Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu tách và tạo hệ nano chứa saponin từ rau má và định hướng ứng dụng trong sản phẩm chăm sóc cá nhân

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Nghiên cứu quá trình chiết xuất và tinh chế hoạt chất saponin từ Centella asiatica, hướng tới tạo hệ nano định hướng ứng dụng cho các sản phẩm chăm sóc da.. Với nội

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây rau má

1.1.1 Phân loại và đặc điểm hình thái

Bảng 1 1: Phân loại cây Centella asiatica [1]

Hệ thống phân loại (Taxonomy)

Giới Phân giới Lớp Phân lớp Họ Chi Loài

Tên khoa học Centella asiatica (L.) Urb

Cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban) là một loại cây thân thảo nhỏ (họ Apiaceae), có khoảng 30 loài trong họ, với hình dáng mảnh mai, hoa màu trắng, sống ở những vùng ẩm ướt, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [1] Rau má phân bố ở nhiều nơi ở Châu Á như: Ấn Độ, Đức, Sri Lanka, Nam Phi, Úc, Indonesia, Malaysia và Việt Nam [2-4]

Hình 1 1: Hình thái cây rau má Centella asiatica

Centella asiatica chứa nhiều hoạt chất chuyển hóa thứ cấp, đặc biệt là asiaticoside, madecassoside, asiatic acid và madecassic acid thuộc nhóm saponin triterpenoid [2, 5, 6]

Asiaticoside được tìm thấy nhiều nhất trong tất cả các thành phần của cây, ngoài ra còn có một lượng nhỏ tinh dầu Một số thành phần khác được công bố chứa trong C asiatica gồm flavonoid như quercetin, kaempferol và một số phytosterol như campesterol, sitosterol và stigmasterol [7]

Các chất chuyển hóa thứ cấp là những sản phẩm thiên nhiên thường tạo từ điều kiện sinh thái do tương tác giữa thực vật và môi trường phát triển của chúng Có thể thu được những sản phẩm này do điều kiện canh tác, nuôi trồng vá cải tiến các phương pháp để cây sản sinh ra những chất mong muốn, tiếp cận các công nghệ sinh học để tăng nồng độ của các chất cần khảo sát Tầm quan trọng của các chất chuyển hóa thứ cấp từ thực vật trong y học, nông nghiệp và công nghiệp đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu về tổng hợp, khảo sát hoạt tính sinh học của các chất này [2, 3] Vậy tùy theo điều kiện môi trường mà hình dạng, hình dáng hay hoạt động trao đổi chất của cây C asiatica sẽ khác nhau [8, 9]

Bảng 1 2: Bảng các thành phần trong cây Centella asiatica

Terpene acetate Germacrene (Caryophyllene) p-Cymol (Pinene)

Quercetin glycoside Kaepferol, glycoside, astragalin

Caryophyllene Elemene và bicycloelemene Trans – farnesene

6-hydroxy asisatic acid (madecassic acid , madasiatic acid)

Betulinic acid (thankunic acid, Isothakunic acid)

Ester của acid triterpenenic và đường

Asiaticoside A Asiaticoside B Brahmoside Thankuniside Isothankuniside

Từ rất lâu trước đây y học dân gian đã sử dụng rau má để điều trị các bệnh như bệnh ngoài da, bệnh tâm thần, tăng cường trí nhớ và bệnh phong [10] Ngày nay, rau má được xem cây dược liệu quan trọng, chứa các hoạt chất ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm thuốc và mỹ phẩm (kem chống lão hóa và kháng oxy hóa, kháng viêm) [11].

Tổng quan về hợp chất saponin

Saponin là nhóm glycoside lớn những sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tìm thấy đa dạng trong các loại thực vật Sự hiện diện của các saponin được công bố có trong hơn 100 họ thực vật, đóng vai trò thiết yếu trong chế độ ăn hằng ngày Nguồn saponin chính trong các cây họ đậu như: đậu nành, đậu xanh, đậu phộng, , chúng còn hiện diện trong yến mạch, các họ tỏi, măng tây, trà, rau bina, củ cải đường, khoai lang Saponin không chỉ phân bố ở thực vật, mà còn trong các loại nấm, và một số ít trong các sinh vật biển, rong biển, sao biển, [12]

Các đặc tính của saponin thể hiện qua cấu trúc chứa các aglycon và một hay nhiều gốc đường, các carbonhydrate như đường C5, C6 hay acid uronic [13] Dựa trên cấu trúc

4 hóa học khác nhau của các khung carbon, aglycon có thể phân thành triterpenoid và steroid, khác nhau bởi những nhóm thay thế, chủ yếu là gốc methyl và gốc carboxyl gắn vào những vị trí khác nhau trong trên khung vòng carbon

Người ta phân loại một số nhóm đường dựa vào cấu trúc như mono, di, tri, Hầu hết đường mono gồm: D-glucose (Glc), D-galactose (Gal), D-glucuronic acid (GlcA), D- galacturonic acid (GalA), L-rhamnose (Rha), L-arabinose (Ara), D-xylose (Xyl), và D- fucose (Fuc), [12] Monodesmosid saponin có một nhóm đường, thường đính vào C3

Bidesmosid saponin có hai nhóm đường thường là một nhóm liên kết ether tại C3 và một nhóm liên kết ester tại C28 (triterpene saponin), hay liên kết ether tại C26 (furastanol saponin)

Bảng 1 3: Hợp chất saponin chứa trong một số loại thực vật [7]

Nguồn thực vật Phần trăm saponin (%) Đậu nành 0.22-0.47

Quả bồ kết 10 Đậu xanh 0.18-4.2

5 1.2.1 Cấu trúc của saponin steroid

Saponin dạng steroid có aglycone là nhóm steroid, steroid aglycones có khung với 27 nguyên tử carbon chia thành hai nhóm nhỏ: C-27 spirostane (nhóm lớn nhất, cấu trúc sáu vòng) và C-26 furostane (cấu trúc năm vòng) [14, 15]

Nhóm spirostan: Nhóm spirostan hiện nay được chú ý nhiều vì là nguồn nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid Hai sapogenin quan trọng nhất là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave)

Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan chỉ khác là vòng F bị biến đổi Vòng F có thể mở, nếu xảy ra sự đóng vòng F thì chuyển thành dẫn chất nhóm spirostan Hoặc vòng F là vòng 5 Ngoài ra còn có các nhóm khác:

Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F mở ở vị trí C-3 đính nhóm NH2 Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum paniculatum

