PHẦN TỔNG QUAN Bảng 1: Thành phần tinh dầu Hương phụ biển và Hương phụ vườn 8 Bảng 2: Các chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu HPB và HPV 9 Bảng 3: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của nước
ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT
Đặc điểm cây Hương phụ biển
Tên khoa học: Cyperus stoloniferus Retz.1786
Cây Hương phụ biển (Cyperus stoloniferus) Ngành: Mộc Lan (Magnoliophyta)
Bộ: Cói (Cyperales) Họ: Cói (Cyperaceae) Chi: Cyperus
Tên Việt Nam: Tam lăng, Cói gấu biển; Cú biển; Cói củ; Cỏ gấu biển; Hương phụ biển;
Tên khác: Cyperus litoralis R Br (1810)., Cyperus bulbosus var elatus Camus
(1912)., Cyperus stoloniferus Vahl (1806)., Cyperus stoloniferus sensu Phamh (1993)
Mô tả cây hương phụ biển:
(a) dạng chung, (b) bông chét, (c) thân rễ
Hình 1:Cây hương phụ biển
Trang 2 Cây Hương phụ biển cỏ lưu niên, có thân rễ hình thoi, thể chất chắc dài từ 1- 5cm, đường kính 0,5- 1,5 cm, mặt ngoài màu nâu hay nâu sẫm có nhiều nếp nhăn dọc và đốt ngang (mỗi đốt cách nhau 0,1-0,6 cm) trên mỗi đốt có lông cứng mọc thẳng góc với củ, có nhiều vết tích của rể con Vết bẻ có sợi bóng nhoáng, cắt ngang thấy rỏ phần vỏ có màu xám nhạt; phần vỏ có màu hồng nhạt, trụ giữa có màu nâu sẫm Mùi thơm, vị hơi đắng ngọt, sau đó có vị hơi cay Thân cao 15-30 cm, có 3 cạnh lá rộng 2-3 mm
Cụm hoa có 2-3 lá bắc dài; tia ngắn; bông chét nâu, dài 6-12 mm, vẩy dài 2-2,6 mm, không mũi
Hình 2: Hương phụ biển mọc hoang ở vùng cửa biển tỉnh Phú Yên
Hình 3: Thân rễ Hương phụ biển Hình 4: Bột thân rễ Hương phụ biển
Phân bố và sinh thái
Chi Chi Cyperus bao gồm khoảng 700 loài phân bố rộng khắp thế giới, tại Việt Nam có khoảng 45 loài, đặc biệt là Hương phụ vườn và Hương phụ biển Hương phụ phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ và châu Đại Dương Ở Việt Nam, Hương phụ biển thường tập trung trên các vùng cát ven biển hoặc bãi cát cửa sông trải dài từ Móng Cái đến Hà Tiên, nhất là ở Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam - Ðà Nẵng, Bình Định, Phú Yên và Bình Thuận, đôi khi chúng tạo thành quần thể lớn.
Hương phụ được thu hoạch quanh năm Thông thường, thời điểm thích hợp là vào mùa xuân hoặc mùa thu Người ta sẽ vun củ lại thành đống, sau đó đốt cháy lá và rễ con Cuối cùng, lấy củ đã đào lên đem phơi hoặc sấy khô để bảo quản lâu dài.
Hương phụ biển là nguồn dược liệu được sử dụng rất phổ biến trong dân gian
Hiện trên thị trường có hai loại Hương phụ vườn (Cyperus rotundus L.) và Hương phụ biển (Cyperus stoloniferus Retz.) Hằng năm, loại dược liệu này cung cấp hàng trăm tấn cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu
Bộ phận dùng: Thân rễ
Thông thường, người ta đào củ về rửa sạch đất cát, phơi khô, đốt cho cháy hết lông, cất nơi khô ráo đề dùng dần làm thuốc.
Tác dụng dược lý của Hương phụ biển
Tính vị: Vị cay, hơi đắng, tính hàn
Quy kinh: Vào kinh Can, kiêm vào 12 kinh mạch
Tác dụng: Thuốc điều khí, khai uất, thông kinh
Chủ trị: Thông kinh nguyệt không đều, chữa các chứng trong thai sản, trừ đờm, tiêu thực, giảm đau
− Can khí uất kết: Đau vùng hông sườn và cảm giác tức ở ngực: Dùng Hương phụ với Sài hồ, Uất kim và Bạch thược
− Can khí phạm Vị biểu hiện như chướng và đau bụng và thượng vị: Dùng Hương phụ với Mộc hương, Hương duyên và Phật thủ
− Vị hàn, khí trệ: Dùng Hương phụ với Cao lương khương trong bài Lương Phụ Hoàn
− Can hàn: Sưng đau tinh hoàn hoặc thoát vị: Dùng Hương phụ với Tiểu hồi hương và Ô dược
− Can khí uất trệ: Kinh nguyệt không đều, vú căng và đau: Dùng Hương phụ với Sài hồ, Đương qui và Xuyên khung
Dùng sống: Thông khí, trừ đờm
Tẩm sao: Vào Can Thận, điều khí huyết, thông kinh, huyết hư, nhuận táo, hành kinh lạc
Sao cháy: Chỉ huyết, bổ hư
Theo Trung Y: Rửa sạch mài xác trên đá nhám cho sạch hết vỏ, ngâm vào nước đái trẻ em cho thấu mềm Phơi khô, giã nát, hoặc dùng sống hoặc sao, hoặc tẩm giấm hay muối tuỳ từng trường hợp (Bản Thảo Cương Mục)
Theo kinh nghiệm Việt Nam: Khi đào về người ta phơi khô rồi sao cho cháy lông và rễ con
Hương phụ mễ (sinh Hương phụ): Phơi thật khô, giã với trấu (cứ 1kg củ cho vào 0,5 kg trấu) bằng chày nhọn đầu cho trụi hết lông, vỏ Việc làm sạch vỏ và lông đòi hỏi nhiều công, giã không khéo sẽ bị nát
Hương phụ thán là Hương phụ rửa sạch, phơi khô, sao cháy đen để tồn tính, bắc chảo ra úp vung cho nguội rồi tán bột Hương phụ chế là cách thường dùng, lấy 1 kg Hương phụ mễ, chia làm 4 phần: 1 phần giã nhỏ, 1 phần sao vàng, 2 phần còn lại sao cháy đen.
Phần I: 250 g tẩm với 200 ml giấm (có độ Acid acetic trên dưới 5%)
Phần 2: 250 g tẩm với 200 ml đồng tiện của trẻ em khoẻ mạnh (lấy phần giữa nước tiểu)
Phần 3: 250 g tẩm với 200 ml nước muối 15%
Phần 4: 250 g tẩm với 200 ml rượu 40 o
Trang 5 Mỗi phần sau khi tẩm để 1 đêm, sáng hôm sau giã dập, sao khô đến khi thấy mùi thơm là được, trừ phần tẩm rượu thì sao khô giã dập rồi mới tẩm rượu Để riêng từng phần cho vào lọ kín Có thể trộn chung 4 phần vào nhau đựng trong lọ kín Sau khi tẩm sao, tán bột để làm hoàn tán Phần tẩm giấm và tẩm đồng tiện là 2 phần quan trọng nhất, không thể không tẩm hai thứ này được
Kiêng kỵ: Chứng âm hư và huyết nhiệt không nên dùng
I.3.2 Tác d ụ ng d ượ c lý [1,2, 3, 10, 13, 15, 17, 23, 26, 30, 36, 38, 40, 41,42,43] Đối với tử cung [1, 2, 3, 17] :Theo Trương Phát Sơ, Trương Diệu Đức và Lưu
Thiệu Quang đã dùng vị Hương phụ nguồn gốc ở tỉnh Quảng Đông, chế thành cao lỏng 5% tiến hành thí nghiệm 102 lần trên tử cung cô lập của thỏ, mèo, chó và chuột bạch đã chứng minh hương phụ có tác dụng ức chế co bóp tử cung, đồng thời làm giảm trương lực Trên tử cung có chữa cũng như trên tử cung bình thường, cao Hương Phụ đều có tác dụng ức chế So sánh với đương quy, tác dụng ức chế co bóp tử cung của Hương Phụ yếu hơn.Thành phần tinh dầu chiết từ Hương phụ có tác dụng kiểu estrogen, nhưng không mạnh
Tác dụng giảm đau [1, 2, 3, 10]: Dịch chiết bằng cồn từ Hương phụ, thí nghiệm trên chuột nhắt trắng gây đau bằng kích thích điện, bằng đường tiêm dưới da với liều 0,5 ml/20 g, dung dịch 20% có tác dụng tăng cao ngưỡng kích thích gây đau
Tinh dầu hương phụ có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương, được chứng minh qua các nghiên cứu trên động vật Cụ thể, trên chuột nhắt trắng, tinh dầu hương phụ kéo dài thời gian gây ngủ do Pentobarbital gây ra Trên thỏ, nó tăng cường tác dụng gây mê của Scopolamin Theo cơ chế tác dụng, hương phụ ức chế chủ yếu quá trình dẫn truyền các xung thần kinh qua synap của tế bào vùng hải mã và bó tháp, nhưng không ảnh hưởng đến dẫn truyền qua sợi trục thần kinh.
Tác dụng chống nôn [1, 2, 3, 23, 40, 43]: Dung dịch trích từ rễ bằng ethanol có tác dụng chống nôn mữa nơi chó do ở hoạt tính đối kháng phản ứng tạo nôn mữa gây ra bởi apomorphine
Hoạt tính kháng viêm và hạ nhiệt [1, 2, 3, 17] : Dịch chiết từ rễ Hương phụ bằng những dung môi hữu cơ có tác dụng chống sưng rất rõ đối với phản ứng phù tạo ra do carageenan nơi chuột bạch tạng dịch chiết bằng petroleum ether ức chế được 75%, chloroform 60.6 %, methanol 57.7 % ở liều 10 mg/kg, so sánh với hydrocortisone ức chế được 57.7 %, hoạt chất chống viêm chủ yếu là α- cyperen có tác dụng ức chế sự hình thành prostaglaridin E2 Dịch chiết bằng alcol từ thân có tác dụng hạ nhiệt, có thể so sánh với sodium salicylate (trong thử nghiệm gây tăng thân nhiệt bằng men) Các hoạt tính này được cho là do ở beta sitosterol trong cây
Peroxycalamenene, a sesquiterpene endoperoxide isolated from the stem of Clerodendrum verbenaceum, exhibits significant antiplasmodial activity against malaria parasites, with an EC50 value of 2.33 × 10-6 M This compound has demonstrated efficacy against both the asexual and sexual stages of the malaria parasite, providing a potential therapeutic intervention for combating malaria.
