Nghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

Nghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệuNghiên cứu xác định một số dược chất nhóm kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu

TỔNG QUAN

Tình hình thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% người dân sống ở các nước đang phát triển vẫn dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe, nhất là ở châu Phi và châu Á Theo một thống kê, số lượng người dân sử dụng chế phẩm từ dược liệu để điều trị bệnh ban đầu chiếm đến 90% dân số của Ethiopia, 75% dân số của Mali, 70% ở Myannar, 70% ở Rawanda, 60% ở Tanzania và chiếm 60% ở Uganda [56]

Ngay tại các nước phát triển ở châu Âu, số lượng các chế phẩm từ dược liệu bán ra cũng chiếm một doanh thu khá lớn trong đó thị phần ở Đức chiếm 39%, ở Pháp chiếm 21% trên tổng số [56]

Tuy nhiên, có nhiều lo ngại cho rằng tình trạng thuốc hóa dược trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu có xu hướng ngày càng tăng, có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người sử dụng Tình trạng này được phản ánh qua số lượng các nghiên cứu trên thế giới về vấn đề phát hiện thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu ngày càng nhiều [53], [73] Trên cổng thông tin của diễn đàn FHH, đã thiết lập một chuyên mục dành riêng cho vấn đề phát hiện chất giả mạo có trong các chế phẩm từ dược liệu Ở đây cũng đã xây dựng được một thư mục dữ liệu về các báo cáo phát hiện chất hóa dược trộn lẫn trong thuốc chứa dược liệu hay thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ dược liệu đã từng có mặt trên thị trường ở các nước châu Á (như

Singapore, Hồng Kông, …) Từ năm 2009 đến nay, bộ dữ liệu này cũng đã ghi nhận được 99 báo cáo

Các chế phẩm từ dược liệu có chứa nhiều chất hóa dược đa dạng, bao gồm glucocorticoid, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc giảm béo, thuốc lợi tiểu, thuốc ức chế PDE-5, thuốc giảm glucose máu, thuốc hạ huyết áp và thuốc kháng histamin Những chất hóa dược này không chỉ có trong thuốc dược liệu mà còn có mặt trong nhiều sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa dược liệu.

Nhận thấy nguy cơ tiềm ẩn và các tác động có hại từ việc làm gian dối này, nhiều qui định đã được đưa ra nhằm kiểm soát chất lượng và đảm bảo an toàn đối với việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu Trong “Hướng dẫn Xây dựng các yêu cầu thử nghiệm đối với thuốc từ dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe ” của nhóm làm việc về “Khoa học sức khỏe và qui định cho các sản phẩm liên quan đến sức khỏe” của FHH cũng đã có qui định về việc thử nghiệm phát hiện chất độc hại và các chất trộn trái phép [57] Đến nay, có khá nhiều nghiên cứu về phát hiện nhóm glucocorticoid, nhóm thuốc giảm đau chống viêm không streroid, nhóm thuốc giảm béo, thuốc ức chế PDE-5, nhóm giảm glucose máu trộn lẫn trong các sản phẩm từ dược liệu Trong khi đó, các nghiên cứu phát hiện các chất nhóm kháng histamin, nhóm điều trị tăng huyết áp còn ít được công bố Sau đây là một số nghiên cứu trên thế giới đối với 2 nhóm dược chất này

1.1.1 Nhóm thuốc điều trị tăng huyết áp

Tăng huyết áp là tình trạng tăng huyết áp tâm thu và/hoặc huyết áp tâm trương có hoặc không có nguyên nhân, đây là bệnh lý mạn tính, có nguy cơ cao gây ra nhiều biến chứng tim mạch như loạn nhịp tim, thiếu máu não, suy tim [5], [8] Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 1,13 tỷ người bị tăng huyết áp với tỷ lệ một trên bốn với nam giới và một trên năm với nữ giới [92] Trên thế giới cũng đã có một số nghiên cứu được tiến hành và phát hiện ra nhiều trường hợp trộn trái phép các chất hóa dược nhóm hạ huyết áp trong các chế phẩm chứa dược liệu như:

Lu Yaling và các cộng sự (2009) đã tiến hành phân tích 8 loại thuốc hóa dược

(Clonidin, dihydrochlorothiazid, triamteren, metoprolol, phentolamin, chlorthalidon, furosemid và valsartan) trộn bất hợp pháp trong thực phẩm bổ sung điều trị tăng huyết áp bằng phương pháp HPLC-MS [68]

Y.L Lu và cộng sự (2010) tiến hành nghiên cứu phân tích 18 dược chất được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp bao gồm thuốc lợi tiểu, thuốc chẹn kênh calci và thuốc ức chế men chuyển được trộn trong thực phẩm bổ sung và các loại thuốc truyền thống Trung Quốc bằng sắc ký khối phổ ion hóa điện tử (LC/ESI-MS) Tiến hành phân tích 35 mẫu thực phẩm bổ sung và các thuốc cổ truyền phát hiện 9 mẫu có chứa hydrochlorothiazid, 2 mẫu có chứa clonidin và 2 mẫu chứa triamteren [67]

Tại Brazil, Ana Paula Lanỗanova Moreira và cỏc cộng sự (2016) đó tiến hành nghiên cứu phân tích đồng thời 13 loại thuốc điều trị cao huyết áp bao gồm thuốc lợi tiểu, β-blockers, thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II và thuốc ức chế men chuyển angiotensin trong các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược bằng phương pháp UHPLC-

Bằng phương pháp ESI-MS/MS, phân tích 34 mẫu chế phẩm chứa dược liệu lưu hành tại Brazil đã phát hiện có 3 mẫu có chứa hydrochlorothiazid và 2 mẫu chứa furosemid [74].

Seok Heo và các cộng sự (2017) tiến hành phân tích đồng thời 35 chất hóa dược điều trị tăng huyết áp trong thực phẩm bổ sung bằng LC/MS/MS Thực hiện thử nghiệm trên 97 mẫu thực phẩm bổ sung thu thập trên thị trường Hàn Quốc bao gồm 15 mẫu dạng viên nén, 4 mẫu viên nang cứng, 18 mẫu nang mềm, 22 mẫu dạng bột, 19 mẫu viên hoàn và 19 mẫu dạng lỏng Không phát hiện mẫu nào có chứa 35 dược chất đã nghiên

Kesting J R và cộng sự (2010) khi phân tích viên nang mềm Gold Night một thuốc thảo dược của Trung Quốc dùng để điều trị cao huyết áp) bằng phương pháp LC–

HRMS: sử dụng cột ZORBAX Eclipse Plus (C18; 1,8 àm) 3,0 mm ì 50 mm và LC- MS-SPE/NMR: sử dụng cột Phenomenex Max-RP (C12; 4 àm) 4,6 mm ì 250 mm (với pha động là các chương trình gradient của hỗn hợp dung môi ACN - nước có chứa 0,1% acid formic) đã phát hiện ba chất amlodipin (1,3 mg), indapamin (1,3 mg), valsartan

(30,8 mg) trộn trái phép trong viên [61]

Zhu và các cộng sự (2014) nghiên cứu phát hiện nhanh 4 chất hóa dược điều trị tăng huyết áp trong thuốc y học cổ truyền của Trung Quốc: Nicardipin hydroclorid, doxazosin mesylat, propranolol hydroclorid, hydroclorothiazid bằng phương pháp TLC- SERS cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phỏt hiện khoảng 0,005 àg Kết quả phỏt hiện 2 trong số 10 thuốc y học cổ truyền dương tính với các chất nghiên cứu Trong đó 1 mẫu dương tính với doxazosin mesylat và 1 mẫu dương tính với cả hydroclorothiazid và propranolol [97]

Nghiên cứu của Heo S và các cộng sự (2016) xây dựng phương pháp xác định đồng thời 25 hợp chất chống tăng huyết áp trong thực phẩm bổ sung bằng phương pháp UPLC với hệ sắc ký pha đảo, chiết mẫu đơn giản bằng MeOH Phương pháp có LOD,

LOQ của mẫu rắn lần lượt là 0,20 - 1,00 àg/ml và 0,60 - 3,00 àg/ml, của mẫu lỏng lần lượt là 0,30 - 1,20 và 0,90 - 3,60 g/ml Độ đúng trong ngày và khác ngày lần lượt là

82,25% - 111,42% và 80,70% - 115,64% Phân tích 97 mẫu thực phẩm bổ sung trên thị trường phỏt hiện 2 mẫu cú chứa atenolol với hàm lượng từ 16,81 - 28,07 àg/g [59]

Tình hình chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu tại Việt Nam

Trong hệ thống y tế quốc gia, dược liệu Việt Nam đóng vai trò quan trọng và được nghiên cứu, phát triển, ứng dụng từ lâu Theo Quyết định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013, Nhà nước ưu tiên phát triển dược liệu thành hàng hóa đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu Quyết định số 376/QĐ-TTg ngày 17/03/2021 tiếp tục nhấn mạnh ưu tiên đầu tư nghiên cứu, sản xuất thuốc dược liệu chất lượng cao Bộ Y tế ban hành nhiều văn bản hướng dẫn đảm bảo chất lượng dược liệu và chế phẩm chứa dược liệu, như Thông tư 43/2014/TT-BYT Luật Dược 2016 dành riêng Chương IV với 8 điều quy định về dược liệu và thuốc cổ truyền sản xuất và lưu hành tại Việt Nam.

Các chế phẩm từ thảo dược gồm dược liệu, thuốc cổ truyền, TPBVSK và thuốc đông y do lương y kê đơn, được đăng ký và chịu quản lý bởi các cơ quan khác nhau

Dược liệu và thuốc cổ truyền được Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền cấp số đăng ký; thuốc từ dược liệu do Cục Quản lý Dược Việt Nam cấp số đăng ký, được sản xuất bởi các cơ sở sản xuất đạt tiêu chuẩn sản xuất tốt (GMP) hoặc tương đương, sản phẩm được kiểm tra chất lượng từng lô và chỉ được bán tại các nhà thuốc TPBVSK do Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm cấp số công bố và quản lý, cơ sở sản xuất phải đạt GMP đối với cơ sở sản xuất TPBVSK, sản phẩm được bán qua nhiều kênh khác nhau như kênh kinh doanh truyền thống tại nhà thuốc, cửa hàng bán sản phẩm chăm sóc sức khỏe, hệ thống kinh doanh đa cấp; qua mạng internet Thuốc đông y do lương y kê đơn được bán ngay tại phòng khám và không có hệ thống kiểm soát chất lượng Tỷ lệ thuốc từ dược liệu, thuốc cổ truyền được lưu hành trên thị trường Việt Nam chiếm khoảng 20%, phần còn lại chủ yếu là TPBVSK, dược liệu, thuốc đông y theo đơn của lương y chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ

Số lượng các chế phẩm từ dược liệu tại Việt Nam đã tăng mạnh trong những năm gần đây, nhất là TPBVSK Nếu năm 2005, trên cả nước mới chỉ có 143 cơ sở kinh doanh TPBVSK với 300 sản phẩm chủ yếu là nhập khẩu thì tới năm 2015 đã tăng vọt lên với số lượng trên 1600 cơ sở kinh doanh và trên 5000 sản phẩm, mà trong đó, hai phần ba là sản phẩm trong nước do chính Việt Nam sản xuất Sự tăng trưởng này cũng phản ánh xu thế chung trên thế giới về chăm sóc sức khỏe

Ngày nay, thị trường dược liệu đa dạng, phức tạp do nhiều thành phần khác nhau và kiểm soát khó khăn vì được bán qua nhiều kênh như hiệu thuốc, cửa hàng chăm sóc sức khỏe, internet, siêu thị Điều này làm gia tăng nguy cơ làm giả sản phẩm, gây hậu quả khó lường khi sử dụng.

Cao Công Khánh và các cộng sự (2013) đã xây dựng qui trình xác định đồng thời sibutramin, furosemid, dexamethason và piroxicam trong thực phẩm chức năng dùng để giảm cân, hỗ trợ điều trị các bệnh về xương, khớp, gout bằng kỹ thuật HPLC detector UV 225 nm Nghiờn cứu sử dụng cột Waters Symmetry C18 (250 mm ì 4,6 mm, 5 àm), pha động là dung dịch đệm acetat (pH 3,5) - MeOH Qui trình xây dựng có khoảng tuyến tớnh 0,5 àg/mL - 50 àg/mL với furosemid, LOD và LOQ khoảng 0,1 mg/100 g và 0,4 mg/100 g, độ thu hồi từ 98,4% -102,7% cho tất cả các chất phân tích [17]

Năm 2012, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã kiểm tra mẫu ‘Thuốc bổ Tỳ’ của cơ sở Phước Lợi Đường tại Đà Nẵng với công dụng kích thích ngon miệng đã phát hiện có trộn dexamethason và cyproheptadin [40]

Năm 2017, Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện cơ sở đông y Nhơn Tâm Tế (quận 12) lưu giữ và bày bán nhiều chế phẩm chứa dược liệu điều trị biếng ăn cho trẻ em, kết quả kiểm nghiệm cho thấy có chứa corticoid và cyproheptadin [39] Để tăng cường kiểm soát mối nguy hại từ các hoạt động bất hợp pháp này, ngày 30/06/2021, Bộ Y tế đã ban hành thông tư Số 10/2021/TT-BYT qui định về Danh mục 80 chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe [12] Các chất có trong danh mục này hầu hết đều là các chất/nhóm chất đã từng được công bố phát hiện được trong các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu từ khắp các khu vực trên thế giới

Như vậy, có thể thấy tình hình chế phẩm có thành phần dược liệu bị trộn trái phép các chất hóa dược thuộc nhiều nhóm thuốc có tác dụng dược lý khác nhau ở mức độ báo động trên phạm vi toàn cầu Một số quốc gia đã có các nghiên cứu độc lập thu thập mẫu và đánh giá thực trạng một cách tổng quát Còn ở Việt Nam, các mẫu phát hiện có trộn tân dược trong chế phẩm đông dược chủ yếu là do thanh tra lấy mẫu của cơ quan quản lý nên kết quả thu được mang tính chất sự vụ, lẻ tẻ chưa phản ánh đúng tình hình thực tiễn

Tuy nhiên, các nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin, đặc biệt là các thuốc nhóm kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm từ dược liệu cho đến nay vẫn còn hạn chế Nhóm thuốc hóa dược điều trị tăng huyết áp trộn trái phép vào các chế phẩm từ dược liệu đã được một số nước nghiên cứu, nhưng ở Việt Nam vẫn có rất ít các công bố, chủ yếu là các nghiên cứu về nhóm thuốc liên quan là nhóm lợi niệu

Dựa trên thông tin về các dược chất kháng histamin và điều trị tăng huyết áp trộn trái phép đã từng được phát hiện trên thế giới và danh mục các chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh TPBVSK theo thông tư Số 10/2021/TT-BYT, nghiên cứu này được thực hiện sẽ mở rộng đối tượng nghiên cứu trên các dược chất nhóm kháng histamin H1 và điều trị tăng huyết áp Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng được một bộ công cụ dùng để phát hiện một số dược chất thông dụng thuộc nhóm kháng histamin và nhóm điều trị tăng huyết áp bằng nhóm phương pháp sắc ký từ đơn giản là HPTLC, đến phương pháp thường qui HPLC và cuối cùng là phương pháp hiện đại có độ đặc hiệu, độ nhạy, độ chính xác cao LC-MS/MS.

