NHIEM VỤ VÀ NỘI DUNG: — Tổng quan tài liệu về các phương pháp điều chế, tính chất của nano đồng vàkhảo sát hoạt tính kháng khuẩn của nano đồng lên vi khuẩn Vibrioparahaemolyticus gây bện
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Hóa chất và thiết bị s%* Hóa chat
Hóa chất Phân tử khối (g/mol) Xuất xứ Đồng clorua 170 Xilong — Trung Quốc Natri hidroxit 40 Xilong — Trung Quốc Axit axetic 60 Xilong — Trung Quốc Axit ascorbic 176 Xilong — Trung Quốc Chitosan %DD ~ 85% DOMESCO Đồng Tháp s%* Thiết bị
— Thiết bị khuấy từ gia nhiệt RC — Velp (Italia)
— Thiết bị đo pH (Mettler Toledo MP 120)
— Cân phân tích TE214S (Sartorius — Duc)
— Máy ly tâm (Hettich Rotina 38)
— Thiết bị quang phổ UV — Vis (U — 2900, Hitachi — Nhật Bản) !
— Kính hiến vi điện tử truyền qua TEM (JEM — 1400) ?
— Thiết bị đo FTIR (Bruker tensor 27) ?
— Thiết bị đo EDX (kết hợp với FE— SEM, S — 4800 Hitachi) 4
! Thiết bị đặt tại phòng thí nghiệm vô cơ, đại học Bách Khoa Tp.HCM
?Thiết bị đặt tại phòng thí nghiệm vật liệu polymer và composite — Đại học Bách Khoa Tp.HCM 3 Thiết bị đặt tại Viện công nghệ hóa học Tp.HCM
Thiết bi đặt tại Viện vệ sinh dịch té trung ương — Ha Nội.
2.2 Phương pháp tong hợp và phân tích tính chất dung dịch nano đồng/chitosan s%* Hòa tan chitosan
Sử dụng 1,0 gam chitosan hòa tan trong 100 mL dung dịch axit axetic 1%, khuấy 50°C trong 3 ngày để chitosan tan hoàn toàn Ly tâm 3000 rpm trong 30 phút Rút 50 mL sử dụng cho quy trình điều chế nano déng/chitosan (nano Cu/CS) Bột chitosan trước hòa tan va dung dich chitosan 1% có trang thai như hình 2.1. a b
“* Quy trình điêu chế nano dong
Mô tả: Quá trình tong hợp hệ nano đồng theo phương pháp khử hóa học được thực hiện với tiền chất là muối đồng clorua CuCl2.2H2O Chất khử đông thời đóng vai trò chất chống oxy hóa là axit ascorbic Chất hoạt động bé mặt là chitosan Dung môi là nước Các bước tiên hành:
Bước |: Cân 0,1705g CuCl2.2H20 hòa vào 20 mL nước cất thu được dung dịch CuCl: 0,05M Điều chỉnh pH của dung dịch bang NaOH 0,1M.
Bước 2: 50 mL dung dịch chitosan được bố sung vào dung dịch muối đồng đã chuẩn bị Hỗn hợp được khuấy cho đến khi đồng nhất.
Bước 3: Cân 0,1761g axit ascorbic định mức 50 mL bằng nước cất Khuay cho đến khi thu được hỗn hợp đồng nhất và sử dụng NaOH 0,1M chỉnh giá trị pH.
Bước 4: Cho hỗn hợp đã chỉnh pH vào bình cầu ba cô 250 ml được lắp thiết bị sinh hàn Bắt đầu gia nhiệt và sục khí nitơ (khoảng 30 phút).
Bước 5: Khi nhiệt độ hỗn hợp đạt đến 80°C, dung dịch axit ascorbic được nhỏ từ từ vào trong hỗn hợp trong 3h dé thực hiện phản ứng khử Khí nito được giữ đúng lưu lượng cho đến khi phản ứng kết thúc Sau đó, làm nguội
25 dung dịch nano Cu/CS đến nhiệt độ phòng và lưu trữ trong bình kín Nhận biết hệ nano Cu/CS băng màu đỏ gạch đặc trưng.
Hiéu chinh Hiéu chinh Hiéu chinh pH pH pH
Sục khí N, trước 30 phút và giữ lưu lượng trong suốt phản ứng
Khuấy từ + gia nhiệt đến 80°C
Nhỏ giọt từ Ỷ từ trong 3 gid Phản ứng
Hình 2.2 Quy trình tong hop nano đồng/chitosan 2.3 Khảo sát các thông số anh hướng đến kích thước hat nano đồng/chỉitosan
2.3.1 Khảo sát sự anh hướng của pH
Giá trị pH môi trường được điều chỉnh theo các mức 4, 5, 6, 7 nhằm xác định ảnh hưởng của pH đến kích thước hạt nano đồng/chitosan Phản ứng được thực hiện với các thông số như bảng 2.1.