Các dịch chiết từ thân Hương phụ bằng dichloromethane, petroleum ether và methanol cho thấy tác dụng chống Plasmodium falciparum chủng K1 Liều IC50 là 5-9 g/ml cho dịch chiết bằng dichloromethane, và 10-49 g/ml cho petroleum ether hay methanol
Tác dụng chống béo phì [1, 2, 3] : Trong một thử nghiệm trên 30 người mập phì cho dùng bột tán từ thân Hương phụ trong 90 ngày: Kết quả ghi nhận có sự giảm cân cùng với giảm cholesterol và triglycerides trong máu
Khả năng bảo vệ tế bào [1, 2, 3, 38, 40, 41]: Nước sắc từ rễ Hương phụ đã được đánh giá về khả năng chống lại các tác hại gây ra nơi bao tử do ethanol:
Dịch chiết, cho uống bằng những liều 1.25, 2.5 và 4 gram bột rể thô/ kg cho thấy có tác dụng chống u loét, tác dụng này tùy theo liều thuốc sử dụng Hoạt tính bảo vệ có liên hệ đến việc ức chế bài tiết dịch vị và các chất prostaglandins nội sinh)
Tác dụng trên các sắc tố [1, 2, 3] : Dịch chiết bằng methanol, sau khi được thăng hoa, có tác dụng kích thích sự sinh sản các tế bào mang sắc tố (melanocytes), giúp giải thích việc sử dụng Hương phụ trong các sản phẩm làm đen tóc, thoa da
MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY HƯƠNG PHỤ BIỂN
Các công trình nghiên cứu tại Việt Nam
Mặc dù Hương phụ biển là một dược thảo được biết đến từ rất lâu nhưng cho đến nay có rất ít công trình trong nước cũng như thế giới nghiên cứu về Hương phụ biển
Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng, Vũ Văn Điền, Vũ Ngọc Lộ (1995) đăng trên Tạp chí Dược học đã thành công phân tích và xác định được thành phần hóa học trong tinh dầu Hương Phụ biển và Hương Phụ vườn, bao gồm các chất sau:
Bảng 1: Thành phần tinh dầu của Hương phụ vườn và Hương phụ biển
23 Isomer of 9H cyclo isolongifolen 0,95 1,15 24 Đồng phân của cyperon 14 12,26
Các chỉ tiêu hóa lý của hai loại tinh dầu
Bảng 2: Các chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu HPB và HPV
Các chỉ tiêu HPB HPV
Nhóm tác giả Vũ Văn Điền, Cao Văn Thu [9] Tạp chí dược học, số 2, 1994 “ Một số kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của hương phụ biển họ cói (Cyperaceae)” được trình bày:
Bảng 3: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của nước sắc hai loài HP
Hương phụ vườn (HPV) Hương phụ biển (HPB) Kháng sinh chuẩn
Chủng vi khuẩn HPVS HPVC1 HPVC2 HPBS HPBC1 HPBC2 Pen Step
− : không thể hiện tác dụng 0: không thử
Kết quả: Nước sắc HPV, HPB dạng sống và dạng chế có tác dụng trên 5 chủng vi khuẩn: B.S, E.C, Pro, Sar, Star, trong đó HPB có tác dụng mạnh hơn
Trang 11 Bên cạnh đó nhóm tác giả cũng thử tác dụng kháng khuẩn của các nhóm hợp chất alcaloid, saponin, glycosid, tinh dầu được chiết ra từ HPB và HPV Kết quả trình bày ở bảng sau:
Bảng 4: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn của tinh dầu, alcaloid, glycosid,
Saponin không có tác dụng kháng khuẩn, glycosid, alcaloid, tinh dầu có tác dụng trên cả 10 chủng vi khuẩn trong đó glycosid thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất
Nhóm tác giả Vũ Văn Điền, Mai Tất Tố [10] Tạp chí dược học, số 1, 1994 bài báo “ Góp phần nghiên cứu tác dụng giảm đau của Hương Phụ biển” cho thấy:
Trang 12 Nước sắc của hai loài HP (HPV và HPB)ở dạng sống và dạng chế đều có tác dụng giảm đau nội tạng
Phương pháp chế theo Viện Y học cổ truyền Việt Nam có tác dụng mạnh hơn dạng sống và phương pháp chế theo DĐVNI
Trong các nhóm hợp chất chiết tách từ HPB và HPV thì alcaloid có tác dụng giảm đau mạnh nhất, sau đó là tinh dầu, glycosid và saponin không có tác dụng giảm đau
Phương pháp gây đau bằng nhiệt thì hai loài Hương Phụ đều không có tác dụng giảm đau
Nước sắc của hai loài HP đều không độc qua đường uống, tinh dầu HPB có LD50 là 12,1ml/kg Nếu xét về mặt giảm đau nội tạng thì có thể dùng HPB thay cho HPV.
Các công trình nghiên cứu trên thế giới
II.2.1 Thành phần hóa học của thân rễ Hương phụ biển [1, 2, 3, 13]
Hiện nay chưa xác định hết các hợp chất có trong cây Hương phụ biển
Tinh dầu 0,62%; Alcaloid 0,128%; glycosid tim 0,77%; Saponin 0,05%;
Flavonoid 0,78%, giàu Sesquiterpen Tinh dầu chứa Cyperen 8,9%; β− caryophylen 4,89%; 5β-H, 7 β, 10α-selinen 4(14)-11-dien 10,67%; Cyperotudon 2,88%; Cyperolon 1,39%; Caryophylen oxid 21,31%; 9H- cyclolongifolen-8-oxo 2,35%; patchoulenon 2,69%, α−cyperon 3,95%; α−cyperol 4,73%, đồng phân của cyperon 14% Ngoài ra trong Hương phụ còn chứa rất nhiều tinh bột
Năm 1978 các tác giả D Allan, R J Wells, R L Correll and J K Macleod trình bày sự hiện diện của một số quinoid có trong chi cyperus, riêng trong cây Hương phụ biển có hai loại quinoid là Cyperaquinon và Hydroxycyperaquinon
Trang 13 Trên thế giới có rất ít công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cây Hương phụ biển cho nên chúng tôi chọn thành phần hóa học của cây HPV (Cyperus rotundus L) để làm tài liệu tham khảo Những cây cùng một chi có thể chứa những hợp chất giống nhau hoặc hợp chất có cùng loại khung sườn
II.2.2 Một số hợp chất tiêu biểu được cô lập từ HPV ( Cyperus rotundus L) a Hợp chất Monoterpen [24] b Hợp chất sesquiterpen [13, 15, 28, 29, 31, 36, 39]
Trang 15 c Hợp chất Sesquiterpen alcaloid [35] d Các hợp chất Saponin [33] e Hợp chất steroid [18]
Oleanolic Acid oleanolic acid-3-O-neohesperidoside.
Trang 16 f Các triterpen [24] g Hợp chất Furochromone [25]
Trang 18 Các hợp chất Flavonoid [19, 20, 21, 26, 41]
SƠ LƯỢC VỀ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam
Đái tháo đường là một trong những căn bệnh phổ biến, đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe con người Theo ước tính của Viện nghiên cứu đái tháo đường quốc tế thì năm 2010 có khoảng 221 triệu người mắc bệnh đái tháo đường và đến năm 2025 sẽ tăng lên 330 triệu người ( gần 6% dân số toàn cầu).Theo kết quả nghiên cứu được bệnh viện nội tiết trung ương công bố Việt Nam năm 2010 có khoảng 5,3 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, đến năm 2025 số người mắc có thể tăng lên 8 triệu người và là một trong
Trang 20 những nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế giới (khoảng 8%-10% một năm)
Bệnh đái tháo đường
III.2.1 Khái niệm Đái tháo đường (Diabetes Mellitus) là hội chứng rối loạn sự thay thế chuyển hóa các chất glucose, protein và chất béo do trong cơ thể thiếu insulin hoặc tăng thêm những kích thích chống insulin gây nên Đặc trưng của nó là trong quá trình tuần hoàn máu, nồng độ glucose tăng cao khác thường, dẫn đến lượng đường trong máu và trong nước tiểu quá cao, xuất hiện triệu chứng ba nhiều một ít điển hình, tức uống nhiều, tiểu nhiều, ăn nhiều và thể trọng giảm nhẹ
Có 2 dạng đái tháo đường chính:
− Đái tháo đường type 1: Phụ thuộc hoàn toàn vào insulin Dạng tiểu đường này xảy ra khi tuyến tụy sản xuất ra quá ít hay không sản xuất ra insulin
− Đái tháo đường type 2: Không phụ thuộc vào insulin Trong dạng bệnh này, tuyến tụy vẫn tiếp tục tiết insulin, nhưng các tế bào của cơ thể trở nên đề kháng với tác dụng của insulin.
Hóa dược trị đái tháo đường
III.3.1 Ức chế α-glucosidase Các loại thuốc thường dùng:
• Voglibose(C10H21NO7) Dùng cho đái tháo đường type 2 Cơ chế: Acarbose, miglitol và voglibose ức chế men α-glucosidase trong ruột khiến các polysaccharose (tinh bột, đường mía saccharose …) chậm thủy phân thành glucose, kết quả là glucose vào máu từ từ nên glucose huyết không tăng nhiều sau bữa ăn
III.3.2 Nhóm Sulfonylurea Các loại thuốc thường dùng:
Trang 21 Cơ chế: Nhóm Sulfonylurea có tác dụng kích thích tế bào beta của tuyến tụy tiết ra insulin Sulfonylurea chỉ tăng tiết insulin chứ không liên quan đến việc tổng hợp chất này.
PHƯƠNG PHÁP ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE
Men α-glucosidase
Là một loại enzyme nằm ở tế bào biểu mô niêm mạc ruột non Tên khác: Maltase, Glucoinvertase, Glucosidosucrase, Maltase-glucoamylase, α- glucopyranosidase, Glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α- 1,4-glucosidase
(Nhóm hydrolaza: Nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân)
Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose
Sơ đồ 1: Vai trò của α-glucosidase trong quá trình hình thành glucose
Dưới tác dụng của men amylase, tinh bột (kết hợp nhiều phân tử đường glucose) sẽ bị thủy phân thành maltose (gồm 2 phân tử đường glucose) Sau đó, với tác dụng của men α-glucosidase, đường maltose sẽ tiếp tục bị thủy phân thành đường glucose
Ngoài sự hấp thu tinh bột, cơ thể còn hấp thu saccharose (gồm 1 phân tử đường glucose kết hợp với 1 phân tử đường fructose) Dưới tác dụng của men α-glucosidase, đường saccharose cũng bị thủy phân thành đường glucose và đường fructose
Glucose huyết tăng Ức chế Ức chế
Trang 22 Các phân tử đường glucose này sẽ được hấp thụ vào mạch máu trong cơ thể con người và trở thành glucose huyết cung cấp năng lượng cho mọi hoạt động sống
Nhưng với sự xuất hiện của một chất ức chế nào đó, men α-glucosidase sẽ hạn chế hoạt động, quá trình thủy phân maltose và saccharose diễn ra chậm Vì vậy hàm lượng glucose không tăng mạnh sau khi ăn.
Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế men α-glucosidase
Phương pháp ức chế men α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường type 2 là phương pháp được ưu tiên sử dụng vì có cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy… như các phương pháp khác
Phương pháp in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa trên nguyên tắc:
− Men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose
− Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside, dưới tác dụng của men α-glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường D-glucose và p-Nitrophenol
− P-Nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 405nm Từ đó xác định được lượng D-glucose sinh ra.
Tính toán % ức chế và chỉ số IC 50
IV.4.1 % ức chế Hoạt tính ức chế của các cao chiết và chất sạch được tính theo công thức:
Do [glc] = [PNP] nên: % ức chế = [ ] [ ] 100
Vì [PNP] tuyến tính bậc 1 với A nên
[PNP]0: Nồng độ PNP sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM)
Trang 23 [PNP]i: Nồng độ PNP sinh ra khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i (mM)
[A]0: Độ hấp thu trung bình khi không sử dụng chất ức chế [A]i: Độ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế ở nồng độ i IV.4.2 Chỉ số IC50
Chỉ số IC50 mô tả nồng độ chất ức chế ức chế 50% phản ứng Chỉ số này có thể xác định từ đồ thị hoặc phương trình đường cong thể hiện mối quan hệ giữa phần trăm ức chế và nồng độ chất ức chế.
I NGUYÊN LIỆU I.1 Thu hái nguyên liệu
Nguyên liệu là thân rễ hương phụ biển tươi được thu hái ở vùng ven biển tỉnh Phú Yên vào tháng 6/2011, do cử nhân sinh học Hoàng Xuân Lâm, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu và Sản xuất dược liệu miền Trung, huyện Đông Hòa, tỉnh Phú Yên xác định tên khoa học là Cyperus stoloniferus RETZ., mẫu thực vật hiện đang được lưu giữ tại Phòng bảo tồn cây thuốc của Trung tâm
I.2 Xử lý mẫu nguyên liệu
Thân rễ hương phụ biển được rửa sạch, loại bỏ lông và nghiền nhỏ trước khi chưng cất tinh dầu và điều chế các cao thô.