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

Trong các chế phẩm từ dược liệu, thuốc kháng histamin H1 và thuốc điều trị tăng huyết áp là hai nhóm thuốc dễ bị pha trộn trái phép Nghiên cứu lựa chọn các dược chất này vì chúng thường được chỉ định ban đầu trong phác đồ điều trị dị ứng và tăng huyết áp Các dược chất này phổ biến, giá rẻ, dễ mua, và có tỷ lệ pha trộn cao trong chế phẩm dược liệu dựa trên liều điều trị.

Ngoài ra, tiêu chuẩn chất lượng của các dược chất được lựa chọn trong nghiên cứu này đều đã được đưa vào trong các Dược điển Dựa vào các đặc tính lý hóa của chúng, việc áp dụng các phương pháp TLC, HPLC hay LC-MS/MS để phân tích là hoàn toàn phù hợp

1.3.1 Nhóm điều trị tăng huyết áp

Giới thiệu sơ lược về bệnh tăng huyết áp và các thuốc điều trị

Tăng huyết áp là một bệnh lý trong đó trị số huyết áp lúc nghỉ cao hơn mức bình thường: Huyết áp tâm thu ≥ 140 mmHg và/hoặc huyết áp tâm trương ≥ 90 mmHg

Tăng huyết áp là một trong những nguyên nhân gây tử vong sớm ở bệnh nhân tim mạch [14] Trên thế giới, tỷ lệ người mắc tăng huyết áp trung bình là gần 20% (theo WHO) và tỷ lệ này tăng dần theo độ tuổi Tại Việt Nam, ước tính đến năm 2025 sẽ có gần 10 triệu người bị tăng huyết áp

Các nhóm thuốc thường dùng để điều trị tăng huyết áp hiện nay:

+ Nhóm thuốc lợi tiểu: Hydroclorothiazid, furosemid… Dùng đơn độc khi bị cao huyết áp nhẹ, dùng phối hợp với thuốc khác khi bệnh cao huyếp áp nặng thêm

Nhóm thuốc chẹn kênh calci, tiêu biểu là amlodipin, felodipin, nifedipin, là lựa chọn thích hợp cho bệnh nhân cao tuổi và những người mắc bệnh đau thắt ngực Chúng vẫn hiệu quả trong điều trị tăng huyết áp mà không gây ảnh hưởng đến chuyển hóa đường và mỡ trong cơ thể.

+ Nhóm thuốc tác động lên thần kinh trung ương: Reserpin, methyldopa, clonidin… Hiện nay ít dùng do tác dụng phụ gây trầm cảm, khi ngừng thuốc đột ngột sẽ làm tăng vọt huyết áp

+ Nhóm thuốc chẹn beta (tác dụng trên hệ giao cảm): Atenolol, propranolol…

Chống chỉ định đối với người có kèm hen suyễn, suy tim, nhịp tim chậm

+ Nhóm thuốc ức chế men chuyển: Captopril, enalapril, lisinopril… Là thuốc được chọn khi người bị kèm hen suyễn (chống chỉ định với chẹn beta), đái tháo đường (lợi tiểu, chẹn beta)

+ Nhóm thuốc đối kháng thụ thể angiotensin II: Losartan, irbesartan, valsartan

Chống chỉ định của thuốc là không dùng cho phụ nữ có thai hoặc người bị dị ứng với thuốc

Ngoài ra, để hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu cũng có thể được các bệnh nhân sử dụng

Bằng cách đánh giá nguy cơ, 4 dược chất dùng trong điều trị cao huyết áp được lựa chọn cho nghiên cứu này bao gồm: Furosemid, amlodipin, felodipin và nifedipin

Bốn dược chất này được đánh giá là những chất dễ bị sử dụng trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu Trong đó, furosemid là chất đã có trong danh mục chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh TPBVSK và cũng là chất được phát hiện bị trộn trái phép trong nhiều nghiên cứu; nhóm đối kháng calci là nhóm được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, nhất là đối với người cao tuổi do các đặc tính đã nêu trên

Cấu trúc, đặc tính vật lý/hóa học và liều dùng của các chất được lựa chọn để nghiên cứu

Cấu trúc, đặc tính hóa lý và liều dùng của 4 dược chất xem ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Cấu trúc, đặc tính hóa lý và liều dùng của các dược chất điều trị tăng HA

Công thức hóa học, cấu trúc hóa học Đặc tính hóa lý và liều dùng

Tính tan: Dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol khan, khó tan trong nước và 2-propanol [7]

Liều dùng: 5-10 mg/lần, ngày uống 1

Tính tan: Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, trong ethanol khan, trong methanol và trong methylen clorid [7]

Liều dùng: 2,5-10 mg/lần, ngày uống

Tính tan: Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol, methanol [7]

Liều dùng: 10 mg/lần, ngày uống 3 lần [7], [8]

Tính tan: Tan trong aceton và methanol, hơi tan trong ethanol 96 %, khó tan trong nước, acetonitril và cloroform Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng [7], [43]

Liều dùng: 20 mg - 40 mg / lần ngày uống 2 lần [7], [8]

Tác dụng không mong muốn

Thường gặp là phù cổ chân từ nhẹ đến trung bình (phù ngoại vi như sưng mắt cá chân, bàn chân, cẳng chân, do dịch thấm từ khoang mạch vào mô liên quan đến giãn tiểu động mạch tiền mao mạch), nhức đầu, chóng mặt, choáng váng, buồn nôn, mệt mỏi đỏ bừng mặt hoặc cảm giác nóng bừng, phù mạch, nhịp nhanh và có cảm giác nóng, mệt mỏi, suy nhược; Huyết áp thấp, rối loạn nhịp tim Khô miệng, phát ban da, táo bón hoặc tiêu chảy Bệnh trào ngược dạ dày thực quản (GERD) [6], [8], [14]

Tác dụng phụ gây phù mạch tuy hiếm gặp nhưng rất nguy hiểm, sau vài phút tới vài giờ dùng thuốc bệnh nhân có thể thấy sưng môi, lưỡi, họng dẫn đến khó thở Đây là những triệu chứng cấp cứu và đòi hỏi phải ngừng sử dụng thuốc.

1.3.2 Nhóm kháng histamin H1 Giới thiệu sơ lược về bệnh dị ứng và các thuốc kháng histamin H1

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, dị ứng là một rối loạn quá mẫn của hệ miễn dịch

Phản ứng dị ứng xảy ra để chống lại các chất vô hại trong môi trường được gọi là chất gây dị ứng (phấn hoa, lông thú cưng hoặc một số loại thực phẩm…), các phản ứng này xảy ra nhanh chóng và có thể dự đoán được

Bệnh lý dị ứng hiện nay được Tổ chức Y Tế Thế Giới xếp vào loại bệnh mãn tính Bệnh có độ lưu hành tăng gấp đôi mỗi 15 năm và nhất là hiện nay đang tăng cao trên toàn thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam Có nhiều giả thuyết giải thích tại sao bệnh dị ứng ngày càng gia tăng, nhất là bệnh dị ứng đường hô hấp và dị ứng môi trường bao gồm giả thuyết về vệ sinh môi trương sống, cũng như các mùa dị ứng kéo dài hơn do biến đổi khí hậu toàn cầu

Dị ứng nhẹ xảy ra khá phổ biến, thường gây ra các triệu chứng như viêm kết mạc dị ứng, ngứa và chảy nước mũi Đôi khi có thể dẫn đến một phản ứng viêm nặng như chàm, phát ban, sốt, lên cơn hen suyễn … thậm chí là sốc phản vệ 1 Để điều trị dị ứng, ngoài tránh tiếp xúc với các tác nhân gây dị ứng hoặc dùng liệu pháp miễn dịch, còn có thể sử dụng các thuốc hóa dược chống dị ứng như:

- Nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1

- hoặc có thể dùng các chế phẩm từ dược liệu

Trong đó, thuốc kháng histamin H1 thường là lựa chọn đầu tay với 2 nhóm chính là thuốc thế hệ 1 và thuốc thế hệ 2 Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 có thể gây buồn ngủ bao gồm: Clorpheniramin, promethazin… Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 2 ít gây buồn ngủ hơn như: Cetirizin, loratadin… Tuy nhiên, tác dụng của các thuốc kháng histamin chủ yếu là điều trị triệu chứng, không phải điều trị căn nguyên

Cũng dựa trên đánh giá nguy cơ, 5 dược chất kháng histamin H1 thường dùng trong điều trị dị ứng được lựa chọn cho nghiên cứu này bao gồm: Cinarizin, clorpheniramin, cyproheptadin, loratadin và promethazin Năm dược chất này được đánh giá là những chất dễ bị sử dụng trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu

Tổng quan về phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu

1.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật đã được phát triển từ lâu, cho phép tách được hỗn hợp nhiều cấu tử với lượng phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh (có thể phân tích hàng loạt mẫu) Chính vì vậy mà hiện nay TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ khác nhau

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một công cụ tiên tiến hơn của sắc ký lớp mỏng (TLC) HPTLC có thể được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển sắc ký, nhận diện vết sắc ký được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích

Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy scan và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [42]

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản mỏng này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100 àm so với khoảng 250 àm của bản mỏng TLC) với bột mịn cú kớch thước hạt 5 àm độ đồng đều cao hơn (kớch thước hạt nhỏ và đồng đều như hạt pha tĩnh C8 hay C18 của HPLC) Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời

Phương pháp HPTLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như hóa thực vật, y sinh, kiểm soát chất lượng chế phẩm thảo dược và thực phẩm chức năng Ưu điểm của phương pháp này là khả năng phân tích đồng thời nhiều mẫu trong thời gian ngắn, đảm bảo độ tin cậy và chính xác Do đó, HPTLC được ứng dụng hiệu quả trong việc sàng lọc mẫu, bán định lượng, chuẩn bị cho các phương pháp định lượng hiện đại hơn.

* Ưu, nhược điểm của HPTLC

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng, do bộ phận scanner có thể ghi lại phổ hấp thụ của chất, nên định tính đặc hiệu hơn so với TLC thông thường, định lượng chính xác hơn so với chụp ảnh và đo mật độ màu của vết

Sắc ký là kỹ thuật phân tích mạnh mẽ trong phòng thí nghiệm nhờ khả năng xử lý số lượng mẫu lớn cùng lúc Điều này giúp tiết kiệm đáng kể thời gian và chi phí so với các phương pháp phân tích khác Chi phí cho mỗi lần phân tích sắc ký cũng khá thấp, khiến kỹ thuật này trở thành lựa chọn hiệu quả cho các ứng dụng phân tích.