Bảng 2.1 Thông số các phản ứng trong khảo sát ảnh hưởng của pH
Axit CuCh.2H20 Nhiệt độ Thoi gian Mau ascorbic CS (mL)
2.3.2 Khao sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol Cu**/ axit ascorbic Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa muối đồng và dung dịch axit ascorbic băng cách giữ cô định các thông số va thay đổi ty lệ mol Cu**:AA theo các giá trị 1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4 Hệ được thực hiện ở điều kiện pH và hàm lượng chất hoạt động bẻ mặt đã khảo sát.
Bang 2.2 Thông số phản ứng trong quá trình khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol Cu*:axit ascorbic
Mau’ CS (mL) han ú ) độ pH phản ứng gam
2.3.3 Khảo sát anh hưởng của chat hoạt động bề mat chitosan Ảnh hưởng chất hoạt động bể mặt chitosan được khảo sát bằng cách thay đôi hàm lượng chitosan lần lượt 0.25%, 0,5%, 0.75%, 1% và 1,25% kết hợp với các điều kiện phản ứng đã khảo sát: pH (mục 2.3.1), tỷ lệ mol muối đồng va axit ascorbic (mục
Bảng 2.3 Thông số phản ứng trong quá trình khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bê mặt chitosan
2.3.4 Khao sát độ bên của hệ dung dich nano déng/chitosan
Tiến hành khảo sat độ bền của dung dịch nano Cu/CS sau các mốc thời gian 0 tuân, 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần bang phương pháp UV — Vis với các thông số pH, tỷ lệ mol muối đồng và axit ascorbic, hàm lượng chitosan đã khảo sát Kết luận thời gian tốt nhất để bảo quản dung dịch nano Cu/CS.
2.4 Các phương pháp đánh giá cấu trúc vật liệu 2.4.1 Phương pháp quang pho hồng ngoại Fourier (FT — IR)
Phuong pháp hữu hiệu cho phép định danh các nhóm chức phân cực trong vat liệu Việc sử dụng IR có thê chứng minh có khả năng có sự hiện diện cua chitosan trên bề mặt nano đồng khi có sự sai lệch vi trí các peak Phố FTIR của dung dịch nano đồng 400 — 4000 cm'!, chất nền là KBr.
Bảng 2.4 Bước sóng của các vạch phố
2.4.2 Phương pháp quang pho hấp thụ phân tứ (UV — Vis) Phương pháp được sử dụng rộng rãi dựa vào hiện tượng cộng hưởng Plamon bề mặt Đối với hạt nano đồng, phố UV — Vis sẽ cho bước sóng cực đại 550 — 600 nm.
Dựa vào vi tri peak và bề rộng pho, có thé dự đoán được kích thước hat và nông độ nano đồng có trong dung dịch (thuyết Mie) Đây là phương pháp đơn giản và dé vận hành.
Phương pháp UV — Vis được sử dụng dé xác định sự hiện diện của nano đồng có trong dung dịch với khoảng quét từ 400 — 700 nm và tốc độ quét 400 nm/min được đặt tại phòng thí nghiệm vô cơ trường đại học Bách Khoa Tp.HCM Mẫu được hút từ dung dịch và tiễn hành đo, không pha loãng.
Phương pháp cũng được sử dung dé xác định độ bền của dung dịch nano Cu/CS bang cách đánh giá sự thay doi độ hap thu của dung dich sau các mốc thời gian.
2.4.3 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Phương pháp sử dụng dé xác định kích thước va phân bố hạtcủa dung dich nano Cu/CS Các bước tiền hành:
— Mau dung dich nano Cu/CS được pha loãng (tránh hiện tượng mật độ hạt quá dày) và nhỏ lên một tâm len nhỏ có đường kính khoảng 2 mm.
— Mau sẽ được dé khô tự nhiên, sau đó cho vao thiết bị và hút chân không và tiền hành chụp mẫu ở các độ phóng dai 200 nm, 100 nm, 50 nm và 20 nm.
OOOC
0 ppm 50 L 50 wh 2,5 ppm 5 ppm 10 ppm
CuCl AA/CS — nano Cu/CS nanoCu/CS nano Cu/CS
Hình 2.4 Quy trình khảo sát khả năng kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên nước ao đã tiệt trùng
2.5.4 Khao sát kha năng kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên nước ao nuôi tôm không tiệt trùng
— _ Thực hiện kiểm tra nông độ của vi khuân Vibrio parahaemolyticus trên nước ao không tiệt trùng.