Thiết bị
− Điểm tan chảy (melting point) được đo trên máy IA 9000 Series, của Anh, dùng mao quản không hiệu chỉnh
− Máy đo quang phổ hồng ngoại VECTOR 22 của Mỹ, dùng viên nén KBr
− Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân AV500, Bruker
− Máy khối phổ LCMS 1260/6120 AGILENT TECHNOLOGIES, của Mỹ
− Máy khối phổ AGILENT 1100 (LC/MS, MSD Ion Trap)
− Máy sắc kí khí ghép khối phổ: Agilent Technologies 6890N
− Sắc kí cột trung áp dùng silicagel 60, Merc, đường kính hạt0,040 – 0,063mm
− Sắc kí điều chế - pha đảo dùng silicagel 60, Merc, đường kính hạt 5μm
− Sắc kí bản mỏng được thực hiện trên bản silicagel MERC – KG 60 F254 tráng sẵn , kích thước 20×20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,22 mm
− Máy cô quay chân không B CHI Ratavapor R-200
− Máy đo độ hấp thu Biotek model Elx500
Hóa chất
− n-hexan, Cloroform, ethyl acetate, acetone, methanol,và ethanol
− Dung dịch p-nitrophenol (PNP) chuẩn 0.1mM (Merck)
− Dung dịch p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-Glc) 0,255 mM (pha trong nước khử ion) (Merck)
− α-glucosidase (α-Glc) 0.031U/ml (pha trong nước khử ion lạnh) (Sigma)
− Mẫu đối chứng thuốc viên acarbo 50 mg.
ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT TRONG THÂN RỄ HƯƠNG PHỤ BIỂN
Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid
Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa với alkaloid
Công thức: 1,35g HgCl 2 hòa tan trong 100 ml dung dịch KI 5%
Dấu hiệu nhận biết: tạo kết tủa màu trắng vàng
+Dung dịch A: 850 mg Bi(NO 3 ) 3 5H 2 O trong 40 ml H 2 O và 10 ml acetic băng
+Dung dịch B: Hòa tan 8 g KI trong 20 ml H 2 O
Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử
Dấu hiệu nhận biết: tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ
Công thức: Hòa tan 5g Iod trong 100 ml dung dịch KI 10%
Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen
Công thức: I 2 2,5 g và 5,0 g KI hòa tan trong 10 ml nước cất
Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu hoặc màu vàng đậm
Acid picric bão hòa trong H 2 O
Trang 26 Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu từ vàng cam đến đỏ
Cân 5 g bột thân rễ Hương phụ biển ngâm với 80 ml HCl 1% trong 4-6 giờ Lọc lấy dịch trong làm mẫu thử
-Với thuốc thử Wagner: thấy kết tủa
-Với thuốc thử Mayer: thấy kết tủa
Trong thân rễ Hương phụ biển có một lượng nhỏ alkaloid
Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid
Trong dung dịch, flavonoid tạo kết tủa màu vàng cam hoặc màu đỏ với acetate chì, tạo kết tủa màu xanh lục, đôi khi màu nâu đỏ với sắt (III) clorur, FeCl 3
Flavonoid được xác định bởi phản ứng Shibata, còn gọi là phản ứng Shinoda hay Cyanidin của Willstater Thuốc thử là tập hợp các hóa chất gồm: dung dịch HCl đậm đặc, bột Mg kim loại, rượu isoamylic [CH 3 (CH 3 )CHCH 2 CH 2 CH 2 OH]
Đun hoàn lưu 5 gam mẫu bột trong 50 ml cồn 95% trong 30 phút Tiến hành lọc, lấy 1 ml dịch cồn cho vào ống nghiệm, nhỏ thêm vài giọt HCl đặc Thêm một ít bột Mg vào, lắc đều và nhỏ từ từ từng giọt rượu isoamylic thấy dung dịch chuyển sang màu tím.
Kết luận: Trong thân rễ Hương phụ biển có flavonoid.
Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycoside
-Thuốc thử Tollen (xác định theo đường khử trong glycoside)
Công thức: pha 0,5 ml dung dịch AgNO 3 10% với 0,5 ml dung dịch NaOH 10%
Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH 4 OH đến khi tan kết tủa
Dấu hiệu nhận biết: có Ag kết tủa
Công thức: nhỏ 1 - 2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1 ml H 2 SO 4 đậm đặc
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện màu đỏ thẫm
Trang 27 Công thức: pha dung dịch acid picric 1% trong cồn với dung dịch NaOH 10% trong nước theo tỷ lệ thể tích 1:1
Dấu hiệu nhận biết: Nhỏ 3 - 4 giọt thuốc thử vào 1 ml chất thử, nếu có màu vàng cam hoặc hồng xỉn là phản ứng dương tính
Lấy 1 ml mẫu thử cho vào 2 - 3 giọt pyridin, thêm 1 giọt dung dịch Natri nitroprussiat 0,5% mới pha, sau đó cho từ từ từng giọt dung dịch KOH 2 N
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện màu đỏ tím
Lấy 10 g bột thân rễ Hương phụ biển, loại các chất không phân cực bằng ether petrole Tiếp theo chiết bằng Soxhlet với dung môi ethanol 50% Dịch lọc ethanol 50% được loại tạp bằng Pb(CH 3 COO) 2 cho đến khi không còn trầm hiện Sau đó, loại Pb(CH 3 COO) 2 bằng Na 2 SO 4 bão hòa Cô cạn dịch lọc được cao glycoside thô Hòa tan cao bằng ethanol 95% và lấy dung dịch này làm mẫu thử
Dùng thuốc thử Tollen: xuất hiện kết tủa trắng
Dùng thuốc thử Molish: dung dịch có màu đỏ
Kết luận: Trong thân rễ Hương phụ biển có glycoside.
Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá
Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện kết tủa và kết tủa sẽ tan khi có dư thuốc thử
Dung dịch tách làm 2 lớp: lớp H 2 SO 4 có màu xanh, lớp CHCl 3 có màu nâu đỏ
Hòa tan 1 g bột thân rễ hương phụ biển trong 20 ml CHCl 3 Lọc, lấy dịch lọc làm mẫu thử
Với thuốc thử Liebermann-Burchard: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 ml thuốc thử Libermann-Burchard theo thành ống nghiệm Quan sát thấy vòng ngăn cách
Với thuốc thử Salkowski: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 ml H 2 SO 4 đặc theo thành ống nghiệm Dung dịch tách làm hai lớp, lớp H 2 SO 4 (lớp trên) có màu xanh và lớp CHCl 3 (lớp dưới) có màu đỏ
Với thuốc thử Rosenheim: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch mẫu, cho tiếp vào 1 ml CH 3 COOH 90% Lắc đều, để yên và quan sát, có xuất hiện kết tủa
Kết luận: thân rễ Hương phụ biển có steroid.
Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin
II.5.1 Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin a Cơ sở của phương pháp
Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1 cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định b Cách tiến hành thử nghiệm và dấu hiệu nhận biết
Cân 1 g bột dược liệu cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100 ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5… 10 ml dịch lọc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút, sau đó đo chiều cao các cột bọt Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt là dưới 100, thì coi như không có saponin
Chỉ số bọt (CSB) được tính theo công thức:
CSB0x10i CSB:Chỉ số bọt i: ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1 cm
Ví dụ: Bọt ở ống thứ 2 có chiều cao 1 cm Khối lượng này coi như đã pha loãng
100 lần Như vậy, nguyên liệu có chỉ số tạo bọt bằng 500
II.5.2.Dựa vào các phản ứng đặc trưng
+ Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene
+ Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid
SbCl 3 bão hòa trong CHCl 3 Dấu hiệu nhận biết:
+ Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene
+ Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid
Cân 1g bột thân rễ hương phụ biểncho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi.Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa, lọc, để nguội Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ và lắc mạnh trong 15 giây thì thấy có bọt (cột bọt cao 1.5 - 2 cm)
Hòa tan mẫu bằng 1ml anhydrid acetic, thêm từ từ 0.3 - 0.5 ml H 2 SO 4 đậm đặc thấy vòng ngăn cách có màu xanh lá cây
Kết luận: trong thân rễ Hương phụ biển có chứa saponin.
CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TINH DẦU HƯƠNG PHỤ BIỂN
Chiết xuất tinh dầu
Cho 300 g mẫu tươi được xay nhỏ cho vào bình cầu 2 lít của bộ chưng cất tinh dầu CLEVENER, cùng với 1,5 lít nước cất rồi chưng cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trong 4 giờ, thu được 1ml tinh dầu Hiệu suất 0,22%
Quy trình ly trích tinh dầu theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước được thực hiện theo quy trình sau:
Sơ đồ 2: Quy trình ly trích tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Hình 5: Bộ dụng cụ Clevenger Hình 6: Tinh dầu Hương phụ biển III.2 Xác định các đặc trưng vật lý của tinh dầu [5]
− Dùng phương pháp cảm quan để nhận xét màu sắc, mùi của tinh dầu
− Dựa vào thể tích tinh dầu để tính hiệu suất
− Đo tỷ trọng bằng phương pháp cân tinh dầu ở nhiệt độ phòng
− Góc quay cực riêng tính bằng công thức:
- Tách nước - Làm khan bằng Na2SO4
Nước cất Đun sôi Nguyên liệu
Tinh dầu và nước bã Tinh dầu
Phân tích thành phần hóa học tinh dầu Hương phụ biển
C: nồng độ dung dịch (g/ml) l: chiều dài ống mẫu
PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT TỪ CAO THÔ
Điều chế các cao thô
Thân rễ Hương phụ biển sau khi loại bỏ lông và nghiền nhỏ được trích kiệt bằng ethanol 96% Cao ethanol thu được tiếp tục được chiết lỏng-lỏng với n-hexan để thu dịch n-hexan Cô dịch n-hexan dưới áp suất thấp thu được cao CrH với hiệu suất 7,5%.
Pha nước còn lại sau khi lắc chiết với n-hexan được lắc tiếp tục với ethylacetate, thu lấy dịch ethylacetate cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được 40 g cao thô (hiệu suất 10%), đặt tên là cao CrE
Pha nước còn lại sau khi lắc chiết với ethylacetate cô loại dung môi dưới áp suất kém thu được 300 g cao thô (hiệu suất 75%), đặt tên là cao CrW
Sau khi tiến hành điều chế các cao chiết, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) để kiểm tra chất lượng của các cao này Dựa trên kết quả TLC, chúng tôi đã chọn cao CrH và CrE để thực hiện các bước phân lập và tinh chế nhằm thu được các hợp chất riêng lẻ.
Phân lập và tinh chế các chất từ cao CrH
Trước khi chạy sắc ký cột cũng như trong suốt quá trình sắc ký cột thì chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để kiểm tra quá trình sắc ký cột, như công cụ để thăm dò các chất có trong cao thô và các phân đoạn, gom các phân đoạn có các vết giống nhau và kiểm tra sơ bộ độ sạch của các chất trong quá trình tinh chế
Bản mỏng được dùng là bản nhôm silicagel MERC-GF 60F 254 tráng sẵn, kích thước 20 x 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,22 mm của hãng Merck, Germany
Quá trình phân lập được thực hiện theo sơ đồ sau:
− Loại dung môi dưới áp suất kém
− Loại dung môi dưới áp suất kém
BỘT THÂN RỄ HƯƠNG PHỤ BIỂN
− Loại dung môi dưới áp suất kém
− Lắc với 500ml n- hexan (×5 lần)
− Lắc với 500ml EtOAc (×5 lần)
− Loại dung môi dưới áp suất kém CAO CrW
Sơ đồ 4: Phân lập các hợp chất từ cao CrH
IV.2.1 Tiến hành Cao CrH tiến hành sắc ký cột trung áp silica gel pha thường cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm
− Dung môi ổn định cột: n-hexan
− Dung môi giải ly n-hexan và CHCl3 có độ phân cực tăng dần
IV.2.2 Kết quả chạy sắc kí cột trung áp cao CrH
Từ cao CrH (10g), tiến hành sắc ký cột trung áp pha thường (hình 7) với hệ dung môi giải ly n-hexan và CHCl3 có độ phân cực tăng dần Kiểm tra các phân đoạn bằng
Hình 7 :Sắc ký cột trung áp (MPLC) Hình 8: Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Trang 34 TLC dùng dung dịch H 2 SO 4 10% trong EtOH làm thuốc thử Các phân đoạn có R f giống nhau được gom chung và được trình bày trong bảng 5
Phân đoạn Hệ dung môi Khối lượng (g) TLC
5 CHCl3: MeOH = 95:5 0,23 1 vết đậm 6 CHCl3: MeOH = 85:15 0,26 Nhiều vết 7 CHCl3: MeOH = 85:15 0,25 Nhiều vết
Bảng 5: Kết quả chi tiết chạy cột cao CrH
Trong quá trình phân đoạn 2, tinh thể đã được cô lập Tiếp theo, tinh thể này được kết tinh lại nhiều lần trong n-hexan để thu được chất bột màu trắng ký hiệu là CrA, với khối lượng thu được là 256 mg CrA cho kết quả dương tính với phản ứng màu hồng tím và có giá trị Rf = 0,4 khi sử dụng chloroform làm dung môi di động trên bản mỏng (TLC), trùng khớp với giá trị Rf của hợp chất chuẩn β-sistosterol Khi sử dụng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH trên bản mỏng, CrA vẫn cho kết quả dương tính Sau đó, cấu trúc của CrA được xác định bằng phân tích phổ 1H và 13C.