Nhóm spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F được thay bằng NH

Nhóm solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này Ở đây 2 vòng E và F cùng chung 1C và 1N Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất glycoalcaloid

Hình 1 2: Khung aglycone: Spirostan (diosgenin) – trái, Furostan (prodiosgenin) – phải

6 1.2.2 Cấu trúc của saponin triterpene

Saponin triterpene có chứa triterpene aglycone (sapogenin) và một hoặc nhiều gốc đường liên kết với nhau thông qua các liên kết glycosidic acetal hoặc este tại một hoặc nhiều vị trí [12, 15] Triterpene aglycone khác nhau về cấu trúc hóa học và được chia thành hai loại dựa vào số lượng vòng hydrocacbon, gồm các triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic

Triterpenes của C.asiatica chủ yếu là triterpene pentacyclic, thuộc loại ursane hoặc oleanane gồm asiaticoside, madecassoside, acid asiatic, và acid madecassic [9] Thay thế methyl trên C19 và C20 thành các phân nhóm oleanane và ursane [16], ngoài ra còn mốt số nhóm như lupan, hopan,

Nhóm olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này

Phần aglycon thường có 5 vòng Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường

Hình 1 3: Cấu trúc khung olean

7 Nhóm ursan: Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19 Những saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean Cinchona glycosid A, cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, asiaticoside, madecassoside có trong rau má là những saponin của nhóm này

Hình 1 4: Cấu trúc khung ursane

Hình 1 5: Cấu trúc khung lupan (trái), hopan (phải)

8 1.2.3 Cấu tạo của các hợp chất triterpene có trong rau má

Bảng 1 4: Công thức cầu tạo của các hợp chất saponin triterpene trong rau má

Asiaticoside Danh pháp: Urs-12-en-28-oic acid, 2,3,23-trihydroxy-, O-6- deoxy-.alpha.-L-mannopyranosyl -(1.fwdarw.4)-O-.beta.-D- glucopy ranosyl-(1.fwdarw.6)- beta.-D- glucopyranosyl ester, (2.alpha., 3.beta.,4.alpha.) Công thức: C48H78O19 Trọng lượng phân tử: 959.12

Madecassoside Danh pháp: O-6-Deoxy-alpha-L- mannopyranosyl-(1.4)-O-beta-D- glucopyranosyl-(1.6)-beta-D- glucopyranosyl(2alpha,3beta,4al pha,6b eta)-2,3,6,23- tetrahydroxyurs-12-en-28-oate Công thức: C48H78O20

Asiatic acid Danh pháp: Urs-12-en-28- oic acid, 2,3,23-trihydroxy- , (2alpha,3beta,4alpha)- Công thức: C30H48O5 Trọng lượng phân tử: 488.70

1,2,6a,6b,9,12a- hexamethyl 2,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,1 4b-tetradecahydro-1H-picene-4a- carboxylic acid

Công thức: C30H48O6 Trọng lượng phân tử: 504.70

1.2.4 Tính chất hóa lý của các hợp chất saponin

Ban đầu các nghiên cứu thường sử dụng dịch chiết thô từ các cây có saponin để đánh giá hoạt tính sinh học Sự phát triển của công nghệ tách chiết, tinh chế giúp phát hiện chính xác hoạt tính sinh học của những cấu trúc saponin cụ thể Trong tự nhiên saponin từ các nguồn thực vật khác nhau, có sự đa dạng về tính chất lý học, hóa học và đặc điểm sinh học, nhưng đa số chúng đều có những đặc điểm cơ bản sau:

Saponin là chất hoạt động bề mặt không ion, đặc trưng bởi tính chất tạo bọt và khả năng nhũ hóa [5, 17], tan trong nước làm giảm sức căng bề mặt Đa số các hoạt chất saponin có vị đắng, dễ gây kích ứng niêm mạc Saponin là chất hoạt quang, điểm nóng chảy thường rất cao (khoảng 200 o C), tan trong nước, trong ethanol, methanol, rất ít tan trong acetone,

Các công trình nghiên cứu liên quan

Thành phần triterpenoid chính trong chiết xuất của rau má là asiaticoside, madecassoside, asiatic acid và madecassic acid Quá trình tinh chế và phân tách để thu được riêng biệt những thành phần riêng trên từ cây rau má đòi hỏi phải kết hợp thực hiện nhiều bước Tuy nhiên, khi tiến hành tinh chế với hiệu suất cao thường đem lại sản phẩm có tính kinh tế thấp vì tốn nhiều chi phí Vì thế nhiều nghiên cứu tập trung khảo sát tiềm năng của một nhóm thành phần với việc sử dụng những dung môi thích hợp để ứng dụng vào mỹ phẩm và dược phẩm hơn là tinh chế tạo thành phần tinh khiết

11 1.3.1 Quy trình chiết hoạt chất trong Centella asiatica

Lá (nguyên liệu tươi) được cân, cắt và được chiết với cồn tuyệt đối (1:12, w/v) để tách các chất chuyển hóa thứ cấp Hỗn hợp được khuấy từ trong 24 giờ sau đó ly tâm Mẫu được đem lọc và cô quay chân không ở 45 °C thu được cao triterpene saponin [5]

Nguyên liệu khô (Centella asiatica) cũng được chiết xuất bằng cách ngấm kiệt với dung dịch propylene glycol 80% Bột khô còn được chiết với 50 ml (tỉ lệ 1:10) methanol 80%, dịch chiết được lọc và dịch lọc được làm bay hơi bằng thiết bị cô quay chân không

Theo một phương pháp khác, lá tươi của cây Centella asiatica được sấy khô ở 40 °C và nghiền thành bột, sau đó được chiết bằng ethanol trong thiết bị Soxhlet Chiết xuất chất lỏng màu xanh đem cô quay, cao chiết thu được được đông khô và bảo quản ở 4 ˚C [24]

1.3.2 Tạo hệ nano asiaticoside sợi bằng quá trình phosphoryl hóa hỗn hợp polymer gelatin và chitosan

Theo Sudrajat và các cộng sự: Chitosan (mức độ acetyl hóa 75-85%, MW 50,000) và gelatin (từ da bò), sodium tripolyphosphate (TPP) và dung dịch đệm phosphate (PBS pH 7.4), asiaticoside và acid acetic Hòa tan 22 g gelatin, 50 mg chitosan và ethylene glycol trong acid acetic 70% khuấy đều và hòa tan hoàn toàn trong 24 giờ Sau đó thêm TPP vào hệ gelatin-chitosan để phosphoryl hóa Xác định độ dẫn và pH dung dịch Dung dịch được chuẩn bị trong một ống tiêm có đường kính 0.8 mm Tốc độ dòng chảy của dung dịch (0.3 ml/h) được kiểm soát bằng bơm tiêm, đồng thời áp một điện áp 7.5 kV Một tấm nhôm nằm cách đầu ống kim tiêm 10 cm để thu thập sợi nano [25]