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước như lọc và khử khí, lượng dung môi pha động tiêu thụ cho mỗi mẫu thấp

- Về mặt kỹ thuật, rất đơn giản để tìm hiểu và vận hành

- Pha tĩnh có độ chọn lọc cao để tách các thành phần trong hỗn hợp nhiều chất [88]

- Hiện nay để tăng độ tin cậy của kết quả phân tích, có thể sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân giả được tăng cường do vết sắc ký nhỏ hơn, thời gian sắc ký ngắn hơn [1]

Nền mẫu từ dược liệu rất phức tạp, thành phần đa dạng, các thành phần trong dược liệu có thể xuất hiện tại vị trí phát hiện chất phân tích nên có thể xảy ra hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả khi phương pháp không đáp ứng về độ nhạy [88]

* Ứng dụng của TLC để phát hiện chất hóa dược trộn lẫn trong chế phẩm từ dược liệu

TLC là một kỹ thuật phân tích tiên tiến, có ứng dụng tích cực trong phân tích định tính và định lượng một loạt các hợp chất, đặc biệt là với các dược liệu, thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ dược liệu [76], [88]

Phương pháp HPTLC cũng có khả năng định tính và định lượng các chất hóa dược trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu với độ nhạy và độ lặp lại cao hơn

Theo công bố trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật TLC để phát hiện các chất hóa dược trộn lẫn trong chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu [25], [26], [27], [28], [29], [31], [33], [36], [71], [72] Trong đó, cũng đã có một vài nghiên cứu phát hiện nhóm chất hóa dược điều trị cao huyết áp, kháng histamin trộn lẫn trong chế phẩm từ dược liệu, xem Bảng 1.3

Bảng 1.3 Các nghiên cứu phát hiện chất hóa dược trộn lẫn trong chế phẩm từ dược liệu bằng phương pháp TLC

Hoạt chất và mẫu thử

Nền mẫu Phương pháp phân tích Tài liệu

Nicardipin hydrochlorid, doxazosin mesylat, propranolol hydrochlorid, hydrochlorothiazid

Thuốc từ dược liệu (ở Trung Quốc)

TLC- SERS LOD từ 0,005 àg/mL

- Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60F254

- Pha động: Chloroform - methanol - acid acetic băng - amoniac (9,5 : 0,5 : 0,1 : 0,1) (tt/tt/tt/tt)

- Thể tớch chấm: 10 àl dung dịch 100 àg/mL

(Tương quan tuyến tính thu được trong khoảng 0,2-2 và 0,4-1,6 àg/ dải chấm lần lượt đối với dimenhydrinat và cinnarizin)

- Phát hiện ở bước sóng: 235 nm

Cyproheptadin hydrochlorid, Loratadin, Promethazin hydroclorid

Chế phẩm từ dược liệu

- Pha tĩnh: Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F254 Pha động: Cyclohexan - aceton - triethylamin (8:

2: 0,5) (tt/tt/tt) - Thể tớch chấm: 5 àL - Phát hiện ở bước sóng 254 nm - Dung môi chiết: Methanol

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao [4]

Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào yếu tố đó

Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải ra chất phân tích với thời gian hợp lý [1]

Tổng quan về nền mẫu nghiên cứu

1.5.1 Dược liệu và chế phẩm từ dược liệu dùng trong điều trị và hỗ trợ điều trị tăng huyết áp

Theo Y học cổ truyền, tăng huyết áp thuộc phạm vi của các chứng: Huyễn vựng, đầu thống, thất miên và do nhiều nguyên nhân gây ra Có thể ví dụ như: Do can dươngvượng hoặc do tình chí không thư thái, uất ức lâu ngày khiến can dương thăng động gây nhiễu lên trên làm cho hoa mắt chóng mặt, choáng đầu, ù tai…; Do lao động nặng nhọc lâu ngày hoặc do tuổi cao sức yếu làm tổn thương các cơ quan trong cơ thể

Thận âm hư, không nuôi dưỡng được can mộc làm suy yếu cả hai, dẫn đến can thận âm hư Khi đó, can dương sẽ bốc lên gây chóng mặt, đau đầu, hay quên Thêm vào đó, ăn nhiều đồ béo, hại tỳ vị, khiến thức ăn không chuyển hóa thành tân dịch mà thành đàm thấp, làm thanh dương không thăng, trọc âm không giáng gây huyễn vựng, khiến đầu choáng váng.

Với mỗi thể lâm sàng, tùy từng tình trạng bệnh lý của người bệnh và tùy từng nguyên nhân gây ra cao huyết áp, có những bài thuốc và sử dụng các dược liệu điều trị gia giảm khác nhau như khi tinh thần căng thẳng, lo âu, cáu ngắt, tức giận (Âm hư dương xung) sử dụng bài thuốc thiên ma câu đằng ẩm; khi mắc chứng thiên về âm hư có lục vị qui thược; thiên về dương xung can hỏa thịnh có long đởm tả can thanh Can thận âm hư có kỷ cúc địa hoàng thang, can thận dương hư dùng lục vị địa hoàng thanh gia giảm, thể tâm tỳ hư điều trị theo bài qui tỳ thang gia giảm… [16]

Trong bài thuốc điều trị cao huyết áp, các dược liệu Hòe hoa, Cúc hoa, Câu đằng, Ba gạc, Nhàu thường được lựa chọn sử dụng Chúng có thể được dùng riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau để tạo thành bài thuốc có hiệu quả cao hơn.

- Các dược liệu được sử dụng để đem lại tác dụng lợi tiểu như râu ngô, mã đề, trạch tả, bạch phục linh… Các dược liệu này thường được sử dụng phối hợp trong các bài thuốc, chế phẩm từ dược liệu để hỗ trợ điều trị cao huyết áp

- Hiện nay trên thị trường có rất nhiều sản phẩm từ dược liệu dùng trong điều trị và hỗ trợ điều trị cao huyết áp Sau đây là một số chế phẩm từ dược liệu có chỉ định hỗ trợ điều trị cao huyết áp đang được lưu hành trên thị trường:

Bảng 1.6 Một số chế phẩm chứa dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị tăng huyết áp trên thị trường

STT Tên sản phẩm Thành phần Nhà sản xuất, số đăng ký Liều dùng

1 Viên nang cứng Hạ áp ích nhân Địa long, nattokinase, hòe hòa, huyền sâm, câu đằng, hạ khô thảo

CT Nam Dược 1464/2014/ATTP- XNCB

2 Viên nén Định áp vương

Cao lá dâu tằm, cao cần tây, cao tỏi, cao hoàng bá,

3 Cốm Dưỡng huyết thanh não PQA

Dạ giao đằng, câu đằng, thiên ma, ích mẫu, phục linh, đỗ trọng, thạch quyết minh, hoàng cầm, ngưu tất, tang ký sinh

CT TNHH tư vấn y dược Quốc Tế

5 Viên nén Hạ hồi đơn

Táo nhân, đỗ trọng, câu đằng, ngưu tất, hạ khô thảo, bạch thược, đảng sâm, sinh địa, linh chi

Công ty CP Dược VTYT Hải phòng

6 Viên nang Thanh áp đan

Cao xa tiền thảo, hòe hoa, ngọc mễ tu, hạ khô thảo, tinh lá sen

Công ty TNHH IPHA công nghệ

7 Viên hoàn Ích áp cao

Cao giảo cổ lam, cao vương tôn

Công ty TNHH thảo dược Kiên Minh 29530/2017/ATTP- XNCB

8 Viên hoàn Hạ áp đan Medi Happy

Ba gạc, Ba kích, Cúc hoa, Hòe hoa, ALA, L-arginin,

Công ty trách nhiệm hữu hạn Medistar Việt Nam

9 Viên hoàn Hoàn lục vị bổ thận âm

Thục địa, sơn thù, trạch tả, hoài sơn, phục linh, đơn bì

10 Viên hoàn Tư âm bổ thận hoàn

Thục địa, sơn thù, trạch tả, hoài sơn, phục linh, đơn bì, mạch môn, thạch hộc, đỗ trọng, ngưu tất

Viên hoàn mềm 2 viên/lần

11 Viên nang mềm Hạ huyết áp PV

Hoàng cầm, hạ khô thảo, hoa hòe, ngưu tất, đương qui, sinh địa, đan sâm, câu đằng, thảo quyết minh, địa long, trân châu

1.5.2 Dược liệu và chế phẩm từ dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều các chế phẩm từ dược liệu đã được cấp số đăng ký lưu hành, có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa Các kinh giới, bồ công anh, ngưu bàng tử, cúc hoa …) cũng như dạng bào chế (viên hoàn, thuốc bột, viên nang, cốm tan)

“Danh mục thuốc cổ truyền, vị thuốc cổ truyền, thuốc dược liệu thiết yếu” được ban hành kèm theo Thông tư số 19/2018/TT-BYT, ký ngày ngày 30 tháng 8 năm 2018 của Bộ trưởng Bộ Y tế (Thông tư “Ban hành Danh mục thuốc thiết yếu”) và “Danh mục thuốc đông y, thuốc từ dược liệu và vị thuốc y học cổ truyền” ban hành kèm theo Văn bản hợp nhất số 13/VBHN-BYT, ký ngày 15/10/2021 (Thông tư “Ban hành Danh mục thuốc đông y, thuốc từ dược liệu và vị thuốc y học cổ truyền thuộc phạm vi thanh toán của quỹ bảo hiểm y tế”) đều bao gồm nhiều dược liệu có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa [9], [10], [21] Dưới đây là một số dược liệu thông dụng có trong danh mục:

Bảng 1.7 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng

TT Dược liệu Bộ phận dùng TT Dược liệu Bộ phận dùng

1 Bạc hà Toàn cây 9 Kim ngân hoa Hoa

2 Bồ công anh Toàn cây 10 Liên kiều Quả chín

3 Cúc hoa Hoa 11 Ngưu bàng tử Quả chín

4 Đạm đậu xị Hạt 12 Phòng phong Rễ

5 Đơn lá đỏ Lá 13 Sài đất Toàn cây

6 Hoàng bá Vỏ thân 14 Thổ phục linh Thân rễ 7 Kinh giới Phần trên mặt đất 15 Thuyền thoái Xác của con ve sầu

8 Ké đầu ngựa Quả 16 Xuyên khung Thân rễ

Dược điển Việt Nam V [7] cũng đã đưa vào 2 chuyên luận thuốc cổ truyền có công dụng giải độc, điều trị dị ứng và/hoặc mẩn ngứa là Hoàn Ngân kiều giải độc và Hoàn Nhị trần Trong đó:

Thành phần Hoàn Ngân kiều giải độc gồm - Kim ngân hoa 200 g

- Đạm đậu xị (Đỗ đen chế) 100 g - Ngưu bàng tử sao 120 g

Thành phần Hoàn Nhị trần gồm

Bảng 1.8 Một số chế phẩm chứa dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng lưu hành trên thị trường

STT Tên chế phẩm Thành phần Dạng bào chế

1 Ngân kiều giải độc Favomin

Cao đặc qui về khan (tương ứng với Kim ngân hoa 267 mg; Liên kiều 267 mg; Bạc hà 160 mg; Kinh giới 107 mg; Đạm đậu xị 133 mg; Ngưu bàng tử 160 mg; Cát cánh 160 mg; Đạm trúc diệp 107 mg;

Thanh nhiệt giải độc SXH

Mỗi gói 5,5 g chứa cao khô dược liệu (tương ứng: Tang diệp 4 g; Cúc hoa 4 g;

Kim ngân hoa 4 g; Liên kiều 4 g; Bạc hà 2 g; Cát cánh 2 g; Mạch môn 2,7 g;

Hoàng cầm 2,7 g; Quả dành dành 2,7 g)

Công ty Cổ phần BV Pharma

3 Thuốc bột giải nhiệt tiêu ban tán

Mỗi gói 1 g chứa: Bạch chỉ 0,15g; Phòng phong 0,15 g; Cát căn 0,15 g; Sài hồ 0,10 g; Kim ngân hoa 0,10g; Liên kiều 0,10 g;

Ma hoàng 0,10 g; Tô diệp 0,05 g; Bạc hà 0,05 g; Cam thảo 0,05 g

Bảo bảo nhiệt độc thanh

Cao khô dược liệu (12:1) 0,25 g (tương đương với: Bồ công anh 0,5 g; Kim ngân hoa 0,5 g; Sài đất 0,5 g; Thổ phục linh 0,5 g; Ké đầu ngựa 0,4 g; Hạ khô thảo 0,5 g; Huyền sâm 0,1 g)

Danh mục các dược liệu trong chế phẩm và thành phần công thức của chế phẩm này là cơ sở để lựa chọn hợp lý, xây dựng hệ thống nền mẫu sử dụng trong nghiên cứu.

* Với nội dung tổng quan đã nêu, có thể thấy rằng:

+ Việc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng các kỹ thuật phân tích với độ nhậy cao, tiến hành nhanh chóng, thuận tiện để phát hiện các dược chất nhóm kháng histamin và nhóm điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong các chế phẩm chứa dược liệu, đặc biệt là đối với các sản phẩm không rõ nguồn gốc, xuất xứ là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn lớn

+ Các nghiên đã công bố thường chỉ sử dụng một kỹ thuật phân tích như TLC, HPLC hoặc LC-MS/MS và xây dựng dựa trên nền mẫu của 1 sản phẩm cụ thể, chưa thể hiện được tính đại diện cao cho nhiều loại sản phẩm chứa dược liệu Hầu hết các nghiên cứu phân tích đồng thời nhiều dược chất điều trị tăng huyết áp hay kháng histamin đã công bố đều là các nghiên cứu của các nhà khoa học quốc tế, sử dụng các phương pháp sắc ký với kỹ thuật phân tích hiện đại như Q-TOF, LC-MS/MS

+ Có thể thấy, không có kỹ thuật riêng lẻ nào có khả năng xử lý tất cả các chất cần phân tích, sự kết hợp của các phương pháp phân tích sẽ làm tăng thêm tính chắc chắn cho kết quả phân tích và tăng khả năng áp dụng trong thực tiễn Từ đó định hướng nghiên cứu được xác định là xây dựng và phát triển một hệ thống các phương pháp từ sàng lọc nhanh bằng phương pháp đơn giản (TLC) đến định lượng các chất phát hiện được bằng phương pháp chính xác hơn sau khi đã được sàng lọc (HPLC ; LC-MS/MS)

+ Các chất nghiên cứu bao gồm 4 dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp (Amlodipin, Felodipin, Furosemid, Nifedipin) và 5 dược chất nhóm kháng histamin (Cinarizin, Clorpheniramin, Cyproheptadin, Loratadin, Promethazin) Các chất này được lựa chọn dựa vào đánh giá nguy cơ dễ bị sử dụng để trộn trái phép vào sản phẩm chứa dược liệu với đặc điểm là thông dụng, dễ kiếm, giá thành rẻ và từng được phát hiện có mặt trong một số sản phẩm chứa dược liệu theo các nghiên cứu đã công bố trên thế giới

NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, trang thiết bị

Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc

1 Cinarizin Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTHCM Hàm lượng: 99,7% (nguyên trạng) SKS: QT082060916

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTHCM Hàm lượng: 100,34% (nguyên trạng) SKS: QT145090516

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,75% (nguyên trạng) SKS: 0209032

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 100,64%, độ ẩm 7,6%

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,30%, độ ẩm 0,06%

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,51% (nguyên trạng), độ ẩm 0,07%; SKS: 0103128

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,24% (khan), độ ẩm 0,02%; SKS: 0108242

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,68% (nguyên trạng) SKS: C0319200.03