*Các đặc tính của CrA
− Chất rắn kết tinh trong n-hexan Dạng bột, màu trắng, khối lượng 256 mg
− Giải ly bằng n-hexan- ethylacetace (9:1) cho vết tròn màu hồng tím có R f 0,18 trên TLC khi dùng thuốc thử là H 2 SO 4 10% trong EtOH khi hơ nóng
Hình 9: TLC của CrA n-hexan: EtOAc = 90:10
Trang 35 Tại phân đoạn 5: kết tinh lại nhiều lần trong MeOH thu được bột màu trắng kí hiệu CrB, khối lượng 265mg, CrB hiện vết màu hồng tím có R f = 0,37 (chloroform: methanol = 85:15) trùng với R f của β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside trên TLC khi dùng thuốc thử là H 2 SO 4 10% trong EtOH CrB được tiến hành xác định cấu trúc bằng các phổ 1 H, 13 C
*Các đặc tính của CrB
− Chất rắn kết tinh trong MeOH Dạng bột, màu trắng, khối lượng 265mg
− Giải ly bằng chloroform:methanol (CHCl 3 :MeOH) (90:10) cho vết tròn màu hồng tím có R f = 0.25 trên TLC khi dùng thuốc thử là H 2 SO 4 10% trong EtOH khi hơ nóng
Hình 10: TLC của CrB Hình11: Tinh thể CrB
Phân lập và tinh chế các chất từ cao CrE
Quá trình phân lập được thực hiện theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 5: Phân lập các hợp chất từ cao CrE
Cao CrE được tiến hành chạy sắc ký cột trung áp silicagel pha thường 60G, MERC
− Dung môi ổn định cột: n-hexan
− Dung môi giải ly n-hexan và EtOAc có độ phân cực tăng dần
IV.3.2 Kết quả chạy sắc kí cột trung áp cao CrE
Từ cột sắc ký đã chuẩn bị với chiều dài 25cm, đường kính 2cm chứa 10g CrE, tiến hành sắc ký cột thường với hệ dung môi giải ly n-hexan và EtOAc có độ phân cực tăng dần Kiểm tra các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH làm thuốc hiện màu Các phân đoạn có giá trị Rf giống nhau được gộp chung, cho ra 8 phân đoạn chính Chi tiết quá trình sắc ký cột được trình bày trong Bảng 6.
Hệ dung môi Khối lượng
2 n-hexan: EtOAc P:50 0,156 Có một vết chính đậm 3 n-hexan: EtOAc P:50 0,05 Có một vết chính đậm
Sắc kí cột trung áp
Sắc kí cột trung áp
Sắc kí cột trung áp
Sắc kí cột Pha đảo
5 n-hexan: EtOAc %:75 0,5 Một vết chính đậm
7 EtOAc: MeOH = 85:15 0,88 Có một vết chính rất đậm 8 EtOAc: MeOH = 7:3 0,185 Nhiều vết
Bảng 6: Kết quả chi tiết chạy cột cao CrE
Tại phân đoạn 2 thấy có vết chính, khối lượng 156 mg tiếp tục tiến hành sắc kí cột trung áp để tách chất này ra
Cao PĐ2: sắc ký cột trung áp silica gel pha thường cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm
Khối lượng cao PĐ2: 156 mg
Dung môi ổn định cột: CHCl 3 :MeOH (92:8) Mỗi phân đoạn: 4 ml
Dung môi chạy cột là hệ dung môi CHCl 3 :MeOH (92:8) thu được 3 phân đoạn
Phân đoạn thứ 2 (PĐ2-2) có chứa tinh thể Kết tinh lại nhiều lần trong acetone thu được 5 mg bột màu trắng, có vết màu tím khi chạy TLC (CHCl3:MeOH = 85:15, Rf = 0,35) và phản ứng với thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH Đặt tên cho chất này là Cr01 và xác định cấu trúc của nó bằng phổ IR, MS và NMR.
*Các đặc tính của Cr01
+ Chất rắn kết tinh trong acetone Dạng bột, màu trắng, khối lượng 5mg, + Không hấp thu UV 254 nm
+ Tan trong MeOH, ít tan trong CHCl3 + Sắc ký lớp mỏng hiện 1 vết màu hồng bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH khi hơ nóng
+ R f = 0,35 với hệ dung môi CHCl3:MeOH = 85:15
+ Nhiệt độ nóng chảy mp = 204 – 207 o C
Tại phân đoạn 3 thấy có1 vết chính, khối lượng 43 mg tiếp tục tiến hành sắc kí cột trung áp để tách chất này ra
Cao PĐ3: sắc ký cột trung áp silica gel pha thường cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm
Khối lượng cao PĐ3: 43 mg
Dung môi ổn định cột: CHCl 3 :MeOH (90:10) Mỗi phân đoạn: 4 ml
Dung môi chạy cột là hệ dung môi CHCl 3 :MeOH (90:10) thu được 3 phân đoạn
Tại phân đoạn thứ 2 (PĐ3-2) thấy có tinh thể, tinh chế bằng cách kết tinh nhiều lần trong acetone , thu được 5 mg dạng bột màu trắng, cho một vết màu tím có R f = 0.27 (CHCl 3 :MeOH = 85:15) trên TLC khi dùng thuốc thử là H 2 SO 4 10% trong EtOH Đặt tên Cr02 được tiến hành xác định cấu trúc bằng các phổ IR, MS, các phổ NMR…
*Các đặc tính của Cr02
+ Chất rắn kết tinh trong MeOH Dạng bột, màu trắng, khối lượng 5mg
+ Không hấp thu UV 254nm
+ Tan trong MeOH, tan tốt trong CHCl3-MeOH, ít tan trong CHCl3 + Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH 1vết màu hồng khi hơ nóng
+ R f = 0,27 với hệ dung môi CHCl3:MeOH = 85:15
+ Nhiệt độ nóng chảy mp = 183-184°C
Hình 12: TLC của Cr01 Hình 13:Tinh thể Cr01
Phân tích TLC (Hình 15) mẫu CrO2 cho thấy nhiều vết, trong đó có một vết chính rất đậm ở phân đoạn thứ 5 khi sử dụng hệ dung môi CHCl3:MeOH Để thu được chất chính này, phương pháp sắc ký cột pha đảo được áp dụng.
Cao PĐ5: sắc ký cột silica gel pha đảo cỡ hạt 5μm
Khối lượng cao PĐ5: 78 mg Đường kính cột: 21×150 mm Tốc độ dòng 8 ml/ph
Dung môi chạy cột H2O:MeOH có độ phân cực giảm dần, thu được ba phân đoạn Tại phân đoạn thứ hai thấy có tinh thể, đem kết tinh lại nhiều lần trong EtOAc thu được tinh thể hình kim, màu trắng hiện vết màu hồng cam có R f = 0,15 (CHCl 3 :MeOH
Hợp chất Cr04 có thể được xác định bằng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH Ký hiệu tinh thể của hợp chất này là Cr04 (5 mg) Để xác định cấu trúc của Cr04, người ta sử dụng các phổ IR, MS, NMR và các phương pháp phân tích khác.
* Các đặc tính của Cr04
+ Tinh thể hình kim, không màu, kết tinh trong MeOH
+ Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH có vết màu hồng cam khi hơ nóng
+ R f = 0.15 với hệ dung môi CHCl3:MeOH = 85:15
Hình 16: Tinh thể Cr04 Hình 17: TLC của chất Cr04
CHCl3:MeOH = 85:15 Tại phân đoạn thứ 7 thấy có tinh thể, đem rửa nhiều lần trong MeOH lạnh thu được chất dạng bột màu trắng hiện vết màu xanh đen có R f = 0,1 (CHCl3:MeOH:H2O 7:3:0,5) trên TLC khi dùng thuốc thử là H 2 SO 4 10% trong EtOH khi hơ nóng Ký hiệu tinh thể này là Cr03 (7 mg) Cr03 được tiến hành xác định cấu trúc bằng các phổ IR, MS, các phổ NMR…
*Các đặc tính của Cr03
+ Không hấp thu UV 254 nm
+ Tan trong DMSO, tan ít trong MeOH
+ Hiện màu bằng H2SO4 10% trong EtOH có màu xám khi hơ nóng
+ R f = 0,23 với hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O = 60:40:10
V KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE [12], [45]
Hình 19: Tinh thể Cr03 Hình 20: TLC của Cr03
Trang 41 V.1 Phương pháp tiến hành
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP Vì vậy có thể đo độ hấp thu của PNP ở bước sóng 405 nm để xác định lượng glucose sinh ra So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không ức chế để xác định % ức chế Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định chỉ số IC50 Điều kiện phản ứng: T = 38 0 C, pH = 6.8, nồng độ enzyme α-Glc 0.031U/ml, nồng độ chất nền PNP-Glc 0.255 mM
− Chuẩn bị các dung dịch thử chuẩn (enzyme, chất nền, dung dịch đệm, chất ức chế)
− Mẫu trắng (dung dịch đệm, chất ức chế, nước)
− Trộn lẫn các dung dịch gồm: 125 μl đệm pH = 6.8, 25 μl enzyme, 25 μl chất ức chế
− Hoạt hóa hỗn hợp ở 38 0 C trong thời gian 20 phút
− Thêm 25 μl chất nền, duy trì phản ứng ở 38 0 C, trong thời gian 30 phút
− Đo độ hấp thu A ở λ = 405 nm, dựa vào đường chuẩn để xác định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định % ức chế (% I) và suy ra chỉ số IC50
Chuẩn bị các mẫu ức chế có nồng độ nồng độ 100 μg/ml trong hỗn hợp phản ứng
Pha loãng để có các nồng độ 80, 60, 40, 20 μg/ml
V.2 Kết quả đo độ hấp thu V.2.1 Xây dựng đường chuẩn cho PNP
Pha các dung dịch PNP với các nồng độ tương ứng: 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM đo độ hấp thu A ở bước sóng 405nm
NO 2 OH p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside α-D-glucopyranoside p-nitrophenol
Trang 42 Bảng 7: Độ hấp thu của PNP chuẩn theo nồng độ
V.2.2 Khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của cao CrE Độ hấp thu Nồng độ
Bảng 8: Kết quả độ hấp thu của mẫu ức chế cao CrE
V.2.3 Khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của cao CrW Độ hấp thu Nồng độ
20 0.07 0.074 0.068 Độ hấp thu Nồng độ
Bảng 9: Kết quả độ hấp thu của mẫu ức chế cao CrW
V.3 Khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của mẫu đối chứng Độ hấp thu Nồng độ
Bảng 10: Kết quả độ hấp thu của mẫu ức chế đối chứng
V.4 Khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của chất Cr04 Độ hấp thu Nồng độ
