0,94% khối lượng berberine trong hệ phân tán hạt nano kích thước trong vùng 100 –150 nm đã được nghiên cứu cải thiện nâng cao hàm lượng berberine trong hệ nano BBr@CS bằng phương pháp n
TỔNG QUAN
Sơ lược về berberine
Berberine (BBr) là một alkaloid thuộc nhóm isoquinoline có thể được chiết xuất dễ dàng từ thực vật hoặc từ quá trình tổng hợp hóa học Trong tự nhiên, BBr với công thức cấu tạo ở Hình 1.1 được chiết xuất từ các loại cây thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis với hàm lượng trong khoảng 1,5-3% [1]
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BBr
Sản phẩm bột BBr thương mại có độ tinh khiết > 90%, có màu vàng, không mùi, có vị rất đắng BBr tan trong methanol, ethanol, rất ít tan trong nước và khó tan trong ether Ở dạng muối clorid, BBr tan ở tỷ lệ 1/400 trong nước ở điều kiện thường, tan nhiều trong ethanol, không tan trong chloroform và ether Ở dạng muối sulfat, BBr dễ tan trong nước ở tỷ lệ 1/30, tan tốt trong ethanol [2]
BBr đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền, thường được dùng nhiều để trị các bệnh đường ruột, bệnh gan mật, bệnh ngoài da, … BBr đã thu hút được sự chú ý trong những năm gần đây do có tác dụng dược lý như chống ung thư [3], kháng virus, kháng khuẩn [4], chống viêm, điều hòa lipid máu hạ đường huyết [5, 6], chống rối loạn nhịp tim [7], hỗ trợ điều trị tiểu đường [8] BBr được xem là chất kháng sinh tự nhiên và đã sử dụng rộng rãi trong ngành dược.
Sơ lược về nano berberine
Mặc dù có nhiều tính chất dược lý nhưng BBr có độ hòa tan trong nước kém và độ sinh khả dụng thấp từ đó ảnh hưởng đến tác dụng dược lý của BBr đối với cơ thể
[2] Trong nghiên cứu Liu và cộng sự (2016) [9] đã có thảo luận rằng (Hình 1.2): khi dùng bằng đường uống khoảng 0,5% liều BBr có thể được hấp thu vào tĩnh mạch; khoảng 56% liều uống BBr không được hấp thu ở đường tiêu hóa do tự kết tụ, tính thấm kém, chảy qua trung gian P-glycoprotein và đào thải qua gan mật; khoảng 43,5% liều BBr sẽ được chuyển hóa ở ruột Vì vậy cần một lượng BBr nhiều hơn để đạt được mức nồng độ BBr trong huyết tương đủ để có tác dụng điều trị hiệu quả Tuy nhiên, lượng BBr cao hơn có thể dẫn các tác dụng phụ không mong muốn Chính vì thế việc điều chế berberine có kích thước nano mét được xem là chiến lược giúp cải thiện khả năng ứng dụng của BBr, giúp BBr có thể phát huy hết tác dụng dược lý của mình
Hình 1.2: Mức độ hấp thu của berberin vào cơ thể
Một số báo cáo liên quan đến công nghệ nano cho thấy các hạt BBr được phân tán ở kích thước nano giúp cải thiện đáng kể khả năng hấp thu nano BBr thông qua đường uống, cũng như hiệu quả dược lý của nano BBr cũng được cải thiện đáng kể Báo cáo của Azadi và cộng sự (2020) [10] đã chỉ ra rằng khả năng chống oxy hóa và chống viêm gây thiếu máu ở não đã được cải thiện rõ rệt khi sử dụng nano BBr với liều lượng 25 mg/kg (lượng này rất thấp so với khi sử dụng bột BBr 100 mg/kg Sharifi và cộng sự (2021) [11] đã báo cáo kết quả chống oxi hóa (bằng phương pháp
DPPH) và khả năng ức chế tế bào Hep G2 (bằng phương pháp in vitro) trên hệ BBr dạng nano tốt hơn đáng kể so với khi sử dụng tinh chất BBr dạng bột khối Ngoài ra, nano BBr còn được báo cáo về dược tính cải thiện khả năng chống ung thư, khối sự phát triển của các khối u và hỗ trợ bảo vệ gan [12].
