin 2

57 Asmai Buprofezin Trừ sâu Điều hoà sinh trưởng côn trùng 2

58 Bravo Glyphosat Trừ cỏ Phosphor hữu cơ 2

59 Deltox Deltamethrin Trừ sâu Pyrethroid 2

60 Kannup Glyphosat Trừ cỏ Phosphor hữu cơ 2

61 Para Carbaryl Trừ sâu Carbamat 2

63 Rampart Metalaxyl Trừ nấm Amid 2

64 Regent Fipronil Trừ sâu Pyrazole 2

65 Sattrungdan Nereistoxin Trừ sâu Nereistoxin 2

66 Sifa Pyrazosulfuron Trừ cỏ Pyrazole 2

67 Valivithaco Validamycin Trừ nấm Kháng sinh 2

68 Vifuran 3G Carbofuran Trừ sâu Carbamat 2

69 Butavi Butachlor Trừ cỏ Amid 1

70 Marchal Carbofuran Trừ sâu Carbamat 1

71 Chữ Trung Quốc Acephate Trừ sâu Phosphor hữu cơ 1

72 Chữ Trung Quốc Dichlorvos Trừ sâu Phosphor hữu cơ 1

74 Gfaxon Paraquat Trừ cỏ Amoni quatenari 1

75 Kanras Trừ cỏ Nitơ Aliphatic 1

Hầu hết các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được bán tại các cơ sở đều nằm trong danh mục cho phép sử dụng ở Việt Nam, chỉ có 2 HCBVTV nằm trong danh mục hạn chế sử dụng Trong số 75 HCBVTV được kinh doanh, có 9 loại gồm hai thành phần và 2 loại gồm ba thành phần, với hoạt chất phổ biến như carbofuran và kẽm phosphid nằm trong danh mục hạn chế sử dụng.

Các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) thường bao gồm 3 thành phần chính, trong đó đa số được sử dụng để trừ sâu hại, một số khác để trừ cỏ và trừ nấm Tại Đồng Văn, Hà Giang, người dân thường sử dụng các loại HCBVTV nhập khẩu từ Trung Quốc, được người H'Mong mua bán và phân phối hạn chế cho những người quen biết Đáng chú ý, các sản phẩm này thường có nhãn mác bằng tiếng Trung Quốc, khiến việc xác định thành phần chỉ có thể thực hiện được thông qua phân tích tại phòng thí nghiệm.

Hình 3.3 Hình ảnh một số HCBVTV không có nguồn gốc

Dựa trên các kết quả ở bảng 3.1, các hoạt chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được thống kê về số lượng tên thương mại của mỗi loại và được xếp hạng theo các nhóm phân loại tương ứng, với kết quả chi tiết được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2 Sự phổ biến của các HCBVTV theo nhóm phân loại

TT Hoạt chất Phân loại Số tên thương mại

OP PY Car Neo Mac Khác

8 Buprofezin Điều hoà sinh trưởng côn trùng 2

TT Hoạt chất Phân loại Số tên thương mại

OP PY Car Neo Mac Khác

Chú thích: OP – nhóm phosphor hữu cơ; PY – nhóm pyrethroid; Car – nhóm carbamat; Neo – nhóm neonicotinoid; Mac – nhóm macrocyclic lacton

Nhóm phosphor hữu cơ là nhóm hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được sử dụng rộng rãi nhất, chiếm 23% thị phần với 9 hoạt chất và 51% thị phần với 20 tên thương mại Trong khi đó, nhóm pyrethroid có 3 hoạt chất được sử dụng, nhưng thành phần cypermethrin lại được sử dụng rất phổ biến với 9 tên thương mại khác nhau.

3.1.2 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số vùng lân cận

Khảo sát việc sử dụng HCBVTV trong trồng cây thuốc tại một số cơ sở ở các địa phương sau:

- Xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, Hưng Yên: 9 cơ sở

- Xã Bình Minh, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên: 8 cơ sở

- Xã Hải Lộc và Hải Toàn, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định: 3 cơ sở

- Xã Tân Cương, thành phố Thái Nguyên: 20 cơ sở

- Xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội: 5 cơ sở

- Phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, thành phố Hà Nội: 5 cơ sở

Tổng cộng đã khảo sát 40 cơ sở trồng cây thuốc (20 cơ sở trồng chè) và 10 cơ sở kinh doanh dược liệu, nhằm hướng đến hai mục tiêu chính:

- Thứ nhất, khảo sát các loại dược liệu phổ biến trong những vùng nói trên

- Thứ hai, khảo sát các loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc

Bảng 3.3 Danh mục cây thuốc và dược liệu ở các địa phương khảo sát

TT Tên dược liệu Bộ phận dùng

Trồng cây thuốc Kinh doanh dược liệu

1 Bạc hà Phần trên mặt đất x x x x

4 Bồ công anh Phần trên mặt đất x x x

6 Chè vằng Phần trên mặt đất x

8 Chó đẻ răng cưa Phần trên mặt đất x x

9 Cỏ ngọt Phần trên mặt đất x x x

10 Cỏ xước Phần trên mặt đất x

11 Cối xay Phần trên mặt đất x x x

13 Địa liền Phần trên mặt đất x x x

14 Diệp hạ châu Phần trên mặt đất x x x

19 Hoắc hương Phần trên mặt đất x x x

22 Hương nhu tía Phần trên mặt đất x x

23 Hương nhu trắng Phần trên mặt đất x x

24 Ích mẫu Phần trên mặt đất x x

TT Tên dược liệu Bộ phận dùng

Trồng cây thuốc Kinh doanh dược liệu

27 Kim tiền thảo Phần trên mặt đất x x x

28 Kinh giới Phần trên mặt đất x x x

31 Ngải cứu Phần trên mặt đất x x x x x

33 Nhân trần Phần trên mặt đất x

34 Nhọ nồi Phần trên mặt đất x

37 Sài hồ nam Cả cây x x x

40 Thanh hao hoa vàng Lá x x

42 Tía tô Phần trên mặt đất x x x x

43 Trinh nữ hoàng cung Thân, lá x x

45 Xấu hổ Phần trên mặt đất x

Nhận xét: Tại thời điểm khảo sát, tại xã Tân Quang (Văn Lâm, Hưng Yên) có

Khảo sát tại các địa phương cho thấy đa số các loại cây thuốc được trồng thuộc loại thân thảo hoặc dây leo, giống cây ngắn ngày và bộ phận sử dụng là phần trên mặt đất Tại xã Bình Minh (Khoái Châu, Hưng Yên), người dân trồng 15 loại cây thuốc, trong khi đó các cơ sở bán buôn bán lẻ dược liệu ở Ninh Hiệp và Lãn Ông (Hà Nội) cung cấp đa dạng các loại dược liệu khác nhau Một số địa phương ở Hải Hậu (Nam Định) cũng áp dụng mô hình GACP để trồng cây thuốc như dây thìa canh, đinh lăng thông qua hợp tác với các công ty dược.

Dây thìa canh – Nam Định Rau má – Hưng Yên Chè xanh – Thái Nguyên

Hình 3.4 Một số loại cây thuốc được trồng phổ biến ở các địa phương

Kết quả khảo sát việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong trồng cây thuốc được thu thập thông qua phiếu hỏi và quan sát trực tiếp tại ruộng, nơi vỏ HCBVTV được để lại Dữ liệu thu thập được cho thấy các loại HCBVTV phổ biến được sử dụng trong trồng cây thuốc, kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 3.5.

Hình 3.5 Một số vỏ HCBVTV sau sử dụng tại ruộng Bảng 3.4 Danh mục HCBVTV sử dụng trong trồng cây thuốc

TT HCBVTV Hoạt chất Cây thuốc Mục đích Số lần/vụ PHI

1 Amateur Indoxacarb Bồ công anh Trừ sâu 1 7 ngày

2 Antaco Acetochlor Cỏ ngọt, khoai mỡ, ngải cứu Trừ cỏ 1 7-10 ngày

3 Apfara Thiamethoxam Kim tiền thảo, mã đề Trừ sâu 1 10 ngày

4 Bian Dimethoat Khoai mỡ Trừ sâu 2 3 ngày

Bạch chỉ, kim tiền thảo, kinh giới, mã đề, mướp đắng Trừ sâu 2 7-10 ngày

6 Carbenzim Carbendazim Tam thất, cúc hoa, hoắc hương Trừ nấm 2 2-3 tuần

7 Cavil Carbendazim Kinh giới Trừ nấm 1 2 tuần

Chè xanh, kim tiền thảo Trừ sâu 1 7-10 ngày

9 Conphai Imidacloprid Bồ công anh, mã đề Trừ sâu 1 7-10 ngày

10 Địch bách trùng Trichlorfon Bồ công anh, mã đề, cỏ ngọt, cúc hoa Trừ sâu 2 7-10 ngày

Bồ công anh, mã đề, tía tô, địa liền, dây thìa canh

Emamectin Bạc hà Trừ sâu 1 7-10 ngày

13 Folicur Tebuconazol Địa liền, diệp hạ châu Trừ nấm 1 7-10 ngày

Isoprocarb Rau má, sài hồ nam Trừ sâu 1 10 ngày

15 Limectin Abamectin Chè xanh Trừ sâu 1 7-10 ngày

16 Mizin Atrazin Hương nhu, ngưu tất Trừ cỏ 1 1 tháng

17 Natiduc Azoxystrobin, tebuconazol Ngải cứu, ngưu tất Trừ cỏ 2 2-3 tuần

Trichlorfon Tam thất, hoài sơn Trừ sâu 1 7-10 ngày

19 Para Carbaryl Hoắc hương Trừ sâu 1 7 ngày

Bạc hà, cúc hoa, hoắc hương

Cyhalothrin Chè xanh Trừ sâu 1 7-10 ngày

22 Reasgant Abamectin Chè xanh Trừ sâu 1 7-10 ngày

Bạc hà, địa liền, ngưu tất, mã đề, tía tô, kinh giới Trừ sâu 1 7-10 ngày

24 Sieufatox Abamectin, emamectin Bạc hà, kinh giới, tía tô, hương nhu Trừ sâu 1 7-10 ngày

Bạc hà, địa liền, ngưu tất, mã đề, tía tô, kinh giới, bồ công anh

26 Tungperin Permethrin Bạc hà, địa liền, ngưu tất, mã đề, tía tô, kinh giới

Dimethoat Bạch truật Trừ sâu 1 7 ngày

Cypermethrin Chè xanh Trừ sâu 1 7-10 ngày

Chú thích: PHI – Thời gian từ khi phun lần cuối đến khi thu hoạch

Có nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được sử dụng trong trồng cây thuốc, tùy thuộc vào loại cây thuốc và mục đích cụ thể Theo khảo sát, khoảng 75% các loại thuốc sử dụng là để diệt trừ sâu, với các hoạt chất phổ biến như cypermethrin, chlorpyrifos, abamectin, emamectin, imidacloprid và acetamiprid Các vùng trồng dược liệu thường tuân thủ việc sử dụng HCBVTV, không sử dụng các loại đã bị cấm hoặc hạn chế, và số lần sử dụng thường là 1 lần/vụ, với thời gian từ khi phun lần cuối đến khi thu hoạch trung bình là 7-10 ngày.