Bảng 11: Kết quả độ hấp thu của mẫu ức chế Cr04
I KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ
Bảng 12: Kết quả định tính các nhóm hợp chất
STT HỢP CHẤT THUỐC THỬ HIỆN TƯỢNG KẾT
2 FLAVONOID HCl đđ/Mg/rượu isoamylic dd có màu tím +
Tollen xuất hiện kết tủa trắng +
Molish dung dịch có màu đỏ +
Liebermann-Burchard vòng ngăn cách + Salkowski tách làm hai lớp + 4 STEROID
Rosenheim xuất hiện kết tủa +
Liebermann vòng ngăn cách + 5 SAPONIN
Tạo bọt Bọt bền + Chú thích: + dương tính
Như vậy, qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học nhận thấy: Thân rễ Hương phụ biển có saponin, alkaloid, flavonoid, steroid, glycosid
Ngoài ra, thân rễ Hương phụ biển có thể chứa các thành phần khác như acid hữu cơ, các hợp chất cô vơ, các chất vi lượng… mà chúng tôi chưa có điều kiện khảo sát
XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TINH DẦU HƯƠNG PHỤ BIỂN
Xác định thành phần hóa học của tinh dầu
Dựa vào thời gian lưu và đối chiếu mẫu chuẩn đã định danh và xác định tỉ lệ phần trăm các thành phần trong tinh dầu (phụ lục 1.1, 1.1a) được thể hiện ở bảng 7:
Bảng 13: Các thành phần đã tách và xác định được trong tinh dầu Hương phụ biển
1 15,76 0,28 Cyclohexanon, 2-methyl-5-(1-methylethenyl)-, trans 2 21,21 0,84 Chưa xác định
3 22,97 0,46 Lonon 4 23,07 0,62 Chưa xác định 5 23,57 0,46 Chưa xác định 6 23,74 1,88 Copaen 7 24,49 0,52 β-elemen 8 24,78 22,27 Cyperen 9 27,31 6,62 Chưa xác định 10 28,49 6,13 Eudema-4(14),11-dien hay -selinen 11 28,85 1,16 α-selinen
12 30,06 1,01 Calamenen 13 30,22 3,05 Spathulenol 14 32,46 4,45 Caryophyllen oxid 15 33,97 4,8 9H-Cycloisolongifolen, 8-oxo 16 34,26 1,76 Cubenol
18 34,85 1,64 2-Butenal, 2-methyl-4-(2,6,6-trimetyl-1-cyclohexen-1-yl) 19 35,70 0,94 Chưa xác định
22 36,9 16,05 2(1H)Naphthalenon,3,5,6,7,8,8a-hexahydro-4, 8a-dimethyl-6-(1- methylethenyl) 23 37,18 1,81 Chưa xác định 24 38,65 0,85 Chưa xác định 25 38,76 0,91 Chưa xác định 26 38,97 13,74 Cyperon
Tổng số thành phần trong tinh dầu Hương phụ biển là 26 chất, có 7 chất chưa xác định tên nhiều hơn 4 chất so với công trình nghiên cứu trước của tác gỉa Nguyễn Xuân Dũng, Vũ Văn Điền, Vũ Ngọc Lộ [8] có 22 chất đã định danh.Thành phần tinh dầu Hương phụ biển trong hai nghiên cứu khác nhau, thành phần chủ yếu trong tinh dầuHương phụ biển ở luận văn này là Cyperen (22,27%), Cyperon (13,74%), và đồng phân của Cyperon (16,05%), trong khi đó thành phần chủ yếu mà nhóm tác giả Nguyễn Xuân Dũng, Vũ Văn Điền, Vũ Ngọc Lộ [8] nghiên cứu là caryophyllen oxid (21%), đồng phân cyperon (14%) và 5β-H, 7 β,10 α-Selinen (14),11-dien (10,67%) Điều này được giải thích là cùng một cây nhưng hàm lượng và thành phần hóa học khác nhau tùy thuộc vào thổ nhưỡng nơi cây mọc, thời gian thu hái…
17 chất cơ bản trong tinh dầu Hương phụ biển được thể hiện ở bảng 8
Bảng 14: Các thành phần cơ bản trong tinh dầu Hương phụ biển
2-Butenal, 2-methyl-4- (2,6,6-trimetyl-1- cyclohexen-1-yl)
CÁC ĐẶC TRƯNG VẬT LÝ VÀ NHẬN DANH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC
Hợp chất CrA
− Phổ 1 H-NMR (phụ lục 6.1, 6.1a và 6.1b) có các mũi cộng hưởng tương ứng với các lọai proton đặc trưng:
• Tín hiệu 0.60 – 2.31: proton của nhóm –CH3, –CH2–, >CH–
• Tín hiệu 3.52: proton của nhóm >CH–OH
• Tín hiệu 5.35: proton của nhóm –CH=C<
Chất CrA cho trắc nghiệm dương tính với hai thuốc thử đặc trưng cho sterol là thuốc thử Lieberman-Burchard và Salkowski So sánh điểm nóng chảy với chất β- sitosterol và các dữ liệu về phổ 1 H, 13 C, phụ lục (6.1, 6.1a và 6.1b, 6.2, 6.2a, 6.2b) chất CrA được nhận danh là β-sitosterol có công thức phân tử là: C29H50O
Bảng15: So sánh dữ liệu phổ 13 C của CrA với tài liệu tham khảo
Vị trí C/H CrA Tài liệu tham khảo [6]
Hợp chất CrB
− Phổ 1 H-NMR (phụ lục 7.1, 7.1a , 7.1b, 7.1c) có các mũi cộng hưởng tương ứng với các lọai proton đặc trưng:
• Tín hiệu proton methyl ở 0.61 ppm (3H, m)
• Tín hiệu proton của liên kết đôi ở 5.29 ppm (1H, m, H6)
• Tín hiệu 1 proton anomer (–O–CH–O–) của đường ở δH 4,34 (d, J= 8, H1’)
• Tín hiệu nhóm proton của đường ở vùng 3.15-3.78 ppm
− Phổ 13 C-NMR phụ lục (7.2, 7.2a, 7.2b) cho thấy 35 tín hiệu của nguyên tử carbon, trong đó:
• 6 tín hiệu carbon methin kề oxygen (–CH–OH) (vùng từ 61,72- 79 ppm)
• 2 tín hiệu 140,11 và 121,98 ppm thuộc về liên kết đôi tại vị trí C5 và C6
• Tín hiệu 100,93 ppm là carbon anomeric của đường
So sánh điểm nóng chảy với chất β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside và các dữ liệu về phổ 1 H, 13 C, phụ lục (7.1, 7.1a, 7.1b, 7.1c và 7.2, 7.2a, 7.2b) chất CrB được nhận danh là β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside có công thức phân tử là: C35H60O6
Bảng16: So sánh dữ liệu phổ 13 C của CrB với tài liệu tham khảo
1 H-NMR (δppm) 13 C-NMR (δppm) Vị trí
C/H CrB Tài liệu tham khảo (TLTK)
Hợp chất Cr01
Nhận danh cấu trúc Cr01
− Phổ ESI-MS (negative) (phụ lục 2.1) có mũi ion[M-H]- tại m/z= 712 Ứng với công thức chung C40H75NO9
− Phổ IR (KBr, νmax , cm -1 ) (phụ lục 2.2), cho một số mũi dao động đặc trưng như sau:
• 3374: cho vạch hấp thu mạnh, rộng của nhóm –OH
• 2845: ứng với dao động của nối C–H trong –CH2–
• 1538 và 1645: thể hiện sự dao động của nhóm –NH
• 1081: ứng với dao động của nối C–O (đường)
− Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD, δ ppm) (phụ lục 2.3, 2.3a và 2.3b) kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 (phụ lục 2.4 và 2.4a) cho tín hiệu của 40 carbon trong đó:
• 2 mũi dương tại 14.45 là tín hiệu của –CH3
• 1 mũi ở 177.2 là carbon tứ cấp nhóm amid (–CO–NH–)
• 12 mũi dươngcủa các carbon methin (>CH-), trong đó:
9 1 mũi dương ở 54.59 là carbon >CH– gắn vào –NH
9 4 mũi dương ở (130.66; 131.17; 131.99 và 134.46) là carbon loại –CH=
9 1 mũi dương ở 104.69 là carbon acetal (–O–CH–O–) của đường, kết hợp các tương tác trên các phổ HSQC (phụ lục 3.6, 3.6a, 3.6b), HMBC (phụ lục 3.7, 3.7a, 3.7b, 3.7c) và COSY (phụ lục 3.8, 3.8a, 3.8b, 3.8c, 3.8d) cho biết năm tín hiệu tại 62.66; 71.56; 74.98; 77.89 và 77.96 là năm nhóm -CH-OH của đường glucose Như vậy, phân tử Cr01 có chứa một đơn vị gốc đường glucose
Trang 54 9 6 mũi dương (71.56; 72.86; 73.10; 74.98; 77.89 và 77.96) là carbon methin kề oxygen (–CH–OH), trong đó có 4 nhóm thuộc phân tử đường và 2 nhóm ở dây nhánh tại 73,1 của C2’ và 72,86 của C3
• 12 mũi âm là carbon methylen (–CH2–), trong đó có :
9 2 mũi âm là carbon methylen kề oxygen(–CH2–O–) ở 62.66 và 69.74
9 23 mũi âm tại 23.74; 33.07; 33.32; 33.66; 33.70; 35.87 và trong khoảng 26.16 – 30.83 là –CH2–, trong đó 3 mũi âm là carbon methylen kề carbon olefin ở 33.32; 33.66 và 33.70
Vậy Cr01 có tất cả 40 C, 9 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử nitơ
Bảng 17: Dữ liệu phổ 13 C-NMR và DEPT của Cr01
Vị trí C 13 C (δppm) DEPT 90 DEPT 135 Kết luận
1 69.74 Biến mất Mũi âm –CH2–O
2 54.59 Mũi dương Mũi dương –CH<
3 72.86 Mũi dương Mũi dương >CH–OH
4 131.17 Mũi dương Mũi dương –CH5 134.46 Mũi dương Mũi dương –CH6 33.70 Biến mất Mũi âm –CH2–
7 33.66 Biến mất Mũi âm –CH2–
8 131.99 Mũi dương Mũi dương –CH9 130.66 Mũi dương Mũi dương –CH10 33.32 Biến mất Mũi âm –CH2– 11 – 15 26.16 – 30.83 Biến mất Mũi âm –CH2–
16 33.07 Biến mất Mũi âm –CH2– 17 23.74 Biến mất Mũi âm –CH2– 18 14.45 Biến mất Mũi dương –CH3
Trang 55 2’ 73.10 Mũi dương Mũi dương >CH–OH 3’ 35.87 Biến mất Mũi âm –CH2–
4’ – 13’ 26.16 – 30.83 Biến mất Mũi âm –CH2– 14 ’ 33.07 Biến mất Mũi âm –CH2– 15 ’ 23.74 Biến mất Mũi âm –CH2– 16’ 14.45 Biến mất Mũi dương –CH3
1’’ 104.69 Mũi dương Mũi dương O–CH–O 2’’ 74.98 Mũi dương Mũi dương >CH–OH 3’’ 77.89 Mũi dương Mũi dương >CH–OH
4’’ 71.56 Mũi dương Mũi dương >CH–OH 5’’ 77.96 Mũi dương Mũi dương >CH–O 6’’ 62.66 Biến mất Mũi âm –CH2–OH
− Phổ 1 H-NMR, (CD3OD, δ ppm) (phụ lục 2.5, 2.5a và 2.5b) cho các mũi tín hiệu proton:
• 4 proton olefin ở δH 5.5 (1H, dd, J=7.5 và 15.5, H4), 5.75 (1H, d, J.5, H5 ) và 5.45 (2H, t, J, H8, H9)
• 1 proton methin kề nitrogen ở δH 4,01(1H, dd, J=4 và 8, H2)
• 1 proton anomer (–O–CH–O–) của đường ở δH 4,29 (d, J= 8, H1’’) Chứng tỏ đây là đường β
• 6 proton methin kề oxygen ở δH 4,14(1H, dd, J=7.5 và 10.5, H3), 4,01(1H, dd, J=4 và 8, H2’), 3,21(1H, t, J=8, H2’’), 3,38 (1H, m, H3’’), 3,3 (1H, m, H4’’) và 3,38 (1H, m, H5’’)
