Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Nghiên cứu khả năng kháng lại vi khuẩn staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) của một số cây bản địa Bình Dương

TÊN ĐỀ TÀI - Bằng tiếng Việt: Nghiên cứu khả năng kháng lại vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin MRSA của một số cây bản địa Bình Dương - Bằng tiếng Anh: Antibacterial acti

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN THỊ YẾN NHI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG LẠI VI KHUẨN

STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN

(MRSA) CỦA MỘT SỐ CÂY BẢN ĐỊA BÌNH DƯƠNG

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa Học

Mã số: 8520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG TP HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trương Vũ Thanh

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS Mai Huỳnh Cang

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Hà Cẩm Anh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM, ngày

05 tháng 02 năm 2023

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS Nguyễn Thị Phương Phong

2 Phản biện 1: PGS.TS Mai Huỳnh Cang

3 Phản biện 2: TS Hà Cẩm Anh

4 Ủy viên Hội đồng: TS Tống Thanh Danh

5 Ủy viên –Thư ký Hội đồng: TS Lê Vũ Hà

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Trần Thị Yến Nhi

Ngày, tháng, năm sinh: 17/01/1998

MSHV: 2070653 Nơi sinh: Tiền Giang

I TÊN ĐỀ TÀI

- Bằng tiếng Việt: Nghiên cứu khả năng kháng lại vi khuẩn Staphylococcus aureus

kháng methicillin (MRSA) của một số cây bản địa Bình Dương

- Bằng tiếng Anh: Antibacterial activity of Binh Duong plant extracts against

methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

- Khảo sát hoạt tính và thành phần hóa học của cao tổng

- Khảo sát hoạt tính và thành phần hóa học của cao phân đoạn

- Khảo sát hợp lực giữa cao phân đoạn và kháng sinh

- Khảo sát hợp lực giữa các cao phân đoạn

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 14/2/2022

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/12/2022

IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS Trương Vũ Thanh

TP.HCM, ngày 23 tháng 12 năm 2022

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành cùng sự kính trọng đến PGS.TS Trương Vũ Thanh đã luôn lắng nghe ý kiến của em, định hướng cách tư duy, cách làm việc và hỗ trợ em giải quyết khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài Ngoài

ra, em cũng xin cảm ơn TS Mai Thị Ngọc Lan Thanh đã nhiệt tình hỗ trợ cơ sở vật chất cũng như chỉ bảo em rất nhiều kiến thức quý báu

Đặc biệt, em xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến các bạn sinh viên K17 và K18 trong team Thanh Trương Cảm ơn các bạn đã đoàn kết và chăm chỉ trong suốt thời gian gắn bó với nhau Luận văn này sẽ không thể hoàn thành và khoảng thời gian ấy

sẽ nhàm chán đi rất nhiều nếu thiếu mọi người

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, những người luôn ở bên cạnh động viên, ủng hộ và là nguồn động lực to lớn giúp con vững bước trên con đường

đã chọn

TÓM TẮT

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các cây thuốc cổ truyền ở Bình Dương (Việt

Nam), bao gồm lá Thành Ngạnh Nam (Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume)

và lá Xăng Mã (Carallia brachiata (Lour.) Merr.) Kết quả khảo sát điều kiện chiết

cao tổng cho thấy phương pháp chiết Soxhlet và dung môi ethanol 70% cho hiệu quả tốt nhất ở cả hai đối tượng, với hàm lượng flavonoid là 186,8 mg QUE/g NLK (lá Xăng Mã) và 604 mg QUE/g NLK (lá Thành Ngạnh Nam); giá trị MIC trên chủng MRSA là 5 mg/mL (lá Xăng Mã) và 1,25 mg/mL (lá Thành Ngạnh Nam) Thành Ngạnh Nam có hai phân đoạn thể hiện hoạt tính kháng MRSA là ethyl acetate

(MIC=2,5 mg/mL) và n-butanol (MIC=5 mg/mL), trong đó chỉ có ethyl acetate thể

hiện khả năng hợp lực với cefoxitin (FICI= 0,129), làm giảm nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh 256 lần Xăng Mã có ba phân đoạn thể hiện hoạt tính kháng MRSA

là n-hexane (MIC=0,3125 mg/mL), ethyl acetate (MIC=2,5 mg/mL) và n-butanol (MIC=5 mg/mL), trong đó n-hexane có hợp lực một phần (FICI=1,004), n-butanol

có hợp lực (FICI=0,065) và ethyl acetate không có hợp lực với cefoxitin Phân đoạn

n-butanol của lá Xăng Mã và phân đoạn ethyl acetate của lá Thành Ngạnh Nam không

thể hiện sức mạnh hiệp đồng khi kết hợp với nhau

ABSTRACT

This study was carried out on traditional medicinal plants in Binh Duong

province (Vietnam), including leaves of C.cochinchinense and leaves of C.brachiata

The survey on total extraction conditions showed that the Soxhlet extraction method

and the 70% ethanol solvent gave the best results in both subjects, with a total

flavonoid content of 186.8 mg QUE/g NLK (C.brachiata) and 604 mg QUE/g NLK

(C.cochinchinense); MIC values on MRSA strain were 5 mg/mL (C.brachiata) and

1.25 mg/mL (C.cochinchinense) C.cochinchinense had tow fractions showing

anti-MRSA activity, the ethyl acetate fraction (MIC=2.5 mg/mL) and the n-butanol

fraction (MIC=5 mg/mL), in which only the ethyl acetate fraction showed synergistic

ability with cefoxitin (FICI=0.129), reducing the minimum inhibitory concentration

of this antibiotic 256 times C.brachiata had three fractions that exhibit anti-MRSA

activity, the n-hexane fraction (MIC=0.3125 mg/mL), the ethyl acetate fraction

(MIC=2.5 mg/mL) and the butanol fraction ( MIC=5 mg/mL), in which the

n-hexane fraction was partially synergistic (FICI=1.004), the n-butanol fraction was

synergistic (FICI=0.065) and the ethyl acetate fraction was not synergistic with

cefoxitin The n-butanol fraction of C.brachiata and the ethyl acetate fraction of

C.cochinchinense did not show synergistic strength when combined

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết

quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực và không sao chép

từ bất kỳ một nguồn nào, dưới bất kì hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài

liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy

MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ I LỜI CẢM ƠN II TÓM TẮT III LỜI CAM ĐOAN V DANH MỤC BẢNG IX DANH MỤC HÌNH ẢNH X DANH MỤC VIẾT TẮT XI