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU

VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU

3.2.1 Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ

3.2.1.1 Đ i ề u ki ệ n s ắ c ký l ỏ ng kh ố i ph ổ

Để phân tích hợp chất có hoạt tính sinh học (HCBVTV) bằng sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực, điều kiện khối phổ cần được xác định rõ ràng Cụ thể, cần phải xác định được ion phân tử và ion sản phẩm của HCBVTV Với kỹ thuật ion hóa ESI (Electrospray Ionization) ở chế độ ion dương, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton (H+) vào khối lượng phân tử của HCBVTV.

76 phân tử của chất đó (M+H) Tuy nhiên, để định tính và định lượng cần phải xác định được ion sản phẩm của từng HCBVTV

Để xác định hai ion sản phẩm ứng với mỗi chất, sử dụng kim tiêm mẫu 1 mL tiêm trực tiếp các chất chuẩn HCBVTV có nồng độ 0,1 mg/mL vào thiết bị MS Ion có tín hiệu lớn và ổn định hơn sẽ được chọn làm ion định lượng, trong khi ion còn lại được sử dụng cho mục đích xác nhận Các thông số bắn phá như thế đầu vào (DP), áp suất khí bắn phá (CAD), thế đầu ra (CXP) và năng lượng bắn phá (CE) sẽ được tối ưu tự động theo thiết bị MS để đảm bảo kết quả chính xác và ổn định.

Các kết quả được tổng hợp ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Các điều kiện MS trong LC-MS/MS để phân tích HCBVTV

TT HCBVTV Ion phân tử [M+H] + (m/z) Định lượng Xác nhận

Ion phân tử [M+H] + (m/z) Định lượng Xác nhận

Sau khi xác định các điều kiện bắn phá của MS, cần khảo sát các điều kiện của nguồn ion hóa ESI trong hệ dung môi sắc ký Để tối ưu hóa các thông số, dung dịch chuẩn hỗn hợp HCBVTV với nồng độ 0,1 mg/mL được tiêm qua hệ thống LC với dung môi pha động là methanol và acid acetic 0,1% (tỷ lệ 1:1) và tốc độ dòng 0,5 mL/phút, không sử dụng cột sắc ký Các thông số như thế ion hóa, nhiệt độ nguồn ion, áp suất khí nguồn 1, áp suất khí nguồn 2 và áp suất khí màng được tối ưu hóa bằng phần mềm của thiết bị, với kết quả được trình bày trong bảng 3.6.

Bảng 3.6: Các thông số hoạt động đã tối ưu của nguồn ion hoá

Thông số (đơn vị) Giá trị tối ưu

CUR (psi) 20 CAD (psi) 7 ISV (V) 5500 TEM ( o C) 450 GS1 (psi) 25 GS2 (psi) 15 Dwell time (ms) 25

Nhận xét: Với các điều kiện của nguồn ion hoá, và điều kiện bắn phá ở tứ cực

Kết quả nghiên cứu đã xác định được điều kiện MS/MS cho 25 chất nghiên cứu, bao gồm cả chất nội chuẩn TPP (bảng 3.5 và bảng 3.6) Mỗi hợp chất bị vỡ (HCBVTV) đều có hai ion sản phẩm được xác định, sử dụng cho mục đích định lượng và xác nhận, đảm bảo yêu cầu về tính chọn lọc của một phương pháp phân tích dư lượng theo tiêu chuẩn quốc tế hiện nay của các tổ chức như châu Âu và Mỹ.

 Điều kiện sắc ký lỏng

Pha tĩnh trong sắc ký lỏng đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất với nhau và với các thành phần khác trong mẫu Đối với các chất bảo vệ thực vật (BVTV) kém phân cực, cột tách không phân cực được sử dụng Trong nghiên cứu này, cột pha đảo XBridge BEH C18 của Waters (Mỹ) đã được áp dụng để tách các HCBVTV, kết hợp với tiền cột XBridge C18 để bảo vệ cột Loại cột C18 này được ưa chuộng nhờ khả năng ứng dụng rộng rãi, phù hợp với các dung môi phân cực như methanol, acetonitril và nước, đồng thời có chi phí thấp.

Trong kỹ thuật LC-MS/MS, nhờ ưu điểm của MS có khả năng nhận biết các chất theo tỷ số khối lượng trên điện tích (m/z), hiệu quả tách tín hiệu hỗn hợp các HCBVTV vẫn được đảm bảo trên loại cột sắc ký Đặc biệt, nhờ khối phổ, hai chất carboxin và carbaryl có thời gian lưu gần nhau (9,03 phút và 9,05 phút) vẫn được tách hoàn toàn, như minh họa trong sắc ký đồ tổng ion của hỗn hợp các HCBVTV và sắc đồ các mảnh ion tương ứng.

Hình 3.6 Sắc đồ tổng ion của hỗn hợp chuẩn HCBVTV 0,1 mg/mL và sắc đồ của 2 mảnh ion sản phẩm của carboxin, 2 mảnh ion sản phẩm của carbaryl

Sử dụng dung dịch hỗn hợp chuẩn HCBVTV 0,1 mg/mL để khảo sát gradient của pha động Cố định các thông số sau:

- Cột XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 àm) và tiền cột XBridge C18

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

- Điều kiện MS theo bảng 3.5 và bảng 3.6

Bảng 3.7 Khảo sát gradient pha động (A = acid acetic 0,1%; B = methanol)

TT Điều kiện gradient Tốc độ mL/phút Nhận xét

Gradient 1 Ban đầu 10% B đến 1 phút, tăng lên 90% từ 1-8 phút; giữ 90% B trong 2 phút và đưa về điều kiện ban đầu Tổng thời gian 15 phút