• 2 nhóm methylen kề oxygen ở δH 3,74 (1H, dd, J = 3,5 và 10,5, H1a), 4,14 (1H, dd, J = 7,5 và 10,5, H1b), 3,70 (1H, m, H6a’’) và 3,90 (1H, d, J = 10,5, H6b’’)
• Tín hiệu ở δH 1,32 mũi đơn cao, rộng là proton trên ankan dây dài
Trang 56 Từ kết quả phổ 1 H và 13 C-NMR, có thể dự đoán hợp chất Cr01 là một cerebrosid trong đó phần ceramid có hai nối đôi và phần đường là β− glucopyranoside
− Phổ HMBC cho thấy sự tương tác của proton anomer ở δH 4,29 (H1”) với cabon δC
69,74 (C1) chứng tỏ phần đường nối vào dây amid ở vị trí C1 Các dữ liệu phổ NMR 1 chiều và 2 chiều được ghi rõ ở bảng 18
Bảng 18: Dữ liệu phổ 1 H, 13 C-NMR; DEPT, COSY VÀ HMBC của Cr01
1 H-NMR δppm (số H; dạng mũi; J =
14 ’ 33.07 –CH2– 1.32 (2H, br) 15 ’ 23.74 –CH2– 1.32 (2H, br) 16’ 14.45 –CH3 0.92 (3H, t, J = 7) H16’→C14’,15’
Như vậy, Cr01 có công thức phân tử là C40H75NO9, phân tử khối là 714 đvC; độ bất bão hòa là 4, trong đó: 2 nối C=C chiếm 2 độ bất bão hòa; 1 độ bất bão hòa của đường và 1 nối C=O chiếm 1 độ bất bão hòa, phù hợp với cơ cấu của 2-(-2’- hydroxyhexadecanoylamino)-3-hydroxyoctadeca-4,8-dien-1-O-β-D-glucopyranoside
So sánh với tài liệu tham khảo [14,30] , chúng tôi dự đoán Cr01 là 2-(-2’- hydroxyhexadecanoylamino)-3-hydroxyoctadeca-4,8-dien-1-O-β-D-glucopyranoside
Bảng 19: So sánh dữ liệu phổ của Cr01 với tài liệu tham khảo
Vị trí C/H 1 H-NMR (δppm) 13 C-NMR (δppm)
Cr01 Tài liệu tham khảo
Cr01 Tài liệu tham khảo
Ghi chú: Các cặp vị trí (*) và (**) có thể hoán đổi nhau
Tóm lại, dựa vào các kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ IR, MS, HSQC, HMBC, COSY, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công bố [26,31] , chúng tôi nhận danh chất Cr01 là: 2-(-2’-hydroxyhexadecanoylamino)-3-hydroxyoctadeca-4,8- dien-1-O-β-D-glucopyranoside
Hợp chất Cr02
Nhận danh cấu trúc Cr02
− Khối phổ ESI-MS (phụ lục 3.1) có mũi ion [M+H] + tại m/z = 858.5 nên phân tử khối của Cr02 là 857 đvC, tương ứng với công thức chung: C49H95NO10
− Phổ hồng ngoại IR (KBr, νmax, cm -1 ) (phụ lục 3.2) cho một số mũi dao động đặc trưng:
• 3311: ứng với giao động của nhóm O-H
• 2919 – 2850: thể hiện sự dao động của C-H
• 1085: tín hiệu đặc trưng cho liên kết C-O
• 1621: tín hiệu đặc trưng của nhóm amid (-CO-NH-)
− Phổ 13 C-NMR (CD3OD + CDCl3, δ ppm) (phụ lục 3.3, 3.3a, 3.3b) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 4.3, 4.3a, 4.3b) (bảng 20) cho biết có 49 carbon gồm:
9 2 mũi dương ở 14.43 và 14.45 là tín hiệu của -CH3 9 1 mũi ở 177.04 là carbon tứ cấp nhóm amid (-CO-NH-)
9 11 mũi dương của các carbon methin (>CH-), trong đó:
+ 1 mũi dương ở 51.57là carbon methin (>CH-) gắn với –N<
+ 2 mũi dương ở 130.89 và 131.67 là carbon olefin (-CH=)
+ 1 mũi dương ở 104.57 là tín hiệu carbon acetal (-O-CH-O-) của đường, kết hợp các tương tác trên các phổ HSQC, HMBC và COSY cho biết năm tín hiệu tại 71.48; 74.90; 77.89; 77.90; 62.58 là năm nhóm -CH-OH của đường glucose Như vậy, phân tử Cr02 có chứa một đơn vị gốc đường glucose
+ 7 tín hiệu carbon methin kề oxygen (-CH-O-), trong đó có 4 nhóm thuộc phân tử đường và 3 nhóm ở dây nhánh tại 72.89 của C4, tại 75.48 của C3 và tại 72.94 của C2’ 9 35 mũi âm là carbon methylen (-CH2-), trong đó có:
+ 2 mũi âm là carbon methylen kề oxygen (-CH2-O-) ở 62.58 và 69.86
+ 2 mũi âm là carbon methylen kề carbon olefin ở 28.20 và 28.30
+ 31 mũi âm trong khoảng 23.66 đến 35.65 là các nhóm -CH2- Vậy: Cr02 có tất cả 49 nguyên tử carbon, 10 nguyên tử oxi và 1 nguyên tử nitơ
Bảng 20: Dữ liệu phổ 13 C-NMR và DEPT của chất Cr02
13C-NMR (δ ppm) DEPT 90 DEPT 135 Nhóm C 18 14.43 Biến mất Tín hiệu dương –CH3
25′ 14.45 Biến mất Tín hiệu dương –CH3
3′ 26.05 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– 6 27.19 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– 10 28.20 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– 7 28.30 Biến mất Tín hiệu âm –CH2–
Trang 61 5 30.38 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– 11 → 17 23.66 → 35.65 Biến mất Tín hiệu âm –CH2– 4′ → 24′ 23.66 → 35.65 Biến mất Tín hiệu âm –CH2–
2 51.57 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–N<
6″ 62.58 Biến mất Tín hiệu âm –CH2–O–
1 69.86 Biến mất Tín hiệu âm –CH2–O–
4″ 71.48 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–O–
4 72.89 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–O–
2′ 72.94 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–O–
2″ 74.90 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–O–
3 75.48 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–O–
3″ 77.89 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–O–
5″ 77.79 Tín hiệu dương Tín hiệu dương >CH–O–
1″ 104.57 Tín hiệu dương Tín hiệu dương –O–CH–O–
9 130.89 Tín hiệu dương Tín hiệu dương –CH8 131.67 Tín hiệu dương Tín hiệu dương –CH1′ 177.04 Biến mất Biến mất >C=O
− Phổ 1 H-NMR (CD3OD + CDCl3, δ ppm) cho các tín hiệu của:
• Nhóm proton có tín hiệu đơn cao và rộng ở 1.31 là proton trên hai dây ankan dài
• 1 proton anomer (-O-CH-O-) của đường ở 4.30 (d, J = 7.5 Hz - H1″) chứng tỏ đây là đường β
• 1 proton methin (>CH-NCH-OH) của dây amid ở 3.54 (m, H4);
• 2 proton methylen kề oxygen (-CH2-OH) của gốc đường glucose ở 3.70 (dd, J = 3.5 và 11.5 - H6a″) và 3.90 (d, J = 11.5, H6b″)
• 4 proton kề oxygen (-CH-OH) của gốc đường glucose ở 3.20, 3.31, 3.33, và 3.38
Từ kết quả phổ 1 H và 13 C-NMR, có thể dự đoán hợp chất Cr02 là một cerebrosid trong đó phần ceramid có một nối đôi và phần đường là β− glucopyranoside
− Phổ HMBC cho thấy sự tương tác của proton anomer ở δH 4,3 (H1”) tương tác với carbon ở δC 69,86 (C1) chứng tỏ phần đường nối vào dây amid ở vị trí C1 Các dữ liệu phổ NMR 1 chiều và 2 chiều được ghi rõ ở bảng 21
Như vậy, Cr02 có công thức phân tử là C49H95NO10, phân tử khối là 858 đvC; độ bất bão hòa là 3, trong đó có: 1 nối C=C chiếm 1 độ bất bão hòa, 1 độ bất bão hoà của vòng đường và 1 nối C=O chiếm 1 độ bất bão hòa
Bảng 21: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT, COSY và HMBC của chất Cr02
1H-NMR (δ ppm, J = Hz) COSY HMBC
Trang 63 a, b, c: trong cùng một cột có thể hoán đổi cho nhau
Tóm lại, dựa vào các kết quả phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC, COSY và các đặc trưng vật lý và các tài liệu đã công bố [26, 31] , chúng tôi dự đoán chất Cr02 là một cerebrosid: 2-(-2'-hydroxypentacosanoylamino)-3,4-dihydroxyoctadec-8-en-1-O-β- D-glucopyranoside, có công thức cấu tạo:
Hợp chất Cr03
Nhận danh cấu trúc Cr03
− Phổ khối lượng MS (phụ lục 4.1) có peak ion [M + H] + tại m/z = 343,296 nên phân tử khối của Cr03 là 342 ứng với công thức chung C12H22O11
− Phổ IR (phụ lục 4.2) cho các tín hiệu đặc trưng:
• 3389 cho vạch hấp thu mạnh, rộng của nhóm-OH
• 1068 ứng với dao động của nối C-O
− Phổ 1 H NMR (phụ lục 4.5, 4.5a) cho biết:
• Tín hiệu proton anomer của đường ở δH 5,17 (1H, d, j=3,5, H1) chứng tỏ đây là đường α
• 7 proton methin kề oxygen (>CH-O-) ở δH 3,12 (1H, t, J = 8, H4), 3,17−3,19 (1H, m, H2), 3,44-3,51 (1H, m, H3), 3,55-3,58 (1H, m, H5’), 3,63-3,65 (1H, m, H5), 3,76 (1H, d, J=4,5, H4’) và 3,87 (1H, t, J=7,5, H3’)
• 6 proton của 3 nhóm methylen kề oxygen (-CH2-O-) ở δH 3,44-3,51 (2H, m, H6a, H1a’) và 3,55-3,58 (4H, m, H6b, H1b’, H6’)
− Phổ 13 C NMR (phụ lục 4.3, 4.3a) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 4.4, 4.4a) cho biết trong phân tử Cr03 có 12 nguyên tử carbon trong đó:
• 3 tín hiệu âm là carbon methylen kề oxygen (–CH2–O–) ở δC 60,5 (C6), δ C 62,1 (C6′) và δ C 62,1 (C6′)
• 6 tín hiệu dương là carbon methin kề oxygen (>CH–O–) của đường tương ứng δ C 69,9 đến 77,1 ppm
• 1 hiệu dương là carbon methin kề oxygen (>CH–O–) của đường tương ứng δC 82,6 (C5′)
• 1 carbon acetal ở δC 91,8 (C1) và 1 carbon tứ cấp kề oxygen ở δC
104,1 (C2′) chứng tỏ Cr03 là một glycoside có 2 đơn vị đường, mỗi đơn vị 6 carbon
Phổ HSQC cho thấy tương tác của proton anomer H1 (δ 5,17 ppm) với C1 (δ = 91,8 ppm) và phổ HMBC cho thấy H1 tương tác với carbon acetal tứ cấp ở δC 104,1 (C2’) Điều này chứng tỏ phân tử Cr03 có phần đường thứ nhất là glucose và phần đường thứ 2 là fructose, gắn vào nhau ở vị trí C2'.
