khảo sát hoạt tính kháng nấm da của cao riềng nếp ở dạng phối hợp

3: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – cao riềng – terbinafine bằng phương pháp khuếch tán chủng nấm da T.. 5: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – cao riềng – terbinafine bằng phương p

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM DA CỦA CAO RIỀNG NẾP Ở DẠNG PHỐI HỢP

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS.TS Nguyễn Đinh Nga SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm MSSV: 0953010773

Khóa: 2009 - 2013

Tp Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm i

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS Nguyễn Đinh Nga đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu để em hoàn thành tốt chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này

Các thầy cô và các anh (chị) trong bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh Trùng tại khoa Dược trường đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ, hỗ trợ em trong thời gian tiến hành chuyên đề khóa luận tốt nghiệp

Tất cả các thầy cô đã giảng dạy đại học khóa 2009 khoa Công nghệ Sinh Học đã giúp em trau dồi kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trường

Cảm ơn các anh (chị) đang làm đề tài tại bộ môn Ký Sinh Trùng cùng các bạn khóa 2009 đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trên hết, với tất cả lòng kính yêu con xin chân thành cảm ơn đến ba mẹ và mọi người trong gia đình đã tạo điều kiện từ tinh thần đến vật chất, là chỗ dựa thật vững chắc để con yên tâm học tập và hoàn thiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này

TP.HCM, ngày 25 tháng 05 năm 2013

Trịnh Thị Thanh Trâm

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm iii 2.2.1.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của nấm da (MIC) bằng

phương pháp pha loãng 19

2.2.2 Khảo sát hiệu quả phối hợp của các chất kháng nấm 20

2.2.2.1 Xác định phối hợp giữa các hợp chất kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán 20

2.2.2.2 Xác định tỉ lệ phối hợp giữa các hợp chất kháng nấm bằng phương pháp loãng theo bàn cờ 21

2.2.3 Xác định hoạt tính kháng nấm ex vivo trên mô hình móng nhiễm 23

3.1 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 26

3.1.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm của tinh dầu Tràm Trà Úc 26

3.1.2.3 Khảo sát hiệu quả phối hợp giữa cao riềng và các chất kháng nấm trên M gypseum 35

3.1.2.2 Xác định tỉ lệ phối hợp giữa các hợp chất kháng nấm bằng phương pháp pha loãng theo bàn cờ 40

3.1.3 Kết quả kháo sát tác động của chất kháng nấm lên T.mentagrophytes trên mô hình móng nhiễm 46

3.2 THẢO LUẬN KẾT QUẢ 47

1 KẾT LUẬN 50

2 ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 53

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

E floccosum Epidermophyton floccosum

T mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm v

DANH MỤC BẢNG

I TỔNG QUAN

Bảng 1 1 Phân loại nấm da dựa trên đặc điểm của bào tử đính lớn 6

II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Bảng 3 1: Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi nấm (MIC) 26 Bảng 3 2: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – cao riềng – Cao BMT bằng

phương pháp khuếch tán chủng nấm da T mentagrophytes 27

Bảng 3 3: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – cao riềng – terbinafine bằng

phương pháp khuếch tán chủng nấm da T mentagrophytes 29

Bảng 3 4: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – cao riềng – cao BMT bằng

phương pháp khuếch tán chủng nấm da T rubrum 31

Bảng 3 5: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – cao riềng – terbinafine bằng

phương pháp khuếch tán chủng nấm da T rubrum 33

Bảng 3 6: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – cao riềng – cao BMT bằng

phương pháp khuếch tán chủng nấm da M gypseum 35

Bảng 3 7: Kết quả xác định phối hợp giữa TTO – Cao riềng – terbinafine bằng

phương pháp khuếch tán chủng nấm da M gypseum 37

Bảng 3 8: Kết quả phối hợp của cao riềng và TTO của chủng nấm 40 Bảng 3 9: Kết quả phối hợp của cao riềng và cao BMT của chủng nấm 41 Bảng 3 10: Kết quả phối hợp của cao riềng và TTO của chủng nấm T rubrum 42 Bảng 3 11: Kết quả phối hợp của cao riềng và cao BMT của chủng nấm 43 Bảng 3 12: Kết quả phối hợp của cao riềng và TTO của chủng nấm M gypseum 44 Bảng 3 13 : Kết quả phối hợp của cao riềng và cao BMT của chủng nấm 45 Bảng 3 14: Tóm tắt hiệu quả phối hợp giữa cao Riềng và các chất kháng nấm 46 Bảng 3 15: Tác động ức chế sự phát triển của T mentagrophytes 46

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ

I VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sơ đồ 1: Sơ đồ bản nhựa 96 giếng 22

DANH MỤC HÌNH I TỔNG QUAN Hình 1.1 Cây Riềng nếp 3

Hình 1.2 Microsporum canis 7

Hình 1.3 T mentagrophytes 7

Hình 1.4 E floccosum 7

Hình 1.5 Hắc lào trên da 9

Hình 1 6: Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy 11

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2 1: Quy trình thực hiện MIC bằng phương pháp pha loãng 19