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1TỔNGQUANVỀMRSA 5

1.1.1 Lịch sử và phân loại học 5

1.1.2 Đặc điểm 6

1.1.3 Các yếu tố độc lực 7

1.1.4 Cơ chế kháng thuốc 8

1.2TỔNGQUANVỀKHÁNGSINHCEFOXITIN 9

1.2.1 Phân loại 9

1.2.2 Cơ chế tác động 10

1.2.3 Phổ kháng khuẩn 10

1.2.4 Chất thay thế methicillin 11

1.3TỔNGQUANVỀTHÀNHNGẠNHNAM 12

1.3.1 Phân loại thực vật 12

1.3.2 Đặc điểm 13

1.3.3 Thành phần hóa học 14

1.3.4 Hoạt tính sinh học 16

1.4TỔNGQUANVỀXĂNGMÃ 17

1.4.1 Phân loại thực vật 17

1.4.2 Đặc điểm 18

1.4.3 Thành phần hóa học 19

1.4.4 Hoạt tính sinh học 20

1.5TỔNGQUANVỀCAOCHIẾT/PHÂNĐOẠNKHÁNGMRSA 21

1.5.1 Tác động riêng lẻ 21

1.5.2 Tác động khi kết hợp 23

1.6SỰCẦNTHIẾTCỦAĐỀTÀI 24

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM 25

2.1VẬTLIỆU,HÓACHẤTVÀTHIẾTBỊ 25

2.1.1 Vật liệu 25

2.1.2 Hóa chất 25

2.1.3 Thiết bị 26

2.2PHƯƠNGPHÁPXỬLÝNGUYÊNLIỆU 26

2.2.1 Diệt men 27

2.2.2 Làm khô 27

2.2.3 Xác định độ ẩm 27

2.3PHƯƠNGPHÁPCHIẾTCAOTỔNG 28

2.3.1 Chiết ngâm dầm 28

2.3.2 Chiết Soxhlet 29

2.4PHƯƠNGPHÁPCHIẾTCAOPHÂNĐOẠN 30

2.5PHƯƠNGPHÁPĐỊNHLƯỢNGFLAVONOID 32

2.5.1 Nguyên tắc 32

2.5.2 Tiến hành 33

2.6PHƯƠNGPHÁPXÁCĐỊNHHOẠTTÍNHKHÁNGMRSA 35

2.6.1 Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm 35

2.6.2 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch 36

2.6.3 Phương pháp vi pha loãng 36

2.7PHƯƠNGPHÁPXÁCĐỊNHKHẢNĂNGHỢPLỰCCHECKERBOARD 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38

3.1KẾTQUẢXỬLÝNGUYÊNLIỆU 38

3.2KẾTQUẢKHẢOSÁTĐIỀUKIỆNCHIẾTCAOTỔNG 40

3.2.1 Hiệu suất chiết cao tổng 42

3.2.2 Hàm lượng flavonoid tổng 44

3.2.3 Hoạt tính kháng MRSA 46

3.3KẾTQUẢCHIẾTCAOPHÂNĐOẠN 48

3.3.1 Hiệu suất chiết cao phân đoạn 48

3.3.2 Kết quả hàm lượng flavonoid và hoạt tính kháng MRSA 50

3.4KẾTQUẢKHẢOSÁTHỢPLỰCGIỮACAOPHÂNĐOẠNVÀKHÁNG SINHCEFOXITIN 55

3.5KẾTQUẢKHẢOSÁTHỢPLỰCGIỮACAOPHÂNĐOẠNCỦATHÀNH NGẠNHNAMVÀCAOPHÂNĐOẠNCỦAXĂNGMÃ 58

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

4.1KẾTLUẬN 61

4.2KIẾNNGHỊ 61

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC 62

DANH MỤC THAM KHẢO 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Giới hạn phát triển của S.aureus Nguồn: ICMSF 1996 [16] 7

Bảng 1.2 Tiêu chí xác định MRSA bằng khuếch tán đĩa oxacillin và cefoxitin 11

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng MRSA từ lá của một số cây thuốc cổ truyền 21

Bảng 1.4 Một số tinh chất kháng MRSA 22

Bảng 1.5 Tác động hiệp lực giữa tinh chất thực vật và kháng sinh β-lactam trên MRSA 23

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 25

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị 26

Bảng 3.1 Giá trị độ ẩm trung bình của nguyên liệu sau khi phơi 40

Bảng 3.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp chiết Soxhlet và phương pháp chiết ngâm dầm 41

Bảng 3.3 Kết quả hiệu suất chiết cao tổng 42

Bảng 3.4 Hàm lượng flavonoid tổng của cao tổng 44

Bảng 3.5 Giá trị MIC của cao tổng 46

Bảng 3.6 Sơ đồ thí nghiệm tìm giá trị MIC của cao phân đoạn 51

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát cao phân đoạn 51

Bảng 3.8 Sơ đồ thí nghiệm tìm giá trị FICI 56

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng hợp lực với cefoxitin 57

Bảng 3.10 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp hai phân đoạn 59

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi Nguồn: [13] 6

Hình 1.2 Khuẩn lạc của S.aureus 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các kháng sinh 10

Hình 1.4 Đặc điểm hình thái của Thành Ngạnh Nam 13

Hình 1.5 Cấu trúc của một số triterpene ở Thành Ngạnh Nam (Việt Nam) 14

Hình 1.6 Cấu trúc của một số xanthone ở Thành Ngạnh Nam (Việt Nam) 15

Hình 1.7 Một số xanthone từ Thành Ngạnh Nam (nghiên cứu ngoài nước) 16

Hình 1.8 Đặc điểm hình thái của Xăng Mã 19

Hình 1.9 Một số cấu trúc hóa học phân tách từ Xăng Mã 20

Hình 2.1 Quy trình xử lý nguyên liệu 27

Hình 2.2 Quy trình chiết ngâm dầm 29

Hình 2.3 Quy trình chiết Soxhlet 30

Hình 2.4 Quy trình chiết cao phân đoạn 32

Hình 2.5 Quy trình định lượng flavonoid toàn phần 34

Hình 2.6 Phương trình đường chuẩn quercetin 34

Hình 3.1 Hình thái của nguyên liệu sau khi diệt men 38

Hình 3.2 Hình thái của nguyên liệu sau khi phơi 39

Hình 3.3 Hình thái nguyên liệu sau khi xay 40

Hình 3.4 Hiệu suất chiết cao phân đoạn của Thành Ngạnh Nam 48

Hình 3.5 Hiệu suất chiết cao phân đoạn của Xăng Mã 49

Hình 3.6 Mối liên hệ giữa hàm lượng flavonoid toàn phần và hoạt tính kháng MRSA của cao phân đoạn lá Xăng Mã 54

Hình 3.7 Mối liên hệ giữa hàm lượng flavonoid toàn phần và hoạt tính kháng MRSA của cao phân đoạn lá Thành Ngạnh Nam 55

Hình 3.8 Kết quả khảo sát hợp lực giữa hai phân đoạn 59

DANH MỤC VIẾT TẮT BuOH Butanol

DMSO Dimethylsulfoxide

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EtOAc Ethyl acetate

EtOH Ethanol

FICI Fractional inhibitory concentration index - Nồng độ ức chế phân đoạn

MIC Minimal inhibitory concentration - Nồng độ ức chế tối thiểu

MRSA Methicillin - resistant Staphylococcus aureus - Tụ cầu kháng methicillin

MSSA Methicillin - sensitive Staphylococcus aureus - Tụ cầu nhạy methicillin

PBPs Penicillin binding proteins: các protein gắn penicillin

QUE Quercetin equivalent - Đương lượng quercetin

TF Total flavonoid content - Hàm lượng flavonoid tổng

IC50 The half maximal inhibitory concentration – Giá trị ức chế 50%

PHẦN MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Hiện tượng kháng thuốc đã và đang tác động tiêu cực đến sức khỏe của hàng triệu người, ở cả các quốc gia phát triển và đang phát triển, đồng thời có tác động lớn về

mặt tài chính đối với xã hội Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là mối

đe dọa chính trong số các tác nhân kháng kháng sinh gây tử vong ở Mỹ với chi phí chăm sóc lên tới 3-4 tỷ đô la Mỹ mỗi năm Theo số liệu thống kê từ Trung tâm Kiểm

soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ, số ca nhiễm Staphylococcus aureus kháng

methicillin (MRSA) hàng năm còn nhiều hơn tổng 3 căn bệnh truyền nhiễm khác gộp lại bao gồm HIV, viêm gan và lao phổi [1] Còn trong một nghiên cứu ở 10 nước châu