Từ kết quả phổ 1 H NMR, phổ 13 C NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, COSY chúng tôi nhận danh Cr03: Sucrose
Vị trí C 13C-NMR (δppm) DEPT 90 DEPT 135 Nhóm C
6 60,5 Biến mất Peak âm –CH2–O–
1′, 6′ 62,2 Biến mất Peak âm –CH2–O–
4 69,9 Peak dương Peak dương >CH–O–
2 71,7 Peak dương Peak dương >CH–O–
5 72,8 Peak dương Peak dương >CH–O–
3 72,9 Peak dương Peak dương >CH–O–
4′ 74,4 Peak dương Peak dương >CH–O–
3′ 77,1 Peak dương Peak dương >CH–O–
5′ 82,6 Peak dương Peak dương >CH–O–
1 91,8 Peak dương Peak dương >CH–O–
Bảng 23: Dữ liệu phổ 13 C NMR , 1 H NMR, COSY và HMBC của Cr03
Bảng 22: Dữ liệu phổ 13 CNMR, DEPT 90 và DEPT 135 của Cr03
Hình 26: Công thức cấu tạo sucrose ( Cr03) Tên khác: Hex–2–ulofuranosyl hexopyranoside
Nhận danh cấu trúc Cr04
− Khối phổ ESI-MS (phụ lục 3.1) cho tín hiệu ion [M+H2O-H] - tại m/z 25 nên phân tử khối của Cr04 là 308 đvC
− Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD, δ ppm) (phụ lục 4.2, 4.2a và 4.2b) cho các mũi tín hiệu proton:
• Tín hiệu của proton ở δH 5,92 (1H, d, J = 2, H3 (H5)) ghép cặp meta với proton ở δH 5,85 (1H, d, J = 2, H5 (H3)) trên vòng benzen
• Tín hiệu của proton ở δH 6,71 (1H, dd, J = 2 và 8, H6’) lần lượt ghép cặp ortho và meta với proton ở δH 6,76 (1H, d, J = 8, H5’) và 6,84 (1H, d, J = 2, H2’) trên vòng benzen
• 2 Tín hiệu proton methin kề oxygen ở δ H 3,96 (1H, td, J = 5 và 7,5, H8) và 4,56 (1H, d, J = 7,5, H9)
• 2 proton của nhóm methylen ở δH 2,50 (1H, dd, J = 8 và 16, H7b) và 2,85 (1H, dd, J = 5,5 và 16, H7a)
− Phổ Cosy (phụ lục 5.6, 5.6a) cho thấy sự tương tác của các proton kề bên
• 2 proton của nhóm methylen ở δH 2,50 (1H, dd, J = 8 và 16, H7b) và 2,85 (1H, dd, J = 5,5 và 16, H7a) tương tác với proton methin kề oxygen ở δH 3,96 (1H, td, J = 5 và 7,5, H8)
• Tương tác giữa 2 proton methin kề oxygen ở δH 3,96 (1H, td, J = 5 và 7,5, H8) và 4,56 (1H, d, J = 7,5, H9)
− Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD, δ ppm) (phụ lục 3.2, 3.2a và 3.2b) cho các tín hiệu của 15 carbon, trong đó:
• 5 tín hiệu carbon methin vòng thơm ở δC 95,6 (C3 (C5)), 96,4 (C5
• 2 tín hiệu carbon tứ cấp vòng thơm ở δC 100,9 (C1) và 132,3 (C1′)
• 5 tín hiệu carbon tứ cấp vòng thơm kề oxygen ở δC 157,6 (C2 (C6)), 157,9 (C6 (C2)), 146,2 (C4’, C4) và 156,9 (C3′)
• 2 tín hiệu carbon methin kề oxygen ở δC 68,8 (C8) và 82,9 (C9)
Vậy Cr04 là một phenolic có 2 vòng thơm: một vòng ba nhóm thế, một vòng bốn nhóm thế và một dây nhánh
− Phổ HMBC (phụ lục 5.5, 5.5a và 5.5b) cho thấy :
• 2 proton vòng thơm ghép cặp meta ở δH 5,92 (1H, d, J = 2, H3 (H5)) và 5,85 (1H, d, J = 2, H5 (H3)) đều cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm ở δC 100,1 nên carbon này là C1
• 2 proton vòng thơm ở δH 6,76 (1H, d, J = 8, H5’) và 6,84 (1H, d, J 2, H 2 ’) đều cho tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm ở δ C 132,3 nên carbon này là C1’
• 2 proton của nhóm methylen ở δH 2,50 (1H, dd, J = 8 và 16, H7b) và 2,85 (1H, dd, J = 5,5 và 16, H7a) tương quan với carbon tứ cấp vòng thơm ở δC 100,9 (C1) nên carbon δC 28,5 (C7) gắn vào vòng thơm thứ nhất ở vị trí C1 Tương tự, proton ở δH 3,96 (1H, td, J = 5 và 7,5, H8) tương quan với carbon ở δC 132,3 (C1’) nên carbon δC 82,9 (C9) gắn vào vòng thơm thứ hai ở vị trí C1’
Tóm lại từ phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, kết hợp với phổ COSY, HSQC, HMBC; chúng tôi nhận danh hợp chất Cr04 là 1-( 2’, 4’, 6’-trihydroxyphenyl)-3-(3’’, 4’’- dihydroxyphenyl) propan-2,3-diol
Hình 27: Công thức cấu tạo của Cr04 Bảng 24: Dữ liệu phổ 13 C NMR , 1 H NMR, COSY và HMBC của hợp chất Cr04
KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ MEN α-GLUCOSIDASE
Kết quả xây dựng đường chuẩn cho PNP
Bảng 25: Độ hấp thu trung bình của PNP chuẩn theo nồng độ
[PNP] (μM) Độ hấp thu A tb
Trang 70 Nhận xét: Từ đồ thị ta có phương trình đường chuẩn: y = 0.001x+0.11, là dạng phương trình đường thẳng Do đó độ hấp thu A tỉ lệ thuận với nồng độ PNP, tức là tỉ lệ với nồng độ glucose sinh ra Vì vậy để tính phần trăm ức chế ta có thể dựa vào độ hấp thu.
Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của các mẫu thử
IV.2.1 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của CrE
Bảng 26: Độ hấp thu trung bình của PNP chuẩn theo nồng độ Nồng độ (μg/ml) Độ hấp thu A tb % Ức chế
Kết quả cho thấy cao CrE có hoạt tính cao Ở nồng độ 100 μg/ml có thể ức chế đến 97.566% hoạt động của men α-glucosidase
Chúng tôi lập được phương trình đường chuẩn của cao CrE như sau: y = 2.10 -8 x 5 –10 -5 x 4 + 10 -3 x 3 – 0.151 x 2 + 6.123 x+10 -9 R 2 = 1
Dựa vào đồ thị, nội suy được giá trị IC50 của cao CrE là 11μg/ml
IV.2.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của cao CrW
Bảng 27: Độ hấp thu trung bình của PNP chuẩn theo nồng độ
Nồng độ (μg/ml) Độ hấp thu A tb % Ức chế
Kết quả cho thấy cao CrW có hoạt tính cao Ở nồng độ 100 μg/ml có thể ức chế đến 98.173% hoạt động của men α-glucosidase
Dựa vào đồ thị, nội suy giá trị IC50 của cao CrW là 10 μg/ml
Dựa vào kết quả phần trăm ức chế, có thể thấy chiết xuất lá rau ngót (CrE) và chiết xuất lá rau dền gai (CrW) có giá trị phần trăm ức chế cao, cho thấy cả hai chiết xuất này đều chứa nhiều hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase Do đó, chiết xuất lá rau ngót được lựa chọn để chạy sắc ký cột nhằm xác định các hợp chất có hoạt tính ức chế α-glucosidase cụ thể.
IV.2.3 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của mẫu đối chứng
Bảng 28: Độ hấp thu Atb và % ức chế của mẫu đối chứng theo nồng độ
Nồng độ (μg/ml) Độ hấp thu Atb % Ức chế
Phương trình đường chuẩn của mẫu đối chứng có dạng như sau: y = 14.946Ln(x) – 3.1807 R 2 = 0.9992
Dựa vào phương trình đường chuẩn suy ra giá trị IC50 của mẫu đối chứng là: IC50
IV.2.4 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase của chất Cr04
Bảng 29: Độ hấp thu Atb và % ức chế của chất Cr04 theo nồng độ
Nồng độ (μg/ml) Độ hấp thu A tb % Ức chế
Phương trình đường chuẩn của mẫu đối chứng có dạng như sau: y = -5.10 -6 x 4 + 0.001x 3 – 0.129x 2 + 5.608x + 0.034 R 2 = 1
Dựa vào đồ thị nội suy giá trị IC50 của Cr04 là: IC50 = 12 μg/ml
Nếu so sánh khả năng ức chế men α-glucosidase của chất Cr04 với chất chuẩn acarbo (IC505,1 μg/ml) thì khả năng ức chế men α-glucosidase của chất Cr04 (IC50 12 μg/ml) cao hơn
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC CỦA LUẬN VĂN
Bước đầu khảo sát thành phần hóa học Hương phụ biển mọc hoang tại bờ biển tỉnh Phú Yên, chúng tôi đạt được các kết quả sau:
− Từ dịch chiết cồn 96%, chúng tôi tiến hành tách riêng 3 loại cao dựa trên độ phân cực của các hợp chất có trong Hương phụ biển:
+ phần còn lại cao CrW 300 g
− Khảo sát định tính sơ bộ thành phần hóa học nhận thấy: Hương phụ biển có saponin, alkaloid, flavonoid, steroid
− Ly trích tinh dầu Hương phụ biển theo phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, hiệu suất ly trích tinh dầu là 0,22%
− Xác định thành phần hóa học của tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ, kết quả cho thấy thành phần cơ bản của tinh dầu Hương phụ biển là Cyperene (22,27%), Cyperone (13,74%), và đồng phân của Cyperone(16,05%) và 17 hợp chất khác có hàm lượng lớn hơn 1% Đã cô lập dưới dạng tinh khiết và nhận danh cấu trúc 6 hợp chất tinh khiết Ngoài β-Sitosterol (CrA) và β-Sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside (CrB) cô lập được từ cao n-hexan Từ cao ethyl acetace đã cô lập và nhận danh 4 chất:
2-(-2’-hydroxyhexadecanoylamino)-3-hydroxyoctadeca-4,8-dien-1-O-β-D- glucopyranoside (Cr01); 2-(-2'-hydroxypentacosanoylamino)-3,4- dihydroxyoctadec-8-en-1-O-β-D-glucopyranoside (Cr02); đường sucrose (Cr03);
1-( 2’, 4’, 6’-trihydroxyphenyl)-3-(3’’, 4’’-dihydroxyphenyl) propan-2,3-diol (Cr04).
− Thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase in vitro các cao, chất Cr04
− Đã công bố một bài báo trên tạp chí khoa học và công nghệ, tập 50, số 3A, 2012.