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Hình 3 1: Phối hợp kháng nấm T mentagrophytes của BMT – cao riềng 28

Hình 3 2: Phối hợp kháng nấm T mentagrophytes của terbinafine – Cao riềng 29

Hình 3 3: Phối hợp kháng nấm T rubrum giữa của cao riềng – cao BMT 31

Hình 3 4: Phối hợp kháng nấm T rubrum giữa của cao riềng – terbinafine 33

Hình 3 5: Phối hợp kháng nấm M gypseum của BMT – cao riềng 35

Hình 3 6: Phối hợp kháng nấm M gypseum của terbinafine – cao riềng 37

Hình 3 7: Tác động ức chế sự phát triển của T.mentagrophytes khi tiếp xúc với chất thử (quan sát bằng mắt thường) 47

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3 1: Đường kính vòng kháng nấm của cao Riềng ở các nồng độ TTO 38

Biểu đồ 3 2: Đường kính vòng kháng nấm của cao BMT ở các nồng độ TTO 39

Biểu đồ 3 3: Đường kính vòng kháng nấm của terbinafine ở các nồng độ TTO 39

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm vii

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1: So sánh đường kính vòng kháng nấm T mentagrophytes của dầu Riềng ở các nồng độ TTO khác nhau 54 Phụ lục 2: So sánh đường kính vòng kháng nấm T mentagrophytes của cao BMT ở

các nồng độ TTO khác nhau 55 Phụ lục 3: So sánh đường kính vòng kháng nấm T mentagrophytes của dầu Riềng

ở các nồng độ TTO khác nhau 56 Phụ lục 4: So sánh đường kính vòng kháng nấm T mentagrophytes của terbinafine

ở các nồng độ TTO khác nhau 57 Phụ lục 5: So sánh đường kính vòng kháng nấm T rubrum của dầu Riềng ở các

nồng độ TTO khác nhau 58 Phụ lục 6: So sánh đường kính vòng kháng nấm T rubrum của cao BMT ở các

nồng độ TTO khác nhau 59 Phụ lục 7: So sánh đường kính vòng kháng nấm T rubrum của dầu Riềng ở các

nồng độ TTO khác nhau 60 Phụ lục 8: So sánh đường kính vòng kháng nấm T rubrum của terbinafine ở các

nồng độ TTO khác nhau 61 Phụ lục 9: So sánh đường kính vòng kháng nấm M gypseum của dầu Riềng ở các

nồng độ TTO khác nhau 62 Phụ lục 10: So sánh đường kính vòng kháng nấm M gypseum của cao BMT ở các

nồng độ TTO khác nhau 63 Phụ lục 11: So sánh đường kính vòng kháng nấm M gypseum của dầu riềng ở các

nồng độ TTO khác nhau 64 Phụ lục 12: So sánh đường kính vòng kháng nấm M gypseum của terbinafine ở các

nồng độ TTO khác nhau 65

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa vừa nóng vừa ẩm, lại là nước nông nghiệp, người dân phải tiếp xúc nhiều với bùn đất, ẩm ướt kéo dài… Tất cả những yếu tố đó là điều kiện thuận lợi cho các loại vi sinh vật như vi nấm, vi khuẩn… phát triển để gây bệnh Do đó các bệnh về nấm ở Việt Nam rất phổ biến và đa dạng Đặc biệt, nấm da là một trong những vấn đề y khoa thường gặp ở nước ta, và bệnh biểu hiện dưới rất nhiều dạng khác nhau, các thể bệnh thường xuất hiện ở nhiều nơi như da, móng, niêm mạc và tóc Bệnh nấm da là một nhóm bệnh gồm nhiều bệnh do nhiều chủng nấm khác nhau, gây thương tổn ở da, tóc và móng

Nếu không được điều trị, nấm móng rất hiếm khi tự khỏi, thường có xu hướng lan ra tất cả các cấu trúc giải phẫu của móng và lây lan sang các móng khác cũng

như những người xung quanh

Hiện nay bệnh nấm da đã có thuốc điều trị nhưng hầu hết là có nguồn gốc tổng hợp như: kem clotrimazol, kem nizoral, kem terbinafine (lamisol), …

Việc sử dụng thuốc có nguồn gốc tổng hợp thường cho hiệu quả tốt nhưng giá thành cao và mang lại nhiều tác dụng phụ không mong muốn, và dễ gây ra hiện tượng chọn lọc các chủng nấm kháng thuốc Do đó, ngoài việc nâng cao ý thức sử dụng thuốc hợp lý trong cộng đồng thì việc nghiên cứu tìm ra những hợp chất mới có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn từ nguồn gốc thảo dược cũng như tìm ra các phối hợp hiệp lực, cộng lực giữa các chất kháng nấm để phòng và trị bệnh đang được quan tâm

Dựa theo các nghiên cứu trước đây, cao Riềng nếp, chiết xuất từ thân rễ Riềng nếp (Alpinia galanga Swartz Zingiberaceae), cho tác động kháng nấm da tốt nhưng khi sử dụng ở nồng độ cao có thể gây kích ứng da, vì vậy để khắc phục nhược điểm này chúng tôi khảo sát một số dạng phối hợp giữa cao Riềng nếp và một số hợp chất khác nhằm tìm phối hợp tăng tác động kháng nấm và giảm nồng độ cao Riềng