Á thì tỷ lệ tử vong 30 ngày liên quan viêm phổi dao động từ 18,7% đến 40,8%, và

MRSA chiếm 82,1% của các chủng S aureus phân lập Trong nghiên cứu ANSORP, S.aureus là một trong 4 nguyên nhân hàng đầu của viêm phổi liên quan thở máy

(12,2%) [2]

MRSA đề kháng với hầu hết các kháng sinh nhóm β-lactam (penicillin,

cephalosporin và carbapenem) bằng cách tạo ra các protein liên kết với penicilin (PBP, PBP2a), thể hiện ái lực thấp đối với kháng sinh, thay đổi tính thấm của màng và thoát dòng kháng sinh ra bên ngoài tế bào [3] Do đó, số lượng kháng sinh có thể sử dụng để điều trị MRSA rất hạn chế, chỉ bao gồm vancomycin, teicoplanin, telavancin, linezolid,

Sự xuất hiện của sự đa kháng thuốc ở vi khuẩn Gram dương nói chung và MRSA nói riêng là một vấn đề y tế toàn cầu và là một thách thức trong điều trị Việc kiểm soát lây nhiễm và giảm thiểu sự kháng thuốc của vi khuẩn đối với các loại thuốc thông thường hiện đang là mục tiêu quan trọng đối với các nhà nghiên cứu

Mặc dù có hiệu quả thấp hơn so với các loại thuốc kháng sinh cổ điển nhưng sản phẩm kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật vẫn là một giải pháp đầy hứa hẹn Ngày nay, các hợp chất tự nhiên có thể được sử dụng theo cách kết hợp với thuốc kháng sinh hoặc kết hợp với nhau để tăng cường hoạt động kháng khuẩn Hướng nghiên cứu này

đã thành công trong việc phát triển các liệu pháp chống lại ung thư, HIV, vi khuẩn lao

Mycobacterium và các trường hợp phức tạp của bệnh sốt rét [4] Nhiều nhà khoa học

cũng đã chứng minh việc phối hợp thuốc có tác dụng tích cực trong điều trị các bệnh nhiễm trùng, bệnh do vi sinh vật gây ra, hạn chế sự phát triển đề kháng và ngăn ngừa việc lạm dụng kháng sinh [5]

Trước nhu cầu trên và tiếp nối với các nghiên cứu: “Sàng lọc kháng sinh thực vật

tan trong dung môi nước kháng Staphylococcus aureus” và “Đánh giá đặc điểm kháng Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của một số dược liệu thu hái tại tỉnh

Bình Dương” của Tiến sĩ Mai Thị Ngọc Lan Thanh, đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng

lại vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của một số cây bản địa

tại Bình Dương” đã được thực hiện trên hai đối tượng là lá Thành Ngạnh Nam và lá

Xăng Mã

Mục đích nghiên cứu

Với mục đích tìm kiếm các tác nhân kháng MRSA từ cây thuốc cổ truyền, tái sử dụng kháng sinh cũ và cải thiện hoạt tính ở các chiết xuất thực vật, đề tài tập trung vào

04 mục tiêu cụ thể như sau:

1) Đưa ra điều kiện chiết xuất hiệu quả đối với lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng

4) Đánh giá và đưa ra công thức hợp lực giữa các cao phân đoạn

Đối tượng nghiên cứu

Đề tài tập trung vào 03 đối tượng nghiên cứu như sau:

1) Cao ethanol toàn phần/cao phân đoạn từ hai cây thuốc cổ truyền thu hái tại

tỉnh Bình Dương bao gồm: lá Thành Ngạnh Nam (Cratoxylum cochinchinensis) và lá Xăng Mã (Carallia Brachiata)

2) Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC®

33591 được cung cấp bởi Microbiologics, Mỹ

3) Kháng sinh cefoxitin (Sigma, Đức)

Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trong phòng thí nghiệm

Nội dung nghiên cứu

Với mục tiêu trên, đề tài tập trung vào các nội dung chính như sau:

1) Khảo sát điều kiện chiết cao ethanol tổng bằng cách thay đổi hai thông số là phương pháp chiết (ngâm dầm, Soxhlet) và nồng độ dung môi ethanol (EtOH 99,5 –

96 – 70 – 50% v/v) Từ đó chọn điều kiện chiết tốt nhất thông qua kết quả phân tích nồng độ ức chế tối thiểu MIC trên chủng MRSA và hàm lượng flavonoid tổng

o Nguyên liệu: lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng Mã

o Mục tiêu: điều kiện chiết tốt nhất

o Thông số đánh giá: nồng độ ức chế tối thiểu MIC trên chủng MRSA và hàm lượng flavonoid tổng

2) Khảo sát hoạt tính kháng MRSA và hàm lượng flavonoid tổng của các cao

phân đoạn (gồm: n-hexane, ethyl acetate, n-butanol và nước)

o Nguyên liệu: cao tổng đã lựa chọn – kết quả của nội dung (1)

o Mục tiêu: cao phân đoạn có hoạt tính

o Thông số đánh giá: nồng độ ức chế tối thiểu MIC trên chủng MRSA và hàm lượng flavonoid tổng

3) Khảo sát và tìm công thức hợp lực của các cao phân đoạn với kháng sinh cefoxitin thông qua phương pháp checkerboard

o Nguyên liệu: cao phân đoạn có hoạt tính – kết quả của nội dung (2)

o Mục tiêu: cao phân đoạn có hợp lực/công thức hợp lực

o Thông số đánh giá: chỉ số FICI

4) Khảo sát và tìm công thức hợp lực giữa cao phân đoạn của lá Thành Ngạnh Nam và cao phân đoạn của lá Xăng Mã thông qua phương pháp chekerboard

o Nguyên liệu: cao phân đoạn có hợp lực với kháng sinh cefoxitin – kết quả của nội dung (3)

o Mục tiêu: khả năng hợp lực giữa hai cao phân đoạn

o Thông số đánh giá: chỉ số FICI

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Đề tài ghi nhận hoạt tính kháng MRSA của các cây thuốc cổ truyền ở Bình Dương gồm lá Thành Ngạnh Nam và lá Xăng Mã, tìm được điều kiện chiết cao tổng tốt nhất

để có thể tận dụng hiệu quả tiềm năng kháng khuẩn của hai đối tượng này Ngoài ra,

đề tài cũng khảo sát được khả năng kết hợp giữa cao phân đoạn của đối tượng nghiên cứu với kháng sinh cefoxitin và khả năng kết hợp giữa cao phân đoạn Thành Ngạnh Nam với cao phân đoạn Xăng Mã Kết quả của đề tài góp phần vào công cuộc tìm ra liệu pháp kháng MRSA nhưng hạn chế xuất hiện cơ chế kháng, tái sử dụng lại kháng sinh thế hệ cũ, từ đó, làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn trong công cuộc kiểm soát MRSA

mọng [6] Đến năm 1884, bác sĩ người Đức, Friedrich Julius Rosenbach, đã phân biệt

Staphylococcus bằng màu sắc của các khuẩn lạc, chia Staphylococcus thành hai loài là S.aureus (từ tiếng Latinh là aurum, vàng) và S.albus (tiếng Latinh có nghĩa là trắng)

[7]

Năm 1920, Staphylococcus được Winslow và các cộng sự phân vào họ Micrococcaceae [8] Sau đó, ba nhóm loài Staph aureus, Staph epidermidis và Staph Saprophyticus được Baird-Parker (1974) công nhận vào chi Staphylococcus trong ấn

bản Baird-Parker của Bergey’s Manual [9] Cho đến nay, có ít nhất 25 loài khác đã được mô tả trên cơ sở nghiên cứu tương đồng DNA và các đặc điểm hóa miễn dịch và sinh hóa của chi này [10]