KIẾN NGHỊ 78 BÀI BÁO
− Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học của các cao còn lại để tìm các chất ở
Trang 75 những phân đoạn phân cực
− Thử hoạt tính sinh học khác của các cao còn lại và hợp chất tinh khiết
[1] Đỗ Huy Ích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn ( 2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Viện Dược Liệu, tr 551
[2] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr 51-54
[3] Dược điển Việt Nam II
[4] Hùng Quang (2005), Bệnh tiểu đường, gan và thận, Nhà xuất bản Thanh Niên
[5] Lê Ngọc Thạch (2003), Tinh dầu, NXB ĐH Quốc gia Tp HCM
[6] Nguyễn Hoàng Hạt, Nguyễn Công Hào, Nguyễn Cửu Khoa
(2010), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây mộc ký ngũ hùng
Dendrophtoe pentandra (L.) Miq., họ chùm gửi (loranthaceae) ký sinh trên cây mít ( Artocarpus integrifolia) và cây na ( Annona squamosa), tạp chí hóa học, tập 48 (4)
[7] Tôn Nữ Liên Hương, Nguyễn Minh Hiền và Trần Đình Luận
(2011), Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ xước (Achyranthes aspera L) ở Trà Vinh, Tạp chí Khoa học (19b), tr 56-61
[8] Nguyễn Xuân Dũng, Vũ Văn Điền, Vũ Ngọc Lộ (1995), Kết quả nghiên cứu tinh dầu Hương Phụ biển và Hương Phụ vườn ,Tạp chí dược học (1) tr 4-6
[9] Vũ Văn Điền, Cao Văn Thu (1994), Một số kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của Hương Phụ biển họ cói (Cyperaceae) Tạp chí dược học, (2)
[10] Vũ Văn Điền, Mai Tất Tố (1994, Góp phần nghiên cứu tác dụng giảm đau của Hương Phụ biển, Tạp chí dược học, (1)
[11] A K Meena, A K Yadav, U S Niranjan, Brijendra Singh, A K
Nagariya, Mansiverna (2010), Review on Cyperus rotundus, Apotential herb, International journal of pharmaceutical and clinical research 2, (1), pp 20-22
[12] Ankita Bachhawa J, Mohamed ShamShihabudeen and Kavitha Thirumurugan (2011), Screening of fifteen Indian ayurvedic plants for alpha-glucosidase inhibitory activity and enzyme kinetics
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, (3), pp 975-1491
Yuthavong (1995), Antimalarial sesquiterpenes from tubers of Cyperus rotundus: Structure of 10,12, Peroxycalamenene, A sesquiterpene endoperoxide, Phytochemistry 40, (1), pp 125-128
[14] D.Allan, R J Wells, R L Correll and J K Macleod (1978), The presence of quinones in the genus Cyperus as an aid to classification, Phytochemistry 17, pp 263-266
[15] Eun Ji Seo, Dong- Ung Lee, Jong Hwan Kwak, Sun- Mee Lee, Yi- Sook Jung (2011), Antiplatelet effects of Cyperus rotundus and its component (+)- nootkatone, Journal of Ethnopharmacology 135, pp
[16] Francesca Cateni, Jelena Zilic, Marina Zacchigna (2008), Isolation and Structure Elucidation of Cerebrosides from Euphorbia Platyphyllos L., Sci Pharm, 76, pp 451-469
[17] M B Gupta, T K Palik, N Sing, K P Bhargava (1971), Pharmacological studies to isolate the active constituents from Cyperus rotundus possessing anti-inflammatory, antipyretic and analgesic activities, Indian J Med Res 59, pp 76-82
[18] Hanaa M Sayed, Mamoud H Mohamed, Salwa F Farag, Gamal A Mohamed (2007), Anew steroid glycoside and furochromones from
Cyperus rotundus L Natural product research 21, (4), pp 343-350
[19] Hiroshi Hikino and Keitaro Aota (1976), 4α, 5α - Oxidoeudesm- 11-en-3α-ol, Sesquiterpenoid of Cyperus rotundus, Phytochemistry 15, pp 1265-1266
[20] H T Clifford and J.B Harborne (1969), Flavonoid pigmentation in te Sedges ( Cyperaceae), Phytochemistry 8, pp 123-126
[21] I El-Habasy, R M A Mansour, M.A Zahran, M N El – Hadidit
(1989), Leaf Flavonoids of Cyperus species in Egypt, Biochemical systematics and ecology 17, (3), pp 191-195
[22] Jeffrey B Harborne, Christine A.Williams and Karen L.Willso
(1982), Flavonoids in leaves and inflorescences of Autralian Cyperus species, Phytochemistry 21, (10), pp 2491-2507
[23] Jeong Ho Jin, Dong-Ung Lee, Yeong Sik Kim and Hyun Pyo kim
(2011), Anti- allergic Activity of Sesquiterpenes from the Rhizomes of
Cyperus rotundus, Arch Pharm Res 34, (2), pp 223-228
[24] Jun–Li Yang, Yan–Ping Shi (2012), Structurally diverse terpenoids from the Rhizomes of Cyperus rotundus L, Planta Med 78, (1), pp 59-64
[25] Kelly Marie Winter, Identification of Bioactive compounds in wheat, Southern Cross University (2008), pp 40-42
[26] K.R Nagulendran, S Velavan, R Mahesh, V Hazeena Begum
(2007), Invitro antioxidant activity and total polyphenolic content of
Cyperus rotundus rhizomes E-Journal of chemistry 4, (3), pp 440-449
[27] Mee Jung Jung et al (2004), Isolation of Flavonoids and a Cerebroside from the Stem Bark of Albizzia julibrissin, Arch Pharm Res, (6), pp 593-599
[28] Mesmin Mekem Sowa, Wilfried A Koing (2000), Chemical study of esential oil of Cyperus rotundus, Phytochemistry 58, pp 799- 810
[29] M Morimoto, K Komai (2006), Plant growth inhibitors;
Patchoulane-type sesquiterpens from Cyperus rotundus L., Allelopathy journal 18, (2), pp 203-209
[30] NA Raut, NJ Gaikwad (2006), Antidiabetic activity of hydro- ethanol extract of Cyperus rotundus in alloxan induced diabetes in rat, Fitoterapia77, pp 585-588
[31] Oladipupo A Lawal and Adebola O Oyedeji (2009), Chemical composition of the essentail oils of Cyperus rotundus L from south Africa, molecules 14, pp 2909-2917
In a study by Pei Liu et al (2010), a new cerebroside, a type of glycolipid, was isolated from the radix of Cyperus rotundus L This cerebroside exhibited anti-proliferative effects on vascular smooth muscle cells (VSMCs), suggesting its potential in preventing or treating cardiovascular diseases.
[33] P.N Singh and S.B Singh (1980), A new Saponin from mature tubes Cyperus rotundus, Phytochemistry 19, pp 2056
[34] R D Allan, R J.Well, R L.Correll and J K Macleod (1978), The presence of quinones in the genus cyperus as an aid to classification, Phytochemistry 17, pp 263- 266
[35] Sei-Joon Jeong, Tomofumi Miyamoto, Masamori Inagaki, Youn- Chul Kim and Ryuichi Higuchi (2000), Rotundines A-C, Three novel Sesquiterpene Alkaloids from Cyperus rotundus, Journal of Natural Products 63, (5)
[36] S Kilani, A Abdelwahed, I Chraief, R Ben Ammara, N Hayder, Hammami, M Ghedira K (2005), Chemical composition, antibacterial and antimutagenic activities of essentail oil from ( Tunisian) Cyperus rotundus J Esent Oil Res 17, pp 695-700
[37] S Kilani, R Ben Ammara, I Bouhle (2005), Investigation of extracts from (Tunisian) Cyperus rotundus as antimutagens and radical scavenggers, Enviromental toxicology and pharmacology 20, pp 478- 484
[38] Soumaya Kilani, Ines Bouhlel, Ribai Ben Ammar, Mohamed Ben Sghair, Ines Skandrani, Jihed Boubaker, Amor mahmoud, Marie- Genevieve Dijoux- Franca (2007), Chemical investigation of different extracts and essential oil from the tubers of ( Tunisian) Cyperus rotundus Correlation with their antiradical and antimutagenic properties Annals of microbiology 57, (4), pp 657-664
[39] S Ohira, T Hasewaga, KI Hyashi, T Hoshino, D Takaoka, H Nozaki (1998), Sesquiterpenoids from Cyperus rotundus, Phytochemistry 47, pp 1577-1581
[40] Uddin SJ, Mondal K, Shilpi JA, Rahman MT (2006), Antidiarrhoeal activity of Cyperus rotundus Fitoterapia 77, pp 134- 136
[41] Zeid Amn, Majid S J, Raghhidah I, Huda Aah (2008), Extraction, Identification and antibacterial activity of Cyperus oil from Iraqi C
[42] Zhong liu Zhou and Wenqing Yin (2012), Two novel Phenolic compounds from the Rhizomes of Cyperus rotundus L, Molecules 17, pp 12636-12641
[43] M Zhu, HS Luk, Fuag, CT Luk CT (1997), Cytoprotective effects of Cyperus rotundus against ethanol induced gastric ulceration in rats
[44] Vareerat Jaiboon, Jaruntorn Boonyanupahapi, Sajee Suwansri, Puntarika Ratanatraiwong and chanida Hasawasdi (2012), Alpha amylase inhibition and roasting time of local vegetables and herbs prepared for diabetes risk reduction chilipaste Asian joural of food and Agro – industry 3, (01), pp 01-12
[45] Weiwei Meng, Chongming Wu, Jingyao Shen, Pingping He, Liang Li (2012), The α- glucosidase inhibiting isoflavones isolated from Belamcanda chinensis leaf extract Rec Nat Prod, pp.110-120 ục 1.1: Phổ GC/MS của tinh dầu PL1 ục 1.1a:Phổ GC/MS của tinh dầu PL2 ục 2.1: Phổ MS Cr01 PL3 ục 2.2: Phổ IR Cr01 PL4
Phụ lục 2.5: Phổ Cr01- CD 3 OD- 1 H-NMR PL10 ục 2.5a: Phổ Cr01- CD 3 OD- 1 H-NMR PL11 ục 2.5b: Phổ Cr01- CD 3 OD- 1 H-NMR PL12 ục 2.3: Phổ Cr01- CD 3 OD- 13 C-NMR PL5 ục 2.3a: Phổ Cr01- CD 3 OD- 13 C-NMR PL6 ục 2.3b: Phổ Cr01- CD 3 OD- 13 C-NMR PL7 ục 2.4: Phổ DEPT Cr01 PL8 ục 2.4a: Phổ DEPT Cr01 PL9 ục 2.6: Phổ Cr01- CD 3 OD-HSQC PL13 ục 2.6a: Phổ Cr01- CD 3 OD-HSQC PL14 ục 2.6b: Phổ Cr01- CD 3 OD-HSQC PL15 ục 2.6c: Phổ Cr01- MeOD-HSQC PL16 ục 2.7: Phổ Cr01- CD 3 OD-HMBC PL17 ục 2.7a: Phổ Cr01- CD 3 OD-HMBC PL18 ục 2.7b: Phổ Cr01- CD 3 OD-HMBC PL19 ục 2.7c: Phổ Cr01- CD 3 OD-HMBC PL20 ục 2.8: Phổ Cr01- CD 3 OD-COSY PL21 ục 2.8a: Phổ Cr01- CD 3 OD-COSY PL22 ục 2.8b: Phổ Cr01- CD 3 OD-COSY PL23 ục 2.8c: Phổ Cr01- CD 3 OD-COSY PL24 ục 3.1: Phổ MS Cr02 PL25 ục 3.2: Phổ IR Cr02 PL26 ục 3.3: Phổ Cr02- CD 3 OD &CDCl 3 - 13 C-NMR PL27 ục 3.3a: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 - 13 C-NMR PL28 ục 3.3b: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 - 13 C-NMR PL29 ục 3.4: Phổ DEPT Cr02 PL30 ục 3.4a: Phổ DEPT Cr02 PL31 ục 3.4b: Phổ DEPT Cr02 PL32 ục 3.5: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 - 1 H-NMR PL33 ục 3.5a: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 - 1 H-NMR PL34 ục 3.5b: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 - 1 H-NMR PL35 ục 3.6: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -HSQC PL36 ục 3.6a: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -HSQC PL37 ục 3.6b: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -HSQC PL38 ục 3.7: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -HMBC PL39 ục 3.7a: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -HMBC PL40 ục 3.7b: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -HMBC PL41 ục 3.7c: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -HMBC PL42 ục 3.8: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -COSY PL43 ục 3.8a: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -COSY PL44 ục 3.8b: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -COSY PL45 ục 3.8c: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -COSY PL46 ục 3.8d: Phổ Cr02- CD 3 OD&CDCl 3 -COSY PL47 ục 4.1: Phổ MS Cr03 PL48 ục 4.2: Phổ IR Cr03 PL49 ục 4.3: Phổ Cr03- DMSO- 13 C-NMR PL50 ục 4.3a: Phổ Cr03-DMSO- 13 C-NMR PL51 ục 4.4: Phổ DEPT Cr03 PL52 ục 4.4a: Phổ DEPT Cr03 PL53 ục 4.5: Phổ Cr03-DMSO- 1 H-NMR PL54 ục 4.5a: Phổ Cr03-DMSO- 1 H-NMR PL55 ục 4.6: Phổ Cr03-DMSO- HSQC PL56 ục 4.6a: Phổ Cr03-DMSO- HSQC PL57 ục 4.7: Phổ Cr03-DMSO- HMBC PL58 ục 4.7a: Phổ Cr03-DMSO- HMBC PL59 ục 4.8: Phổ Cr03-DMSO- COSY PL60 ục 4.8a: Cr03-DMSO- COSY PL61 ục 4.8b: Cr03-DMSO- COSY PL62
Phụ lục 5.1: Phổ MS Cr04
PL63 ục 5.2: Phổ Cr04- CD 3 OD- 13 C-NMR PL64 ục 5.2a: Phổ Cr04- CD 3 OD- 13 C-NMR PL65 ục 5.2b: Phổ Cr04- CD 3 OD- 13 C-NMR PL66 ục 5.3: Phổ Cr04- CD 3 OD- 1 H-NMR PL67 ục 5.3a: Phổ Cr04- CD 3 OD- 1 H-NMR PL68 ục 5.3b: Phổ Cr04- CD 3 OD- 1 H-NMR PL69 ục 5.4: Phổ Cr04- CD 3 OD-HSQC PL70 ục 5.4a: Phổ Cr04- CD 3 OD-HSQC PL71 ục 5.5: Phổ Cr04- CD 3 OD-HMBC PL72 ục 5.5a: Phổ Cr04- CD 3 OD-HMBC PL73 ục 5.5b: Phổ Cr04- CD 3 OD-HMBC PL74 ục 5.5c: Phổ Cr04- CD 3 OD-HMBC PL75 ục 5.6: Phổ Cr04- CD 3 OD-COSY PL76 ục 5.6a: Phổ Cr04- CD 3 OD-COSY PL77 ục 5.6b: Phổ Cr04- CD 3 OD-COSY PL78 ục7.1: Phổ 1 H của CrB PL79 ục7.1a: Phổ 1 H của CrB PL80 ục7.1b: Phổ 1 H của CrB PL81 ục7.1c: Phổ 1 H của CrB PL82 ục7.2: Phổ 13 C của CrB PL83 ục7.2a: Phổ 13 C của CrB PL84