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM DA CỦA CAO RIỀNG NẾP Ở DẠNG PHỐI HỢP

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 2

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 3

1.1 KHÁI QUÁT VỀ RIỀNG NẾP [4, 5, 11, 15]

Danh pháp khoa học: Alpinia galanga (L.) Willd

Tên đồng nghĩa: Languas galanga (L.) Stuntz, Alpinia pyramidata Blume Tên nước ngoài: Greater galangal (Anh), grand galanga (Pháp)

Họ: Gừng (Zingiberaceae)

Hình 1.1 Cây Riềng nếp ⮚ Hình thái và phân bố

✔ Hình thái:

Cây thuộc loại thảo, cao 1 - 2 m Thân cỡ 5 - 7 mm, thân rễ to 2-3 cm có mùi thơm Lá hình mũi giáo nhọn, thót lại nơi gốc, dài 30 - 40 cm, rộng 7 - 8 cm, không có lông Chùy hoa dài 15 - 30 cm, rộng 8 - 10 cm, nhiều hoa Chùy có lông nhung và nhánh nhiều, sát nhau Cuống hoa mọc đứng, có lông Hoa màu trắng, có vạch hồng, dài 20 - 25 mm; tràng hoa có ống ngắn, cánh hoa hình giáo tù, dài 10 - 15 mm; cánh môi hình giải xoan ngược, phiến

mm, màu đỏ nâu chứa 3 - 5 hạt… ✔ Phân bố

nhiệt đới của châu Á và trên các đảo ở Thái Bình Dương

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 4

nước Đông Nam Á ⮚ Công dụng

Công dụng quan trọng và nổi trội là làm gia vị trong thực phẩm Ngoài ra, tinh dầu riềng nếp còn được dùng làm chất phụ gia trong kỹ nghệ nước giải khát, rượu như Chartreuse Nụ hoa và hoa dùng làm thực phẩm dịch chiết được thêm vào các loại rượu có nồng độ cồn thấp để tạo cảm giác rượu mạnh hơn

Riềng nếp được dùng như riềng ấm chữa đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa, lỵ

một nhúm ngậm, cắn nhẹ và nuốt dần dần giúp giải khát, đỡ mệt khi làm việc mệt nhọc hoặc đi nắng nhiều khát nước Thân rễ riềng nếp được ghi trong dược điển nhiều nước châu Âu, và được dùng rộng rãi trong y học cổ truyền trị bệnh

bụng, lỵ, ung thư miệng và dạ dày, nhiễm khuẩn toàn thân, bệnh dịch tả và làm thuốc long đờm Ở Trung Quốc, Lào và Campuchia, thân rễ được uống chống co giật, gây trung tiện và long đờm, trị lỵ, trị viêm phế quản, và dùng ngoài trị thấp khớp Ở Thái Lan, thân rễ được dùng trị nhiều bệnh, làm thuốc lọc máu, trị khó

ghẻ cóc, đau dạ dày, bệnh dịch tả, ngứa, nấm da, bệnh da, chốc lở, mày đay, đau răng, trị giun, chống co thắt, gây trung tiện, đầy hơi Ở Philippin, thân rễ được dùng gây trung tiện, kích thích, và nước sắc lá dùng làm nước tắm trị thấp khớp Ở Indonesia, thân rễ nạo nhỏ trộn với ít muối uống lúc đói trị lách to, và nước ngâm thân rễ uống trị bệnh phong Ở Malaysia, hạt được dùng trị cơn đau bụng,

bệnh viêm xổ, đặc biệt trong viêm xổ phế quản, và cùng với hồ tiêu và gừng trị sốt Cao lá dùng bôi trị ngứa và bệnh dị ứng da Thân rễ riềng nếp là thuốc kích dục của người Ả Rập Xê Út, phối hợp với ba dược liệu khác chữa viêm khớp dạng thấp ở Cô Oét

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 5

⮚ Tính chất dược lý

- Tác dụng ngừa ung thư:

Một nghiên cứu tại trường Dược, ĐH Kangwon National University,

galangin có những hoạt tính chống oxy hóa và thu nhặt các gốc tự do gây hại cho tế bào, do đó có thể ngừa tác hại của các chất gây ung thư

Hoạt chất 1’- acetoxychavicol acetat có tác dụng chống ung thư mạnh in

vitro và in vivo, chống u báng Sarcoma 180 ở chuột nhắt trắng, ức chế phát triển u ruột kết gây bởi azoxymethan ở tế bào người, ức chế sự gây ung thư nội sinh gan chuột cống trắng Những hoạt chất khác có khả năng chống ung thư là 1’- acetoxy – eugenol – trans - cinnamat và ethy 4 – methoxy – trans - cinnamat Cao methanol thân rễ ức chế mạnh tác dụng gây đột biến của 3 –

TA 98

- Tác dụng kháng nấm

khô đều biểu lộ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng động vật nguyên sinh, trừ sâu và long đờm mạnh Cao nước, cồn hoặc ete thân rễ có hoạt tính

aureus, Streptococcu shemolytcus và Pseudomonas aeruginosa Cao cồn và

neoformans, Epidermophyton floccosum, Microsporum gypseum, Trichophyton mentagrophytes, T concentrium, T rubrum, Aspergillus niger, Penicillium expansum và Rhizopus stolonifer, với nồng độ tối thiểu ức chế là 50 – 250 µg/ml.