0,5 Các píc còn tù, một số píc bị chẻ ngọn, độ rộng chân píc khoảng 0,5 phút; abamectin chưa rửa giải

0,6 Píc vẫn bị chẻ ngọn, abamectin rửa giải ở 13 phút tuy nhiên chưa đẹp và bị chẻ ngọn

0,6 Một số píc còn bị chẻ ngọn, abamectin rửa giải ở 12,5 phút đỡ bị chẻ ngọn

0,7 Các píc cân đối, không bị chẻ ngọn

Hình 3.7 Sắc ký đồ một số HCBVTV theo chế độ gradient 4

Kết quả được trình bày ở bảng 3.7 cho thấy gradient 4 mang lại điều kiện tách tốt nhất Do đó, điều kiện gradient này được lựa chọn và trình bày chi tiết ở bảng 3.8 để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.8 Điều kiện gradient để tách hỗn hợp HCBVTV

(mL/phút) Kênh A: HCOOH 0,1 % trong nước (% V/V) Kênh B: Methanol

 Đánh giá độ lặp lại của hệ thống LC-MS/MS

Để đánh giá độ lặp lại của hệ thống, hỗn hợp chuẩn 0,1 mg/mL đã được tiêm 6 lần lặp lại và các kết quả được trình bày ở bảng 3.9, cho thấy hệ số biến thiên của thời gian lưu và diện tích píc sắc ký.

Bảng 3.9 Độ lặp lại của hệ thống LC-MS/MS

HCBVTV Thời gian lưu (phút) RSD% (Thời gian) RSD% (Diện tích)

Hệ số biến thiên của diện tích píc dao động từ 1,9 đến 5,0% đáp ứng yêu cầu để ứng dụng phương pháp khối phổ, với mức độ ổn định này là phù hợp theo tiêu chuẩn (≤ 5%) Đồng thời, hệ số biến thiên của thời gian lưu rất thấp (< 1%) cho thấy thiết bị có độ ổn định cao, đáp ứng yêu cầu về độ tin cậy trong quá trình phân tích.

3.2.1.2 Đ i ề u ki ệ n s ắ c ký khí kh ố i ph ổ

Để phân tích bằng sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS), việc khảo sát các điều kiện tách bằng GC và xác định bằng MS/MS là rất quan trọng Điều này giúp đảm bảo rằng quá trình phân tích diễn ra chính xác và hiệu quả, từ đó mang lại kết quả đáng tin cậy.

 Lựa chọn các điều kiện tách của GC

Việc xác định đồng thời nhiều loại HCBVTV có bản chất khác nhau đòi hỏi sử dụng các pha tĩnh có khoảng áp dụng rộng Trong nghiên cứu này, cột sắc ký DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 μm) của Agilent, Mỹ, với pha tĩnh (5%-Phenyl)-methylpolysiloxan, đã được lựa chọn Loại pha tĩnh này có bản chất phân cực trung bình đến yếu, có ứng dụng rộng rãi và phù hợp với nhiều loại HCBVTV khác nhau Cột số 5 là loại cột phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam, và các loại cột tương tự cũng có thể được sử dụng hiệu quả.

- Khí mang được sử dụng là Heli có độ tinh khiết trên 99,99%, với tốc độ dòng được khảo sát là 0,8 mL/phút

Bộ tiêm mẫu SSL là lựa chọn phổ biến hiện nay với hai chế độ tiêm mẫu chính: chia dòng và không chia dòng Trong khi chế độ chia dòng có thể tạo ra hình dạng píc đẹp hơn, độ nhạy lại giảm do lượng chất phân tích vào cột bị chia nhỏ nhiều lần Vì vậy, nghiên cứu này áp dụng chế độ tiêm mẫu không chia dòng để đảm bảo độ nhạy cao hơn.

Thể tích tiêm mẫu trong GC với bộ tiêm mẫu SSL chỉ phù hợp với mức 1-2 µL, ở mức 2 µL độ nhạy của thiết bị có thể tăng nhưng thường có dấu hiệu kéo đuôi do không hóa hơi toàn bộ Vì vậy, để đảm bảo kết quả chính xác và ổn định, nghiên cứu này lựa chọn thể tích tiêm mẫu cố định là 1 µL với bộ tiêm mẫu tự động.

Điều kiện gradient nhiệt độ được lựa chọn bao gồm nhiệt độ ban đầu 60 o C trong 2 phút, sau đó tăng 20 o C/phút lên 180 o C và tiếp tục tăng 4 o C/phút lên 260 o C trong 2 phút Tổng thời gian phân tích là 31,5 phút Với điều kiện này, các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng (HCBVTV) được tách hoàn toàn, thể hiện qua kết quả ở bảng 3.11.

DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU

VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU

Sau khi xây dựng và thẩm định, các quy trình này được áp dụng để phân tích các HCBVTV trong nhiều đối tượng khác nhau, bao gồm dược liệu tươi, dược liệu khô và sản phẩm từ dược liệu như thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược, nước ép thảo dược và chè, nhằm đảm bảo chất lượng và an toàn cho người sử dụng.

3.3.1 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi

Dược liệu tươi được lấy tại vườn của một số vùng trồng dược liệu ở Hà Nội và

Tại Hưng Yên, quá trình lấy mẫu được thực hiện ngay trong giai đoạn thu hoạch hoặc ngay sau khi hoàn thành thu hoạch Tổng cộng 22 loại dược liệu đã được thu thập, chủ yếu là các loại lấy lá Kết quả phân tích chi tiết được trình bày trong bảng 3.23.