Sự kháng thuốc của S.aureus xuất hiện trong vòng 2 năm sau khi penicillin ra đời (năm 1941) Sau đó, kháng sinh bán tổng hợp methicillin - có khả năng chống lại S.aureus kháng penicillin - đã được phát hiện vào cuối năm 1950 và S.aureus kháng

methicillin (MRSA) được xác định trên lâm sàng vào năm 1960 [11] Kể từ đó, mặc

dù methicillin không còn được sản xuất nhưng các chủng S.aureus đã phát triển khả

năng đề kháng với các loại kháng sinh (kể cả nhóm penicillin và cephalosporin) đều

được gọi chung là S.aureus kháng methicillin (MRSA) [12]

Staphylococcus aureus là cầu khuẩn Gram dương, có đường kính từ 0,5–1,5 μm

và có xu hướng sắp xếp thành từng cụm giống như “chùm nho” (Hình 1.1), không có lông, không có nha bào, thường không có vỏ [6]

Hình 1.1 Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi Nguồn: [13]

Staphylococcus aureus thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, một số có

khả năng làm tan huyết trên thạch máu ngựa nhưng vùng tan huyết tương đối nhỏ so

với đường kính khuẩn lạc (Hình 1.2a) Hầu hết các dòng S.aureus đều tạo sắc tố vàng

(Hình 1.2b), nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo nhiều hơn trong môi trường hiện diện lactose hay các nguồn hydrocacbon khác mà sinh vật này có thể bẽ gãy và

sử dụng [14] Các thử nghiệm sinh hóa điển hình của S.aureus bao gồm: dương tính

với catalase, dương tính với coagulase, nhạy cảm với novobiocin và có khả năng lên men mannitol [15]

Môi trường thạch máu cừu Môi trường thạch MSA

Hình 1.2 Khuẩn lạc của S.aureus

S.aureus tồn tại và phát triển phụ thuộc vào một số yếu tố môi trường như: nhiệt

độ, độ ẩm, hoạt độ nước (aw), sự hiện diện của oxy và thành phần nuôi cấy Các thông

số tăng trưởng vật lý này thay đổi tùy thuộc vào từng chủng Theo ICMSF 1996 thì

giới hạn phát triển của đa số S.aureus được tóm tắt như trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Giới hạn phát triển của S.aureus Nguồn: ICMSF 1996 [16]

Khả năng gây bệnh của S.aureusphụ thuộc vào sức đề kháng của vật chủ và một loạt các yếu tố độc lực cũng như các cơ chế trốn tránh sự phòng thủ của hệ miễn dịch

người Thành tế bào của S.aureus được cấu trúc bởi các protein liên kết bề mặt như:

protein A – ngăn cản quá trình quang hóa hệ thống bổ thể và fibrinogen – tạo ra sự bám dính [18] Ngoài ra, thành tế bào của vi khuẩn này cũng được bao quanh bởi các polysaccharide dạng viên nang, giúp làm suy yếu bổ thể và quá trình opso hóa qua trung gian kháng thể, từ đó, ức chế quá trình thực bào [19] Khi bám vào mô vật chủ,

S.aureus tiết ra các độc tố hemolysin (alpha, beta, gamma và delta) gây hoại tử tuyến

vú; độc tố ruột (enterotoxin loại A, B, C, D và E) gây ngộ độc thực phẩm và đặc biệt

là Panton-Valentine leukocidin gây phá hủy màng sinh chất của các tế bào đa hình

[20] S.aureus cũng có khả năng giải phóng các enzym ngoại bào là coagulase – gây

đông máu huyết tương và protease – đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn lây lan sang tế bào khác [20]

Chất kháng khuẩn thường tác động đa dạng vào các quá trình sinh tổng hợp của

vi khuẩn, bao gồm ức chế tổng hợp thành tế bào (β-lactam, glycopeptide), khử cực màng tế bào (lipopeptide), ức chế tổng hợp protein (aminoglycoside, tetracyline), ức chế tổng hợp acid nucleic (quinolone, fluoroquinolone) và ức chế các con đường trao đổi chất (sulfonamide, trimethoprim) [21]

Tuy nhiên, với một loạt các cơ chế như trên nhưng kháng sinh vẫn chưa thể kiểm soát tốt được các vi sinh vật kháng thuốc Nguyên nhân là do vi khuẩn rất linh hoạt và thích nghi, có khả năng tự bảo vệ chống lại sự tấn công của các chất kháng khuẩn Hơn nữa, sự gia tăng tiêu thụ (ở cả người và động vật) và lạm dụng quá mức kháng sinh đã góp phần tạo điều kiện cho vi khuẩn có thời gian cũng như không gian để phát triển các cơ chế kháng thuốc Hậu quả là vi khuẩn có thể tạo nên tính kháng mức độ cao ở các thế hệ kế tiếp ngay cả khi kháng sinh được sử dụng ở nồng độ rất thấp Trong đó, chỉ riêng trường hợp của MRSA đã có 4 cơ chế kháng thuốc chính: (1) sửa đổi phân tử

đích, (2) sản xuất enzym β-lactamase, (3) khả năng thấm màng ngoài và (4) hình thành

màng sinh học

(1) Sửa đổi phân tử đích PBP: Trong nhiễm sắc thể của MRSA có sự hiện diện

của một đoạn DNA ngoại lai lớn (40-60 Kb), được gọi là phần tử gen mecA, có chức

năng mã hóa cho protein liên kết penicillin 2a hoặc 2’ (PBP2a hoặc PBP2’) PBP2a có

đặc điểm cấu trúc giống với những PBP khác nhưng lại có ái lực thấp với kháng sinh

thuộc nhóm β-lactam [22] Nghĩa là, ở mức điều trị mà kháng sinh có thể ức chế hoạt động dịch chuyển đối với PBP của S.aureus nhạy methicillin thì PBP2a của MRSA vẫn thực hiện được các phản ứng tổng hợp peptidoglycan Cơ chế trên giúp S.aureus

đề kháng với methicillin và tất cả các kháng sinh nhóm β-lactam, steptomycin và tetracylin [23]

(2) Sản xuất enzym β-lactamase: MRSA tiết ra enzym β-lactamase để làm giảm tác dụng của kháng sinh thông qua 2 cơ chế chính Đầu tiên là cơ chế thủy phân, β-

lactamase hydrol hóa và làm bất hoạt các kháng sinh, ví dụ, penicillin, cephalosporin,

monobactam và carbapenem [24, 25] Thứ hai là cơ chế chèn ép, một lượng lớn

β-lactamase liên kết nhanh chóng và chắc chắn với kháng sinh ngoại bào, ngăn cản kháng sinh đến không gian nội bào và do đó, kháng sinh không thể đến được vị trí đích [25] (3) Khả năng thấm màng ngoài: Khi tính thấm của màng tế bào giảm xuống, quá trình chuyển hóa năng lượng của vi khuẩn bị ảnh hưởng, do đó, sự hấp thu thuốc bị giảm, dẫn đến tình trạng kháng thuốc [25] Hori và Hiramatsu (1994) và Andrade

(2014) đã phát hiện ra S.aureus đề kháng với aminoglycoside là do cơ chế này [26]

(4) Hình thành màng sinh học: Màng sinh học vi khuẩn là một cấu trúc phức hợp ngoại bào, bao gồm một quần thể vi sinh vật gắn liền với bề mặt của chất nền Các sinh vật bên trong màng sinh học được bao quanh bởi một chất nền polyme ngoại bào ngậm nước cao, bảo vệ vi khuẩn thích nghi với môi tường xung quanh Đặc điểm nổi bật nhất của màng sinh học là khả năng bám dính và kháng thuốc mạnh, cho phép vi khuẩn chống lại các phản ứng miễn dịch của vật chủ và tránh bị tiêu diệt bởi kháng sinh [25]