Chuẩn đối chiếu thứ cấp

Chuẩn VKNTTW Hàm lượng: 99,65% (khan), độ ẩm 0,13%; SKS : 0204085

- Các dược liệu bào chế nền mẫu gồm: Liên kiều, bạc hà, bạch thược, cam thảo, cát cánh, chi tử, đạm đậu xị, đan bì, huyền sâm, khương hoạt, kim ngân hoa, kinh giới, ngưu bàng tử, phòng phong, ké đầu ngựa, sài hồ, thăng ma, xuyên khung, hoài sơn, mẫu đơn bì, thục địa, sơn thù du, trạch tả, bạch linh, râu ngô, hạ khô thảo, rễ nhàu, thục địa, cúc hoa, mã đề, hoa hòe, ngưu tất, đỗ trọng, táo nhân Các dược liệu được mua nhượng lại của Công ty Dược phẩm Tâm Bình và được kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển

- Dung môi, hóa chất: Methanol, acetonitril, acid formic loại dùng cho HPLC và

LC-MS (Merck) Dung môi hữu cơ khác như n-hexan, ethyl acetat, acid acetic, cloroform, n-butyl acetat, amoniac sử dụng loại tinh khiết phân tích (Prolabo, Baker;

- Các tá dược thường dùng trong bào chế viên nén, viên nang cứng: Bột talc, magnesi stearat, cellulose vi tinh thể, tinh bột, sorbitol 50%, glycerin, propylen glycol, gôm xanthan đạt tiêu chuẩn dược dụng; nguồn do công ty cổ phần dược phẩm Traphaco cung cấp

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Agilent 6460 Triple Quad LC-MS/MS, Mỹ

- Hệ thống HPLC Shimazu 20AD với detector UV-PDA, Nhật

- Hệ thống HPLC Waters Alliance e2695 detector PDA, Mỹ

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thuỵ Sỹ): Bộ phận chấm bán tự động; Bộ phận khai triển tự động; Máy chụp ảnh Phần mềm điều khiển winCATS và phần mềm video Scan của Camag: quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc ký, xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính

- Bản mỏng TLC và HPTLC Silica gel 60 F254 của Merck – Đức

- Cân phân tích Mettler – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg)

- Cân phân tích Mettler – Toledo XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg)

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 – Ý

- Máy lọc hút chân không

- Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức

- Máy siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc

- Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức

- Các dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, pipet, micropipet, mao quản, ống ly tâm,…

Các trang thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm là của Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương, Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia Đây đều là các phòng thí nghiệm đạt chuẩn mực ISO/IEC 17025 và/hoặc GLP.

Đối tượng nghiên cứu

Các chế phẩm từ dược liệu (bao gồm thuốc dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe) được sử dụng phổ biến để điều trị các bệnh lý như tăng huyết áp, lợi tiểu, cảm cúm, dị ứng và mẩn ngứa Những chế phẩm này được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau và được bán tại các nhà thuốc, trên internet, hoặc do lương y cung cấp Danh sách các mẫu thử đã được sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong Phụ lục 4.

+ 2 nền mẫu chuẩn bị từ các dược liệu có tác dụng điều trị/hỗ trợ điều trị tăng huyết áp dạng rắn (mẫu nền HA.N1) và dạng lỏng (mẫu nền HA.N2)

+ 2 nền mẫu chuẩn bị từ các dược liệu có tác dụng điều trị cảm cúm, dị ứng, mẩn ngứa dạng rắn (mẫu nền N1 hoặc DU.N1) và dạng lỏng (mẫu nền N2 hoặc DU.N2)

Mẫu nền có thêm các chất chuẩn nghiên cứu với tỉ lệ nhất định.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng và bào chế nền mẫu 2.3.1.1 Phương pháp xây dựng công thức nền mẫu

Thành phần nền mẫu cho các chế phẩm từ dược liệu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, “Danh mục thuốc cổ truyền, vị thuốc cổ truyền, thuốc dược liệu thiết yếu” được ban hành kèm theo Thông tư số 19/2018/TT-BYT và “Danh mục thuốc đông y, thuốc từ dược liệu và vị thuốc y học cổ truyền” ban hành kèm theo Văn bản hợp nhất số 13/VBHN-BYT; các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu đã công bố và các chế phẩm từ dược liệu có thị phần lớn đang lưu hành trên thị trường

2.3.1.2 Phương pháp bào chế nền mẫu

Các dược liệu trong mỗi công thức thành phần nền mẫu được bào chế thành dạng cao lỏng (Nền dạng lỏng: Mẫu nền N2) và cao khô (Nền dạng rắn: Mẫu nền N1) theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V: Chiết dược liệu bằng phương pháp sắc với nước

Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết trên cách thủy cho tới khi 1 ml cao tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc: Thu được cao lỏng;

Dịch chiết được tiếp tục cô đặc và sấy khô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60°C:

Các tá dược được cân hoặc đong theo tỷ lệ trong công thức thành phần, trộn đều

2.3.2 Xây dựng qui trình định tính bằng HPTLC 2.3.2.1 Chuẩn bị các dung dịch

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc đơn 1 mg/mL, tiến hành cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất chuẩn CIN, CLO, CYP, LOR, PRO, AML, FEL, FUR, NIF rồi cho vào bình định mức 10,0 mL Sau đó, hòa tan và định mức vừa đủ 10,0 mL bằng methanol.

- Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp các chất nhóm kháng histamin 1 mg/mL: Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chuẩn CIN, CLO, CYP, LOR, PRO vào 1 bình định mức 10,0 mL, hòa tan và định mức vừa đủ 10,0 mL bằng methanol

- Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp các chất nhóm điều trị tăng huyết áp 1 mg/mL:

Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chuẩn AML, FEL, FUR, NIF vào 1 bình định mức 10,0 mL, hòa tan và định mức vừa đủ 10,0 mL bằng methanol

- Dung dịch chuẩn đơn (0,1 mg/mL): Lấy chính xác 1,0 mL mỗi dung dịch chuẩn gốc đơn cho vào các bình định mức 10,0 mL riêng biệt, thêm methanol vừa đủ thể tích

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,1 mg/mL: Lấy chính xác 1,0 mL dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp, cho vào bình định mức 10,0 mL, thêm methanol vừa đủ thể tích

2.3.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích bằng HPTLC

* Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký Đối với các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp:

Dựa vào các nghiên cứu đã công bố [48], [49], [70], [79] tiến hành khảo sát các dung môi với tỷ lệ phù hợp đối với các chất nghiên cứu

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254

- Hệ dung môi khai triển:

+ Ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac (3:18:6:0,6) + Cloroform – ethyl acetat – acid acetic băng (6:5:0,2) + Ethyl acetat – methanol – amoniac (8:2:0,1)

+ Toluen – ethyl acetat – acid acetic (17:13:1)

- Thể tớch chấm sắc ký: 10 àL

- Nồng độ chất phân tích: 0,1 mg/mL - Phát hiện: Khảo sát điều kiện phát hiện với các bước sóng khác nhau bằng đèn tử ngoại

Lựa chọn điều kiện tách riêng các chất, các vết gọn, phổ trùng với phổ chuẩn để định tính Sử dụng phần mềm chuyên dụng, quét phổ tại vị trí tương ứng vết của mỗi chất phân tích trên máy scanner và chồng phổ thu được của chất phân tích của mẫu thử tự tạo (mẫu nền thêm chuẩn) và mẫu chuẩn để xác nhận chất dương tính trong mẫu thử Đối với các dược chất nhóm kháng histamin:

Tham khảo tài liệu đã công bố [18], [41] và điều kiện sẵn có Tiến hành khảo sát và xác định điều kiện tách 5 chất nhóm kháng histamin CIN, CLO, CYP, LOR, PRO với điều kiện sắc ký dự kiến:

- Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254

- Hệ dung môi khai triển: Cyclohexan – aceton – triethylamin (8:2:0,5) - Thể tớch chấm: 10 àL

- Bước sóng phát hiện: 254 nm - Nồng độ chất phân tích: 0,1 mg/mL Sử dụng phần mềm chuyên dụng, quét phổ tại vị trí tương ứng vết của mỗi chất phân tích trên máy scanner và chồng phổ thu được của chất phân tích của mẫu thử tự tạo (mẫu nền thêm chuẩn) và mẫu chuẩn để xác nhận chất dương tính trong mẫu thử

* Khảo sát và lựa chọn khoảng nồng độ chất phân tích

Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp pha loãng bằng dung môi pha mẫu, tiến hành sắc ký để tạo ra các dung dịch có nồng độ 10 - 20 - 50 - 100 µg/mL Sau đó, quan sát các vết sắc ký dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm bằng mắt thường để xác định các thành phần trong dung dịch.

Khoảng nồng độ làm việc được xác định là khoảng mà các vết có thể quan sát rõ ràng bằng mắt thường ở điều kiện phát hiện đã lựa chọn Nồng độ lựa chọn để chấm sắc ký là: 100 àg/mL

Dựa vào tính tan của các chất phân tích [7] và một số nghiên cứu đã công bố [19], [62], [66] đối với các chất nhóm kháng histamin và các công bố [15], [95] đối với các chất nhóm điều trị tăng huyết áp, cũng như kết quả khảo sát hiệu suất chiết các chất thu được ở phần phân tích bằng HPLC, tiến hành xử lý mẫu như sau:

Để đảm bảo tính thống nhất của mẫu thử, đối với mẫu rắn (khoảng 5 gam hoặc 5-10 đơn vị mẫu), cần nghiền mịn Đối với mẫu lỏng (khoảng 10 mL hoặc 3-5 đơn vị mẫu), cần lắc kỹ.

- Cân chính xác khoảng 0,50 g mẫu dạng rắn hoặc 1,00 g mẫu dạng lỏng vào ống falcon

- Thêm chính xác 10,0 mL methanol

- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng

- Chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp dịch trong được lọc qua màng lọc PTFE cú kớch cỡ lỗ lọc 0,45 àm

Tiến hành thẩm định phương pháp trên mẫu tự tạo chứa các chất nghiên cứu với các chỉ tiêu theo AOAC 2016 và ICH [44], [45], [60]:

Phân tích đồng thời 3 mẫu: Dung dịch hỗn hợp chuẩn chất phân tích, mẫu nền và mẫu nền thêm chuẩn trên hệ thống HPTLC Thực hiện trên 2 nền mẫu

Sắc ký đồ mẫu nền thêm chuẩn phải trùng màu sắc và giá trị Rf với sắc ký đồ mẫu chuẩn, hệ số phù hợp trên 0,99 Sắc ký đồ mẫu nền không chứa vết tương đương với các vết chính trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu nền thêm chuẩn.

- Giới hạn phát hiện (LOD):

Thêm hỗn hợp chuẩn vào nền mẫu với nồng độ giảm dần:

+ Với nhóm điều trị tăng huyết áp: Thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 mg/mL lần lượt là 1000 àL – 500 àL – 200 àL – 100 àL vào nền mẫu (0,50 g đối với nền rắn hoặc 1,00 g đối với nền lỏng → tương ứng với dung dịch đem chấm sắc ký cú nồng độ: 100 àg – 50 àg – 20 àg – 10 àg/mL), lắc đều, để yờn 15 phỳt

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Xây dựng và bào chế nền mẫu

3.1.1 Xây dựng công thức nền mẫu

3.1.1.1 Xây dựng công thức nền mẫu chế phẩm có tác dụng điều trị, hỗ trợ điều trị tăng huyết áp

Dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế công nhận, thành phần các chế phẩm chứa dược liệu có thị phần lớn đang lưu hành trên thị trường đã tham khảo 3 bài thuốc đặc trưng được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Các bài thuốc đặc trưng có tác dụng điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu

Bài thuốc Hoàn lục vị gia giảm

Bài thuốc Hạ áp thể đờm thấp

Câu đằng 6 g Đỗ trọng Bạch thược Đẳng sâm

Từ đó lựa chọn và xây dựng được thành phần công thức nền mẫu dùng trong phân tích các dược chất điều trị tăng huyết áp, được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Thành phần công thức nền mẫu để phân tích dược chất điều trị tăng HA

TT Dược liệu Khối lượng

TT Dược liệu Khối lượng

2 Mẫu đơn bì 12 10 Mã đề 20

4 Sơn thù du 16 12 Ngưu tất 10

3.1.1.2 Xây dựng công thức nền mẫu chế phẩm có tác dụng điều trị, hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa

Dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế công nhận, thành phần các chế phẩm thuốc có thị phần lớn đang lưu hành trên thị trường đã tham khảo 3 bài thuốc đặc trưng được trình bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Các bài thuốc đặc trưng điều trị, hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa

Bài thuốc: Liên kiều bại độc tán

Bài thuốc: Tiêu phong tán gia giảm

Chi tử 12 g Đạm đậu xị 20 g Đan bì 8 g

Xuyên khung 10 g Đạm trúc diệp 16 g Đương qui 12 g

Từ đó lựa chọn và xây dựng được thành phần công thức nền mẫu dùng để phân tích các dược chất kháng histamin, được trình bày trong bảng 3.4:

Bảng 3.4 Thành phần công thức nền mẫu để phân tích các dược chất thuộc nhóm kháng histamin

TT Dược liệu Khối lượng

TT Dược liệu Khối lượng

2 Bạc hà 8 11 Kim ngân hoa 10

4 Cam thảo 8 13 Ngưu bàng tử 12

6 Chi tử 12 15 Ké đầu ngựa 8

7 Đạm đậu xị 10 16 Sài hồ 12

3.1.2 Bào chế nền mẫu 3.1.2.1 Bào chế nền mẫu dạng lỏng từ dược liệu

- Dược liệu được rửa sạch, để ráo và sấy khô ở nhiệt độ khoảng 60 o C

- Các dược liệu được thái lát mỏng, cắt nhỏ nếu cần

- Cân dược liệu theo tỷ lệ như bảng 3.2 và bảng 3.4 gấp 5 lần mỗi mẻ

Đặt dược liệu vào nồi, thêm nước ngập trên dược liệu khoảng 3 cm Đun sôi nhẹ trong 3 giờ, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập trên dược liệu Sau đó, gạn dịch sang một nồi khác Lặp lại quá trình đun và gạn thêm 1 lần nữa, rồi tập hợp lại toàn bộ dịch đã gạn vào nồi trên.