Bảng 3.23 Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu tươi

Ký hiệu Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Kết quả (HCBVTV và nồng độ) - mg/kg

Nghĩa Trai, Khoái Châu, Hưng Yên

DL6 Cúc hoa Chlorpyrifos (0,30); dichlorvos (0,080)

DL8 Mật quỷ Xuân Mai, Chương

Ngọc Lâm, Long Biên, Hà Nội

DL14 Ngải cứu Dimethoat (0,022), azoxystrobin (0,015)

Cypermethrin (0,33) DL21 Tía tô Carbendazim (0,006)

DL22 Kinh giới Carbendazim (0,007), acetamiprid (0,005); chlorpyrifos (0,27)

Kết quả phân tích cho thấy có khoảng 36% mẫu (8/22) chứa hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) vượt quá mức giới hạn cho phép (MRL) là 0,01 mg/kg Trong số các HCBVTV được phát hiện, carbendazim và azoxystrobin là những chất được tìm thấy nhiều nhất, với carbendazim có hàm lượng cao nhất lên đến 0,39 mg/kg trong một số mẫu.

3.3.2 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô

Tổng cộng 30 mẫu dược liệu khô đã được thu thập tại 3 địa điểm khác nhau Hầu hết các mẫu đều không rõ nguồn gốc xuất xứ và được bày bán tại chợ thuốc Ninh Hiệp và các quầy thuốc đông y tại Lãn Ông, Hà Nội Một số mẫu còn lại được lấy tại Hải Hậu, Nam Định, bao gồm cả các mẫu được đặt hàng sản xuất bởi các công ty dược phẩm như dây thìa canh và đinh lăng Kết quả phân tích chi tiết của các mẫu này được trình bày trong bảng 3.24.

Bảng 3.24 Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu khô

Ký hiệu Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu

Kết quả (HCBVTV phát hiện và nồng độ - mg/kg)

Xã Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội

G06 Kim tiền thảo Imidacloprid (0,25); chlorpyrifos (0,54)

G07 Trinh nữ hoàng cung Azoxytrobin (0,15), Carbofuran (0,015),

Fenobucarb (0,010) G08 Bồ công anh Atrazin (0,020); chlorpyrifos (0,18)

Phố Lãn Ông, Hoàn Kiếm, Hà Nội

Ký hiệu Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Kết quả (HCBVTV phát hiện và nồng độ - mg/kg)

L14 Trinh nữ hoàng cung Cypermethrin (0,40)

Kết quả phân tích 30 mẫu dược liệu cho thấy có 7 mẫu (chiếm khoảng 23%) chứa hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV), trong đó nhóm neonicotinoid chiếm tần suất xuất hiện lớn nhất với 4/7 mẫu.

3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần thảo dược

Kết quả phân tích cho thấy tổng số mẫu được kiểm tra là 140 mẫu, trong đó có 41 mẫu phát hiện HCBVTV với nồng độ trên 0,01 mg/kg, chiếm tỷ lệ 29,3% tổng số mẫu.

Các HCBVTV phát hiện và số lượng như sau:

Đáng chú ý, hợp chất endosulfan sulfat, một loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) thuộc nhóm clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng từ nhiều năm trước, vẫn được phát hiện trong 2 mẫu với hàm lượng lần lượt là 0,033 và 0,10 mg/kg.

Về mặt hàm lượng, các loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được xác định đều không đạt so với quy định MRL là 0,01 mg/kg Đáng chú ý, một số loại HCBVTV có hàm lượng cao gấp hàng nghìn lần so với giới hạn cho phép, điển hình như chlorpyrifos, cypermethrin và permethrin.

3.3.3.1 Đ ánh giá theo nhóm s ả n ph ẩ m

Bảng 3.25 thống kê số lượng mẫu phát hiện HCBVTV theo nhóm sản phẩm, ba nhóm sản phẩm được đánh giá gồm:

- Nhóm sản phẩm dạng viên

- Nhóm sản phẩm dạng túi, trà

- Nhóm sản phẩm dạng nước ép

Bảng 3.25 Tần suất phát hiện HCBVTV trong các nhóm sản phẩm khác nhau

TT Nhóm sản phẩm Tổng số mẫu Số mẫu phát hiện Tỷ lệ

1 Viên 50 10 20,0 Imidacloprid, acetamiprid, cypermethrin, permethrin, carbofuran, chlorpyrifos, fenobucarb, dimethoat, azoxystrobin, endosulfan sulfat

2 Túi, trà 50 20 40,0 Imidacloprid, acetamiprid, cypermethrin, permethrin, carbofuran, chlorpyrifos, fenobucarb, dimethoat, azoxystrobin, dichlorvos, endosulfan sulfat, abamectin

3 Nước 40 11 27,5 Imidacloprid, acetamiprid, cypermethrin, permethrin, carbofuran, abamectin, chlorpyrifos, fenobucarb

Tỷ lệ HCBVTV được phát hiện trong các mẫu tương đối cao, đặc biệt là trong các nền mẫu trà thảo dược với tỷ lệ lên đến 40% tổng số mẫu Điều này có thể được giải thích bởi hàm lượng thảo dược cao hơn trong các nền mẫu trà so với các nền mẫu viên và nước ép Ngoài ra, quá trình xử lý các sản phẩm trà cũng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của HCBVTV, bao gồm cả nhiệt, ẩm và ánh sáng.

Một trong những ưu điểm của thảo dược HCBVTV là hàm lượng ít, giúp giảm thiểu quá trình phân hủy trong chế biến so với các sản phẩm dạng viên hoặc nước ép, vốn phải trải qua các quy trình phức tạp như đóng nang, dập viên hoặc chiết xuất với dung môi.