1.3.3 Quy trình tổng hợp nano Centella asiatica bọc maltodextrin và gum arabic

Theo nghiên cứu của Meliana và các cộng sự: Maltodextrin và gum arabic được nghiền sơ bộ bằng máy nghiền bi trong 4 giờ Dung dịch chất mang chứa hai polymer trên sau đó được hòa tan trong nước, dịch chiết Centella asiatica (2.5%) và chiết xuất Zingiber officinale (1%) hòa tan trong ethanol trước rồi thêm thật chậm vào hệ polymer đã chuẩn bị trước với tỉ lệ polymer và hoạt chất là 4:1 Sử dụng máy đồng hóa với tốc độ cao để tạo hỗn hợp đồng nhất Sau cùng hỗn hợp được sấy phun để thu được bột nano [26]

Hình 1 6: Quy trình tạo hệ nano asiaticoside và gingerol bằng maltodextrin và gum Arabic [26]

Ứng dụng hợp chất saponin trong thương mại

Các tính chất hóa lý và sinh học đa dạng của saponin đã được khai thác thành công trong một số ứng dụng thương mại trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Chiết xuất saponin từ cây Yucca và Quillaja được EU phân loại là chất tạo bọt để sử dụng trong các đồ uống không cồn, có gas và không có gas (200 mg/lít) (Public for Publications of European Communities, 1996) Saponin còn được sử dụng trong thực phẩm như tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm men Chiết xuất nhân sâm Hàn Quốc được gọi là saponia ứng dụng trong thực phẩm chức năng Sự kết hợp giữa saponin với cholesterol dùng để loại bỏ cholesterol từ các sản phẩm sữa, dầu, bơ hay kết tủa có chọn lọc chất béo từ phô mai [12]

20 p Đồng hóa 15,000 vòng/p, 30 p Đồng hóa 15,000 vòng/p, 20 p

Do các đặc tính hoạt động bề mặt, các chất saponin được sử dụng như chất hoạt động bề mặt tự nhiên trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân như gel tắm, dầu gội, dầu xả, sữa tắm, súc miệng và kem đánh răng, sản phẩm chăm sóc trẻ em [12] Saponin và sapogenin cũng được bán trên thị trường như là thành phần hoạt tính sinh học trong công thức mỹ phẩm ngăn ngừa mụn và quá trình lão hóa của da

Trong công nghiệp mỹ phẩm, nền tảng được thiết kế phổ biến nhất bao gồm micelles, micelles polyme, dendrimer, liposomes niosomes, ethosomes, hạt nano glycosome và nanocapsule Các hạt nhỏ hơn có thể được hấp thụ dễ dàng hơn vào da để tối ưu hóa việc phân phối các thành phần chức năng vào da và cho phép các nguyên liệu này tiếp cận vùng hành động nhanh hơn Công nghệ nano từ chiết xuất thảo dược trong các sản phẩm chống lão hóa Asiaticoside chiết xuất từ Centella asiatica giúp tăng tổng hợp collagen và do đó hiệu quả chống nếp nhăn Nguyên nhân chủ yếu gây lão hóa da liên quan đến sự giảm mức độ collagen loại I, thành phần chính của lớp hạ bì da Chất chiết xuất từ nhà máy đã được xây dựng thành nhiều sản phẩm thương mại bao gồm Collaven™, Emdecassol™, Madecassol™, Centelase™, Marticassol™, Blastoestimulina™ và Trofolastin™ [27]

Bảng 1 5: Một số sản phẩm thương mại đi từ chiết xuất rau má [9]

Chiết xuất Thành phần Ứng dụng

Asiatic acid > 95% Asiatic acid Chống lão hóa, dùng sau liệu pháp laser, dược mỹ phẩm

Titrated Extract of Centella Asiatica (TECA)

Chống lão hóa, nếp nhăn, rạn nứt, mờ sẹo

Asiaticoside > 95% Asiaticoside Kháng viêm, chống dị ứng, kích ứng

Kháng khuẩn, trị mụn trứng cá

Bảng 1 6: Các sản phẩm thương mại sử dụng chiết xuất Centella asiatica

Tên sản phẩm Hình ảnh Thành phần

Centella asiatica extract, aloe barbadensis leaf water, butylene glycol, sodium hyaluronate, arginine, caprylyl glycol, simmondsia chinensis seed oil, camellia sinensis leaf extract, salix alba bark extract, olea europaea fruit oil, lecithin,

Asiaticoside, asiatic acid, madecassoside , madecassic acid, glycerin, torreya nucifera seed oil , camellia sinensis leaf extract, opuntia coccinellifera fruit extract, citrus unshiu peel extract, hydrogenated lecithin, palmitic acid, cetearyl glucoside, panthenol, water,

Asiaticoside, asiatic acid, madecassic acid, madecassoside, butyrospermum parkii butter, citrus grandis peel oil, lavandula angustifolia oil, rosmarinus officinalis leaf oil, arnica montana flower extract, beeswax, sodium ascorbyl phosphate, dextrin, glyceryl stearate, panthenol, water,

Saponin được sử dụng trong y học cổ truyền và y học thay thế do các tính chất dược lý của nó Ngoài việc chữa lành vết thương, saponin còn thử nghiệm đề điều trị bệnh phong, giãn tĩnh mạch, eczema, bệnh vảy nến, tiêu chảy, sốt, giảm lo âu và cải thiện trí nhớ [12]

Nhiều nghiên cứu việc phát triển saponin như là chất bổ sung trong vaccine cho người trong thập kỷ qua, dẫn đến sự phát triển của một thế hệ vaccine mới chống lại bệnh ung thư và các bệnh truyền nhiễm ở các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng trên động vật [28].

THỰC NGHIỆM

Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu này nhằm khảo sát quá trình chiết xuất và tinh chế sơ bộ hoạt chất saponin từ Centella asiatica, hướng tới tạo hệ nano để khai thác tốt các đặc tính và định hướng ứng dụng cho sản phẩm chăm sóc cá nhân.