—_ Xử lý vi khuẩn trong nước ao không tiệt trùng bang dung dịch nano Cu/CS dé kiến tra khả năng kháng khuẩn Vibrio parahaemolyticus với nồng độ ức chế hoàn toàn vi khuẩn ở mục 2.43 s* Mô tả
— _ Bước 1: Chuan bị mẫu nước ao không tiệt trùng, sử dụng trải dia ở các nông độ dé xác định mật độ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ờ thời diém Oh.
— _ Bước 2: Sử dụng dung dịch nano Cu/CS dé khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên nước ao không tiệt trùng ở nồng độ đã kiểm chứng ở mục 2.4.3 theo nghiệm thức:
STT Tênmẫu V kuán (mL) V vật iẹu (UL)
Nông độ kháng hoàn toàn vi
— _ Bước 3: Thực hiện trải đĩa sau Oh, 2h và 4h với nồng độ đã kiểm chứng
— _ Bước 4: U các đĩa khuẩn đã trang trong tủ 4m qua đêm ở 30°C.
— _ Bước 5: Đếm khuẩn và ghi nhận số liều Xử lý số liệu và xác định kha năng ức chế Vibrio parahaemolyticus trên nước ao không tiệt trùng.
Rút ra kết luận và nhận xét về khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của dung dịch nano Cu/CS
KET QUA VA THAO LUAN
x10° - 0.0 ỡNNNjjNNĐ NNNNNNNNN ùNNNNNNNNNNN
Hình 3.16 Biéu đồ mật độ vi khuẩn (CFU/mL) Vibrio parahaemolyticus xử lý
4) bang nano Cu/CS Thực hiện xử lý số liệu với công thức (2) (phụ lục T) thu được kết quả khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong môi trường nước ao tiệt trùng Đồ thị thé hiện khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (hình 3.17) cho kết qua như sau:
‘D> 20- of) s Đ 0 ơ T T Bộ Š ppm 10 ppm 20 ppm
Hình 3.17 Biểu đồ khả năng ức chế (%) Vibrio parahaemolyticus của dung dịch nano Cu/CS trên nước ao tiệt trùng ở các thời điểm Oh, 2h và 4h Sau 2h và 4h, Vibrio parahaemolyticus khi xử lý bằng dung dịch nano Cu/CS ở nông độ 0 ppm trong nước ao tiệt trùng vẫn tăng sinh lần lượt tăng 33,32% và 34,34% so với mật độ vi khuẩn trong dung dịch tại thời điểm 0h.
Khi được xử lý bằng nano Cu/CS ở 5 ppm thì mật độ khuẩn giảm đáng kể sau 2h (phan trăm ức chế 99.98%) và sau 4h xử lý thì hoàn toàn không còn khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch TCBS.
Khi xử lý bằng nano Cu/CS ở 10 ppm và 20 ppm thì đĩa thạch sau 2h và 4h hầu như không có khuẩn lạc.
3.2.2 Khao sát khả năng kháng khuẩn của nano đồng/chitosan va đối chứng Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch nano đồng/chitosan và các đối chứng gồm dung dịch Cu2* và dung dịch AA/CS Đối chứng Cu?! (5 ppm) và AA/CS (cách pha dung dịch được trình bày trong phân phụ lục 1).
46 dung dịch dung dich dung dịch đồng clorua AA/CS nano Cư/CS Hình 3.18 Các mẫu khảo sát khả năng kháng khuẩn Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trên các dung dịch đối chứng lần lượt là dung dịch Cu” và dung dich AA/CS; dung dịch nano Cu/CS ức chế khuẩn các nồng độ dung dich ở các nồng độ 2,5 ppm, 5 ppm và 10 ppm Thí nghiệm được thực hiện hai lần với các điều kiện nước ao không thay đôi để có xác định được độ tin cậy của khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của dung dịch nano Cu/CS Kết quả trung bình kha năng ức chế vi khuẩn (%) Vibrio parahaemolyticus được thé hiện trong hình 3.19.
Hình 3.19 qua các thời điểm 2h, 4h, Cu** và dung dịch AA/CS không thé hiện khả năng kháng khuẩn, môi trường còn là điều kiện cho dịch khuẩn tăng sinh Sau 2h và 4h, môi trường dung dịch Cu** giúp Vibrio parahaemolyticus tăng sinh 47,13% và 53,05% tương ứng Bên cạnh đó, môi trường AA/CS tăng sinh Vibrio parahaemolyticus 51% và 27,23% sau 2h và 4h.
Thí nghiệm sau khi xử lý băng vật liệu thì Vibrio parahaemolyficus với 2.5 ppm sau 2h thì khả năng ức chế được 96,39% vi khuan và ức chế 97,51% sau 4h.