Ứng dụng của nano berberine
Berberine được đánh giá là có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng với 17 loài vi khuẩn đã được khảo sát Trong đó, gồm hai vi khuẩn gram âm như Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, hai vi khuẩn gram dương Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, sáu loại nấm dạng sợi Penicilium chrysogenum, Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, Trichoderma viride , Fusarium nivale, Mycrosporum gypseum và hai loại nấm men Candida albicans và Sacchaeromyces cerevisiaeromyces [13]
Cơ chế hoạt động kháng khuẩn của berberine là ức chế Filamenting temperature sensitive mutant Z (FtsZ) [14-16], một loại protein quan trọng trong quá trình phân chia tế bào vi khuẩn Các monome FtsZ lắp ráp thành một vòng co lại (gọi là vòng Z) Sự lắp ráp FtsZ thành vòng Z là cần thiết cho sự phân chia tế bào Berberine liên kết với FtsZ (Hình 1.3), ức chế sự lắp ráp FtsZ để hình thành vòng Z từ đó ngăn chặn sự phân chia tế bào của vi khuẩn Một số nghiên cứu chứng minh rằng berberine là một phối tử DNA, có thể liên kết với cả DNA sợi đơn và mạch kép trong ống nghiệm [15] Do đó, berberine có thể liên kết với DNA ở vi khuẩn dẫn đến tổn thương DNA của vi khuẩn [14-16]
Hình 1.3: Vị trí hoạt động của berberine trên FtsZ [14]
Một số nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của hệ nano BBr có hiệu quả hơn so với BBr thông thường Cụ thể như hoạt tính kháng khuẩn của nano berberine được chế tạo bằng các phương pháp bay hơi kết tủa của các hạt có kích thước nano (EPN) và chống kết tủa dung môi bằng bơm tiêm (APSP) đã được báo cáo trong nghiên cứu của Sahibzada và cộng sự (2018) [17] Các hạt nano bán tinh thể (NP) đã được chế tạo bằng phương pháp APSP có đường kính 90 –110 nm và phương pháp EPN có đường kính 65 – 75 nm Kết quả chỉ ra rằng các NP đã tăng khả năng hòa tan và tốc độ hòa tan đáng kể do chuyển đổi cấu trúc tinh thể sang dạng bán tinh thể Bên cạch đó nghiên cứu này cũng đã cho thấy các nano berberine bán tinh thể được chuẩn bị bằng phương pháp APSP và EPN có hoạt động kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương ở giỏ trị MIC tương ứng là 128 àg/mL và 64 àg/mL Hoạt tớnh khỏng khuẩn chống lại E coli ở mức MIC là 32 àg/mL của cỏc nano berberine bỏn tinh thể được điều chế bằng phương pháp EPN đã được chứng minh là tốt hơn so với BBr chưa qua xử lý Hoạt tính kháng khuẩn của nano berberine bán tinh thể đối với vi khuẩn C albicans và C glabrata đã được ghi nhận ở các giá trị MIC tương ứng là 64 àg/mLvà 128 àg/mL, thấp hơn rất nhiều so với BBR chưa qua xử lý (MIC là 256 àl/mL) [17]
Gần đây, nhóm nghiên cứu của Sonali Dash và cộng sự (2020) [18] đã tăng cường khả năng kháng khuẩn của berberine thông qua sự kết hợp với các hạt nano chitosan (CNPs) được tổng hợp bằng phương pháp gel hóa ion giữa chitosan và chất liên kết sodium tripholyphosphat (STPP) Kết quả của nghiên cứu cho thấy đối với khuẩn S aureus nồng độ ức chế MIC của CNPs là 150 mg/mL và berberine là 200 mg/L, tuy nhiên khi kết hợp CNPs với berberine nồng độ ức chế MIC đã giảm còn
50 mg/mL Tương tự, đối với khuẩn B subtilis, nồng độ ức chế MIC của CNPs là
200 mg/mL và berberine là 250 mg/mL cũng giảm xuống còn 50 mg/mL khi kết hợp CNPs với berberine [18]
Berberine cũng được đánh giá có khả năng ức chế hệ vi khuẩn gây bệnh trong khoang miệng (Bảng 1.1), cụ thể là bệnh sâu răng được gây ra bởi vi khuẩn