Kết quả xác định HCBVTV trong mẫu có nguồn gốc trong nước và nhập khẩu được tóm tắt trong bảng 3.26

Bảng 3.26 Đánh giá hàm lượng HCBVTV trong TPCN theo nguồn gốc mẫu

Tất cả các sản phẩm TPCN dạng trà thảo dược

Tổng số mẫu Mẫu nhiễm

HCBVTV Tỷ lệ nhiễm (%) Tổng số mẫu Mẫu nhiễm

Kết quả ở bảng 3.26 cho thấy tỷ lệ phát hiện nhiễm HCBVTV ở các mẫu nội địa cao hơn các mẫu nhập khẩu, đặc biệt là đối với nhóm trà thảo dược Điều này cho thấy rằng tỷ lệ phát hiện nhiễm HCBVTV trong mẫu nhập khẩu vẫn ở mức cao, khoảng 25-30%, đồng thời cũng cho thấy rằng tỷ lệ phát hiện ở mẫu sản xuất trong nước cao hơn, tuy nhiên vẫn chưa xác định được nguyên nhân chính là do dược liệu trong nước hay do sử dụng dược liệu nhập khẩu, chủ yếu từ Trung Quốc.

3.3.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh

Các mẫu trà xanh được lấy tại các cửa hàng ở Hà Nội, tổng số mẫu là 20 mẫu Kết quả được trình bày ở bảng 3.27

Bảng 3.27 Kết quả phân tích HCBVTV trong trà xanh

Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu Kết quả (HCBVTV phát hiện và nồng độ - mg/kg)

S1 Tăng Bạt Hổ, Hà Nội Imidacloprid (0,01), Acetamiprid (0,154)

Ký hiệu Địa điểm lấy mẫu Kết quả (HCBVTV phát hiện và nồng độ - mg/kg)

S6 Nguyễn Đình Chiểu, Hà Nội -

S7 Tôn Đức Thắng, Hà Nội -

S8 Siêu thị Fivimart - Đê La Thành -

S9 Khâm Thiên, Hà Nội Imidacloprid (0,0056), Acetamiprid

(0,045), Fenobucarb (0,067) S12 Chợ Ngã Tư Sở, Hà Nội

S14 Siêu thị Fivimart – Lò Đúc -

S16 Trương Định, Hà Nội Acetamiprid (0,016)

S18 Nguyễn Đình Chiểu, Hà Nội Acetamiprid (0,022), Carbofuran (0,086)

S19 Ngọc Lâm, Long Biên, Hà Nội Acetamiprid (0,019)

Kết quả phân tích cho thấy 10/20 mẫu có chứa hàm lượng HCBVTV, mặc dù ở mức thấp, dao động từ 0,004-0,15 mg/kg Đặc biệt, nhóm HCBVTV neonicotinoid được phát hiện nhiều nhất, bao gồm cả imidacloprid, acetamiprid và thiamethoxam, là những chất được sử dụng phổ biến trong sản xuất nông nghiệp.

BÀN LUẬN

VỀ VIỆC SỬ DỤNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG TRỒNG CÂY THUỐC VÀ CHẾ BIẾN DƯỢC LIỆU

4.1.1 Về loại hoá chất bảo vệ thực vật được kinh doanh

4.1.1.1 Đị a đ i ể m kh ả o sát Địa điểm được lựa chọn để khảo sát là các địa phương có vùng trồng cây thuốc và kinh doanh dược liệu phổ biến ở phía Bắc Một số địa phương có vùng trồng dược liệu lớn như ở Hưng Yên, Hải Dương, Nam Định Một số địa phương có vùng trồng chè xanh lớn gồm Phú Thọ, Thái Nguyên Ngoài ra, một số cửa hàng ở Hà Giang được khảo sát thêm với mục đích tìm hiểu các HCBVTV được nhập khẩu theo con đường tiểu ngạch từ Trung Quốc Hà Nội cũng là địa điểm được lựa chọn không chỉ vì có nhiều địa điểm trồng cây thuốc mà còn có nhiều địa điểm kinh doanh dược liệu tươi và khô Như vậy, các địa điểm khảo sát là phù hợp để có thể xác định được các loại HCBVTV được sử dụng trong dược liệu hiện nay

4.1.1.2 Hoá ch ấ t b ả o v ệ th ự c v ậ t đượ c kinh doanh

Có 75 loại HCBVTV được kinh doanh tại các địa chỉ đã khảo sát, trong đó có 9 loại có thành phần gồm 2 hoạt chất, và 2 loại có thành phần gồm 3 hoạt chất Các loại HCBVTV được nhiều cửa hàng kinh doanh có thành phần chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid (imidacloprid, acetamiprid), nhóm macrocyclic lacton (abamectin, emamectin), nhóm phosphor hữu cơ (chlorpyrifos) và nhóm pyrethroid (cypermethrin) Kết quả này cho thấy xu hướng sử dụng HCBVTV hiện nay, đó là sử dụng các HCBVTV ít độc hơn và phối hợp nhiều thành phần trong cùng một loại thuốc Trong số này, các hợp chất nhóm phosphor hữu cơ và nhóm pyrethroid đã được quan tâm từ lâu, nhưng các hợp chất nhóm neonicotinoid và nhóm macrocyclic lacton vẫn chưa được quan tâm đúng mức Hiện nay, yêu cầu về công bố sản phẩm của Bộ Y tế chỉ quan tâm 4 nhóm chính là nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu cơ, carbamat và pyrethroid

Trong tổng số 39 hoạt chất, nhóm phosphor hữu cơ vẫn là nhóm được sử dụng phổ biến nhất với 9 hoạt chất và 20 tên thương mại Các nhóm carbamat, neonicotinoid, pyrethroid và macrocyclic lacton cũng là những nhóm phổ biến khác, với từ 10-12 tên thương mại Điều đáng chú ý là không có hoạt chất nhóm clor hữu cơ được kinh doanh, khẳng định xu hướng sử dụng các hoạt chất an toàn hơn trong thị trường hiện nay.