Nội dung nghiên cứu

Ứng với mục tiêu đã đề ra, nội dung nghiên cứu được thực hiện như sau:

1 Chuẩn bị và đánh giá vật liệu C asiatica (sử dụng lá và thân C asiatica) 2 Xây dựng quy trình chiết saponin từ C asiatica (dung môi, nhiệt độ, thời gian,…) 3 Tăng độ tinh khiết của chiết xuất (loại bỏ chất diệp lục, tạp chất,…)

Nguyên vật liệu và thiết bị

2.3.1 Centella asiatica Được thu gom ở Long An, Đồng Nai và chợ tại TP.HCM sử dụng toàn bộ các bộ phận của cây trừ phần rễ

Bảng 2 1: Hóa chất sử dụng và xuất xứ

STT Tên hóa chất Xuất xứ và tính chất

1 Ethanol 98% VN-Chemsol Co., Ltd

3 Sulfuric acid Xilong Chemical Co., Ltd

4 Asiaticoside Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd

Bảng 2 2: Dụng cụ và thiết bị sử dụng

Bình cầu Cân chính xác

Cánh khuấy Máy cô quay chân không

Nhiệt kế Thiết bị lọc chân không

Becher Máy đánh siêu âm QSonica LLC, Q700

Bình định mức Máy đo độ ẩm SATORIUS MA35 Ống nhỏ giọt Máy đo UV-Vis HELIOS EPSILON

Cuvette Máy đo kích thước hạt HORIBA LA 950-V2

Phương pháp thực hiện

2.4.1 Xác định độ ẩm của mẫu

Hình 2 1: Máy đo độ ẩm SATORIUS MA35

Máy phân tích độ ẩm SATORIUS MA35 được sử dụng để đo hàm lượng nước chứa trong mẫu sấy Sử dụng phương pháp nhiệt trọng lượng là nhiệt được sử dụng để loại bỏ độ ẩm từ mẫu cho đến khi đạt được khối lượng không đổi Sự chênh lệch khối lượng giữa mẫu ban đầu và mẫu cuối cùng được tính toán để thu được hàm lượng nước trong mẫu Mẫu được nghiền nhỏ và sau đó đưa vào một đĩa nhôm và được đặt vào buồng mẫu tiến hành đo

Hàm lượng nước chứa trong mẫu được tính theo công thức:

: hàm lượng nước chứa trong mẫu (%) : hàm lượng nước trong mỗi lần đo (%) n : số lần đo

2.4.2 Sắc ký bản mỏng - TLC

Sắc kí giấy - TLC được sử dụng phổ biến để phân tích các saponin tiện lợi, dễ thực hiện cũng như đánh giá và so sánh sơ bộ các thành phần trong hỗn hợp phức tạp với hệ dung mụi đa dạng [5, 29-32] 3àL mẫu chuẩn và cỏc mẫu phõn tớch được thực hiện riờng biệt trên một tấm silica gel Theo Zainol và cộng sự hệ thống dung môi được sử dụng kết hợp gồm etyl acetate: methanol: nước theo tỉ lệ 8: 2: 1 Tấm silica được đặt vào buồng chạy sắc ký có chứa sẵn dung môi khai triển Chờ cho dung môi chạy đến vạch định sẵn để tách các thành phần Các vết khác nhau được phát hiện bằng thuốc thử là hỗn hợp v ml dung

20 dịch vanillin 0.1% và v ml sulfuric acid 10% So sánh màu sắc, hình dạng vết, khoảng cách của mẫu thử với mẫu chuẩn và tính thông số Rf [10]

2.4.3 Xác định hàm lượng saponin toàn phần trong dịch chiết

Hàm lượng tổng saponin của dịch chiết được xác định bằng phương pháp vanillin- sulfuric acid [33] Dịch chiết được thực hiện phản ứng với vanillin (8%, w/v) và sulfuric acid (72%, w/v) Hỗn hợp được ủ ở 60 o C trong 10 phút, sau đó làm nguội trong nước đá trong 15 phút, tiếp theo là đo độ hấp thu ở bước sóng 538 nm [13]

Dung dịch 8% (w/v): 800 mg vanillin được hòa tan trong 10 ml 99.5% (v/v) ethanol

Dung dịch acid sulfuric 72% (v/v): 72 mL sulfuric acid (98.0% w/w) được hỗn hòa vào 28 ml nước cất

Lập đường chuẩn: Saponin chuẩn được cân chính xác (100 mg) được hòa tan trong dung dịch ethanol 80% (v/v) trong bình định mức 10ml 0.5 ml dung dịch saponin chuẩn ở các nồng độ khác nhau là 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 và 0.6 mg/ml được chuẩn bị từ dung dịch saponin chuẩn 10 mg/ml được cho vào ống nghiệm tương ứng Sau đó thêm lần lượt 0.5 ml dung dịch vanillin và 5 ml sulfuric acid lắc đều và ngâm lạnh Hỗn hợp được làm ấm ở 60 oC trong 10 phút, sau đó làm lạnh trong nước đá trong 10 phút Độ hấp thu được xác định ở bước sóng 538 nm, đo lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình cho mỗi nồng độ Các kết quả phân tích thực hiện trên thiết bị đo quang phổ hấp thu UV/Vis HELIOS EPSILON tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ thuật hóa Hữu cơ, khoa Kỹ thuật Hóa học

Tính toán kết quả: Từ độ hấp thu của dung dịch oleanolic acid tại các nồng độ khảo sát, dựng được đồ thị đường chuẩn

Mối quan hệ giữa độ hấp thu và nồng độ của oleanolic acid theo phương trình sau:

A = 1.9015xC + 0.0314, R 2 = 0.9953 Với A – Độ hấp thu tại bước sóng 538 nm

C – Nồng độ của oleanolic acid (mg/ml) Nồng độ saponin toàn phần trong dịch chiết được tính theo công thức:

21 Nồng độ saponin toàn phần trong cao chiết được tính theo công thức:

    , w - độ ẩm của cao (%) m - khối lượng cao (g) 2.4.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hiện nay được sử dụng rất phổ biến do ưu điểm nhanh, nhạy và chính xác Sử dụng một dung môi thích hợp để tách các saponin triterpene trong Centella asiatica đồng thời định tính và định lượng các thành phần trong dịch chiết Thời gian lưu của các chất sẽ khác nhau tùy thuộc vào sự tương tác của các chất với pha tĩnh và pha động (dung môi) Khi mẫu đi qua cột, nó tương tác giữa hai pha với tốc độ khác nhau, chủ yếu là do sự phân cực khác nhau Các chất tương tác ít với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột nhanh hơn Các khảo sát được tiến hành với máy HPLC Agilent 1260, tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ Thuật Hữu cơ, khoa Kỹ Thuật Hóa Học Với các thông số: Cột pha đảo C18 (150 x 4.6 mm; 5 mm), tiêm mẫu tự động, đầu dò DAD