- Tác dụng kháng khuẩn

Tinh dầu từ thân rễ có hoạt tính kìm trực khuẩn lao với nồng độ 25μg/ml - Tác dụng chống viêm

cầu cừu chống lại tác động của môi trường nhược trương và nhiệt Màng

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 6

hồng cầu giống màng thể tiêu bào; các glucocorticoid và thuốc tương tự aspirin có tác dụng ổn định thể tiêu bào, tác dụng này là một trong những cơ chế chủ yếu chống viêm

Bảng 1 1: Phân loại nấm da dựa trên đặc điểm của bào tử đính lớn

Đặc điểm bào tử đính lớn Microsporum Trichophyton Epidermophyton

Bào tử đính nhỏ Thường rất ít Rất nhiều, hình tròn hay bầu dục, 2-3 µm

Không có Những sợi tơ nấm khác Sợi tơ nấm hình

vợt, hình xoắn (thường ít)

Rất ít sợi tơ nấm xoắn hình sừng nai

Không có

Với ánh sáng đèn Wood cho hiện tượng huỳnh quang

Thường dương tính (trừ M

gypseum)

Thường âm tính (trừ

T tonsunrans, T schoenleinii

Không có

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 7

Hình ảnh đại diện

Hình 1.2 Microsporum canis Hình 1.3 T mentagrophytes Hình 1.4 E floccosum

Khoảng 10% dân số thế giới mắc bệnh nấm da, nhiều loại nấm da gặp ở khắp nơi trên thế giới như T rubrum, M canis, M gypseum, E flocosum Một số loài giới hạn vài nơi như T soundanense, T schoeleinii chỉ gặp ở Châu Phi Khoảng 58% nấm da là T rubrum, 27% là T mentagrophytes, 7% là T

verrucosum, 3% là T tonsunrans Khoảng 1% còn lại là E flocosum, M

audouinii, M canis, M equinum, M nanum, M versicolor, T equinum, T

rabitschekii và T violaceum

Về mặt dịch tễ học, nấm da được chia thành 3 nhóm:

lây lan từ người sang người bằng 2 cách

Trực tiếp khi tiếp xúc giữa người có bệnh và người không có bệnh Gián tiếp qua các vật dụng như quần áo, khăn, nón, chiếu

Ví dụ: T rubrum, E flocosum, T tonsunrans, T schoenleinii , T

violaceum, M audouinii

- Nhóm ưa thú (zoophilie): thường gặp ở chó, mèo, trâu, bò, ngựa lây nhiễm sang người do tiếp xúc với thú vật bị bệnh

Ví dụ: M canis truyền từ chó, mèo sang người

T mentagrophytes truyền từ ngựa hoặc các loài gặm nhấm sang người

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 8

T verrucosum truyền từ trâu, bò sang người

T equinum truyền từ ngựa sang người

sang người do những sang thương trên da M gypseum, T ajelloi có thể gây

bệnh da ở những người làm vườn

Nơi nào trên cơ thể có keratin thì đều có thể bị nấm da ký sinh vì chúng có khả năng làm tan rã keratin để lấy nitrogen làm chất dinh dưỡng Bệnh nấm da rất đa dạng, gồm có: bệnh nấm tóc, bệnh ở da nhẵn và ở nếp da, bệnh nấm móng

Nấm da sống ký sinh ở phần da chứa keratin thuộc lớp ngoài cùng của da và các phần phụ như tóc, móng Do vi nấm có enzym keratinase phân giải được keratin nên có thể xâm nhập và phát triển ở lớp sừng của da Nấm da thường không xâm nhập vào lớp da sâu, nhưng có thể xâm nhập vào nang lông gây viêm nang và áp xe quanh nang lông Trong một vài trường hợp, khi ký chủ suy giảm miễn dịch, vi nấm có thể xâm nhập vào lớp da sâu, phát triển và gây u hạt viêm, được gọi là nấm da sâu

Bệnh nấm da biểu hiện được dấu hiệu lâm sàng, tùy thuộc bởi các yếu tố như loài gây bệnh, số lượng vi nấm nhiễm, vị trí nhiễm và tình trạng miễn dịch của ký chủ Có nhiều cách phân loại các dạng lâm sàng của bệnh nấm da, nhưng hiện nay phân loại thông thường nhất là dựa vào vị trí nhiễm nấm

Bệnh ở lớp sừng của da

Bệnh ở da nhẵn (Tinea corporis) Hắc lào (tinea circinata)

Thương tổn có hình vòng lan rộng, bờ hơi gồ cao có vẩy và có những mụn rộp, ở giữa có màu lọt giống như da lành Kích thước và hình dạng của thương tổn tùy thuộc vào mức độ viêm, M canis gây nhiều hơn T rubrum