1.2 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH CEFOXITIN

Cefoxitin là một loại kháng sinh bán tổng hợp, thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ hai, được Karady và cộng sự (1972) tổng hợp thành công từ cephamycin C Cấu trúc của cefoxitin được tạo ra bằng cách thay nhóm thienyl acetamido cho chuỗi bên

α-aminoadipoyl của cấu trúc tự nhiên ban đầu, có một vòng β-lactam bốn cạnh kết hợp với một dị vòng sáu cạnh (Hình 1.3) Cefoxitin được đặc trưng bởi nhóm 7-α-metoxyl

và 3-cacbamoyl (thay cho nhóm 7-α-hydro và 3-acetoxy của các cephalosporin thế hệ

đầu tiên) Đây cũng là nguyên nhân giúp cefoxitin không chỉ giữ được các đặc tính mong muốn của cephamycin C mà còn có được một phổ kháng khuẩn rộng hơn [27]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các kháng sinh

Cefoxitin là kháng sinh tác động vào quá trình tổng hợp vách tế bào (cell wall) của vi khuẩn Cefoxitin ức chế tổng hợp lớp peptidoglycan thông qua ức chế enzym transpeptidase (còn gọi là PBP) – chịu trách nhiệm hình thành liên kết chéo giữa các monomer Cụ thể, cefoxitin, với cấu trúc hóa học tương đồng với đầu D-Ala-D-Ala của chuỗi peptide, hoạt động như “cơ chất thứ hai” cạnh tranh với D-Ala-D-Ala là cơ chất thứ nhất, làm bất hoạt enzym, dẫn đến các liên kết chéo không được hình thành, vách tế bào vi khuẩn trở nên yếu ớt và dễ dàng bị phá hủy từ chính áp suất thẩm thấu bên trong [28]

Cefoxitin có một phổ kháng khuẩn khá rộng, bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí, kỵ

khí, Gram âm và Gram dương Cefoxitin chống lại S.aureus, Steptococcus pneumoniae

và các liên cầu khuẩn tan huyết trong các thử nghiệm in vitro, thể hiện hoạt tính giống

nhau ở tụ cầu sinh penicillinase và tụ cầu không sinh penicillinase Hoạt tính đối với các vi sinh vật Gram dương của cefoxitin kém hơn so với cephalothin và cephloridine Tuy nhiên, cefoxitin lại có khả năng chống lại một loạt các vi khuẩn Gram âm, bao

gồm Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus mirabilis và các loài dương tính với

indole như Pr.vulgaris, Pr.morganii, Pr.rettgeri, Haemophilus influenzae, Salmonella sp., Shigella sp., Providencia sp., Neisseria gonorrhoeae [29]

Cũng như các cephalosporin khác, cefoxitin không có hoạt tính chống lại

Str.faecalis và các chủng S.aureus kháng methicillin (MRSA) Mặc dù có nhóm metoxyl giúp tăng độ ổn định của thuốc trước sự thủy phân của β-lactamase nhưng

7-α-cefoxitin vẫn bị MRSA đề kháng một cách hiệu quả nhờ vào cơ chế biến đổi protein PBP

Tiêu chuẩn vàng để xác định MRSA là phát hiện gen mecA (phương pháp PCR)

hoặc phát hiện PBP2a bằng cách ngưng kết latex [30, 31] Tuy nhiên, những xét nghiệm này không nằm trong phạm vi của nhiều phòng thí nghiệm và tương đối đắt tiền Do đó, vẫn cần có một phương pháp phát hiện MRSA đáng tin cậy và có thể được thực hiện dễ dàng trong các tình huống thông thường Trước đây, thử nghiệm khuếch tán đĩa methicillin thường được sử dụng để phát hiện MRSA, sau đó được thay thế bằng oxacillin Hiện nay, NCCLS (Ủy ban Quốc gia về Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm Lâm sàng) đã ghi nhận xét nghiệm sàng lọc đĩa cefoxitin là một trong những phương pháp hiệu quả [31], cho kết quả chính xác và lặp lại nhiều hơn so với khi sử dụng oxacillin

Bảng 1.2 Tiêu chí xác định MRSA bằng khuếch tán đĩa oxacillin và cefoxitin

Xét nghiệm MIC oxacillin (μg/mL)

Xét nghiệm MIC cefoxitin (μg/mL)

Khuếch tán đĩa cefoxitin (mm)

Nhiều nghiên cứu cũng đã được thực hiện để đánh giá phương pháp khuếch tán đĩa cefoxitin Kết quả của Anand và cộng sự (2009) cho thấy phương pháp này phù hợp để thay thế cho PCR trong các cơ sở hạn chế về nguồn lực [30] Cụ thể, trong số

50 chủng phân lập, đối với 32 chủng kháng với khuếch tán đĩa cefoxitin đều có kết quả

dương tính với gen mecA Kết luận tương tự cũng được nêu ra trong nghiên cứu của

Fernandes (2005), khi sử dụng cefoxitin làm tiêu chí thì độ nhạy và độ đặc hiệu để

nhận biết kháng methicillin đều là 100% [32] Cùng năm 2009, Akcam và cộng sự đã

sử dụng PCR làm tiêu chuẩn để so sánh phương pháp khuếch tán đĩa cefoxitin và

phương pháp ngưng kết latex PBP2a [33] Kết quả cho thấy đĩa cefoxitin phát hiện

kháng methicillin chính xác ở tất cả các chủng phân lập so với sự hiện diện của gen

mecA Trong khi, bảy trong số 60 chủng dương tính với mecA cho thấy kết quả khác

biệt với phương pháp ngưng kết latex

Có thể thấy, trong bối cảnh methicillin không có sẵn thì cefoxitin được xem là

chất thay thế thích hợp cho methicillin trong việc xác định xem vi khuẩn có biểu hiện

kháng methicillin hay không Do đó, đề tài lựa chọn cefoxitin làm đối tượng nghiên

cứu trong các thí nghiệm về sự kết hợp với cao chiết để có đánh giá hiệu quả nhất về

sự khôi phục tính nhạy cảm của kháng sinh đối với MRSA

Tên khoa học: Cratoxylum cochinchinense (Lour.) Blume

Tên gọi khác: Thành Ngạnh, Ngành Ngạnh, Đỏ ngọn, Vàng La, Cúc Lương,

Hoàng Ngưu Trà

Họ Hypericaceae bao gồm 8 chi và 400 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng ôn đới

và nhiệt đới Họ này có đặc điểm là có rất nhiều nhị hoa liên kết với nhau, tạo thành

bó 3 hoặc bó 5 Tên chi Cratoxylum là sự kết hợp của “kratos” và “xylon” – tiếng Hy

Lạp có nghĩa là thân gỗ chắc khỏe [34] Chi này có 19 loài trên thế giới, đều là cây gỗ

hay cây bụi, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á Ở Việt Nam, có 4-5 loài [35]

Còn tên loài Cochinchinense dùng để chỉ vùng phân bố tự nhiên của loài, gồm hầu hết

các nước ở Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia, Mianma),

Ấn Độ và các tỉnh ở phía nam Trung Quốc [34] Ở Việt Nam, Cochinchinense mọc

phổ biến ở tất cả các tỉnh thuộc vùng núi thấp (dưới 600 m) và trung du [35]