Chương trình 1: Pha động sử dụng hỗn hợp nước: acetonitrile với tỉ lệ 50: 50, điều chỉnh pH của nước khoảng 2.7-2.8 sử dụng orthophosphoric acid Đầu dò phát hiện tín hiệu bước súng 210nm, thể tớch mẫu tiờm là 5 àl, nhiệt độ cột 28 o C, tốc độ dũng 1 ml/phỳt

Chương trình 2: Pha động sử dụng hỗn hợp nước: acetonitrile với tỉ lệ 70: 30, điều chỉnh pH của nước khoảng 2.7-2.8 sử dụng orthophosphoric acid Đầu dò phát hiện tín hiệu bước súng 210 nm, thể tớch mẫu tiờm là 10 àl, nhiệt độ cột 28 o C, tốc độ dũng 1 ml/phỳt

Hàm lượng asiaticoside trong mẫu được xác định bằng cách xây dựng đường chuẩn dựa trờn phương trỡnh hồi quy theo chương trỡnh 2, trong khoảng nồng độ 10 - 1000 àg/ml tín hiệu phát hiện là hàm tuyến tính Đường hiệu chuẩn theo phương trình: y = 1.3769x + 13.656, R 2 = 0.9972, y ứng với diện tích các peak (mAU) và x là nồng độ (àg/ml)

Nồng độ asiaticoside trong dịch chiết và trong cao được tính lần lượt theo công thức:

Với: V – thể tích (ml) w – độ ẩm của cao (%) m – khối lượng cao (mg) Tương tự cho chuẩn madecassoside xây dựng theo chương trình 2, trong khoảng nồng độ (10 - 1000 àg/ml) Đường hiệu chuẩn của madecassoside theo phương trỡnh: y = 1.6873x + 154.57, R 2 = 0.9991, y ứng với diện tích các peak (mAU) và x là nồng độ (àg/ml)

Nồng độ madecassoside trong dịch chiết được tính theo công thức:

Với: V – thể tích (ml) w – độ ẩm của cao (%) m – khối lượng cao (mg)

2.4.5 Tạo hệ phân tán từ chiết xuất saponin triterpenoid

Việc áp dụng siêu âm tạo hệ phân tán ngày nay được sử dụng rộng rãi Vật liệu trong môi trường lỏng bị phá vỡ kết cấu, tăng khả năng va chạm tạo các hạt nhỏ hơn Sóng siêu âm còn tác động làm đồng hóa kích thước hạt và tăng diện tích bề mặt riêng của hệ Phân tán bằng siêu âm tạo ra bọt, khi chất lỏng tiếp xúc với siêu âm, sóng âm lan truyền vào chất lỏng theo các chu kỳ áp suất cao và áp suất thấp xen kẽ Do đó sóng siêu âm là phương pháp hiệu quả tạo hệ phân tán các tiểu phân Hệ phân tán được thực hiện dưới sự hỗ trợ của thiết bị QSonica LLC, Model Q700 tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ thuật hóa Hữu cơ, khoa Kỹ thuật Hóa học

Hình 2 2: Máy siêu âm thanh điều khiển tự động QSonica LLC, model Q700

2.4.6 Phân tích kích thước hạt của hệ phân tán bằng thiết bị LDS

Các hạt lơ lửng trong một chất lỏng có chuyển động ngẫu nhiên và kích thước của các hạt trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ của chúng Hạt nhỏ di chuyển nhanh hơn so với những hạt lớn hơn Trong LDS, ánh sáng đi qua mẫu va đập vào các hạt, ánh sáng nhiễu xạ được phát hiện và ghi nhận ở một góc độ nhất định Sự nhiễu xạ phụ thuộc kích thước, hình dạng hạt Sự phụ thuộc vào thời gian của cường độ nhiễu xạ cho thấy các hạt đang chuyển động thế nào Từ thông tin này, có thể tính toán kích thước trung bình của hạt cũng như sự phân bố kích thước Các kết quả phân tích được thực hiện bằng thiết bị HORIBA LA 950-V2 tại phòng thí nghiệm bộ môn Kỹ Thuật hóa Hữu cơ, khoa Kỹ thuật Hóa học

Hình 2 3: Thiết bị HORIBA LA 950-V2 phân tích kích thước hạt

2.4.7 Kính hiển vi điện tử quét - SEM

Kính hiển vi điện tử quét có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật rắn bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu Ảnh của phương pháp này được sử dụng để quan sát hình thái vi cấu trúc các tiểu phân của hệ phân tán Ảnh được chụp bởi thiết bị FE-SEM S4800 HITACHI ở phòng thí nghiệm Nanotechnology, SHTP, tại Vườn ươm doanh nghiệp, khu công nghệ cao, quận 9, TP.HCM

Hình 2 4: Thiết bị FE-SEM S4800 HITACHI

25 2.4.8 Khảo sát tính chất của sản phẩm chăm sóc da

Các thông số màu được đo bằng máy Chroma Meter CR-400 dựa trên không gian màu CIE LCh dùng trục tọa độ hình trụ Màu sắc được thể hiện bằng những con số và sắp xếp chúng một cách có hệ thống, trong đó mỗi màu có một vị trí theo các trục: Trục h (hue hay tone) thể hiện góc tông màu hoặc ánh màu, từ 0° (đỏ) đến 90° (màu vàng), 180° (xanh lá cây) đến 270 ° (xanh dương) quay lại 0° Trục C (Chromaticity) đại diện cho độ bão hòa hoặc độ thuần sắc đi từ 0 ở tâm của vòng tròn, đến 100 gia tăng phụ thuộc khoảng cách từ tọa độ màu đến tâm và trục L (lightness) mô tả độ sáng chuyển từ màu đen tuyệt đối (L 0) thành màu trắng tuyệt đối (L = 100) Các mẫu được đo màu trực tiếp không cần pha loãng, trong cuvet thủy tinh 1 cm