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 9

Hình 1.5 Hắc lào trên da Vẩy rồng (tinea imbrucata, tolelau)

Nấm bắt đầu ở một điểm rối lan dần, có khi cả thân mình trừ mặt và đầu do bệnh kéo dài lâu năm Da không viêm nhưng tróc vảy tạo thành nhiều vòng

đồng tâm Bệnh do T concentrium gây ra và thường gặp ở Nam Mỹ, Châu Phi

T mentagrophytes thì hai mảng ở bẹn sẽ không đối xứng và lan rộng ra mông hoặc lên thân mình

Bệnh nấm chân (tinea pedis, athlete’s foot )

Tác nhân gây bệnh thường là T rubrum và T mentagrophytes và R

interdigitale , E floccosum

Thông thường kẽ chân tróc vảy nhẹ, chảy nước và ngứa Bệnh do T

mentagrophytes, thương tổn có thể ở kẽ chân , nổi mụn nước ở lòng bàn chân Bệnh nấm móng (tinea unguum, onychomycosis)

Bệnh thường gặp ở xứ nóng, chiếm khoảng 3% dân số, chủ yếu ở người lớn Móng chân dễ bị nhiễm hơn móng tay Có hai dạng móng nhiễm nấm da thường gặp:

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 10

Bệnh bắt đầu từ bờ, hai rìa móng Móng thường dày và cong, vi nấm xâm nhập từ dưới móng (T.rubrum)

Nấm móng cũng có thể do sự nhiễm nấm từ mặt trên móng (nấm móng trắng

ở mặt trên ), vi nấm gây bệnh thường là T mentagrophytes và R interdugitale

Ở Việt Nam, vi nấm gây nhiễm thường gặp là T rubrum , T

mentagrophytes và E Floccosum

Trên lâm sàng, nấm móng được chia làm 4 thể:

Nấm dưới móng ở ngọn và 2 bên móng: có 3 đặc điểm chính là dày sừng ở dưới móng, tiêu móng gây tách móng ra khỏi giường móng và viêm da quanh

móng Nguyên nhân thường gặp nhất là do nấm Trichophyton rubrum

Nấm bề mặt móng: gây rối loạn màu sắc của móng (thường có màu trắng và

đôi khi màu đen), nguyên nhân thường gặp là do nấm Trichophyton

Bệnh nấm tóc (tinea capitis, scalp ringworm)

Còn gọi là bệnh chốc đầu, là bệnh của trẻ em, bệnh thường lây từ trẻ này sang trẻ khác hay từ thú sang trẻ Vi nấm xâm nhập vào tóc theo ba kiểu Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh thay đổi tùy theo kiểu xâm nhập

1.2.2 Một số thử nghiệm hoạt tính kháng nấm [1, 10, 12, 17]

1.2.2.1 Phương pháp khuếch tán

Dựa vào sự khuếch tán chất thử vào môi trường, nếu chất thử có tác dụng sẽ ức chế sự phát triển của vi nấm hoặc vi khuẩn thì xung quanh đĩa giấy tẩm chất thử, vi nấm và vi khuẩn không phát triển Mức độ ức chế của chất thử đối với vi sinh vật so với mẫu chứng sẽ cho biết mức độ hoạt tính của chất thử Do đó phương pháp này có thể áp dụng để định tính và bán định lượng hoạt tính của chất thử

Dịch treo vi nấm được chuẩn bị trong dung dịch nước muối sinh lý có

tương ứng với giá trị OD ≈ 0,08 – 0,12

Dùng tăm bông vô trùng tẩm dịch treo vi nấm và trải đều lên bề mặt thạch

Đĩa giấy đã tẩm chất thử phải được cho bay hơi dung môi hoàn toàn, sau đó, đặt đĩa giấy lên bề mặt đĩa thạch

Kết quả được đọc sau thời gian quy định với từng loại vi sinh vật

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 12

1.2.2.2 Phương pháp pha loãng

Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ cao đến thấp trong môi trường đã cấy nấm Độ đục của mẫu thử được xác định bằng mắt thường hoặc bằng quang phổ kế, thường được dùng làm điểm dừng khi đọc kết quả Ở những nồng độ chất thử có tác dụng ức chế vi nấm, các ống thử trong suốt, khi chất thử không có tác dụng, vi nấm phát triển làm môi trường trở nên đục

Kết quả xác định được bằng phương pháp pha loãng mang ý nghĩa định lượng Mức độ ức chế của chất thử nghiệm được xác định qua nồng độ tối thiểu ức chế phát triển vi nấm của chất thử (MIC: minimum inhibited concentration) Trị số MIC càng thấp, chất thử càng có tác dụng mạnh