123 dụng HCBVTV hiện nay Các loại HCBVTV có độc tính cao thuộc nhóm clor hữu cơ đã được loại bỏ hoàn toàn

Trong 75 loại HCBVTV, có 56 loại là thuốc trừ sâu (74,7%), 9 loại thuốc trừ nấm (12,0%) và 8 loại thuốc trừ cỏ (10,7%), chỉ có 1 loại thuốc tăng trưởng (acid giberellic) và 1 loại thuốc trừ chuột (kẽm phosphid) Như vậy, mục đích việc sử dụng HCBVTV trong nông nghiệp nói chung và trong trồng cây thuốc nói riêng nhằm trừ sâu hại

Việc khảo sát các loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được thực hiện thông qua phiếu hỏi và danh sách tại các cửa hàng kinh doanh Tuy nhiên, một số loại HCBVTV không được bán công khai mà chỉ được mua bán truyền tay, đòi hỏi phải tìm hiểu thông qua người dân địa phương Các loại HCBVTV thu thập được đều không có thông tin về hoạt chất và hàm lượng bằng tiếng Việt hay tiếng Anh, chỉ được xác định sau khi phân tích tại phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy các sản phẩm này thuộc nhóm phosphor hữu cơ, nhưng vẫn còn nhiều sản phẩm tương tự đã được sử dụng mà chưa được phát hiện Điều này cho thấy việc quản lý sử dụng HCBVTV còn gặp nhiều khó khăn và thách thức.

4.1.2 Về loại HCBVTV được sử dụng trong trồng cây thuốc

Kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy có 28 loại HCBVTV với 23 hoạt chất được sử dụng, bao gồm 9 loại có 2 thành phần và 1 loại có 3 thành phần Các hoạt chất này đều tương thích với những hoạt chất đã được khảo sát tại các cửa hàng kinh doanh HCBVTV Điều này cho phép lựa chọn ưu tiên các hoạt chất (trừ acid giberellic là chất tăng trưởng) để đưa vào nghiên cứu phân tích.

Trong số các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được sử dụng, nhóm phosphor hữu cơ vẫn là nhóm được dùng nhiều nhất, chiếm khoảng 25% số thuốc và 18% số hoạt chất Tuy nhiên, xu hướng sử dụng các HCBVTV mới thuộc các nhóm neonicotinoid và macrocyclic lacton đang gia tăng, lần lượt chiếm 14% và 18% số thuốc, và 13% và 9% số hoạt chất Ngoài ra, các nhóm khác như pyrethroid, carbamat và strobin cũng được sử dụng phổ biến trong sản xuất nông nghiệp.

Trong số các hoạt chất được sử dụng, không có hoạt chất nằm trong danh mục cấm sử dụng hay danh mục hạn chế sử dụng ở Việt Nam Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy có 2 mẫu phát hiện chứa hoạt chất cấm sử dụng là endosulfan sulfat và 5 mẫu phát hiện chứa hoạt chất hạn chế sử dụng Điều này cho thấy sự khác biệt giữa các hoạt chất được sử dụng và các hoạt chất bị phát hiện trong quá trình phân tích.

Bên cạnh việc sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) có nguồn gốc rõ ràng, vẫn còn tồn tại những loại HCBVTV được truyền tay và chưa được kiểm soát, điển hình như carbofuran.

Các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật (HCBVTV) đã được ứng dụng trên 24 loại dược liệu khác nhau, trong đó đa số là thân thảo với lá và hoa là bộ phận được sử dụng chính Đặc biệt, có đến 21/28 loại HCBVTV được sử dụng để trừ sâu hại, điều này hoàn toàn phù hợp với nguy cơ bị sâu hại của các bộ phận dùng nói trên.

Kết quả nghiên cứu tại một số vùng dược liệu ở phía Bắc cho thấy đã có sự thay đổi đáng kể về loại hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) thường được sử dụng so với các nghiên cứu trước đây Đặc biệt, các HCBVTV nhóm neonicotinoid và macrocyclic lacton đang được sử dụng rộng rãi bên cạnh các nhóm lân hữu cơ, pyrethroid và carbamat Do đó, phương pháp phân tích cần phải được mở rộng và cải tiến để có thể phát hiện và phân tích được hết các nhóm HCBVTV này.

4.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM DƯỢC LIỆU

4.2.1 Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu

4.2.1.1 L ự a ch ọ n HCBVTV cho nghiên c ứ u phân tích

Dựa trên kết quả khảo sát về tình hình kinh doanh và sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong trồng cây thuốc và bảo quản dược liệu, các loại HCBVTV có chứa nguy cơ lớn nhất đã được lựa chọn để phân tích, đánh giá và đưa ra giải pháp tối ưu.

Common active ingredients used in growing medicinal plants include abamectin, acetamiprid, acetochlor, atrazine, azoxystrobin, carbaryl, carbendazim, chlorpyrifos, cypermethrin, dimethoate, emamectin, fenobucarb, imidacloprid, indoxacarb, isoprocarb, permethrin, tebuconazole, thiamethoxam, and trichlorfon.

Một số hoạt chất thường gặp khác có mặt trong thành phần của các thuốc được kinh doanh phổ biến bao gồm aldicarb, chlorothalonil, edifenphos, methiocarb, methomyl, profenofos và propoxur Đây là những hoạt chất thường được sử dụng trong các sản phẩm thuốc trừ sâu và thuốc diệt côn trùng.