- Lọc dịch qua 2 lần vải xô

- Cô dịch cách thủy đến tỷ lệ 5:1 được nền mẫu lỏng

3.1.2.2 Bào chế nền mẫu dạng rắn

- Tiến hành tương tự như qui trình bào chế nền mẫu dạng lỏng thu được cao lỏng

- Cô cao lỏng trên cách thủy thành cao đặc

- Sấy cao đặc đến khô trong tủ sấy ở 60 o C, thu được nền mẫu rắn.

Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

huyết áp trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

3.2.1 Phương pháp HPTLC 3.2.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn FUR, AML, NIF, FEL và chuẩn gốc hỗn hợp 4 chất trong methanol có nồng độ 0,1 mg/mL

❖ Khảo sát hệ dung môi pha động:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp gồm 4 chất nghiên cứu AML, NIF, FEL, FUR trong methanol từ dung dịch chuẩn gốc đơn và hỗn hợp có nồng độ 1 mg/mL.

- Khảo sát trên bản mỏng silicagel gel 60 F254, chiều dài 10 cm

- Thể tớch chấm 10 àL, bước súng phỏt hiện 254 nm, 366 nm, thực hiện sắc ký với các hệ dung môi:

• Hệ 1: Ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac (3:18:6:0,6)

• Hệ 2: Cloroform – ethyl acetat – acid acetic băng (6:5:0,2)

• Hệ 3: Ethyl acetat – methanol – amoniac (8:2:0,1)

• Hệ 4: Toluen – ethyl acetat – acid acetic (17:13:1) - Kết quả được trình bày ở hình 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát thành phần dung môi pha động HPTLC tách các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

* Nhận xét: Kết quả ở hình 3.1 cho thấy trong các hệ pha động khảo sát, hệ 1 cho vết của các chất nghiên cứu tách rời khỏi nhau, các vết gọn; hệ 2 cho vết của AML chưa được rửa giải, vẫn ở tại vị trí ban đầu; hệ 3 cho vết của AML, FUR chồng nhau và vết của

NIF, FEL chồng nhau; hệ 4 vết của AML không di chuyển Rf = 0 Do đó, lựa chọn hệ dung môi 1 trong nghiên cứu

❖ Xác định phổ hấp thụ UV - Vis:

Tiến hành quét phổ UV trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm tại vị trí vết của 4 chất phân tích trong sắc ký đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp Kết quả được trình bày ở hình 3.2

Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV của các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp trong phân tích bằng HPTLC

* Nhận xét: Quét phổ tại các vết tương ứng các chất trên sắc ký đồ, kết quả cho thấy

NIF, FUR hấp thụ mạnh tại bước sóng 254 nm; còn AML và FEL hấp thụ mạnh ở bước sóng 366 nm do đó lựa chọn cặp bước sóng để phát hiện các chất nghiên cứu

➢ Từ kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký như sau:

- Pha tĩnh: Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254, kích thước 20 cm × 10 cm

- Hệ dung môi khai triển: Ethyl acetat – toluen – methanol – amoniac (1,5:9:3:0,3)

- Bước sóng phát hiện: 254 nm với NIF, FUR; 366 nm với AML và FEL

Phân tích đồng thời 5 mẫu gồm hỗn hợp chuẩn FUR, AML, NIF, FEL nồng độ mỗi chất 0,1 mg/ml, mẫu nền cao khô (HA.N1) và mẫu nền cao lỏng (HA.N2) thêm chuẩn hỗn hợp cùng nồng độ 0,1 mg/mL; 2 nền mẫu không thêm chuẩn trên hệ thống vết có Rf và màu sắc tương đương với vết thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ của các mẫu nền không xuất hiện vết tương ứng về vị trí với vết của các chất phân tích (Hình 3.3a và 3.3b) Chồng phổ vết tại vị trí tương ứng trên sắc ký đồ của các mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn của từng chất phân tích, kết quả cho thấy hệ số match của cả 4 chất đều đạt lớn hơn 0,997 (Hình 3.3c minh họa đối với FUR) Như vậy, phương pháp đảm bảo độ chọn lọc để phát hiện các chất nghiên cứu trên 2 nền mẫu chế phẩm chứa dược liệu đã xây dựng

Hình 3.3 trình bày sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp phát hiện ở bước sóng 254 nm (a) và 366 nm (b) Kết quả chồng phổ hấp thụ được thực hiện tại vị trí vết của mẫu chứng giúp xác định độ đặc hiệu của phương pháp.

FUR trên sắc ký đồ mẫu nền HA.N1 thêm chuẩn và chuẩn (c)

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPTLC đối với dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

Rf Màu sắc vết phát hiện ở bước sóng

Hệ số match chồng phổ

254 nm 366 nm Nền HA.N1 Nền HA.N2

❖ Giới hạn phát hiện (LOD):

Thêm dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 1 mg/mL vào 0,50 g bột nền mẫu HA.N1 hoặc 1,00 g dịch nền mẫu HA.N2 để sau khi xử lý mẫu theo qui trình thu được các dung dịch cú nồng độ chất phõn tớch 10 – 20 – 50 – 100 àg/mL (tương ứng C1, C2, C3, C4)

Tiến hành sắc ký LOD là nồng độ thấp nhất có thể quan sát được bằng mắt thường

Kết quả, đối với nền HA.N1: Vết NIF quan sát được ở dung dịch C2, các vết khác đều phát hiện được ở dung dịch C1; đối với nền HA.N2: Vết AML và FEL quan sát được ở dung dịch C1, các vết FUR và NIF phát hiện được ở dung dịch C2 LOD của phương pháp đối với cả 4 chất nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.6 và minh họa ở hình 3.4

Phát hiện ở bước sóng 254 nm Phát hiện ở bước sóng 366 nm

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPTLC đánh giá LOD của phương pháp đối với nhóm

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định LOD của phương pháp HPTLC phân tích các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

Mẫu nền HA.N1 Mẫu nền HA.N2

Nồng độ dung dịch sắc ký

Nồng độ tính trên nền mẫu

Nồng độ dung dịch sắc ký

Nồng độ tính trên nền mẫu

* Nhận xét: Từ kết quả thẩm định thu được cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu đảm bảo, LOD đối với cả 4 chất phân tích AML, FEL, NIF, FUR nằm trong khoảng 0,1 – 0,4 mg/g mẫu thử

3.2.2 Phương pháp HPLC 3.2.2.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Chuẩn bị các dung dịch như trình bày ở mục 2.3.3.1

❖ Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký:

Tiến hành phân tích hỗn hợp 4 chất với điều kiện như trình bày ở mục 2.3.2.2 Kết quả được trình bày ở hình 3.5

Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC khảo sát cột sắc ký tách các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp: (a) Cột InertSustain C18; (b) Cột Zorbax SB-C18; (c) Cột Waters Xbridge

* Nhận xét: Sử dụng cả 3 cột (a), (b) và (c) các pic tách riêng biệt, chân pic gọn, cân đối, đạt độ phân giải đường nền, do đó cả 3 cột này đều có thể sử dụng trong nghiên cứu

Dựa vào điều kiện sẵn cú, cột Waters Xbridge C18 (250  4,6 mm; 5 àm) được sử dụng trong nghiên cứu này

❖ Lựa chọn bước sóng phân tích

Quét phổ UV tại vị trí ứng với thời gian lưu pic từng chất trên sắc ký đồ trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm Kết quả thu được được trình bày ở hình 3.6

Hình 3.6 Phổ hấp thụ UV của các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trong phân tích bằng HPLC

* Nhận xét: Hình 3.6 cho thấy, 4 chất phân tích đều có độ hấp thụ lớn trong khoảng từ

230 nm đến 240 nm Trong 4 chất phân tích thì FEL có độ hấp thụ thấp nhất và liều sử dụng thấp, do đó lựa chọn bước sóng 238 nm làm bước sóng phân tích định tính, định lượng đồng thời cả 4 chất

3.2.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol có nồng độ các chất AML, FEL, FUR, NIF là 1 mg/mL

Thờm chớnh xỏc 250 àL dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 1 mg/mL vào 1,00 g nền mẫu và tiến hành xử lý mẫu như ở mục 2.3.3.3 Các dung môi chiết khảo sát là methanol, hỗn hợp (acetonitril – nước) tỷ lệ (50 : 50) Kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.7

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát dung môi chiết các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

(n = 6) trong phân tích bằng HPLC

Mẫu nền rắn (HA.N1) Mẫu nền lỏng (HA.N2)

Hình 3.7 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp

* Nhận xét: Kết quả cho thấy dung môi chiết MeOH cho hiệu suất chiết các chất cao hơn so với hỗn hợp dung môi acetonitril – nước (50:50), độ ổn định khi chiết (độ lặp lại) cao, do đó lựa chọn dung môi chiết mẫu là methanol

➢ Từ kết quả khảo sát, điều kiện phân tích được lựa chọn như sau:

Mẫu thử dạng rắn (khoảng 5 g) được nghiền mịn/ mẫu dạng lỏng (khoảng 10 mL) lắc đều Cân chính xác khoảng 1,00 g mẫu vào ống falcon Thêm khoảng 20 ml methanol Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 25 mL, tráng ống 2 lần, mỗi lần với khoảng 2 mL methanol, tập trung dịch rửa vào bình định mức, thêm methanol tới vạch Lắc đều Chuyển khoảng 10 mL hỗn hợp vào ống ly tâm, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp dịch trong được lọc qua màng lọc 0,45 àm Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Waters Xbridge C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm)

- Pha động: Kênh A: Dung dịch acid phosphoric 0,1%

Chương trình pha động: 0 → 10 phút: 30% B; 10 → 20 phút: 30 → 60%

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

- Bước sóng phát hiện: 238 nm

3.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích

❖ Độ thích hợp hệ thống:

Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích các chất nhóm kháng

trộn trong chế phẩm chứa dược liệu

3.3.1 Phương pháp HPTLC 3.3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn CLO, CYP, CIN, LOR, PRO và chuẩn gốc hỗn hợp 5 chất trong methanol có nồng độ 0,1 mg/ml

❖ Đánh giá điều kiện sắc ký:

Tiến hành phân tích hỗn hợp 5 chất với điều kiện như trình bày ở mục 2.3.2.2

Kết quả được trình bày ở hình 3.17 Tiến hành quét phổ UV trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm tại vị trí vết của 5 chất phân tích trong sắc ký đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp Kết quả được trình bày ở hình 3.18

Hình 3.17 Sắc ký đồ HPTLC phân tích các dược chất nhóm kháng histamin H1

Hình 3.18 Phổ hấp thụ UV của các chất nhóm kháng histamin H1 trong phân tích bằng HPTLC

➢ Từ kết quả thu được, điều kiện sắc ký được lựa chọn là:

- Pha tĩnh: Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 - Hệ dung môi khai triển: Cyclohexan – aceton – triethylamin (8: 2: 0,5)

- Bước sóng phát hiện: 254 nm

Phân tích đồng thời 5 mẫu gồm hỗn hợp chuẩn CLO, LOR, PRO, CYP, CIN nồng độ mỗi chất 0,1 mg/ml, mẫu nền rắn (DU.N1) và mẫu nền lỏng (DU.N2) thêm chuẩn hỗn hợp cùng nồng độ 0,1 mg/mL; 2 nền mẫu không thêm chuẩn trên hệ thống HPTLC Kết quả ở hình 3.19 cho thấy trên sắc ký đồ của cả 2 mẫu nền thêm chuẩn xuất hiện v ết có màu sắc và Rf tương đương với vết thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn; Trên sắc ký đồ của mẫu nền không xuất hiện vết tương ứng về vị trí với vết của các chất phân tích Chồng phổ vết tại vị trí tương ứng trên sắc ký đồ của các mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn của từng chất phân tích, kết quả cho thấy hệ số match của cả 5 chất đều đạt lớn hơn 0,997 Do đó, phương pháp đảm bảo độ đặc hiệu để phát hiện các chất nghiên cứu trên 2 nền mẫu chế phẩm chứa dược liệu đã xây dựng

Hình 3.19 SKĐ HPTLC đánh giá độ đặc hiệu của các chất nhóm kháng histamin H1

Hình 3.20 Kết quả chồng phổ hấp thụ tại vị trí tương ứng với vết của PRO trên sắc ký đồ mẫu nền DU.N1 thêm chuẩn và mẫu chuẩn

Bảng 3.22 Kết quả thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp HPTLC đối với dược chất nhóm kháng histamin H1

Chất phân tích Rf Màu sắc vết

Hệ số match Nền N1 Nền N2

❖ Giới hạn phát hiện (LOD):

Thêm dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 mg/mL vào 0,50 g bột nền mẫu DU.N1 hoặc 1,00 g dịch nền mẫu DU.N2 để sau khi xử lý mẫu theo qui trình thu được các dung dịch cú nồng độ chất phõn tớch 2 – 3 – 6 – 10 àg/mL Tiến hành sắc ký

Kết quả, đối với cả 2 nền mẫu: Các vết CLO và LOR quan sát được rất rõ ràng ở dung dịch nồng độ 10 àg/mL, cỏc vết khỏc (PRO, CYP và CIN) quan sỏt được rừ ràng ở dung dịch nồng độ 6 àg/mL Kết quả LOD của phương phỏp đối với 5 chất nghiờn cứu được trình bày trong bảng 3.23 và minh họa ở hình 3.21

Hình 3.21 Sắc ký đồ xác định LOD của các chất nhóm kháng histamin H1 bằng

Bảng 3.23 Kết quả thẩm định LOD của phương pháp HPTLC phân tích các dược chất nhóm kháng histamin H1

Mẫu nền DU.N1 Mẫu nền DU.N2

Nồng độ dung dịch sắc ký

Nồng độ tính trên nền mẫu

Nồng độ dung dịch sắc ký

Nồng độ tính trên nền mẫu

Như vậy, phương pháp có độ chọn lọc đảm bảo, LOD nằm trong khoảng 0,06 – 0,20 mg/g mẫu thử

3.3.2 Phương pháp HPLC 3.3.2.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Chuẩn bị các dung dịch như trình bày ở mục 2.3.3.1

❖ Khảo sát và lựa chọn cột sắc ký:

Tiến hành phân tích hỗn hợp 5 chất với điều kiện như trình bày ở mục 2.3.3.2

Hình 3.22 SKĐ HPLC khảo sát cột sắc ký tách các dược chất nhóm kháng histamin H1: (a) Cột InertSustain C18; (b) Cột Zorbax SB-C18; (c) Cột Waters Xbridge C18

3 cột (a), (b) và (c) các pic ảnh tách biệt, với chân pic gọn gàng, cân đối và có độ phân giải đạt tiêu chuẩn đường nền, phù hợp để sử dụng trong nghiên cứu.