Các phương pháp pha loãng hiện đang được sử dụng:

loãng (microdilution) theo NCCLS M27-A2 (2002) dùng cho nấm men - Phương pháp pha loãng dùng cho nấm mốc NCCLS M38 (2002) Phương pháp chuẩn của NCCLS có thể được biến đổi để phù hợp với các đặc điểm phát triển riêng biệt cho từng loại vi nấm khác nhau hoặc dễ thực hiện hơn, kinh tế hơn, thuận tiện hơn, nhanh hơn…với điều kiện phương pháp biến đổi cho kết quả phù hợp với phương pháp chuẩn Có sự liên thông kết quả giữa các phòng thí nghiệm, được nhiều phòng thí nghiệm sử dụng

1.2.2.3 xác định hoạt tính kháng nấm ex – vivo [13, 14]

Khi nghiên cứu một chất kháng nấm đưa vào sử dụng, khó khăn nhất của các nhà nghiên cứu là không có sự tương đồng giữa tác động in vitro và hiệu quả điều trị lâm sàng, hoặc khó khăn trong việc tiên lượng nồng độ thử nghiệm in vivo từ kết quả in vitro Vì vậy, việc sử dụng các môi trường thử nghiệm tạo được sự phát triển của vi nấm giống như in vivo để thử hoạt tính sinh học của các hợp chất kháng nấm mới đang được các nhà nghiên cứu quan tâm Hướng nghiên cứu hiện nay là sử dụng mô tế bào người để nuôi cấy vi nấm in vitro, ví dụ như da, móng, tóc….Vi nấm khi được nuôi trên

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 13

các mô này phát triển như khi gây bệnh Do đó, việc khảo sát tác dụng của các chất kháng nấm sẽ cho kết quả phù hợp với thực tế điều trị hơn kết quả in

vitro

Chuẩn bị mô nuôi cấy

Các mô được lựa chọn để gây nhiễm thường là những mô mà vi nấm gây bệnh trên người bình thường như tế bào niêm mạc, da, móng, tóc…Đối với nấm da, vi nấm gây bệnh ở da, móng, tóc một số tác giả đã sử dụng các cơ quan chứa keratin của cơ thể người như móng làm cơ chất gây nhiễm

CFU/ml đối với nấm da Dịch treo vi nấm được cấy trực tiếp lên mô thử nghiệm

1.2.3 Một số thuốc điều trị nấm da và niêm mạc [7]

Hiện nay, thuốc đang được sử dụng phổ biến để trị các bệnh ở da và niêm mạc là các azol, gần đây trên thị trường có thêm terbinafine (Lamisil ) ở các dạng viên uống và kem để trị các bệnh nấm da, đặc biệt là nấm móng do nấm da

Các azol kháng nấm gồm imidazol và triazol có cùng phổ kháng nấm và cơ chế tác động Tuy nhiên các triazol chuyển hóa chậm hơn, ít tác động trên sterol của

người hơn imidazol

Thuộc nhóm imidazol gồm có: keteconazol, clotrimazol, miconnazol… Thuộc nhóm triazol gồm có: itraconazol, fluconazol,…

Các thuốc này có sinh khả dụng đường uống tốt (cần acid dịch vị bình thường), phân phối hầu hết các mô, thấm vào dịch não tủy kém (trừ fluconazol)

Các azol đều được chuyển hóa qua gan ⮚ Hoạt tính kháng nấm

Buồn nôn, ói mửa, ban đỏ, đôi khi tổn thương chức năng gan

Đau đầu, chống mặt, buồn ngủ

Ức chế Cyt P450 nên ức chế tổng hợp steroid thượng thận và androgen gây vú to ở đàn ông

Đối với các azol tác động tại chỗ có thể gây: ngứa, ban đỏ, kích thích tại chỗ

⮚ Tương tác thuốc

Các azol làm tăng nồng độ một số thuốc chuyển hóa qua Cyt P450: phenytoin, cyclosporine, thuốc hạ đường huyết đường uống thuốc chống đông Đặc biệt gây tăng nồng độ astermizol và terfenadin gây loạn nhịp tim đe dọa tính mạng

Rifampin làm tăng nồng độ của fluconazol và itraconazol

Các azol dùng ngoài: thuốc bôi tại chỗ thường thuộc nhóm imidazol, gồm

có :

Clotrimazol: trị nấm Candida miệng, Candida âm đạo, nấm da Miconazol: trị nấm da (da đùi, da thân), Candida âm đạo và âm hộ

Ketoconazol : trị nhiễm nấm Candida mạn (da, niêm mạc, miệng – hầu, âm

đạo, lang ben, nấm da)

Các azol uống:

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 15

Fluconazol: hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, không bị ảnh hưởng bởi thức

ăn và acid dạ dày Thuốc có tác dụng tốt với hầu hết các chủng Candida kể cả

nhiểm nấm ở giai đoạn cuối của bệnh nhân AIDS Tuy nhiên hiện nay nhiều chủng Candida trở nên đề kháng với fluconazol Khi dùng thuốc cũng có thể gặp tăng men gan, buồn nôn, đau bụng,…