Thành Ngạnh Nam là loại cây ưa sáng và có khả năng chịu hạn cao Cây thường

mọc lẫn với nhiều loại cây bụi khác ở đồi, bờ mương rẫy hoặc ven rừng thưa Thành

Ngạnh Nam thuộc loại cây nhỏ có gai ở gốc, để tự nhiên cây có thể cao 6-12 m, cho

gỗ Thân phía ngọn có màu đỏ do lông tơ màu đỏ (đỏ ngọn) Lá hình mác dài 12-13

cm, rộng 35-40 mm, mọc đối, cuống ngắn 3-5 mm, mặt gân chính đỏ đến 1/3 Lá non

gân lá và lá có màu đỏ đến quá nửa Cành non có lông tơ màu vàng nhạt, cành già

nhẵn, màu xám Hoa màu hồng nhạt, mọc riêng lẻ hoặc thành chùm nhỏ, ra hoa vào

khoảng tháng 5 đến tháng 7 Quả nang, dài 15 mm, rộng 7-8 mm Hạt hình trứng, dài

6 mm, rộng 3 mm [36]

Hình 1.4 Đặc điểm hình thái của Thành Ngạnh Nam

Thành Ngạnh Nam có vị đắng chát, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiêu hóa Cho đến hiện tại thì loại cây này chỉ mới được sử dụng trong phạm vi nhân dân với vai trò là một loại thuốc cổ truyền Theo kinh nghiệm dân gian, lá Thành Ngạnh Nam giã nát, trộn với nước vo gạo có tác dụng chữa bỏng và trị đau dạ dày, ngứa lở, kiết lỵ, lậu nhiệt Ngoài ra, dùng rễ hay vỏ cây tươi (40 g) và lá tươi (20 g) sắc nước uống có thể phòng cảm nắng Ngọn Thành Ngạnh Nam cũng có tác dụng hút mũ, làm vết thương khô, sạch, chóng lên da non, gây cảm giác mát, dễ chịu [34]

1.3.3.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 1998, Lê Thị Diệu Nguyên và Harrison đã tiến hành phân tích sắc ký thành phần hóa học của Thành Ngạnh Nam (thu hái ở Nam Bộ) Kết quả cho thấy có 7 hợp chất triterpene hai vòng và 2 cấu trúc xanthone từ loài này [37]

(I.a): (13E, 17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3β-ol (R=β-OH)

(I.b): γ-polyodatetraene (R=H)

(I.c): (13E, 17E)-3β-axetoxypolypoda-7,13,17,21-tetraen-3-one (R=O)

(I.d): (13E, 17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3-one (R=β-O)

Hình 1.5 Cấu trúc của một số triterpene ở Thành Ngạnh Nam (Việt Nam)

Vào năm 2006, lá của C.cochinchinense (thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ

An) đã được Do N.Dai và các cộng sự tiến hành nghiên cứu về thành phần bay hơi Sau khi phân tích GC/MS, sáu mươi bảy hợp chất đã được phát hiện, trong đó, hydrocacbon sesquiterpene chiếm 60,2%, gồm các hợp chất chính là caryophyllene (16,0%) và bicyclogermacrene (18,4%) [34]

Trên các cơ sở đó, từ cao hexane của vỏ cây Thành Ngạnh Nam (thu hái ở Lâm trường Sông Kon, Bình Định), Nguyễn Ngọc Chí (2016) đã phân lập được 3 hợp chất xanthone là cochinchinon A, cratoxylumxanthon B và 9-hydroxycalabaxonthon [38]

Hình 1.6 Cấu trúc của một số xanthone ở Thành Ngạnh Nam (Việt Nam)

Những báo cáo nêu trên là một trong số ít các nghiên cứu được thực hiện trên loài

Cratoxylum cochinchinense ở nước ta Đa số các nghiên cứu còn lại thường tập trung

vào các loài khác cùng chi, điển hình là nghiên cứu của Kitanov và các cộng sự (bao

gồm Assenov và Dam The Van) Lá của Cratoxylum pruniflorum Kurz (thu hái vào

tháng 1 tại Việt Nam) được chứng minh là có chứa 3,9-4,7% tannin và 0,51-0,56% flavonoid Ngoài ra, các tác giả cũng xác định được các hợp chất quercetin hyperosid, 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon, mangiferin và isomangiferin tồn tại đáng kể trong lá [39] Tương tự, năm 1995, khi sàng lọc thành phần hóa học của cây Đỏ Ngọn bằng các phản ứng định tính, Nguyễn Liêm và cộng sự (Học viện quân y) đã phát hiện ra sự có mặt của tannin, flavonoid, saponin, triterpene và các acid hữu cơ trong lá của

Cratoxylum pruniflorum [36] Tác giả còn cho biết không tìm thấy alkaloid và

anthraquinon trong thành phần của cây này ở Việt Nam

1.3.3.2 Nghiên cứu ngoài nước

Các xanthone là nhóm chất lớn nhất, phổ biến nhất có ở hầu hết các loài thuộc

chi Cratoxylum Do đó, khi nghiên cứu về thành phần hóa học của Thành Ngạnh Nam,

các nhà khoa học thường tập trung vào loại hợp chất này Cụ thể, Yinghui Duan và các cộng sự (2012) đã phân lập được 8 xanthone từ dịch chiết ethanol 95% của thân cây

C.cochinchinense (thu hái ở tỉnh Hải Nam, Trung Quốc) [40] Chihiro Ito cũng phân

lập được 10 xanthone từ phân đoạn EtOAc của cành Thành Ngạnh Nam (thu hái ở vườn quốc gia Singapore) vào năm 2016 [41] Ngoài ra, còn nhiều nghiên cứu khác đã được thực hiện để phân lập xanthone như: nghiên cứu của Laphookhieo (2009) thực hiện trên quả (thu hái ở Thái Lan) [42], nghiên cứu của Rattanaburi (2014) thực hiện trên thân (thu hái ở Thái Lan) [43]

Hình 1.7 Một số xanthone từ Thành Ngạnh Nam (nghiên cứu ngoài nước)

Ngoài xanthone, Yang Yu và cộng sự (2009) cũng phân lập được 2 benzophenone glucoside từ dịch chiết EtOH 60% của thân cây Thành Ngạnh Nam (thu hái ở Trung Quốc ) [44] Một số flavonoid cũng được phát hiện như dihydrokaempferol, taxifolin, astilbin [45]

1.3.4.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên Thành Ngạnh Nam hiện chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát thành phần hóa học và tinh chế một số chất Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học còn rất hạn chế Trong những năm gần đây, Học viện Quân y – Hà Nội cho biết

dịch chiết cây Đỏ Ngọn (Cratoxylum pruniflorum) – một loài cùng chi với Thành Ngạnh Nam (C.cochinchinense) có tác dụng chống oxy hóa tốt, hoạt tính đạt 69% trong

khi tanakan chỉ đạt 49% [46] Ngoài ra, bộ môn Dược học quân sự cũng nghiên cứu

được một số tác dụng lâm sàng của đối tượng trên, bao gồm khả năng làm tăng mức phản xạ có điều kiện và dập tắt phản xạ trên chuột nhắt trắng, hoạt hóa thần kinh Các tác giả cũng báo cáo dịch chiết nước của Đỏ Ngọn có hoạt tính kháng lại các loại vi

khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi [46]