Hình 2 5: Không gian màu CIE LCh

2.4.8.2 pHGiá trị pH của sản phẩm được xác định bằng cách sử dụng máy đo pH kỹ thuật số được chuẩn hóa sử dụng hệ đệm pH 4, 7 và 10

Phân tích cảm quan là một kỹ thuật không thể thiếu để giúp người thực hiện đánh giá chất lượng sản phẩm mới, liên quan đến các đặc tính cảm quan Trong quá trình đánh giá, các mẫu luôn được so sánh với một mẫu khác đã được lưu hành trên thị trường Mục đích là để đánh giá sản phẩm ở mức độ cảm nhận, độ bền Đánh giá dựa vào cảm giác và ngoại quan người dùng sử dụng Kết quả đánh giá dựa trên thang điểm 5

Nội dung thực hiện

2.5.1 Quy trình chiết Centella asiatica

Sơ đồ quy trình thực hiện

Hình 2 6: Sơ đồ quy trình tách chiết và tạo hê phân tán saponin từ rau má

Loại tạp chất Xác định saponin tổng cộng

Cặn sau lọc Dung môi

28 Sau khi được thu hoạch cây C asiatica, lá và thân cây tươi được rửa sạch, loại bỏ bụi bẩn, những phần kém chất lượng Sau đó nguyên liệu được sấy khô đạt độ ẩm dưới 11% và đem nghiền thành bột Chiết mẫu bằng dung môi cồn 98%, 50% và đồng thời xác định hàm lượng saponin trong các dịch chiết C asiatica Khảo sát các yếu tố tác động đến quá trình chiết như nguyên liệu, dung môi, số lần chiết Tiếp theo thực hiện loại các thành phần tạp chất trong dịch chiết và tinh chế sơ bộ, nhằm nâng cao hàm lượng hoạt chất mong muốn bằng vật liệu hấp phụ, cụ thể sử dụng than hoạt tính và nhựa HPD300, sau đó tiến hành đánh giá chất lượng các mẫu sau quá trình xử lý

Sắc ký bản mỏng TLC để đánh giá sơ bộ các thành phần trong dịch chiết Phân tích phổ hấp thu UV-Vis để định tính các thành phần trong dịch chiết Mẫu được phân tích HPLC để định lượng các saponin triterpenoid Kết quả là chiết xuất C asiatica có độ tinh khiết cao được sử dụng tạo hệ phân tán nhằm tăng diện tích bề mặt cũng như khả năng thể hiện hoạt tính của saponin Sau cùng ứng dụng hoạt chất vào sản phẩm chăm sóc cá nhân, phối công thức nền serum cơ bản với cao chiết và chế phẩm Sản phẩm được khảo sát trong các điều kiện môi trường khác nhau với mục đích đánh giá tính ổn định và độ bền

2.5.2 Phương pháp chiết tách saponin triterpene từ rau má 2.5.2.1 Chuẩn bị vật liệu

Thân và lá cây rau má sau khi thu hoạch sẽ đem rửa sạch, sấy khô thu được sản phẩm có độ ẩm dưới 11%, nghiền để chuẩn bị cho quá trình chiết tách

2.5.2.2 Tách chiết saponin triterpene bằng dung môi ethanol

Rau má tươi được đem sấy đến độ ẩm dưới 11%, nghiền nhỏ thành bột, sau đó cho bột rau má vào becher chiết với cồn, khuấy đều trong 1 giờ tại 70 o C cho nguyên liệu ngấm đều dung môi Tiếp đó tiến hành lọc chân không để lấy dịch, thực hiện tương tự với các lần chiết sau để thu dịch chiết Sau đó cô quay chân không loại dung môi thu được cao có chứa saponin triterpene

2.5.3 Nâng cao hoạt chất trong dịch chiết

Than hoạt tính là vật liệu hấp phụ dạng bột với các đặc điểm phù hợp được lựa chọn sử dụng do trong cấu trúc có các khoang xốp diện tích hấp phụ trên bề mặt tiếp xúc rất lớn trong khoảng từ 500 - 1500 m 2 /g do vậy nó là một vật liệu lý tưởng dùng để loại các hợp

29 chất màu như chlorophyll, flavonoid trong dịch chiết [34].Tiến hành quá trình loại các hợp chất màu tại nhiệt độ 60 o C, khuấy đều liên tục trong 15 phút, để yên trong 5 phút sau đó lọc dưới áp suất giảm loại bỏ carbon hoạt tính thu được dịch trong

Khảo sát lượng than hoạt tính sử dụng thích hợp để hạn chế ảnh hưởng đến khả năng thất thoát hoạt chất trong quá trình thực hiện Các mẫu 100 ml được chuẩn bị và xác định hàm lượng saponin tổng ban đầu Sau đó đem xử lý với các lượng than hoạt tính khác nhau, ứng với mỗi quá trình, xác định lượng saponin tổng còn lại Từ đó quy ra tỉ lệ saponin ứng với lượng ban đầu để đánh giá sự thay đổi của hoạt chất trong mẫu Tỉ lệ R được xác định:

Hoạt chất được hấp phụ và rửa giải qua cột trao đổi nhằm tăng hàm lượng từ dịch chiết ban đầu Đánh giá khả năng hấp phụ và giải hấp chọn lọc saponin triterpene toàn phần của nhựa macroporous HPD300 Nhựa macroporous là một loại chất hấp phụ polymer có cấu trúc vi mô không có nhóm trao đổi ion, các lỗ xốp trong cấu trúc polymer hình thành do liên kết ngang, một kiểu phân tách phát triển dựa trên nhựa trao đổi ion với những nhóm chức cấu trúc micro và các đặc tính bề mặt, thông thường người ta phân loại dựa vào độ phân cực khác nhau, phân cực mạnh, yếu hay không phân cực Nhựa macroporous có cấu trúc mạng lưới, diện tích bề mặt lớn, độ ổn định cao, dễ tái sinh, điều kiện nhẹ, vòng đời dài và chi phí thấp, được sử dụng rộng rãi trong tinh chế chiết xuất các hoạt chất thực vật tự nhiên như saponin, flavonoid, lactone, alkaloid [14] Trong quá trình xử lý để nâng cao chất lượng mẫu, xác định tỉ lệ R như trên để đánh giá lượng saponin thu nhận trong các bước thực hiện

Bảng 2 3: Đặc tính vật lý của nhựa macroporous HPD300 Đặc điểm Thông số Độ phân cực Không phân cực Đường kính hạt (mm) 0.3 – 1.2