Itraconazol: hoạt tính kháng nấm giống ketoconazol Thuốc lựa chọn trị nhiễm Blastomyces, Sporothrix và nhiễm nấm sợi màu (chrimoblastomycois )

dưới da Thuốc thay thế trị nhiễm Aspergillus lan tỏa và toàn thân.Trị nhiễm

nấm ở sâu như nhiễm Cocidioides, Cryptococcus, Histoplasma và trị vi nấm ngoài da Tác dụng phụ: buồn nôn, tiêu chảy, tăng triglyceride huyết, giảm K+ huyết Itraconazol không ảnh hưởng đến tổng hợp steroid, tương tác với thuốc chuyển hóa qua gan kém hơn ketoconazol

Ngoài ra còn dùng terconazol, saperconazol,…

Các thuốc trong nhóm azol uống thường có độc tính cao trên gan, thận, gây nổi mẫn ngứa, tương tác với nhiều thuốc,…

⮚ Ưu điểm của nhóm azol: là các chất tổng hợp có hoạt tính kháng nấm tốt, hoạt phổ rộng kháng nấm da, nấm mốc và nấm men

⮚ Nhược điểm: chỉ kiềm nấm và hiện nay có một số chủng nấm đã đề kháng với các thuốc đang sử dụng

Terbinafin

Là allylamin tổng hợp Chất diệt nấm do ức chế enzyme squalen epoxidase gây tích tụ squalen và can thiệp tổng hợp ergosterol Tích tụ ở keratin, rất hiệu quả để trị nấm móng

Tác dụng phụ: rối loạn tiêu hóa, ban đỏ, nhức đầu, rối loạn vị giác

khác được chuyển hóa qua enzyme này

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 16

PHẦN 2

VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 17

2.1 VẬT LIỆU2.1.1 Nấm da

Các chủng nấm da T mentagrophytes, T rubrum và M gypseum được cung cấp từ bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh Trùng trường ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh

2.1.2 Chất thử kháng nấm

Cao Riềng (dầu Riềng) nếp, cao Bông Móng Tay (cao BMT) được cung cấp từ bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh Trùng, khoa Dược, ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Terbinafine (độ ẩm 0,06%), nhà sản xuất Hetew labs – India, nhà cung cấp Steda IE

Tinh dầu Tràm Trà Úc (TTO): công ty cổ phần Dược phẩm 3 tháng 2

2.1.3 Môi trường

Brain Heart Infusion Agar (thạch BHI)

Lò hấp

Tủ cấy vô trùng Máy vortex Máy đo OD

Micropipette, Micropipette nhiều kênh Đĩa giấy kháng sinh trắng

Chuẩn bị dịch treo vi nấm trong nước muối sinh lý chứa 0,05% Tween

bào trong 1 ml, tương ứng với giá trị OD ≈ 0,08 – 0,12 ở bước sóng 530 nm

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 19

2.2.1.2 Xác định nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của nấm da (MIC) bằng phương pháp pha loãng [2, 18]

Môi trường thử: SDB Chủng nấm da thử nghiệm: T mentagrophytes, T rubrum, M gypseum

CFU/ml

Chất thử được hòa tan trong DMSO đạt nồng độ cao gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm cao nhất Pha loãng trong môi trường sao cho nồng độ DMSO cuối cùng nhỏ hơn 1% (là nồng độ không ức chế sự phát triển của vi nấm)

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 07 ngày

Đọc kết quả bằng mắt thường MIC là nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi nấm Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, MIC trung bình của thí nghiệm được tính là trung bình nhân của mỗi MIC mỗi lần thử nghiệm

Hình 2 1: Quy trình thực hiện MIC bằng phương pháp pha loãng

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 20

2.2.2 Khảo sát hiệu quả phối hợp của các chất kháng nấm.

2.2.2.1 Xác định phối hợp giữa các hợp chất kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán: [2, 16]

Môi trường thử nghiệm: SDA bổ sung 0.1% Tween 80 (SDA - T) được chuẩn bị sẵn trong ống nghiệm (20 ml môi trường/ống nghiệm)

Vi nấm thử nghiệm: T mentagrophytes, T rubrum và M gypseum Chất thử:

- Tinh dầu Tràm Trà Úc (TTO): được hòa tan trong DMSO sau đó được bổ sung trực tiếp vào môi trường SDA – T đã chuẩn bị trước ở nồng độ từ: 1/4 đến 1/64 MIC

nồng độ 25 µg/10 µl

chuẩn bị trong hộp petri vô trùng

Đĩa giấy: chất thử sau pha loãng được tẩm vào đĩa giấy với nồng độ 10 µl/đĩa giấy

+ Cao Riềng: 0,1 µl/đĩa giấy

+ Cao Bông Móng Tay: 25 µg/đĩa giấy + Terbinafine: 0,008 µg/đĩa giấy

+ Cao Riềng: 0,05 µl/đĩa giấy

+ Cao Bông Móng Tay: 12,5 µg/đĩa giấy + Terbinafine: 0,008 µg/đĩa giấy

Mỗi hộp petri được đặt 2 đĩa giấy có vị trí cách nhau lớn hơn hoặc bằng bán kính vòng kháng nấm của mỗi chất, mỗi đĩa có tẩm 1 nồng độ dung dịch thuốc thử khác nhau tùy thuộc vào từng chất