Streptococci mutans (S mutans) [19] S mutans là vi khuẩn Gram dương được phân lập đầu tiên vào năm 1924 bởi J Clarke Môi trường sống là ở trong các lỗ ở trên
6 răng và đặc biệt hơn là mảng bám răng - màng sinh học chứa nhiều vi khuẩn bám trên bề mặt cứng của răng [20] S mutans bám trên mảng bám răng và sinh ra acid gây mòn men răng S mutans chuyển hóa các cacbonhydrat như đường sucrose, fructose, glucose thành acid lactic và làm cho pH trong miệng giảm xuống, đồng thời tạo ra các enzyme thủy phân protein (thành phần trong nước bọt), phân hủy các chất vô cơ ở trên răng tạo thuận lợi cho sự bám dính thức ăn và các vi khuẩn gây nên bệnh sâu răng [21] Tương tự như các hệ vi khuẩn khác, cơ chế hoạt động kháng khuẩn của berberine lên vi khuẩn S mutans là liên kết với DNA và ARN của vi khuẩn Ngoài ra, báo cáo khác đã ghi nhận berberine cũng có thể ức chế hoạt động lắp ráp thành vòng Z của protein FtsZ; từ đó làm gián đoạn của quá trình phân chia tế bào và vì vậy ngăn chặn sự lớn lên của vi khuẩn S mutans [19] Tuy nhiên các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn S mutans của berberine dạng khối, và chưa có nghiên cứu nào đánh giá tính kháng vi khuẩn S mutans của hệ nano berberine Chính vì thế trong luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành đánh giá hoạt tính kháng của hệ vật liệu nano BBr trên vi khuẩn S mutans
Bảng 1.1: Kết quả kháng một số loài vi khuẩn gây bệnh sâu răng của berberine
Hoạt tính chống ung thư
Nhóm của Xiang-Ping Meng và cộng sự (2016) [22] đã báo cáo nghiên cứu gắn berberine lên chất mang lipid có cấu trúc nano (Ber-NLC) bằng kỹ thuật đồng nhất áp suất cao Khả năng ức chế sự gia tăng của tế bào HepG2, Huh7 và EC9706 của người được thử nghiệm bằng phương pháp biến đổi màu của muối tetrazolium (thử nghiệm MTT) Kết quả cho thấy Ber-NLC ức chế hiệu quả sự gia tăng của tế bào Hep G2, Huh 7 và EC 9706 với giá trị IC50 lần lược là 9,1 μg/mL; 4,4 μg/mL và 6,3 μg/mL (trong khi đó giá trị IC50 của berberine chưa qua xử lý lần lược tương ứng là 18,3 μg/mL, 6,5 μg/mL, và 12,4 μg/mL) Những kết quả này cho thấy việc phân phối Ber-
NLC là một phương pháp giúp berberine tiếp cận và điều trị các khối u có hiệu quả hơn [22]
Trong nghiên cứu của Loo và cộng sự (2020) [23] đã phát triển các nano tinh thể lỏng lyotropic (LCN) bằng phương pháp siêu âm để tăng cường khả năng hòa tan của berberine từ đó cải thiện tác dụng chống ung thư của berberine đối với ung thư vú Kết quả của nghiên cứu đã tạo ra hạt nano có kích thước nhỏ hơn 200 nm với hình dạng khối, đơn phân tán, điện tích bề mặt âm và hiệu suất bám cao Các LCN có tải berberine được điều chế với polyethylene glycon-400 (BBR-LCN-PEG) và TranscutolHP (BBR-LCN-THP) đã cho thấy khả năng sống sót của các tế bào ung thư vú ở người (MCF7) ghi nhận nồng độ ức chế IC50 thấp hơn 10 lần (đối với BBR- LCN-PEG) và 55 lần (đối với BBR-LCN-THP) so với berberine nguyên chất [23]
Shao-Jung Wu (2014) [24] đã phát triển các hạt nano chitosan/FD-Tau chứa berberine để cải thiện sự gián đoạn của hàng rào nối của biểu mô đường ruột bị khiếm khuyết gây ra bởi nội độc tố vi khuẩn (LPS) Trong nghiên cứu này, các hạt nano CS/FD-Tau được nạp BBr đã được phát triển và hoạt động như một vật liệu bảo vệ tế bào biểu mô, ngăn chặn sự phân phối lại protein do các LPS gây ra Các phép đo điện trở xuyên biểu mô (TEER) và đo lượng nội bào bằng huỳnh quang (FITC- dextran) trong các tế bào ung thư biểu mô đại tràng ở người (Caco-2) cho thấy các hạt nano nạp BBr có thể làm giảm sự gia tăng LPS do hàng rào nối chặt chẽ của biểu mô ruột đã