Diện tích bề mặt (m 2 /g) 800 - 870 Đường kính lỗ xốp (A) 50 - 55

Nhựa macroporous HPD300 được chuẩn bị bằng cách ngâm trong ethanol 98% để hoạt hóa trong 24h, sau đó rửa lại sạch bằng nước cất để thực hiện hấp phụ, nhựa sau khi rửa với nước có độ ẩm 81.07% (0.763 g) Cân 3 g nhựa (đã được hoạt hóa) chuẩn bị cột trao đổi, ứng với 3g nhựa thể tích BV là 6 ml (bed volume) Cân 0.5 g cao chiết hòa vào 30ml nước cất, phân tán hệ cao trong bể siêu âm cho đến khi đồng nhất Dịch sau phân tán được cho đi qua cột nhựa hấp phụ 3 lần, rửa cột bằng 4BV nước cất, sau đó rửa giải bằng 1BV dung dịch ethanol để thu được dịch chứa saponin

2.5.4 Tạo hệ phân tán từ chiết xuất Centella asiatica

Dựa vào công thức cấu tạo với khung carbon cồng kềnh cùng với những công bố trước đó cho thấy thành phần saponin trong dịch chiết Centella asiatica ít tan trong nước và dầu, ảnh hưởng đến hoạt tính của hoạt chất [35, 36] Nhiều giải pháp được đề ra để cải thiện độ tan của các hoạt chất giúp gia tăng khả năng thẩm thấu qua da như tăng diện tích bề mặt, sử dụng hoạt động bề mặt tạo hệ micelle hay phối hợp nhiều dung môi để thay đổi tính tan,

Sử dụng sóng siêu âm để tạo hệ phân tán từ chiết xuất Centella asiatica, sóng siêu âm lan truyền vào trong dung môi, liên tục tạo ra các chu kỳ xen kẽ mặc định theo hệ thống, tạo áp lực lên sự liên kết của các hạt, đồng thời sinh ra bọt khí và nhiệt tác động lên chùm hạt làm chúng tách ra

Cao chiết và chế phẩm saponin được phối hợp với các chất hoạt động bề mặt (HĐBM) với các tỷ lệ khác nhau Khảo sát khả năng hình thành hệ phân tán với các hoạt động bề mặt (HĐBM) TWEEN20, TWEEN80 như nghiên cứu của Kim và các cộng sự [37]

31 và HĐBM khác thường dùng trong mỹ phẩm là PEG40-HCO HĐBM được phân tán đều trong dung môi trước sau đó thêm từ từ bột saponin với tỉ chế phẩm: HĐBM theo thứ tự tăng dần 1:1; 1:5; 1:10; 1:20; 1:50 (w: w) Hỗn hợp này tiếp tục được phân tán bằng siêu âm trong 20 phút Các mẫu sau cùng được kiểm tra hình thái, độ bền, độ đồng nhất theo thời gian để lựa chọn HĐBM với tỉ lệ thích hợp

2.5.5 Phát triển công thức mỹ phẩm cơ bản chứa hoạt chất

Công thức mỹ phẩm cơ bản phối hợp với chiết xuất C asiatica được phát triển gồm các thành phần như chất giữ ẩm, tác nhân dưỡng da, vitamin và khoáng chất được thêm với tỷ lệ thích hợp

Serum là một trong những dòng sản phẩm chăm sóc cá nhân với mục đích cung cấp các thành phần hoạt chất có hoạt tính cao nhằm cải thiện, tái tạo da Hơn nữa serum với nền cơ bản không màu và trong suốt là lựa chọn thích hợp để đánh giá các tính chất của chế phẩm Centella asiatica Cao chiết và chế phẩm đã nâng cao độ tinh khiết được thêm vào công thức với nhiều nồng độ, sau đó sản phẩm được khảo sát một số tính chất vật lý và đánh giá cảm quan để lựa chọn ra nồng độ hoạt chất thích hợp nhất

Hai polymer được cung cấp từ SEPPIC được áp dụng để tạo nền cơ sở của serum:

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Rau má tươi gồm thân và lá được rửa sạch, đem phơi tại nhiệt độ phòng trong 24h và sấy ở 55 o C trong 6h đến khi độ ẩm đạt dưới 11% Sau đó nghiền mẫu thành bột, bảo quản kín tránh ẩm

Bảng 3 1: Tính chất của bột Centella asiatica khô

Mùi hương Hương thảo dược nhẹ

Ba loại nguyên liệu có nguồn gốc ở Long An, Đồng Nai và chợ tại TP HCM Các đặc điểm sơ bộ đánh giá về độ ẩm, ngoại quan hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu ở các nơi chênh lệch không đáng kể, vậy trong cùng điều kiện khí hậu không có sự khác biệt nhiều về hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu

Bảng 3 2: Thông tin nguyên liệu thu hái ở các địa điểm Địa điểm thu mẫu Hàm lượng saponin toàn phần, C U c %

3.1.2 Dịch chiết Ở nội dung này, trình bày hai loại dung môi chiết là cồn 98% và cồn 50%, kết quả cho thấy tính chất của dịch chiết và lượng hoạt chất bị ảnh hưởng nhiều bởi dung môi sử dụng và số lần chiết 20 g bột rau má đã sấy khô tiến hành chiết với tỉ lệ bột khô: cồn là 1:10 (w/w)

Thời gian chiết mẫu mỗi lần là 1 giờ và lặp lại 3 lần với các nồng độ cồn khảo sát, nhiệt độ chiết là 70 o C

Hình 3 2: Dịch chiết qua ba lần, cồn 98% (a) và cồn 50% (b)

Có thể thấy rõ sự khác nhau về màu sắc của dịch chiết, cồn 98% sau ba lần có màu xanh đậm rồi nhạt dần, lượng hợp chất màu chlorophyll chiếm tỷ lệ khá cao trong dịch chiết lần đầu và giảm dần ở các lần sau Dịch chiết bằng cồn 50% có màu nâu đậm nhạt dần chuyển sang vàng tối và không thấy ánh xanh, cồn 50% hầu như không hòa tan được chlorophyll trong nguyên liệu

Hình 3 3: Biểu đồ hàm lượng saponin sau ba lần chiết cồn 98%, cồn 50%

36 Từ đồ thị trên cho thấy hàm lượng saponin toàn phần cũng có sự khác biệt với hai loại dung môi và giảm dần theo mỗi lần chiết Với cồn 98% lần chiết đầu cao nhất 5.54 mg/ml chiếm 50.09%, lần hai giảm 2.38 mg/ml (25.13%), lần ba còn 1.2 mg/ml 14.05%