Ủ ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 07 ngày

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 22

MIC của các phối hợp

Hệ số FIC (Fractional Inhibitory Concentration) thường được sử dụng để xác định kiểu tương tác giữa các chất

MIC A/PH: MIC của chất A trong phối hợp MIC A: MIC của chất A

MIC B/PH: MIC của chất B trong phối hợp MIC B: MIC của chất B

FIC ≤ 0,5 : hiệp lực bội tăng (synergistic) FIC ≤ 1 : cộng lực (additive)

1 < FIC ≤ 2 : tác động riêng rẽ (indifferent) FIC > 2 : đối kháng (antagonistic)

❖ Tiến hành

Dãy nồng độ của các chất kháng nấm: - Dầu Riềng: 4% - 0,25%

- Tinh dầu tràm trà Úc (TTO): 4% - 0,25% - Dầu riềng – TTO (1 : 10): 4% - 0,25%

Chất kháng nấm được hòa tan trong môi trường PEG 300 : cồn tuyệt đối (75:25) rồi được pha loãng vào môi trường thạch SDA bổ sung 0,1% Tween 80 thành dãy nồng độ thử nghiệm Mỗi nồng độ được chuẩn bị 1 đĩa, 1 đĩa chứng với môi trường không có chất thử

Móng tay sau khi xử lý được đặt phần lưng móng lên bề mặt đĩa thạch chứa chất thử (3 móng/đĩa/nồng độ chất thử)

Nấm da sau khi hoạt hóa 14 ngày sẽ được kiểm tra khả năng sinh bào tử gây bệnh Bào tử nấm được pha loãng trong nước muối sinh lý có bổ sung 0,05%

CFU/ml

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 24

Cắt thạch chứa nấm đường kính 2 mm đặt lên thành móng

quan sát sự phát triển của nấm trên móng bằng mắt thường và kính hiển vi quang học (vật kính 4 và vật kính 10) Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi nấm của phối hợp và các chất thử riêng rẽ ex vivo

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 26

3.1 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

3.1.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm của tinh dầu Tràm Trà Úc

Bảng 3 1: Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi nấm (MIC)

Nhận xét: Dựa vào bảng kết quả 3.1 cho thấy nồng độ tối thiểu kháng nấm của

tinh dầu Tràm Trà Úc trên các chủng nấm da khảo sát nằm trong khoảng 2,5 - 5 µl/ml

3.1.2 Kết quả khảo sát hiệu quả phối hợp của các chất kháng nấm

Phương pháp sử dụng: kết hợp phương pháp pha loãng và phương pháp khuếch tán

(µl/ml) Chất thử

Đường kính vòng kháng nấm (mm)

Lặp lại

TB 1 2 3 4 5 6

T mentagrophytes

0,000 Cao riềng 20,0 20,0 21,0 20,0 19,0 19,0 19,8a1

± 0,3 Cao BMT 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0a2 ± 0,0 0,08 Cao riềng 24,0 24,0 23,0 22,0 23,0 23,0 23,1b1

± 0,3 Cao BMT 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0a2 ± 0,0 0,156 Cao riềng 30,0 32,0 32,0 27,0 28,0 29,0 29,7c1

± 0,8 Cao BMT 8,0 7,0 8,0 8,0 7,0 8,0 7,7 b2± 0,2 0,313 Cao riềng 40,0 37,0 36,0 38,0 36,0 38,0 37,5d1

± 0,6 Cao BMT 9,0 8,0 8,0 8,0 8,0 9,0 8.3c2 ± 0,2 0,625 Cao riềng - - -

Cao BMT - - - Chú thích: (-) nấm không mọc

Những nồng độ có chữ cái giống nhau không khác biệt ở độ tin cậy 95% Các chữ cái có cùng chữ số được so sánh với nhau

SVTH: Trịnh Thị Thanh Trâm 28

Hình 3 1: Phối hợp kháng nấm T mentagrophytes của cao BMT – cao riềng

Nhận xét: Dựa vào bảng kết quả ở bảng 3.2 cho thấy đường kính vòng

nồng độ 0,08 µl/ml cao riềng, sự khác biệt về đường kính vòng kháng nấm ở môi trường không bổ sung TTO so với môi trường có TTO đã có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% (phụ lục 1) Kết quả này cho thấy có sự cộng hợp kháng

T mentagrophytes giữa TTO và cao riềng

Trong bảng số liệu còn cho thấy đường kính vòng kháng nấm T mentagrophytes của cao BMT tăng nhẹ khi tăng dần nồng độ TTO được bổ sung vào môi trường Theo kết quả thống kê ở phụ lục 2, khi trong môi trường chứa 0,08 µl/ml TTO, đường kính vòng kháng không khác biệt có ý nghĩa ở độ tin cậy 95% so với khi không bổ sung TTO (6 mm), tuy nhiên khi tăng TTO lên 0,156 µl/ml (1/32 MIC) và 0,313 µl/ml (1/16 MIC) thì kích thước vòng kháng nấm tăng lên có ý

nghĩa (7,7 mm và 8,3 mm) Như vậy, có sự phối hợp kháng T mentagrophytes

giữa cao BMT và TTO