được cải thiện Kính hiển vi quét laser đồng tiêu (CLSM) xác nhận rằng các hạt nano nạp BBr đã ngăn chặn sự phân phối lại protein ZO-1 qua trung gian bởi sự gián đoạn của hàng rào nối chặt chẽ của tế bào biểu mô ruột do TNF-a gây ra Những phát hiện này cho thấy hạt nano chứa BBr là chất mang tiềm năng cho việc vận chuyển BBr đặc hiệu tại chỗ đến ruột để ức chế chức năng hàng rào ruột bị suy yếu Các hạt nano có thể phục vụ như một liệu pháp thích hợp để điều trị bệnh liên quan đến rối loạn chức năng hàng rào của biểu mô ruột [24]
Nhóm của Zhiping Wang (2014) [25] nghiên cứu điều chế hệ berberine nanosuspension (BBr-NS) có tác dụng chống đái tháo đường Kết quả cho thấy khi điều trị bằng BBr-NS (50 mg/kg) qua đường miệng trong 8 tuần dẫn đến hạ đường huyết và tổng lượng cholesterol giảm vượt trội so với liều BBr thông thường (300 mg/kg) Dữ liệu chỉ ra rằng BBr-NS liều thấp cũng làm giảm đường huyết và cải thiện chuyển hóa lipid ở chuột C57BL/6 mắc bệnh tiểu đường loại 2 Những kết quả này cho thấy rằng việc cung cấp BBr dưới dạng nanosuspension là một phương pháp đầy hứa hẹn để điều trị bệnh tiểu đường loại 2 [25]
Tăng cường sinh khả dụng đường uống
Nhóm của Ting Wang và cộng sự (2011) [26] đã tạo ra hệ thống phân phối micelle ngược khan (ARM) có tác dụng tăng cường sinh khả dụng đường uống và hiệu quả chống tiểu đường Các ARM nạp BBr được tiêm vào tĩnh mạch chuột bị tiểu đường do streptozotocin gây ra với đường huyết mức độ 6 (BGL) Các ARM tải BBr (57%) làm suy giảm BGL nhiều hơn so với các hệ BBr khác Độ sinh khả dụng đường uống của ARM nạp BBr được tăng gấp 2,4 lần và nồng độ BBr trong máu tối đa được tăng gấp 2,1 lần với thời gian hiệu quả kéo dài đến 2 giờ [26]
Gần đây, các nhà nghiên cứu cũng đã chứng minh khả năng ứng dụng của các hệ nano BBr trong tác dụng bảo vệ gan [27], hỗ trợ điều trị viêm khớp dạng thấp [28], hoạt tính chống khối u [29], … Gần đây, dựa trên hoạt tính kháng khuẩn của BBr, BBr còn được ứng dụng vào các sản phẩm phục vụ cho cuộc sống hàng ngày của con người như: nước súc miệng Asin, nước xịt mũi Asin Corona,… và một số sản phẩm khác Điều đó cho thấy nano BBr là một vật liệu có nhiều ứng dụng trong mỹ phẩm và dược phẩm, thu hút được sự quan tâm của nhiều nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước.
Phương pháp tổng hợp nano berberine
Có nhiều phương pháp khác nhau để chế tạo nano BBr như: gắn BBr trên nano polymer, gắng nano BBr trên silica từ tính, nano BBr trên lipid hoặc gắn nano BBr vào các dendrimer, graphene hay trên các nano vàng, nano bạc,… [12, 30] (Hình 1.4)
Quá trình chế tạo BBr ở dạng nano giúp cải thiện rất đáng kể khả năng phân tán của nano BBr và tạo điều kiện tốt hơn giúp cơ thể hấp thụ hoạt chất BBr Vì vậy BBr được phát huy tối đa dược tính của mình đối với các quá trình chống viêm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn, ngăn chặn quá trình oxy hóa, chống ung thư,…
Hình 1.4: Hình ảnh nano BBr được gắn hoặc bao bọc trên các hạt nano khác nhau: (a) nano BBr được gắn trên các hạt nano polymer, (b) nano BBr được gắn trên các hạt nano dựa trên silic từ tính, (c) nano BBr được gắn trên các hạt nano lipid rắn, (d) nano BBr được trong các hạt nano micelle, (e) nano BBr trong các liposome, (f) nano BBr được gắn trên các Dendrimer G 4 , (g) nano BBr được gắn trên các graphene oxit, (h) nano BBr được bao phủ bởi các hạt nano vàng, (i) BBr được gắn trên các nano hydroxit kép
Phương pháp nhũ tương chế tạo hệ nano berberine