Thí nghiệm sau khi xử lý bằng vật liệu thi Vibrio parahaemolyticus với 5 ppm sau 2h thì khả năng ức chế được 99 68% vi khuẩn và ức chế hoàn toàn ở 5 ppm sau
Thí nghiệm sau khi xử lý bằng vật liệu thì Vibrio parahaemolyticus với 10 ppm sau 2h và 4h thì ức chế hoàn toàn Vibrio parahaemolyticus.
7 Oppm AA/CS CuF5ppm percentage inhibitation (%) 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm
Hình 3.19 Biéu đồ khả năng ức chế (%) vi khuan Vibrio parahaemolyticus Xử lý băng nano đồng và các đối chứng Sau khi lặp lại thí nghiệm hai lần ở các điều kiện cho mỗi thí nghiệm là đồng nhất, có thé rút ra các kết luận sau:
> Các đối chứng không thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Do đó, khi xử lý bang dung dịch nano Cu/CS ở các nồng độ 2,5 ppm, 5 pmm và 10 ppm thì hoạt tính kháng khuẩn thu được chỉ do hoạt tính của nano Cu/CS.
> Kết quả thí nghiệm cho điều kiện tốt nhất Vibrio parahaemolyticus trong môi trường nước ao tiệt trùng là 5 ppm sau 4h.
> Kết quả sử dụng nông độ nano Cu/CS ở 5 ppm được lựa chon dé khảo sát khả năng kháng khuẩn trong nước ao không tiệt trùng.
3.3 Khao sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch nano đồng đối với vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus trên nước ao không tiệt trùng
Khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus va Vibrio spp khác được thé hiện chỉ tiết trong ba thí nghiệm lặp lại ở phụ lục | phan 2 Kết quả trung bình được thể hiện ở hình 3.20.
Hình 3.20 Biéu đồ khả năng ức chế (%) vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và Vibrio spp trong nước ao không tiệt trùng khi xử lý bang nano Cu/CS ở 5 ppm Sau 2h và 4h thì vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và các Vibrio spp khác vẫn tiếp tục tăng sinh So sánh với môi trường nước ao tiệt trùng thì khả năng tăng sinh của Vibrio spp nhanh hon Vibrio parahaemolyticus.
Sau 2h va 4h khi xử lý bang dung dịch nano Cu/CS thì không tim thay các nhóm vi khuẩn Vibrio trên đĩa thạch Do đó, có thé kết luận khả năng ức chế vi khuẩn trong môi trường nước ao không tiệt trùng là hoàn toàn Dung dịch nano Cu/CS chăng những kháng được Vibrio parahaemolyticus mà còn kháng được các nhóm vi khuẩn Vibrio gây bệnh khác: bệnh phân trăng ở tôm
KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ
Hệ dung dich nano déng/chitosan được tổng hợp băng phương pháp khử hóa học với tiền chất là đồng clorua, chất khử là axit ascorbic, chất bảo vệ là chitosan và dung môi hòa tan các chất là nước Các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước hạt được khảo sát và cho kết quả tốt nhất là pH = 7, tỷ lệ mol Cu^*:AA là 1:1, hàm lượng chitosan (w/v) 1%, độ bền của hệ đạt được sau 1 tháng Kết quả thu được hạt nano đồng/chitosan có kích thước nhỏ 1 — 2 nm.
Các tính chất hóa lý đặc trưng cho hệ nano đồng/chitosan được kiểm tra bằng các phương pháp phân tích hiện đại: TEM, UV — Vis, EDX, FTIR.
Khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn của dung dịch nano déng/chitosan trong nghiên cứu này cũng đã cho thay tính kha thi cua việc ứng dung vật liệu nay lên vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus và các nhóm vi khuan Vibrio khác Kết quả thu được kháng
Vibrio parahaemolyticus sau 4h trong môi trường nước ao tiệt trùng và sau 2h trong môi trường nước ao nhiễm khuân.
Cần tiếp nối và mở rộng phạm vi khảo sat để xác định các điều kiện tối ưu tương ứng giúp cho việc tổng hợp nano đồng ngày trở nên dé dàng và pho biến, từ đó giúp cho việc ứng dụng loại vật liệu này vào trong công tác bảo vệ thực vật có tính thực tiễn.
Mở rộng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu nano đồng trên các loại vi khuẩn gây bệnh trên ao nuôi tôm và xác định dư lượng đồng để ứng dụng nano déng/CS vào lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản.
Khảo sát và so sánh khả năng kháng khuẩn của nano Cu/CS đã được điều chế và các sản phâm thương mại.