- Một số hoạt chất có trong thành phần của các thuốc không nguồn gốc: acephat, dichlorvos, carboxin

- Một số hợp chất cấm sử dụng hoặc hạn chế sử dụng: aldrin, endosulfan sulfat carbofuran

Các hợp chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được lựa chọn để nghiên cứu trong bài viết này có sự khác biệt rõ rệt so với các nghiên cứu trước đây của Trần Việt Hùng [15], đặc biệt là khi tập trung vào nhóm clor hữu cơ không được đề cập đến trong các nghiên cứu trước đó.

VỀ DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phát hiện HCBVTV trong các mẫu dược liệu tươi và khô tại Hà Nội và các vùng lân cận tương đối cao, với 36% mẫu tươi và 30% mẫu khô vượt giới hạn MRL 0,01 mg/kg Điều này cho thấy một tỷ lệ đáng kể dược liệu trên thị trường có chứa HCBVTV, chủ yếu thuộc nhóm neonicotinoid như imidacloprid và acetamiprid, cũng như các loại thuốc trừ sâu khác như cypermethrin, chlorpyrifos, carbendazim và carbofuran Tuy nhiên, do cỡ mẫu phân tích còn nhỏ, kết quả này chưa thể đại diện cho toàn bộ thị trường dược liệu hiện nay.

Để kiểm soát tốt hơn dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong dược liệu và nông nghiệp, cần có sự thay đổi trong việc phân tích và quản lý, nhằm đáp ứng yêu cầu mới và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng Việc này đòi hỏi sự cập nhật và đổi mới trong quy trình quản lý dư lượng HCBVTV, từ đó giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát và đảm bảo chất lượng sản phẩm.

Nghiên cứu về dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) trong dược liệu cho thấy tỷ lệ phát hiện khá lớn Một số nghiên cứu ở Trung Quốc và Hàn Quốc đã phát hiện dư lượng HCBVTV trong các mẫu dược liệu, với tỷ lệ phát hiện cao nhất là 69% ở Trung Quốc Các HCBVTV được phát hiện nhiều nhất bao gồm carbendazim, carbofuran, propoxur, triazophos và acetamiprid Đối với các sản phẩm dược liệu, nghiên cứu này chỉ xác định HCBVTV trong một số loại TPCN dạng viên, dạng trà và dạng nước ép, với tỷ lệ phát hiện cao (29,3%), đặc biệt sản phẩm trà thảo dược (40%) Điều này cho thấy nguy cơ đối với sức khỏe người sử dụng là cao hơn do các sản phẩm này không qua quá trình chế biến như đun nấu.

Trong các mẫu thực phẩm chức năng (TPCN) đã phát hiện thấy sự tồn tại của các hoạt chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) bị cấm hoặc hạn chế sử dụng, điển hình như endosulfan sulfat và carbofuran Đồng thời, một số mẫu cũng cho thấy hàm lượng cao của các HCBVTV truyền thống như chlorpyrifos, cypermethrin và permethrin, vốn đang được Bộ Y tế kiểm soát Tuy nhiên, đáng chú ý là sự xuất hiện của các HCBVTV mới thuộc nhóm neonicotinoid như acetamiprid và imidacloprid, chưa được kiểm soát đúng mức, đòi hỏi cần có chế tài phù hợp để quản lý hiệu quả.

Chè xanh là một loại nông sản phổ biến và cũng là dược liệu đặc biệt tại Việt Nam, tuy nhiên, tỷ lệ mẫu chè xanh bị nhiễm hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) rất cao, chiếm đến 50% Điều này đã gây khó khăn cho việc xuất khẩu chè Việt Nam vào các thị trường khó tính như châu Âu, Nhật Bản và Mỹ do dư lượng HCBVTV không được kiểm soát Nhiều lô chè của Việt Nam đã bị trả lại do nhiễm HCBVTV, đặc biệt là hai loại hóa chất imidacloprid và acetamiprid.

Nghiên cứu gần đây cho thấy phần lớn các hoạt chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) chính được phát hiện trên cây chè thuộc nhóm neonicotinoid, bao gồm imidacloprid, acetamiprid và thiamethoxam Những hoạt chất này thường được người trồng chè sử dụng để diệt trừ các loài gây hại như rầy xanh và bọ cánh đỏ Do đó, các nhà quản lý cần có định hướng cụ thể để điều chỉnh và thay đổi thói quen sử dụng HCBVTV trên cây chè.

Giá trị MRL đối với dược liệu và các sản phẩm dược liệu hiện nay vẫn còn hạn chế, chỉ quy định cho 32 hợp chất chủ yếu là các HCBVTV nhóm clor hữu, phosphor hữu cơ và pyrethroid Tuy nhiên, phần lớn các HCBVTV này đã không còn được sử dụng nữa Để đảm bảo sự hài hòa với các quy định hiện nay trên thế giới, nghiên cứu này áp dụng giá trị MRL mặc định là 0,01 mg/kg Việc áp dụng giá trị MRL mặc định này là cần thiết và phù hợp, đặc biệt khi Việt Nam tham gia vào tổ chức thương mại thế giới và cần đáp ứng các yêu cầu của các nước Mức MRL mặc định này khá thấp, dẫn đến tỷ lệ phát hiện HCBVTV vượt MRL trong các sản phẩm nghiên cứu khá cao.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Xác Định Dư Lượng Hoá Chất Bảo Vệ Thực Vật Trong Dược Liệu Và Sản Phẩm Từ Dược Liệu Bằng Sắc Ký Khối Phổ
Tác giả	Trần Cao Sơn
Người hướng dẫn	PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, TS. Lê Thị Hồng Hảo
Trường học	Trường Đại Học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất
Thể loại	Luận Án Tiến Sĩ
Năm xuất bản	2015
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	219
Dung lượng	6,56 MB