1.3.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Thành Ngạnh Nam được nhiều nghiên cứu chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn đáng kể Kết quả của Rattanaburi (2007) và Mahabusarakam (2009) cho thấy

các chiết xuất và hợp chất xanthone tách được từ C.cochinchinense có thể chống lại hoạt động của S.aureus ATCC25923 và MRSA SK1 [47, 48] Năm 2020, khi thực hiện

khảo sát tiềm năng sinh học của nhựa cây, Boonnak và các cộng sự cũng có kết luận

tương tự, C.cochinchinense có một phổ kháng khuẩn khá rộng, bao gồm cả vi khuẩn Gram dương (MRSA ATCC 43300, B.subtilis, E.faecalis, VRE) và vi khuẩn Gram âm (S.typhi, S.sonei, P.aeruginosa) Hơn thế, các tác giả đã chứng minh được giữa Thành

Ngạnh Nam và vancomycin có tác động hiệp đồng trên MRSA [49]

Ngoài kháng khuẩn thì C.cochinchinense còn được đặc trưng bởi nhiều hoạt tính

sinh học khác Cụ thể, nghiên cứu của Laphookhieo (2006) và Rattanaburi (2008) đã chứng minh dịch chiết hexane, CH2Cl2 và MeOH của đối tượng này có khả năng gây độc trên các loại tế bào ung thư như NIC-H187, MCF, HeLa và HT-29 [47, 50] Năm

2012, hoạt tính chống oxy hóa và ức chế peroxy hóa lipid của C.cochinchinense cũng

được báo cáo [51] Gần đây nhất là nghiên cứu của Peng Li và cộng sự (2018) Trong bài báo, Thành Ngạnh Nam thể hiện tiềm năng chống đái tháo đường khi có thể kháng

cực mạnh với enzym α-glucosidase (IC50=4,8 μM) và PTP 1B (IC50=2,4 μM) [52]

1.4 TỔNG QUAN VỀ XĂNG MÃ

Giới: Thực vật (Plantate)

Bộ: Malpighiales

Họ: Rhizophoraceae

Chi: Carallia

Loài: C.brachiata

Tên khoa học: Carallia brachiata (Lour.) Merr

Tên gọi khác: Xăng Mã Chẻ, Xăng Mã Nguyên, Trúc Tiết, Săng Mã

Họ Rhizophoraceae có khoảng 120 loài, 16 chi và 4 phân họ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Phi và Ấn Độ Tên chi xuất phát từ “Karalli” nghĩa là

“cây thuốc Ấn Độ” và tên loài “brachiatus” nghĩa là phân nhánh [53] C.brachiata

được (Lour) Merr mô tả khoa học lần đầu tiên vào năm 1919 trên tạp chí The Plant

List Ở Việt Nam, C.brachiata mọc hầu hết ở các tỉnh có rừng, từ Thanh Hóa, Nghệ

An đến Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước

Xăng Mã thuộc loại cây ưa sáng, thân gỗ, cao 20–25 m, đường kính 50–60 cm Cành non dẹt, màu xanh, sau chuyển sang màu đỏ nâu Vỏ màu nâu xanh, mỏng, nhẵn, thịt vỏ màu đỏ nâu Lá đơn nguyên mọc đối, dài 4–10 cm, rộng 2,5–4,5 cm, hình trứng ngược, hình bầu dục hoặc trái xoan, đầu có mũi ngắn, gốc hình nêm rộng Mặt dưới màu lục nhạt, nổi rõ những chấm nhỏ màu nâu đỏ Cuống lá thô, dài 0,5 cm Hoa nhỏ, màu trắng hợp thành xim phân nhánh ở nách lá Mỗi nhánh mang 3–5 hoa Cánh đài hình chuông, chia 4–8 thùy hình tam giác Quả nang hình cầu, đường kính 0,5 cm, đỉnh

có cánh đài Quả màu da cam [54] Xăng Mã nở hoa vào tháng 2-3, chín quả vào tháng 4-5 và thường rụng lá vào mùa khô (tháng 1-2)

Hình 1.8 Đặc điểm hình thái của Xăng Mã

Cho đến hiện tại thì Xăng Mã chỉ mới được sử dụng trong phạm vi dân gian với

vai trò là một loại thuốc cổ truyền Quả ăn được, có tác dụng thoái nhiệt, dùng trị lở

loét lây lan (Campuchia, Lào, Việt Nam và Ấn Độ) Vỏ cây dùng chữa ghẻ (Ấn Độ),

chữa apto và viêm hầu họng (Ấn Độ) và chữa sốt rét (Trung Quốc) [55]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên Xăng Mã hiện chỉ dừng lại ở mức phân loại

thực vật Tuy nhiên, trên thế giới lại có khá nhiều báo cáo về thành phần hóa học của

đối tượng này Cụ thể, từ lá thu hái ở Ấn Độ, thông qua các phản ứng hóa thực vật sơ

bộ, Junejo và các cộng sự cho thấy hầu hết các loại dịch chiết, gồm chloroform, ethyl

acetate, methanol và nước của Xăng Mã đều có chứa một hàm lượng đáng kể flavonoid,

alkaloid, glycoside và tannin [56] Kết quả tương tự cũng được báo cáo bởi Fitzgerald

vào năm 1995 [57]

Sau đó, năm 1999, Ling và cộng sự tiến hành phân lập các tinh chất từ lá Kết

quả thu được 30 hợp chất, gồm 1 hợp chất diglycoside megastigmane, 2 hợp chất

megastigmane, 1 dẫn xuất 1,2-dithiolane, 7 hợp chất thơm, 5 hợp chất tannin, 12 hợp

chất flavonoid và 2 hợp chất glyceroglycolipid [58]

Hình 1.9 Một số cấu trúc hóa học phân tách từ Xăng Mã

Trên cơ sở đó, Phuwapraisirisan (2006) tiếp tục phân lập các tinh chất từ vỏ Xăng

Mã và cho biết có 3 hợp chất mới, gồm carallidin, mahuannin A và p-hydroxy benzoic

acid [59]

Ở Việt Nam, hiện chưa ghi nhận được báo cáo nào liên quan đến hoạt tính sinh học của Xăng Mã Tuy nhiên, trên thế giới lại có khá nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên đối tượng này Điển hình là kết quả thí nghiệm của Abraham và Thomas vào

năm 2013 Các tác giả đã chứng minh dịch chiết acetone từ vỏ của C.brachiata có tác dụng kháng khuẩn trên các loại vi khuẩn khác nhau như: Bacillus cereus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus rettgeri, Streptococcus haemolyticus [1] Tương tự, Neeharika (2010) đã báo cáo rằng các hợp chất từ vỏ của Xăng Mã có khả năng chống lại Micrococcus luteus (Gram +) và nấm men Saccharomyces cerevisae [60]

Ngoài ra, Xăng Mã còn được đặc trưng bởi hoạt tính kháng oxy hóa Kết quả nghiên cứu của Phuwapraisirisan (2006) cho thấy vỏ của loài cây này có khả năng loại

bỏ gốc tự do DPPH và superoxide [59] Đặc biệt, tác giả đã chỉ ra hợp chất carallidin kháng oxy hóa với giá trị IC50 là 102 μM, cao hơn cả chứng dương BHA (IC50=180 μM) Năm 2012, Neeharika và các cộng sự cũng thực hiện đánh giá khả năng chống oxy hóa của chiết xuất ethyl acetate và methanol thu được từ vỏ Xăng Mã Trong tất

cả các thử nghiệm, bao gồm thử nghiệm trên gốc DPPH, gốc oxit nitric, gốc anion superoxid và gốc hydroxyl, cả hai chiết xuất đều cho thấy hoạt tính tối thiểu là 40% và tối đa là 90% [61]

Xăng Mã còn được biết đến với một loạt các hoạt tính khác như chữa lành vết thương [62], giảm đau, chống viêm và hạ đường huyết trên chuột [63], bảo vệ gan và