Năm 2021, Sharifi và cộng sự [11] đã nghiên cứu chế tạo hệ nano nhũ tương dầu/nước (o/w) với dầu ô liu và chất hoạt động bề mặt (Tween 80 và Span 60) để cải thiện quyết khuyết điểm kém tan và độ sinh khả dụng thấp của BBr Kết quả cho thấy ở tỉ lệ khối lượng dầu : tween 80 : span 60 = 1 : 2 : 2 hạt nano nhũ tương tạo thành có kích thước trung bình vào khoảng 44 nm (Hình 1.5) Hệ nhũ tương chứa nano BBr
10 đã được kiểm tra khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp DPPH và khả năng ức chế tế bào Hep G2 bằng phương pháp in vitro, kết quả cho thấy hệ nano này có tác dụng tốt hơn so với nguyên liệu BBr ban đầu [11]
Hình 1.5: Ảnh SEM của hệ nhũ tương chứa hạt nano BBr
Phương pháp điều chế hạt nano kim loại gắn berberine
Một trong những hướng nghiên cứu chế tạo nano BBr là nghiên cứu quá trình gắn nano BBr lên hạt nano bạc (AgNPs) nhằm kết hợp khả năng diệt khuẩn, ức chế tế bào ung thư từ cả 2 loại vật liệu nano BBr và nano Ag [12] Trong phương pháp này, AgNPs được tổng hợp trước trong các dịch chiết thực vật đóng vai trò là tác nhân trung tâm (chất mang) Bột BBr đã được hòa tan trong dung môi DMSO và trộn lẫn với vật liệu nano bạc để chế tạo AgNPs gắn BBr (AgNPs-BBr) với lỏi là hạt nano bạc đã được bao phủ bên ngoài bởi nano BBr (Hình 1.6) AgNPs-BBr được chế tạo trong môi trường PBS ở pH 7,4 và khả năng giải phóng BBr tại pH 5,5 được khảo sát với tỉ lệ là 45% sau 4 giờ và 95% sau 48 giờ Loại vật liệu này đã được khảo sát khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7, kết quả cho thấy hiệu quả cao hơn so với nguyên liệu BBr [12]
Hình 1.6: Cấu tạo hạt AgNPs-BBr theo nghiên cứu của Iqbal và cộng sự
Phương pháp điều chế hạt nano polymer gắn berberine
Có nhiều hệ thống polymer đã được sử dụng trong dẫn truyền thuốc Chúng thường được phân loại thành hai nhóm bao gồm các loại polyme tự nhiên như: chitosan, gelatin, collagen, albumin, agarose, alginate, axit hyaluronic, carrageenan, dextran, chitosan, cyclodextrin và các loại polyme tổng hợp như: poly (axit lactic), poly (axit glycolic), axit poly lactic-co-glycolic (PLGA), poly (-caprolactone), polymethacrylates, polyvinyl pyrrolidone [31]
Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Chang và các cộng sự [32] đã điều chế nano BBr trên chất mang fucose-chitosan/heparin (Hình 1.7) với kích thước trung bình vào khoảng 200 nm Dược tính ức chế H pylori và giảm viêm dạ dày đã được cải thiện đáng kể trên hệ nano BBr/fucose-chitosan/heparin Nhóm tác giả đã chứng minh vật liệu hệ nano BBr/fucose-chitosan/heparin có khả năng kiểm soát hiệu quả việc giải phóng BBr khi mô phỏng quá trình hoạt động của hệ nano BBr/fucose- chitosan/heparin trong môi trường đường tiêu hóa Các nano BBr được phóng thích đã thể hiện các tương tác đặc biệt tại những vị trí nhiễm H pylori và các hạt nano này đã thúc đẩy quá trình ức chế sự tăng trưởng của H pylori Những kết quả trên cho thấy hệ chất mang nano fucose-chitosan/heparin đã dẫn truyền được BBr, hệ chất
12 mang nano fucose-chitosan/heparin có khả năng xâm nhập môi trường dạ dày và phóng thích nano BBr, là hoạt chất có dược tính tốt trong điều trị ung thư dạ dày [32]
Hình 1.7: Cấu tạo hạt nano hệ nano BBr/fucose-chitosan/heparin