Dựa vào điều kiện sẵn cú, cột Waters Xbridge C18 (250  4,6 mm; 5 àm) được sử dụng nghiên cứu này

❖ Lựa chọn bước sóng phân tích

Quét phổ UV tại các thời điểm lưu của từng hợp chất trên sắc ký đồ trong dải bước sóng từ 190 đến 400 nm Kết quả thu được được trình bày trên Hình 3.23.

* Nhận xét: Kết quả ở hình 3.23 cho thấy tại bước sóng 254 nm các chất đều có đáp ứng lớn nên lựa chọn bước sóng này để phát hiện cả 5 chất phân tích trong nghiên cứu này

3.3.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc trong methanol có nồng độ các chất CIN, CLO, CYP, LOR, PRO là 1,0 mg/ml

Thêm dung dịch chuẩn hỗn hợp vào nền mẫu và chiết với 20 ml dung môi và tiến hành xử lý mẫu như ở mục 2.3.3.3 Các dung môi chiết khảo sát là methanol, hỗn hợp (methanol – nước) tỷ lệ (90 : 10) Kết quả được trình bày ở bảng 3.24 và hình 3.24

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát dung môi chiết các dược chất nhóm kháng histamin H1

Mẫu nền rắn (DU.N1) Mẫu nền lỏng (DU.N2)

Hình 3.24 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết các chất nhóm kháng histamin H1 trong phân tích HPLC

Kết quả chiết xuất cho thấy rằng dung môi đơn MeOH cho năng suất cao hơn so với hỗn hợp dung môi MeOH - nước (90:10) Ngoài ra, độ ổn định khi chiết xuất (độ lặp lại) với MeOH cũng cao hơn, đảm bảo tính nhất quán của kết quả Do đó, MeOH được lựa chọn làm dung môi chiết mẫu tối ưu trong quá trình nghiên cứu này.

➢ Từ kết quả khảo sát, điều kiện phân tích được lựa chọn như sau:

Mẫu thử dạng rắn (khoảng 5 g) được nghiền mịn/ mẫu dạng lỏng (khoảng 10 mL) lắc kỹ cho đồng nhất mẫu Cân chính xác khoảng 0,50 g mẫu dạng rắn hoặc lấy chính xác khoảng 1,00 g mẫu dạng lỏng vào ống falcon Thêm khoảng 20 ml methanol Lắc xoáy 5 phút, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 25 mL, tráng ống 2 lần, mỗi lần với khoảng 2 mL methanol, tập trung dịch rửa vào bình định mức, thêm methanol tới vạch Lắc đều Chuyển khoảng 10 mL hỗn hợp vào ống ly tâm, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Lớp dịch trong được lọc qua màng lọc 0,45 àm Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Waters Xbridge C18 (250 ì 4,6 mm, 5 àm)

- Pha động: Acetonitril - dung dịch natri heptansulfonat 0,01 M (điều chỉnh tới pH = 2,8 bằng acid acetic băng); Gradient dung môi: từ 0 – 17 phút Acetonitril 38% →

CLO PRO CYP LOR CIN

Hiệu suất chiết (%) DU-N2 (MeOH- H2O) DU-N1 (MeOH-H2O)

- Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àL

- Bước sóng phát hiện: 254 nm

3.3.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích

❖ Độ thích hợp hệ thống:

Tiờm lặp lại sỏu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 àg/ml vào hệ thống HPLC, đỏnh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu Kết quả được trình bày ở bảng 3.25

Bảng 3.25 Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống HPLC phân tích các dược chất nhóm kháng histamin H1 (n = 6)

Chất phân tích CLO PRO CYP LOR CIN

Hệ số kéo đuôi 1,5 1,6 1,6 1,3 1,8 Độ phân giải Độ phân giải giữa các pic liền kề: đều ≥ 3 (từ 3 đến 11)

* Nhận xét: Từ các kết quả bảng trên cho thấy: Thời gian lưu và diện tích pic thu được của 6 lần sắc kí lặp lại mẫu chuẩn của 5 chất có giá trị RSD nhỏ hơn 1,1%, đạt yêu cầu theo AOAC (< 2,0%) Hệ số kéo đuôi của các pic (hệ số đối xứng) đều <

2,0 và độ phân giải giữa các pic liền kề đều > 2,0 Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký là phù hợp để định lượng đồng thời CIN, CLO, CYP, LOR, PRO

Phân tích đồng thời 5 mẫu gồm hỗn hợp chuẩn CLO, LOR, PRO, CYP, CIN nồng độ mỗi chất 10 àg/mL, mẫu nền rắn (DU.N1) và mẫu nền lỏng (DU.N2) thờm chuẩn hỗn hợp cựng nồng độ 10 àg/mL; nền mẫu DU.N1 và DU.N2 khụng thờm chuẩn trên hệ thống HPLC Kết quả được minh họa ở hình 3.25

Hình 3.25 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của nhóm kháng histamin H1 bằng HPLC:

Mẫu chuẩn hỗn hợp (a); mẫu nền DU.N1 (b); mẫu nền DU.N1 thêm chuẩn

* Nhận xét: Kết quả ở hình 3.25 cho thấy trên sắc ký đồ của cả 2 mẫu nền thêm chuẩn xuất hiện pic có RT tương đương với RT thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, còn trên sắc ký đồ của mẫu nền không xuất hiện pic tương ứng về RT với pic của các chất phân tích, các pic đều có hình dạng gọn, cân đối Chồng phổ các pic tương ứng thu được từ dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu nền thêm chuẩn đều cho các hệ số Match#Angle nhỏ hơn 10% Do đó, phương pháp có độ đặc hiệu đảm bảo

❖ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành như chỉ dẫn ở mục 2.3.3.4 đối với thẩm định chỉ tiêu LOD và LOQ Kết quả được trình bày tại bảng 3.26 và hình 3.26

Hình 3.26 Sắc ký đồ xác định LOQ nhóm kháng histamin H1 của phương pháp HPLC trên nền DU.N1 (a); mẫu nền DU.N2 (b)

Bảng 3.26 Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp HPLC phân tích các chất nhóm kháng histamin H1

Mẫu nền rắn (DU.N1) Mẫu nền lỏng (DU.N2)

(àg/mL) àg/ g mẫu nền

(àg/mL) àg/ g mẫu nền

(àg/mL) àg/ g mẫu nền

(àg/mL) àg/ g mẫu nền

Nồng độ*: Nồng độ dung dịch sắc ký

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng trong phân tích mẫu thực

Đối với các mẫu chế phẩm chứa dược liệu, thực phẩm chức năng, HPTLC được sử dụng sàng lọc Các mẫu này sau đó được phân tích khẳng định bằng HPLC và LC-MS/MS Quá trình này đảm bảo xác định chính xác các thành phần hoạt chất trong mẫu và loại bỏ khả năng tạp chất hoặc các chất không mong muốn.

3.4.1 Xác định các chất nhóm điều trị tăng huyết áp trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu 3.4.1.1 Phương pháp HPTLC

Tiến hành xử lý các mẫu thử và phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả 47/56 mẫu không phát hiện thấy cả 4 chất nghiên cứu, 9/56 mẫu nghi ngờ dương tính với các chất nghiên cứu AML, NIF, FUR (bảng 3.37 và minh họa ở hình 3.34) Đối với những kết quả dương tính, quét và chồng phổ vết chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu thử và vết của mẫu chuẩn tương ứng, kết quả cho thấy hệ số match đều rất thấp (nằm trong khoảng 0,10 - 0,76), do đó tất cả các mẫu thực đều không phát hiện được dương tính với cả 4 chất nghiên cứu là AML, NIF, FEL, FUR Hình 3.35 minh họa kết quả chồng phổ của mẫu M02 nghi ngờ dương tính với AML và FUR

Hình 3.34 Sắc ký đồ phân tích một số mẫu thực phát hiện các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp bằng HPTLC tại bước sóng 254 nm (a) và 366 nm (b)

Bảng 3.37 Kết quả phân tích một số mẫu thực nghi ngờ chứa các chất nhóm thuốc điều trị tăng huyết áp bằng HPTLC

STT Mẫu thử Dạng bào chế Nguồn gốc Chất phân tích

8 M18 Trà thảo mộc Mẫu gửi + + - -

Hình 3.35 Kết quả chồng phổ UV tại vị trí có R f tương ứng với chất phân tích nghi ngờ dương tính trong mẫu thử M02 (nhóm điều trị tăng huyết áp)

Tiến hành xử lý các mẫu thử và phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả 54/56 mẫu không phát hiện thấy cả 4 chất nghiên cứu, 2/56 mẫu nghi ngờ dương tính với các chất nghiên cứu (bảng 3.38) Đối với những kết quả nghi ngờ này, quét và chồng phổ tại RT pic chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu thử và RT pic của mẫu chuẩn tương ứng, kết quả cho thấy hệ số Match #1 Angle rất lớn (lớn hơn 70), do đó tất cả các mẫu thực đều không phát hiện được dương tính với cả 4 chất nghiên cứu là AML, NIF, FEL,

FUR Hình 3.36 và hình 3.37 trình bày kết quả phân tích mẫu M04 và M10 nghi ngờ dương tính với AML và FUR

Bảng 3.38 Kết quả định tính trên mẫu thực nghi ngờ chứa dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp bằng HPTLC

STT Mẫu thử Dạng bào chế Nguồn gốc Chất phân tích

1 M04 Viên nang cứng Mẫu gửi + - - -

Hình 3.36 Sắc ký đồ HPLC và kết quả chồng phổ UV của mẫu M04 nghi ngờ dương

Hình 3.37 Sắc ký đồ HPLC và kết quả chồng phổ UV của mẫu M10 nghi ngờ dương tính với furosemid 3.4.1.3 Phương pháp LC-MS/MS

Tiến hành xử lý các mẫu thử và phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả 56/56 mẫu không phát hiện thấy cả 4 chất nghiên cứu Hình 3.38 minh họa kết quả phân tích bằng LC-MS/MS của mẫu M04 nghi ngờ dương tính với AML khi phân tích bằng HPLC dựa vào RT

Ion định lượng Ion định tính Phổ đồ

Hình 3.38 Sắc ký đồ và phổ đồ MS/MS của mẫu M04 nghi ngờ dương tính với amlodipin

3.4.2 Xác định các dược chất nhóm kháng histamin trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu 3.4.2.1 Phương pháp HPTLC

Tiến hành xử lý các mẫu thử và phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả 44/55 mẫu không phát hiện thấy cả 5 chất nghiên cứu, 11/55 mẫu nghi ngờ dương tính với các chất nghiên cứu (bảng 3.39 và minh họa ở hình 3.39) Đối với những kết quả dương tính, quét và chồng phổ vết chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu thử và vết của mẫu chuẩn tương ứng, kết quả cho thấy hệ số match đều lớn hơn 0,99, hình 3.40 minh họa kết quả chồng phổ của mẫu BNH93 (dương tính với CLO)

Hình 3.39 Sắc ký đồ HPTLC phân tích một số mẫu thực phát hiện các chất nhóm kháng histamin H1 (1 Mẫu HCH164; 2 Mẫu HCH04; 8 Mẫu VNA05; 10 Mẫu

Hình 3.40 Kết quả chồng phổ UV tại vị trí có R f = 0,27 (vết CLO) của mẫu dương tính

Bảng 3.39 Kết quả phân tích các mẫu dương tính với các chất nhóm kháng histamin

TT Mẫu thử Dạng bào chế Nguồn gốc Chất phát hiện

1 BNH93 Bột Mua Online CLO 0,27 0,9924

2 HA29 Hoàn mềm Mua Online CLO 0,26 0,9994

3 HCH99 Hoàn cứng Mua của

5 VNA05 Viên nang cứng Mẫu gửi CLO 0,26 0,9984

6 VNA35 Viên nang cứng Mẫu gửi CLO 0,26 0,9927

7 HA26-L17 Hoàn mềm Mua của

8 HA32 Hoàn mềm Mua Online CLO 0,26 0,9945

9 HCH04 Bột Mẫu gửi CLO 0,26 0,9962

10 HCH164 Hoàn cứng Mua Online CLO 0,26 0,9936

11 HCH94 Hoàn cứng Mẫu gửi CLO 0,26 0,9925

Tiến hành xử lý các mẫu thử và phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả 43/55 mẫu không phát hiện thấy cả 5 chất nghiên cứu, 12/55 mẫu nghi ngờ dương tính với các chất nghiên cứu (bảng 3.40) Để xác nhận chất dương tính so sánh thời gian lưu, quét và chồng phổ tại RT pic chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu thử và RT pic của mẫu chuẩn tương ứng, kết quả cho thấy hệ số Match#Angle đều thấp hơn 10,0 khi xác nhận CLO trong các mẫu Bảng 3.40 trình bày kết quả định tính các mẫu dương tính, và hình 3.41, hình 3.42 minh họa kết quả phân tích mẫu dương tính BNH93 Tính nồng độ thuốc hóa dược trộn trong mẫu thử dựa vào phương trình hồi qui có hệ số tương quan R 2 ≥ 0,99 xây dựng trong cùng ngày phân tích, bảng 3.41 là kết quả định lượng các chất

Bảng 3.40 Kết quả định tính các mẫu dương tính với chất nhóm kháng histamin bằng

Hình 3.42 Kết quả chồng phổ UV xác nhận CLO, LOR, CIN trong mẫu BNH93

Bảng 3.41 Kết quả xác định hàm lượng các chất nhóm kháng histamin trong mẫu thử dương tính bằng HPLC