Với dịch chiết cồn 50%, tỉ lệ saponin hòa tan vào trong dung môi trong lần chiết đầu tiên chiếm phần lớn 74.68% (5.84 mg/ml) trong toàn bộ saponin tách được Với lượng dung môi sử dụng tương đương nhau trong mỗi lần chiết vậy saponin trong cây đã được tách ra hiệu quả và triệt để sau 3 lần chiết

Sau đó dịch chiết các lần được gom chung và loại dung môi bằng thiết bị cô quay chân không Tiến hành xác định nồng độ saponin toàn phần trong dịch chiết C U dd Từ bảng 3.3 cho thấy thể dịch chiết sau cùng thu được khá chênh lệnh, nhìn chung lượng hoạt chất trong cả hai loại dung môi chiết có sự khác biệt nhưng không đáng kể

Bảng 3 3: So sánh dung môi chiết

Mẫu dịch chiết Thể tích dịch chiết Nồng độ saponin toàn phần C U dd

Hình 3 4: Phổ hấp thu UV-Vis của dịch chiết cồn

Bước sóngDịch chiết cồn 98% Dịch chiết cồn 50%

37 Phổ UV-Vis có dải bước sóng từ 190 đến 800 nm xuất hiện nhiều đỉnh đại diện cho các nhóm thành phần hiện diện trong dịch chiết Theo Subban và nhóm nghiên cứu chỉ ra tại bước sóng 260 và 366 nm là các dẫn chất của flavonoid [38] Chlorophyll a, b cho các đỉnh hấp thu tại vùng bước sóng xanh (gần 428 nm và 453 nm), đỏ (gần 661 nm và 642 nm) [39] So sánh phổ hấp thu của hai dung môi sử dụng để chiết, về thành phần sơ bộ khá tương tự nhau, cả hai phổ đều có xuất hiện đỉnh đặc trưng của thành phần saponin trong vùng 200-210 nm Dịch chiết cồn 98% có đỉnh tại vùng 419 – 451 nm và 665 nm đặc trưng cho chlorophyll a, b và các dẫn xuất của chúng Với cồn 50% có đỉnh hấp thu trong vùng 366 nm khá rõ do hòa tan các hợp chất flavonoid nhiều hơn cồn 98%, mặt khác gần như không hòa tan được chlorophyll trong nguyên liệu

Tính chất của cao chiết bằng cồn 98% và cồn 50% cũng có những sự thay đổi cụ thể ở các tính chất và thông số trong bảng 3.4 bên dưới Một lượng nhất định cao chiết khô đem cân chính xác, đo hàm lượng ẩm Một lượng khác được phân tán trong dung môi nước, tiến hành xác định hàm lượng saponin toàn phần C c U %

Bảng 3 4: Đặc điểm cao chiết với các dung môi

Tính chất Mô tả Khối lượng cao Độ ẩm

Có thể thấy sự khác biệt rõ về màu sắc với hai loại dung môi chiết do độ phân cực thay đổi dẫn đến hòa tan các hợp khác nhau Hiệu suất chiết toàn bằng cồn 50% đạt 41.82% cao hơn cồn 98% (29.58%) so với dung môi methanol là 20% [24] Nhưng nhìn chung về tổng hàm lượng saponin toàn phần chiết được trong cả hai dung môi khá tương đương nhau

Qua quá trình khảo sát trên, nhìn chung hàm lượng saponin trong nguyên liệu thu thập từ khác nguồn khác nhau trong các khu vực lân cận có sự khác nhau nhỏ về kích thước, màu sắc, xét về hàm lượng saponin toàn phần từ các nguồn có chênh lệch nhưng không đáng kể

Hai loại dung môi sử dụng đều hòa tan được hoạt chất trong cây khá hiệu quả, bên cạnh đó có sự khác nhau cơ bản về các thành phần khác hiện diện trong dịch chiết, do tính phân cực của dung môi Hơn nữa cồn 50% cho hiệu suất thu cao nhiều hơn cồn 98% mà

39 tổng lượng saponin thu được không quá khác biệt, nên trong cao cồn 50% tồn tại lượng tạp chất khác nhiều hơn

Khảo sát sơ bộ cho thấy trong rau má chứa lượng hoạt chất khá cao so với những sản phẩm thương mại cũng có nguồn gốc tương tự Cụ thể Taladvance từ SEPPIC có tổng hàm lượng triterpene là 15 - 25%, MadeWhite từ Clariant tuyên bố rằng có chứa madecassoside khoảng 0.4% Do đó, cao chiết cho thấy sẽ là một nguyên liệu tiềm năng hứa hẹn

40 3.2 Nâng cao chất lượng cao chiết

Cao chiết ban đầu ngoài thành phần saponin thì còn chứa khá nhiều các tạp chất mang màu, do vậy trong phần này có hai phương pháp đưa ra nhằm giải quyết vấn đề: Giảm màu cao chiết và nâng cao lượng hoạt chất mong muốn, cụ thể là sử dụng chất hấp phụ

Trong phạm vi đề tài này thực hiện khảo sát hai dạng chất hấp phụ: Than hoạt tính và nhựa trao đổi HPD300

Các mẫu 100 ml dịch chiết: 1, 2, 3 lần lượt dùng 0.5 g; 1 g; 1.5 g và 4, 5, 6 là các mẫu trên tiếp tục xử lý một lần nữa với lượng than tương tự lần đầu

Hình 3 5: Màu sắc dịch chiết cồn 98% (trái) và cồn 50% (phải) xử lý bằng than hoạt tính

Lượng than hoạt tính sử dụng tăng dần màu dịch chiết sau mỗi lần lọc cũng thay đổi các kết quả tương tự nhau trong cả hai loại dung môi Dịch chiết cồn 98% chuyển từ xanh đậm sang vàng đến không màu, vậy một lượng tạp chất màu đã được loại bỏ hiệu quả khỏi mẫu Với dịch cồn 50% ban đầu màu nâu sậm sau đó cường độ nhạt dần nhưng không mất hoàn toàn Ở mẫu 5; 6 vẫn còn màu vàng so với mẫu 6 không màu của dịch cồn 98% nên sự loại màu vẫn chưa hiệu quả Vậy dịch cồn 98% dễ loại bỏ các hợp chất màu hơn để thu được mẫu với độ tinh khiết cao cụ thể về sự thay đổi màu sắc trong hình 3.5