Năm 2018, Wang và cộng sự [33] đã nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan gắn BBr (CS-BBr) bằng phương pháp insitu (Hình 1.8), BBr được hòa tan trong dung môi DMSO và được trộn lẫn với chitosan, hạt nano CS-BBr được tạo thành dưới tác dụng của chất liên kết trisodium phosphate (TPP) Các phân tích hóa lý cho thấy hạt nano CS-BBr có kích thước trung bình 258 nm với độ phân tán tập trung khá cao Ngoài ra, vật liệu này có khả năng dung nạp và giải phóng BBr tốt với tỉ lệ 89% (pH khảo sát 7,4 và 5,8), có tác dụng ngăn chặn tế bào gây ung thư vòm họng cellosaurus cell line-1 (CNE-1) khi thử nghiệm bằng phương pháp MMT và thử nghiệm trên chuột thí nghiệm [33]
Hình 1.8: Quy trình tổng hợp hạt nano CS-BBr
Một trong những loại polymer khác được quan tâm nghiên cứu kết hợp với BBr là poly (lactide-co-glycolide) (PLGA) [34,35] PLGA là polymer tương tích sinh học và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về dược học, do vậy nhiều nhóm đã sử dụng polymer này ở kích thước nano để dẫn truyền BBr nhằm tăng độ tương thích, độ sinh khả dụng của hoạt chất BBr Ví dụ như nghiên cứu của Yu và cộng sự [35] nhằm phát triển thuốc trên hệ vật liệu nano PLGA-BBr (Hình 1.9) nhằm cải thiện sinh khả dụng đường uống của BBr [35]
Hình 1.9: Tổng quát nghiên cứu của Yu và cộng sự
Phương pháp chế tạo nano berberine có độ tinh thể cao
Các nghiên cứu cho thấy các hạt nano BBr được chế tạo bằng phương pháp từ dưới lên có dược tính cao Tuy nhiên, nồng độ BBr trong hệ nano tổng hợp từ phương thức này thường nhỏ hơn 1% khối lượng Quy trình, hệ thống thiết bị tổng hợp vật liệu thường phức tạp, cần sử dụng hiện đại và đắt tiền là một trong những nguyên nhân hạt chế triển khai quy trình tổng hợp nano BBr theo phương pháp từ dưới lên trong sản xuất công nghiệp Do đó, nghiên cứu chế tạo hệ nano BBr có hàm lượng BBr cao (cao hơn so với phương pháp từ dưới lên) là nhu cầu cần thiết nhằm đáp ứng yêu cầu sản xuất bột nano BBr làm nguồn nguyên liệu trong sản xuất các chế phẩm nano BBr dạng viên nang
Phương pháp nghiền quay (phương pháp từ trên xuống) là một trong những hướng được quan tâm chế tạo các loại vật liệu hữu cơ có cấu trúc tinh thể [36] Một số vật liệu nano được chế tạo theo phương pháp này như: nano curcumin [37], nano telmisartan [38], nano nitrendipine [39],… Trong phương pháp này, nguyên liệu ở kích thước micromet sẽ được cho vào thiết bị nghiền với sự hỗ trợ của bi zirconia Khi khởi động buồng quay, bi nghiền sẽ va chạm với nguyên liệu làm giảm kích thước đến kích cỡ nano mét (Hình 1.10) [40]
Hình 1.10: Phương pháp nghiền quay dưới sự hỗ trợ của bi trong chế tạo hạt nano
Tuy nhiên đến nay các nghiên cứu chế tạo nano berberine bằng phương pháp nghiền quay dưới sự hỗ trợ của bi chưa được báo cáo phổ biến trên thế giới Ở Việt Nam, theo ghi nhận của chúng tôi chỉ có hai báo cáo đã sử dụng phương pháp nghiền quay chế tạo hệ nano BBr dưới sự hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt [40, 41] Cụ thể là nhóm của Đỗ Thanh Sinh và cộng sự (2020) [40] đã chế tạo vật liệu nano BBr bằng phương pháp nghiền quay với sự hỗ trợ của chất hoạt động bề mặt và hệ bi zirconia (Hình 1.11) Kết quả thu được hạt nano BBr có kích thước trong khoảng 60 nm khi sử dụng 1% khối lượng tween 80 và 4% khối lượng BBr Vật liệu nano BBr tổng hợp có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú MCF-7 và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan Hep G2 thông qua giá trị IC50 lần lượt tương ứng là 11,11 ± 0,48 àg/mL và 43,45 ± 3,39 àg/mL [40] Nhúm của Trịnh Thị Duyờn và cụng sự (2019) [41] cũng đã sử dụng phương pháp nghiền quay chế tạo nano BBr với các thành phần bao gồm 20% khối lượng berberine, 1% khối lượng hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), 0,4% khối lượng natri lauryl sulfat (NaLS) và nước