STT Mẫu thử Dạng bào chế

Kết quả định tính và xác định hàm lượng

CIN CLO CYP LOR PRO

* Nhận xét: Kết quả ở hình 3.41 và hình 3.42 cho thấy trên sắc ký đồ mẫu thử xuất hiện

3 pic có thời gian lưu tương ứng với CLO, LOR và CIN, nhưng kết quả chồng phổ đối với CLO, LOR và CIN có hệ số Match#Angle lần lượt là 1,836; 31,643 và 53,304 do đó xác nhận mẫu thử chỉ dương tính với CLO Tương tự, như vậy đối với các mẫu thử khác đã xác nhận 11 mẫu nữa dương tính với các chất nghiên cứu (bảng 3.41) Trong các chất nghiên cứu, CLO được phát hiện dương tính trong 12/12 mẫu với hàm lượng nằm trong

3.4.2.3 Phương pháp LC-MS/MS

Tiến hành xử lý các mẫu thử và phân tích theo qui trình đã xây dựng Kết quả 43/55 mẫu không phát hiện thấy cả 5 chất nghiên cứu, 12/55 mẫu dương tính với các chất nghiên cứu (bảng 3.42) Để xác định kết quả dương tính với chất phân tích, bước 1 tính độ chệch về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng, nếu nằm trong giới hạn chấp nhận (≤ 2,5%) thì chuyển sang bước 2; tính độ chệch tỷ lệ cường độ ion chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn, nếu nằm trong giới hạn chấp nhận ở mức tương ứng thì kết luận dương tính

Với mẫu dương tính, xác định hàm lượng chất phân tích trong mẫu thử dựa vào phương trình hồi qui (có hệ số tương quan R 2 ≥ 0,99) xây dựng trong cùng ngày phân tích, lượng cân, độ pha loãng và diện tích pic chất phân tích của mẫu thử Những chất phân tích có hàm lượng thấp hơn LOD của phương pháp thì sẽ kết luận nhỏ hơn LOD

Hình 3.43, 3.44 và bảng 3.42 minh họa kết quả định tính mẫu thực HCH99, bảng 3.43 trình bày kết quả phân tích định tính và định lượng các chất dương tính trong mẫu thực.

Ion định lượng Ion định tính Phổ đồ

Hình 3.43 Sắc ký đồ và phổ đồ LC-MS/MS phân tích mẫu chuẩn nồng độ mỗi chất

Ion định lượng Ion định tính Phổ đồ

Hình 3.44 Sắc ký đồ và phổ đồ LC-MS/MS phân tích mẫu HCH99

Bảng 3.42 Kết quả định tính các chất nhóm kháng histamin trong mẫu HCH99 bằng

Tỷ lệ cường độ ion

Kết luận Thử Chuẩn Bias

PRO 5,247 4,987 5,21% Không đúng 3,7 23,1 - Không đúng

CYP 4,986 4,941 0,91% Đúng 0 48 100% Không đúng CIN 4,961 5,063 -2,01% Đúng 20,5 22,2 -7,66% Đúng

Bảng 3.43 Kết quả định tính và định lượng các mẫu dương tính với các chất nhóm kháng histamin bằng LC-MS/MS

STT Mẫu thử Dạng bào chế

Kết quả định tính và xác định hàm lượng

CIN CLO CYP LOR PRO

* Nhận xét: Kết quả phân tích mẫu HCH99 ở hình 3.43, hình 3.44 và bảng 3.42 cho thấy về thời gian lưu 3 chất (CLO, CYP, CIN) được nhận định là có thời gian lưu nằm trong khoảng chấp nhận (bias ≤ 2,5%), về tỷ lệ cường độ ion 2 chất CLO, CIN có độ chệch nằm trong khoảng chấp nhận (≤ 25%) nên được xác định là dương tính trong mẫu thử

CLO Tương tự, như vậy đối với các mẫu thử khác đã xác nhận 11 mẫu nữa dương tính với các chất nghiên cứu (bảng 3.43) Trong các chất nghiên cứu, CLO được phát hiện dương tính nhiều nhất 12/12 mẫu dương tính và hàm lượng nằm trong khoảng 0,23 – 3,13 mg/g chế phẩm

Kết quả phát hiện các mẫu dương tính với một trong các chất nghiên cứu nhóm kháng histamin bằng cả 3 phương pháp HPTLC, HPLC và LC-MS/MS là khá tương đồng với nhau (Bảng 3.44)

Bảng 3.44 Tổng hợp kết quả định tính và định lượng các mẫu dương tính với các chất nhóm kháng histamin bằng cả 3 phương pháp HPTLC, HPLC và LC-MS/MS

Stt Mẫu thử Dạng bào chế

Kết quả định tính và xác định hàm lượng bằng LC-MS/MS

(mg/ g) CIN CLO CYP LOR PRO

BÀN LUẬN

Đối tượng nghiên cứu

Sản phẩm dược liệu đã được nghiên cứu, phát triển, sử dụng từ lâu đời và đóng vai trò quan trọng trong hệ thống y tế chăm sóc sức khỏe cộng đồng Theo Quyết định 1976/QĐ-TTg, phát triển dược liệu theo hướng sản xuất hàng hóa đáp ứng nhu cầu thị trường, gắn sản xuất nguyên liệu với tiêu thụ sản phẩm, xây dựng vùng trồng dược liệu gắn với công nghiệp chế biến, đa dạng hóa cơ cấu sản phẩm, đảm bảo an toàn, chất lượng, khả năng cạnh tranh cao, đáp ứng đủ nhu cầu trong nước và xuất khẩu.

Sản phẩm chứa dược liệu đa dạng, từ dược liệu thô đến dạng cao chế biến, chế phẩm tương tự thuốc hóa dược Luật Dược và Luật Thực phẩm quy định rõ ràng về vấn đề quản lý chất lượng dược liệu, bao gồm dược liệu, thuốc dược liệu, thuốc cổ truyền, vị thuốc cổ truyền và thực phẩm bảo vệ sức khỏe Đặc biệt, Luật Dược 2016 dành hẳn Chương IV với 8 điều để quy định về dược liệu và thuốc cổ truyền sản xuất lưu hành tại Việt Nam.

Tuy nhiên, cơ quản quản lý và nhiều nghiên cứu đã công bố tình trạng các thuốc hóa dược trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu Nhận thấy nguy cơ tiềm ẩn và các tác động có hại từ việc làm gian dối này, nhiều qui định đã được đưa ra nhằm kiểm soát chất lượng và đảm bảo an toàn đối với việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu Trong “Hướng dẫn xây dựng các yêu cầu thử nghiệm đối với thuốc từ dược liệu và TPBVSK” của nhóm làm việc về “Khoa học sức khỏe và qui định cho các sản phẩm liên quan đến sức khỏe” của FHH cũng đã có qui định về việc thử nghiệm phát hiện chất độc hại và các chất trộn trái phép [57] Tại Việt Nam, thông tư 10/2021/TT- BYT của Bộ Y tế cũng đã đưa ra danh mục 80 thuốc hóa dược và dẫn chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe Trong danh mục đó có các thuốc kháng histamin H1 thường được sử dụng trong điều trị mẩn ngứa, dị ứng như cyproheptadin, chlorpheniramin, cinnarizin và cả thuốc thuộc nhóm điều trị tăng huyết áp là furrosemid

Cho đến thời điểm hiện tại, đã có khá nhiều nghiên cứu về phương pháp phát hiện đối với nhóm thuốc có nguy cơ bị trộn lẫn cao nhất là nhóm giảm đau chống viêm steroid và không steroid, nhưng còn rất ít các công bố về nghiên cứu phát hiện các chất kháng histamin (nhóm thuốc cũng có nguy cơ bị trộn lẫn rất cao, chỉ xếp sau nhóm giảm đau chống viêm nêu trên) và các chất điều trị tăng huyết áp (nhóm thuốc thường được dùng kéo dài, có thể gây tác dụng phụ nghiêm trọng) có mặt trong các chế phẩm chứa dược liệu, đặc biệt là ở Việt Nam

Bằng cách đánh giá nguy cơ, 5 dược chất kháng histamin H1 thường dùng trong điều trị dị ứng bao gồm: Cinarizin, clorpheniramin, cyproheptadin, loratadin, promethazin và 4 dược chất dùng trong điều trị cao huyết áp bao gồm: Furosemid, amlodipin, felodipin và nifedipin đã được lựa chọn cho nghiên cứu này Các dược chất này được đánh giá là những chất dễ bị sử dụng trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu do đây đều là các thuốc thông dụng, dễ kiếm, giá thành không cao và cũng được phát hiện bị trộn trái phép trong các chế phẩm chứa dược liệu đang lưu hành trên thị trường ở một số nước khác

Do đó, nghiên cứu này sẽ thực hiện phát triển phương pháp phân tích 9 thuốc hóa dược thuộc 2 nhóm tác dụng dược lý kháng histamin và điều trị tăng huyết áp nêu trên.

Về xây dựng các nền mẫu chế phẩm chứa dược liệu

Với xu hướng ngày càng chú trọng đến sự an toàn, nguồn gốc tự nhiên, nhu cầu về sản phẩm từ dược liệu trong nước, nhất là nhóm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, không ngừng gia tăng Nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú và nền y học cổ truyền lâu đời của Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển đa dạng các chế phẩm từ dược liệu, bao gồm cả bài thuốc gia truyền, thuốc dược liệu, thực phẩm chức năng Sản phẩm được bào chế theo nhiều dạng khác nhau như viên nén, viên nang, dung dịch, cốm, bột, viên hoàn, chè thuốc, cao thuốc, v.v và đều trải qua quy trình sản xuất, đóng gói, dán nhãn khép kín.

Dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển,

“Danh mục thuốc cổ truyền, vị thuốc cổ truyền, thuốc dược liệu thiết yếu” được ban hành kèm theo Thông tư số 19/2018/TT-BYT và “Danh mục thuốc đông y, thuốc từ dược liệu và vị thuốc y học cổ truyền” ban hành kèm theo Văn bản hợp nhất số 13/VBHN-BYT; công thức thành phần các chế phẩm từ dược liệu có tác dụng điều trị, hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, mề đay, cảm cúm có thị phần lớn đang lưu hành trên thị trường bao gồm 3 bài thuốc Ngân kiều tán, Liên kiều bại độc tán, Tiêu phong tán gia giảm lựa chọn 18 dược liệu để tạo mẫu nền dùng trong thẩm định qui trình phân tích các

Tương tự như vậy, thành phần nền mẫu dùng trong thẩm định phương pháp phân tích xác định các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp trộn lẫn trong các sản phẩm điều trị hay hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, được xây dựng dựa trên các bài thuốc kinh điển, Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế công nhận, thành phần các chế phẩm thuốc điều trị, hỗ trợ điều trị bệnh cao huyết áp có thị phần lớn trên thị trường là 3 bài thuốc Giáng áp hợp tễ, Hoàn lục vị gia giảm và Hạ áp thể đờm thấp, lựa chọn 14 dược liệu

Các nền mẫu được chế tạo theo hướng dẫn của chuyên luận chung “Cao thuốc” trong Dược điển Việt Nam thu được nền cao khô (nền mẫu rắn N1) và cao lỏng (nền mẫu lỏng N2) Qui trình bào chế cao thuốc thường qua 2 giai đoạn: Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp và cô dịch chiết bằng các phương pháp khác nhau để thu được cao lỏng/cao đặc/cao khô Với mục đích sử dụng bằng đường uống, đa phần các cao dược liệu đều được chiết bằng dung môi là nước Phương pháp chiết có thể là: Ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác Trong nghiên cứu này, mục tiêu là phân tích các dược chất bị trộn lẫn vào chế phẩm chứa dược liệu, việc chế tạo nền mẫu là để đánh giá nguy cơ ảnh hưởng của nền mẫu đến việc phân tích nêu trên, do đó phương pháp chế tạo nền mẫu được lựa chọn là phương pháp sắc với nước

Thành phần nền mẫu lỏng và nền mẫu khô thường tương tự nhau, tuy nhiên nền mẫu khô có tỷ lệ chất chiết xuất từ dược liệu cao hơn Để đánh giá ảnh hưởng chính xác của nền mẫu đến quá trình phân tích tạp chất trong các dạng chế phẩm, cần thiết lập nền mẫu gần nhất với các dạng bào chế Theo quy định ISO/IEC 17025, xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích phải thực hiện trên từng loại nền mẫu cho từng dạng bào chế hoặc ít nhất 3 nền mẫu cho tất cả các dạng bào chế Khi nền mẫu ảnh hưởng đến kết quả phân tích, tỷ lệ nền mẫu càng thấp trong dung dịch phân tích thì mức độ ảnh hưởng càng nhỏ, đồng thời quá trình phân tích càng chính xác và giá trị LOD, LOQ càng thấp.

Thực tế, kết quả nghiên cứu đã cho thấy nền mẫu rắn và nền mẫu lỏng có mức độ ảnh hưởng không có nhiều sự khác biệt.