ức chế sự hình thành mỡ [64]

1.5 TỔNG QUAN VỀ CAO CHIẾT/PHÂN ĐOẠN KHÁNG MRSA

Nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn của cây thảo dược đang là xu hướng được áp dụng rộng rãi trên thế giới Nhiều báo cáo về cây thuốc cổ truyền có tác dụng chống MRSA đã được ghi nhận Theo tổng kết của Okwu và các cộng sự (2019), có khoảng

51 cây, thuộc 35 họ có hoạt tính này (Bảng 1.3) [65] Trong đó, hầu hết các nghiên cứu đều được thực hiện trên cao tổng (nước, methanol, ethanol ) thu được từ các bộ phận khác nhau của cây (lá, vỏ, hoa, quả) Các chiết xuất được chứng minh là có sự hiện diện của alkaloid, terpenoid, flavonoid, phenol, steroid và glycoside

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng MRSA từ lá của một số cây thuốc cổ truyền

Giá trị MIC (mg/mL) trên MRSA

Nigeria

Ngoài ra, tinh chất phân lập được từ thực vật cũng được báo cáo là có hoạt tính

kháng MRSA Cụ thể, năm 2012, Sujina và các cộng sự đã phát hiện ra β-asarone từ dịch chiết thân rễ Acorus calamu có thể chống lại MRSA với vùng ức chế là 12 mm

và giá trị MIC là 2,5 mg/mL Năm 2014, Chan EW phân lập được 3 flavonol

rhamnoside từ lá của C.tergemina và chứng minh các hợp chất này có tác dụng tiêu

diệt vi khuẩn kháng methicillin Tương tự, bảy hợp chất flavonoid được phân lập từ

Desmodium caudatum cũng cho thấy hoạt tính chống MRSA in vitro Gần đây nhất,

Horvath và các cộng sự đã làm một bảng tóm tắt ghi nhận hơn 25 hợp chất có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ức chế MRSA (Bảng 1.4) [66] Trong đó, các chất thuộc nhóm flavonoid là nổi bật hơn hết

Tetrandrine,demethyltetrandrine 64-128 μg/mL

Mặc dù cao chiết/tinh chất có hoạt tính kháng MRSA đáng kể nhưng so với kháng sinh thương mại thì hoạt tính này còn thấp hơn rất nhiều Tuy nhiên, thực vật lại có thể kháng lại vi khuẩn theo nhiều cách khác nhau, bao gồm xuyên thấu màng tế bào, ức chế bơm efflux, phá hủy enzym Điều này rất cần thiết trong bối cảnh tình trạng kháng thuốc tăng nhanh và sự phát triển kháng sinh suy giảm Do đó, xu hướng kết hợp kháng sinh với cao chiết/tinh chất đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới

Điển hình là nghiên cứu của Fernades vào năm 2012 Khi kết hợp dịch chiết

P.guineese với 5 loại kháng sinh khác nhau, tác giả đã chứng minh được mối tương tác

hiệp đồng giữa các đối tượng này trên MRSA Đặc biệt, sự kết hợp của dịch chiết

P.guineese với cefoxitin có giá trị FICI thấp nhất, nằm trong khoảng từ 0,125 đến 0,5

MIC của cefoxitin từ 100 μg/mL hạ xuống còn 0,19 μg/mL [67] Năm 2019, khi tiến

hành kết hợp cao ethanol của Morus alba với gentanicin và oxacillin, Aelenei cũng

nhận thấy hoạt tính kháng khuẩn đã được cải thiện đáng kể Cụ thể, giá trị MIC của

kháng sinh giảm từ 4-32 lần, trong khi khả năng kháng khuẩn của Morus alba tăng từ

mức trung bình lên mức cao [68]

Ngoài ra, rất nhiều bài báo đã được công bố về tác động hiệp động giữa tinh chất

từ thực vật với kháng sinh (Bảng 1.5) [69] Trong đó, kháng sinh nhóm β-lactam

thường được sử dụng và sự kết hợp được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc tái tạo tính nhạy cảm với MRSA của các kháng sinh nhóm này

Bảng 1.5 Tác động hiệp lực giữa tinh chất thực vật và kháng sinh β-lactam trên

MRSA Tên hợp chất Tên thực vật Cơ chế tác động

Corilagin Arctostaphylos uva-ursi Ức chế protein PBP2a Baicalin Lycopus europaeus Ức chế β-lactamase

EGCg Dịch chiết trà xanh

Bám trực tiếp lên peptidoglican và ức chế tổng hợp thành thế bào Catechin Dịch chiết trà xanh Ức chế bơm efflux

1.6 SỰ CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nhìn chung, Thành Ngạnh Nam và Xăng Mã là hai cây thuốc cổ truyền Việt Nam

có nhiều tác dụng dược lý trong dân gian, được các nghiên cứu trên thế giới chứng

minh có thành phần hóa học đa dạng với nhiều hoạt tính sinh học in vitro nổi trội Tuy

nhiên, trong phạm vi nghiên cứu tổng quan của đề tài, hiện vẫn chưa ghi nhận được báo cáo về khả năng kháng MRSA, khả năng khôi phục tính nhạy của kháng sinh bị kháng cũng như khả năng kết hợp với nhau của hai đối tượng này Trong khi đó, những thí nghiệm nêu trên đang là xu hướng tiếp cận phổ biến trong công cuộc tìm kiếm liệu pháp ngăn chặn vi khuẩn kháng kháng sinh Do đó, đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng

lại vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) của một số cây bản địa

tại Bình Dương” đã được thực hiện để bổ sung thêm các kết quả chưa được phát hiện

này ở cả Thành Ngạnh Nam và Xăng Mã

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG THỰC NGHIỆM

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) ATCC®

33591, và chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus nhạy methicillin (MSSA) ATCC®

6538 được cung cấp bởi công ty Microbiologics của Mỹ

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất

5 Môi trường lỏng tryptone soy (TSB) Merck Đức

6 Môi trường agar tryptone soy (TSA) Merck Đức

11 Sodium nitric Xilong Trung Quốc

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị

7 Đĩa 98 giếng có nắp tiệt trùng Biologix Hoa Kỳ

2.2 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU

Quy trình xử lý nguyên liệu được thể hiện trong Hình 2.1

Nguyên liệu

Thu háiRửa sạchDiệt menPhơi

Đo độ ẩmBảo quản

Hình 2.1 Quy trình xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu sau khi thu hái được loại bỏ những lá bị hư, sâu hại và héo úa, sau

đó được rửa sạch với nước (giống như rửa rau), để ráo và làm khô trong mát có quạt Tiến hành đun sôi nước, khi lượng hơi nước đủ nhiều xếp dược liệu lên các vỉ hấp Vỉ dưới nằm trên mặt nước Vỉ trên cùng được đậy bằng một nón kim loại để tránh nước khi đọng lại nhỏ trên dược liệu Hấp dược liệu trong vài phút [71]

Lá sau khi diệt men được trải mỏng trên các liếp, làm khô tự nhiên ở nơi thoáng mát và không có ánh nắng mặt trời cho đến khi độ ẩm đạt dưới 12% theo dược điển V

và bảo quản trong túi zip có hút ẩm ở nhiệt độ phòng

Đo độ ẩm nguyên liệu bằng cân sấy ẩm Kern DBS-3 Trải một lớp nguyên liệu mỏng (khoảng 0,5 g) lên đĩa nhôm rồi đặt vào máy đo độ ẩm, tiến hành đo ở nhiệt độ

120oC đến khối lượng không đổi Khi trên màn hình hiển thị chữ END, đọc kết quả và