Hình 1.11: Quy trình chế tạo nano BBr tinh thể bằng phương pháp nghiền quay
Có thể nhận thấy hai nghiên cứu bên trên trong quy trình chế tạo nano BBr bằng phương pháp nghiền quay đã sử dụng nhiều loại chất hoạt động bề mặt như tween 80,
THỰC NGHIỆM
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.1: Danh sách hóa chất cần sử dụng
STT Tên hóa chất Nguồn gốc / Nơi cung cấp
Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco chi nhánh TP.HCM ở A001, 36 Trịnh Đình Thảo, Phường Hoà Thạnh, Quận Tân Phú, TP.HCM
2 Chitosan (DD 91,38 %) Công ty Cổ phần Dược phẩm Thiên Tuế ở số
56/30 đường Tân Thới Nhất, Quận 12, TP.HCM
Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Khu Công nghệ cao
Bảng 2.2: Danh sách thiết bị cần sử dụng
STT Tên thiết bị Nguồn gốc
Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Khu Công nghệ cao Thành Phố Hồ Chí Minh
6 Máy FE-SEM S-4800 Hitachi, Nhật Bản
7 Máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JACCO
8 Máy nhiễu xạ tia X BRUKER XRD-D8
ADVANCE Viện Khoa Học Vật Liệu Ứng Dụng, Thành Phố
9 Máy phân tích kích cỡ hạt (DLS) Horiba SZ-
Nội dung nghiên cứu
Với mục tiêu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước và sự phân bố của hạt nano berberine để thu được hạt nano berberine có kích thước nhỏ, đồng đều nhằm ứng dụng trong thực phẩm, luận văn này tiến hành nghiên cứu theo sơ đồ Hình 2.1 bên dưới:
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
18 Đánh giá đặc trưng của nguyên liệu
Nguyên liệu BBr chuẩn dược phẩm (Hình 2.2) được cung cấp bởi công ty cổ phần dược phẩm Novaco chi nhánh Hồ Chí Minh Nguyên liệu nhận về được đánh giá cảm quan về màu sắc, độ đồng nhất, kiểm tra tính chất hóa lý như:
Chụp SEM xác định hình dạng, kích thước nguyên liệu
Đo nhiễu xạ tia X để kiểm ta mức độ tinh thể
Đo UV-Vis để xác định hàm lượng
2.2.2.1 Phương pháp điều chế nano berberine a Chế tạo nano BBr/chitosan bằng phương pháp insitu (BBr/CS-insitu)
Chế tạo nano BBr bằng phương pháp insitu với chất mang chitosan dựa trên nguyên lý bottom – up, sử dụng chất mang là chitosan - một chất tương thích sinh học, có thể ứng dụng trong thực phẩm
Quy trình tổng hợp nano BBr/CS-insitu được tiến hành thông qua các bước sau: [45,46]
- Chuẩn bị các dung dịch tiền chất: o Chuẩn bị dung dịch acid acetic 0,2% (v/v) o Chuẩn bị dung dịch CS 0,15% (w/v): hòa tan một lượng rắn xác định chitosan (CS) vào dung dịch dung dịch acid acetic 0,2% (v/v), và điều chỉnh pH 5 để tạo dung dịch CS 0,15% (w/v)
19 o Chuẩn bị dung dịch BBr 0,2% (w/v): hòa tan 0,2% (w/v) BBr trong methanol, sau đó lọc loại bỏ thành phần không tan thu được dung dịch BBr
- Hòa tan 0,1% (w/v) sodium tripoly phosphate (STPP) trong nước Thu được dung dịch STPP
- Tổng hợp nano BBr/CS-insitu o Trộn dung dịch BBr vào dung dịch CS với các tỷ lệ khối lượng của BBr và khối lượng CS (mBBr : mCS) lần lượt là 1:8, 1:6, 1:4, 1:2 và 1:1 ở nhiệt độ phòng (RT) Thành phần phối trộn được trình bày trong Bảng 2.3 o Nhỏ từ từ dung dịch STPP vào hệ bên trên (tỷ lệ mCS:mSTPP = 6:1), ở
RT khuấy mạnh trong 30 phút.Tiếp tục khuấy thêm 60 phút ở RT và thu được hệ kết tủa
- Ly tâm lạnh ở 4 o C trong 30 phút, tốc độ 15.000 vòng/phút để gạn bỏ dung môi thu rắn Rửa nhiều lần bằng nước deion và ly tâm lạnh để thu bột BBr/CS-insitu
Hình 2.3: Quy trình chế tạo nano BBr/CS-insitu
Bảng 2.3: Thông số chế tạo BBr/CS-insitu
Mẫu Tỉ lệ m BBr :m CS
STPP (mL) BBr/CS-insitu-1 1-8