Về xây dựng phương pháp phân tích

Với mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định chất trộn trái phép trong chế phẩm chứa dược liệu, thì quá trình xử lý mẫu yêu cầu hiệu suất chiết phải cao và ổn định Để cân bằng 2 yếu tố này, nghiên cứu đã khảo sát từng nhóm hoạt chất dược lý dựa vào cấu trúc hóa học, đặc tính của các chất phân tích và các tài liệu đã công bố để xây dựng qui trình xử lý mẫu phù hợp

Xử lý mẫu trong phân tích là bước quan trọng vì có ảnh hưởng trực tiếp kết quả của phương pháp phân tích, do đó cần lựa chọn phương pháp xử lý mẫu phù hợp để có thể chiết được hoạt chất với hiệu suất cao nhất và hạn chế được sự ảnh hưởng của nhiễu nền Trên thị trường, các chế phẩm chứa dược liệu dạng rắn và lỏng chiếm tỷ lệ lớn trong các chế phẩm đang lưu hành, thành phần rất đa dạng về các loại dược liệu nên việc tìm ra một phương pháp xử lý mẫu vừa nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm chi phí và phù hợp với điều kiện phân tích là rất cần thiết Qua tham khảo một số nghiên cứu trước đây, nghiên cứu đã khảo sát quá trình xử lý mẫu bao gồm khảo sát số lần chiết, cách chiết, thời gian chiết, dung môi chiết và thời gian siêu âm để chiết mẫu

Do mục tiêu của nghiên cứu là phân tích các chất bị trộn lẫn trong sản phẩm từ dược liệu, không phải là phân tích các chất có trong dược liệu (các thành phần được công bố trong công thức bào chế), nên phương pháp chiết mẫu trực tiếp được lựa chọn cho nghiên cứu này Phương pháp này cho phép xử lý mẫu nhanh, đơn giản, dễ đảm bảo tính toàn vẹn của chất chiết được, tuy nhiên cần chọn được dung môi chiết mẫu phù hợp để có thể chiết được hết các chất cần nghiên cứu, nếu có trong chế phẩm Đối với nền mẫu dùng trong thẩm định phương pháp phân tích các thuốc nhóm kháng histamin, nghiên cứu đã khảo sát phương pháp chiết trực tiếp với các dung môi hay được dùng trong các nghiên cứu tương tự ở trong và ngoài nước là methanol, hỗn hợp (methanol - nước) (90:10) và đã chọn được methanol là dung môi có khả năng chiết các chất tốt nhất Theo tài liệu tham khảo [3], ethanol tuy là dung môi rẻ tiền, ít độc nhưng cho hiệu suất chiết các chất phân tích không đồng đều nhau và thấp hơn khi chiết bằng methanol Kết quả trên tương tự khi chiết bằng acetonitril [3] Như vậy, với kết quả thu được, đã chọn được điều kiện xử lý mẫu đơn giản, nhanh, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm thu được hiệu suất chiết cao (> 96%) đáp ứng được các yêu cầu đặt ra khi xây dựng qui trình xử lý mẫu: Chiết được các chất cần nghiên cứu với hiệu suất cao nhất, loại được nhiều chất nền khác (hạn chế được sự ảnh hưởng của nhiễu nền), qui trình xử lý mẫu này sẽ được áp dụng cho cả 3 phương pháp phân tích sắc ký sử dụng trong nghiên cứu Đối với nền mẫu dùng trong thẩm định phương pháp phân tích các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp, nghiên cứu cũng sử dụng phương pháp chiết trực tiếp khảo sát với các dung môi hay được dùng trong các nghiên cứu tương tự ở trong và ngoài nước là methanol, hỗn hợp (acetonitril - nước) (50:50) và đã chọn được methanol là dung môi phù hợp để xử lý mẫu phân tích bằng HPLC, HPTLC và LC-MS/MS

Phương pháp xử lý và dung môi chiết mẫu cũng phù hợp với các công bố đối với các chất phân tích đã được nghiên cứu [15], [18], [19]

HPTLC với ưu điểm chính là phân tích đồng thời được nhiều mẫu cùng một lúc trong cùng một điều kiện sắc ký, do đó tiết kiệm được thời gian phân tích, hóa chất đồng thời cũng cho độ lặp lại cao Khi phân tích bằng HPTLC nếu sử dụng bản mỏng có kích thước 20 cm ×10 cm có thể phân tích tối đa 20 mẫu trong một lần triển khai sắc ký chỉ trong vòng khoảng 30 phút do đó rất phù hợp trong phân tích sàng lọc, số lượng mẫu nhiều

Nghiên cứu này sử dụng silica gel 60 F254 phủ sẵn bản mỏng, là một vật liệu phổ biến và giá rẻ, kết hợp với các dung môi dễ tìm như cyclohexan, aceton, triethylamin, ethyl acetat, toluen, methanol, amoniac, acid acetic băng và cloroform để khảo sát và xây dựng các điều kiện sắc ký.

4.3.2.1 Qui trình phát hiện các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp bằng HPTLC

Với kết quả khảo sát hệ dung môi khai triển của các chất nhóm thuốc điều trị tăng huyết áp, có thể nhận thấy hệ dung môi có tính acid (với sự có mặt của acid acetic) amlodipin gần như không di chuyển, vết sắc ký của amlodipin vẫn nằm ở vạch xuất phát Điều này cũng phù hợp với tính chất của amlodipin besylat, một chất khó tan và phân cực Chính vì vậy, trong 4 hệ sắc ký đã khảo sát thì hệ 2 và hệ 4 không phù hợp do thành phần dung môi khai triển có chứa acid acetic Hệ dung môi khai triển 1 và 3, với thành phần amoniac phù hợp để tách amolodipin, tuy nhiên hai chất nifedipin và felodipin có tính chất và cấu trúc gần giống nhau nên với thành phần dung môi hữu cơ là hỗn hợp ethyl acetat và methanol thì 2 chất này khó tách khỏi nhau (có hệ số di chuyển không khác nhau) Với hệ 1, thành phần dung môi hữu cơ ngoài ethyl acetat và methanol đã cho thêm toluen, nhờ đó điều chỉnh được hệ số di chuyển giữa các chất có sự khác biệt phù hợp, đảm bảo cho các vết tách được khỏi nhau rõ ràng

Sử dụng tính năng quét phổ của phần mềm điều khiển HPTLC là một giải pháp hữu hiệu nhằm tăng tính chọn lọc để phát hiện và phân biệt các chất Trong 4 dược chất thuộc nhóm điều trị tăng huyết áp được nghiên cứu, furosemid có cấu trúc và tính chất có phần khác biệt so với 3 chất còn lại Với hệ sắc ký 2 và 4, furosemid di chuyển nhanh hơn, trong khi đó với hệ 1 (hệ dung môi khai triển đã lựa chọn) vết furosemid đã di chuyển khỏi vạch xuất phát nhưng giá trị Rf của furosemid chỉ khoảng 0,1 Do đó, vết furrosemid cũng dễ bị xen phủ bởi các thành phần khác trong nền mẫu phức tạp Nếu chỉ dựa vào màu sắc và Rf của vết chất phân tích thì cũng dễ có nguy cơ kết luận dương tính giả; nhưng dựa vào phổ đặc trưng và kết quả chồng phổ của chất phân tích trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn trong nghiên cứu sẽ làm tăng tính đặc hiệu, cho phép loại trừ được dương tính giả Điều này đã được thể hiện tại phần thẩm định độ đặc hiệu, hệ số match của cả 4 chất đều đạt lớn hơn 0,997 khi tiến hành chồng phổ vết tại vị trí tương ứng trên sắc ký đồ của các mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn của từng chất phân tích

Ngoài ra, trong nghiên cứu này, với qui trình xác định các dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp sau khi quét phổ UV-Vis của các vết sắc ký cũng đã lựa chọn được 2 bước sóng để tối ưu hóa việc phát hiện các chất: 254 nm để phát hiện NIF, FUR; 366 nm để phát hiện AML và FEL Thực tế, với việc lựa chọn được bước sóng phát hiện tối ưu đôi khi sẽ giảm được ảnh hưởng của nền mẫu và tăng được độ nhạy của phương pháp Độ nhạy của phương phỏp nghiờn cứu cú LOD khoảng 10 – 20 àg/ml dung dịch phân tích tương ứng lượng chất phân tích 0,10 – 0,40 mg/g tùy chất phân tích, giá trị này cao hơn (độ nhạy thấp hơn) so với LOD của phương pháp TLC-SERS có LOD là 24,0 μg/g [49], hay HPLC-PDA 0,03 – 0,05 àg/mL (tương đương lượng chất phõn tớch 0,66 – 1,25 àg/g đối với nền rắn và 0,10 – 0,24 àg/mL nền lỏng) đối với 4 chất nghiờn cứu [59] hoặc phương pháp LC-MS/MS có LOD là 0,3 – 1,0 ppm đối với 3 chất AML,

NIF và FEL [67] Tuy nhiên, với giá trị LOD xác định được của nghiên cứu đối với 4 dược chất AML, FEL, FUR, NIF trong nền mẫu chứa dược liệu cho phép phát hiện mức trộn các thuốc hóa dược này ở mức rất nhỏ so với liều dùng trong điều trị, ví dụ dược chất có liều dùng thấp nhất là amlodipin 5 mg/lần dùng thì phương pháp xây dựng được vẫn có thể phát hiện được mẫu dương tính với dược chất này nếu trộn tại mức lần lượt là 2% và 4% liều khi uống 1 g chế phẩm chứa dược liệu dạng lỏng và dạng rắn

4.3.2.2 Qui trình phát hiện các thuốc nhóm thuốc kháng histamin H1 bằng HPTLC

Với nhóm thuốc kháng histamin 1, dựa vào tài liệu tham khảo [18], [41] lựa chọn hệ dung môi khai triển phù hợp với các chất lựa chọn trong nghiên cứu này Cũng như các chất thuộc nhóm điều trị tăng huyết áp, các chất thuộc nhóm kháng histamin H1 được xây dựng với chương trình sắc ký sử dụng bản mỏng Silica gel 60 F254, phát hiện ở bước sóng 254 nm; nồng độ dung dịch chất phân tích là 0,1 mg/mL, thể tích chấm 10 àl tương ứng với lượng chất cần phõn tớch đưa lờn bản mỏng là 1 àg/vết

Với kết quả đánh giá hệ dung môi khai triển của các chất nhóm thuốc kháng chất phân cực nên hệ dung môi khai triển chủ yếu là dung môi hữu cơ ít phân cực với sự có mặt của triethylamin cho các pic tách hoàn toàn khỏi nhau với hệ số di chuyển Rf đều nằm trong khoảng tối ưu từ 0,2 đến 0,8 Hệ số match của cả 5 chất khi tiến hành chồng phổ vết tại vị trí tương ứng trên sắc ký đồ của các mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn của từng chất phân tích đều đạt lớn hơn 0,997 Như vậy, phương pháp đảm bảo độ đặc hiệu để phát hiện các chất nghiên cứu trên 2 nền chế phẩm chứa dược liệu khảo sát

Với qui trình xác định các chất thuộc nhóm thuốc kháng histamin H1 sau khi quét phổ UV-Vis của các vết sắc ký, các chất đều cho độ hấp thụ cao ở bước sóng 254 nm, do đó bước sóng được lựa chọn để phát hiện các chất là 254 nm Độ nhạy của phương phỏp nghiờn cứu cú LOD khoảng 6 - 10 àg/ml dung dịch phân tích tương ứng lượng chất phân tích 0,06 – 0,20 mg/g tùy chất phân tích Tương tự như bàn luận ở nhóm dược chất điều trị tăng huyết áp, với giá trị LOD xác định được của nghiên cứu đối với 5 dược chất CLOR, LOR, PRO, CYP và CIN trong nền mẫu chứa dược liệu cho phép phát hiện lượng trộn các thuốc hóa dược này ở mức rất nhỏ so với liều dùng trong điều trị, ví dụ dược chất có liều dùng thấp nhất là 2 mg đối với clorpheniramin maleat khi dùng phối hợp thì phương pháp xây dựng được vẫn có thể phát hiện được mẫu dương tính với dược chất này nếu trộn tại mức lần lượt là 5% và 10% liều khi uống 1 g chế phẩm chứa dược liệu dạng lỏng và dạng rắn

4.3.2.3 Bàn luận chung về phương pháp HPTLC

Như vậy, với 2 qui trình sắc ký đã tách thành công các chất của 9 chất với 2 nhóm tác dụng dược lý khác nhau Đặc biệt, với trang thiết bị hiện đại có được (Thiết bị HPTLC Camag có bộ phận Scanner) trong định tính các chất, kết quả chồng phổ cho phép loại được kết luận dương tính giả khi nền chế phẩm chứa dược liệu phức tạp có thể có tín hiệu không phải của chất phân tích xuất hiện tại vị trí tương ứng của nó trên sắc ký đồ Thực nghiệm với phương pháp HPTLC, phát hiện được 11/55 mẫu đem phân tích có chứa từ 1 đến 2 chất trong nhóm 5 chất kháng histamin H1 đã nghiên cứu; không phát hiện được mẫu nào trong số 56 mẫu đem phân tích có chứa 1 trong 4 dược chất điều trị tăng huyết áp đã nghiên cứu Các mẫu này tiếp tục được phân tích bằng phương pháp HPLC và LC-MS/MS để cho một kết luận chính xác

Ngoài ra, trong nghiên cứu này bản mỏng sử dụng vẫn là bản mỏng với kích thước hạt silica gel thông thường, hầu hết các phòng thử nghiệm đều có thể thực hiện được Dựa trên nguyên lý, qui trình phân tích này có thể áp dụng được trên bản mỏng với kích thước hạt mịn hơn (HPTLC plates) và sẽ cho hiệu năng tách tốt hơn Việc sử dụng được trên bản mỏng thông thường sẽ mở rộng được khả năng ứng dụng của phương pháp Các phòng thí nghiệm, nếu không có thiết bị HPTLC (có bộ phận quét phổ) vẫn có thể thực hiện được để đánh giá sơ bộ các mẫu dựa vào giá trị Rf của các vết sắc ký

Nghiên cứu đã thiết lập được 01 phương pháp HPTLC phân tích 5 dược chất nhóm kháng histamin (cyproheptadin, chlorpheniramin, loratadin, promethazin và cinnarizin) trong nền chế phẩm chứa dược liệu có tác dụng điều trị, hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, cảm cúm và 01 phương pháp HPTLC phân tích 4 dược chất nhóm điều trị tăng huyết áp, lợi tiểu (amlodipin, felodipin, furosemid, nifedipin) trong nền chế phẩm chứa dược liệu có tác dụng điều trị, hỗ trợ điều trị bệnh tăng huyết áp Các phương pháp này được thẩm định các tiêu chí độ đặc hiệu, LOD theo qui định của AOAC 2016