BBr/CS-insitu-5 1-1 37,50 b Chế tạo nano BBr@CS bằng phương pháp nghiền quay Đối với phương pháp nghiền quay, mẫu nano BBr@CS sẽ được tổng hợp theo hai giai đoạn Trong đó, nano chitosan (n-CS) được thiết kế như là lớp vỏ bao bọc nano BBr đã được tổng hợp ở giai đoạn 1 Quá trình nghiền bi nguyên liệu BBr với vật liệu n-CS sẽ được tiến hành ở giai 2
Giai đoạn 1: Chế tạo nano chitosan
Chuẩn bị dung dịch chitosan trong môi trường acid acetic, pH5 với nồng độ thay đổi từ 0,15 – 0,45% (w/v) Một lượng xác định dung dịch 0,1% (v/v) STPP được nhỏ giọt vào dung dịch CS (tỷ lệ mCS:mSTPP = 6:1) nhằm tạo dung dịch n-CS [33, 34]
Giai đoạn 2: Chế tạo nano BBr@CS
Nghiền hỗn hợp BBr nguyên liệu với dung dịch n-CS đã được chế tạo ở giai đoạn 1, tốc độ 1200 vòng/phút, với sự hỗ trợ của bi zirconia trong 5 ngày (Hình 2.4) Thành phần phối trộn được trình bày trong Bảng 2.4 Hỗn hợp sau nghiền được loại bi, ly tâm và rửa nhiều lần bằng nước deion Sản phẩm của quá trình là BBr@CS
Hình 2.4: Quy trình chế tạo nano BBr@CS bằng phương pháp nghiền quay n-CS Berberin e
Bảng 2.4: Thông số chế tạo nano BBr@CS bằng phương pháp nghiền quay
Tên Mẫu Tỉ lệ m BBr :m n-CS
Dung dịch Nano CS (mL)
BBr@CS-1 1:4 0,063 0,038 Điều kiện được chọn ở giai đoạn 1
2.2.2.2 Nghiên cứu cải tiến nồng độ pha phân tán
Dựa trên kết quả đánh giá hiệu suất tổng hợp, thời gian chế tạo vật liệu nano BBr, kích thước hạt nano, hàm lượng BBr có trong các mẫu vật liệu nano BBr, chúng tôi sẽ tiến hành lựa chọn phương thức và điều kiện chế tạo phù hợp nhằm cải thiện hàm lượng BBr có trong các mẫu tổng hợp
Kiểm tra tính chất, đặt trưng và xác định hàm lượng BBr trong hệ nano BBr tổng hợp
Tính chất, đặt trưng của hệ vật liệu nano BBr tổng hợp sẽ được đánh giá bằng các phương pháp phân tích như:
Chụp ảnh SEM: các mẫu của các hệ nano BBr được chế tạo trong luận văn này được chụp bằng máy FE-SEM JSM 7401F của Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Khu Công nghệ cao Thành Phố Hồ Chí Minh Mẫu được nhỏ giọt trên lưới đồng đường kính 3 mm, để khô ở nhiệt độ phòng, đặt trên băng dính carbon dẫn điện và tiến hành phân tích ở điện thế 10 kV
Phân tích DLS: mẫu được pha loãng trong nước đến nồng độ khoảng 100 ppm và tiến hành đo ở 25 o C bằng thiết bị Horbiba SZ-100
Phân tích XRD: mẫu nano BBr dạng bột được đo với thiết bị D8 Advance-Bruker, Đức với nguồn phát Cu-K (40 kV, 40 mA), tốc độ quét 4 o /phút
Hàm lượng BBr trong mẫu nguyên liệu và các mẫu vật liệu nano BBr tổng hợp được xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis Các mẫu được đo bằng máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JACCO, Nhật của Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Khu Công nghệ cao Thành Phố Hồ Chí Minh
- Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng BBr bằng phương pháp UV-Vis [47]:
Xây dựng đường chuẩn BBr: hòa tan 6,4 mg BBr tinh khiết (ống chuẩn dùng trong phân tích) vào 25 mL methanol tạo dung dịch BBr Tiến hành pha loãng dung dịch BBr để thu cỏc dung dịch BBr cú nồng độ lần lượt là 5 àg/mL; 7,5 àg/mL; 10 àg/mL; 12,5 àg/mL và 15 àg/mL
Cuvet thạch anh đã được sử dụng để đo độ hấp thụ của dung dịch BBr chuẩn bằng phương pháp UV-Vis (vùng bước sóng 380 – 500 nm) tại bước sóng cực đại hấp thu tại 430 nm
- Xác định độ tinh khiết của BBr nguyên liệu và hàm lượng BBr có trong các mẫu vật liệu nano BBr tổng hợp:
Xác định độ tinh khiết của BBr nguyên liệu: BBr nguyên liệu được hoàn tan trong methanol với nồng độ tớnh toỏn 12,5 àg/mL Độ tinh khiết của BBr trong nguyên liệu được tính toán dựa vào đường chuẩn BBr đã được xây dựng