0331PHÂN LẶP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NÁM, KHÁNG KHUĂN CỦA VI SINH VẬT NỘI SINH TRONG CÂY MUÔNG TRÂU (Cassia alafa L.)

B TR GIÁO D C VẨ ẨO T O NG IH CM TP HCM  BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P Tên đ tài: PHÂN L P VÀ KH O SÁT HO T TÍNH KHÁNG N M, KHÁNG KHU N C A VI SINH V T N I SINH TRONG CÂY MU NG TRÂU (Cassia alata L.) KHOA: CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHI P - D C GVHD : ThS D ng Nh t Linh SVTH : Ph m Th Nguy t H ng MSSV: 1053010210 Khóa: 2010 ậ 2014 Tp H Chí Minh, tháng 05, n m 2014 L IC M N  hoàn thành đ tài này, em xin g i l i c m n đ n Th y Cô khoa Công Ngh Sinh H c, Tr ng i h c M Thành ph H Chí Minh gi ng d y truy n đ t ki n th c cho em su t nh ng n m v a qua đ em làm t t đ tài khóa lu n Em xin g i c m n sâu s c t i cô D ng Nh t Linh t n tình h ng d n, ch b o em su t th i gian em th c hi n đ tài Em xin c m n th y Nguy n V n Minh, ng i truy n đ t cho chúng em nhi u kinh nghi m quý báu Em xin c m th y Linh, nh ng ng an Duy Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi ch Nguy n Th M i anh, ng i ch ng h , giúp đ em lúc làm đ tài Bên c nh đó, tơi xin c m n b n c a tôi, b n sinh viên h c vi c Phịng thí nghi m Cơng ngh Vi sinh quan tâm, giúp đ trình th c hi n đ tài Cu i xin c m n Ba, M , c m n gia đình ln bên con, t o m i u ki n t t nh t đ hoàn thành vi c h c c a Em xin g i l i chúc s c kh e đ n t t c ng ngh sinh h c, Tr g t hái đ ng i th y, ng i đáng kính khoa Cơng i h c m Thành ph H Chí Minh, xin chúc th y cô ngày c nhi u thành công Tôi xin chúc b n c a s luôn thành công đ c ng hi n tài n ng s c tr cho t ng lai đ t n ng b c vào đ i, c Xin chân thành c m n Sinh viên th c hi n Ph m Th Nguy t H ng Tháng 5/2014 KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C HÌNH NH Hình 1.1 Cây mu ng trâu (Cassia alata L.) Hình 2.1 Staphylococcus aureus Hình 2.2 Escherichia coli Hình 2.3 Salmonella typhi 10 Hình 2.4 Pseudomonas aeruginosa 11 Hình 3.1 Candida albicans 12 Hình 3.2 Microsporum gypseum 15 Hình 3.3 Trichophyton rubrum 16 Hình 3.4 K t qu vòng kháng khu n gây b nh c a vi khu n th nghi m 26 Hình 3.5 K t qu vịng kháng khu n gây b nh c a vi n m n i sinh 28 Hình 3.6 K t qu kháng n m c a vi khu n 30 Hình 3.7 Cách b trí m u đ i kháng 31 Hình 3.8 Phân l p vi n m n i sinh PDA có b sung kháng sinh Chloramphenico41l 0,05% (A), phân l p vi khu n n i sinh TSA (B) vƠ đ a đ i ch ng (C) 43 Hình 3.9 C y ria vi khu n n i sinh NA (A), c y đ nh c a s i n m PDA (B).43 Hình 3.10 Hình nh nhu m Gram c a m t s ch ng vi khu n n i sinh 46 Hình 3.11 nh tính kh n ng kháng S.typhi c a m t s ch ng vi khu n n i sinh 48 Hình 3.12 nh tính kh n ng kháng Pseudomonas aeruginosa c a m t s ch ng vi n m n i sinh 51 Hình 3.13 nh tính kh n ng kháng n m c a ch ng vi khu n n i sinh 54 Hình 3.14 nh tính kh n ng kháng n m c a ch ng NR1 n i sinh 57 Hình 3.15 K t qu quan sát vi th c a ch ng vi n m NR1 60 SVTH: PH M TH NGUY T H NG i KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C B NG B ng 3.1 K t qu quan sát đ i th ch ng vi khu n n i sinh 40 B ng 3.2 K t qu quan sát đ i th n m n i sinh 41 B ng 3.3 K t qu quan sát vi th vi khu n n i sinh 44 B ng 3.4 K t qu kh n ng kháng vi khu n gây b nh c a vi khu n n i sinh t mu ng trâu 47 B ng 3.5 ng kính vịng kháng khu n c a ch ng vi khu n n i sinh t mu ng trâu Salmonella Typhi 48 B ng 3.6 K t qu kh n ng kháng vi khu n gây b nh c a vi n m n i sinh t mu ng trâu 50 B ng 3.7 ng kính vịng kháng khu n c a ch ng vi n m n i sinh t mu ng trâu Pseudomonas aeruginosa 51 B ng 3.8 K t qu đ nh tính kh n ng kháng vi n m gây b nh c a vi khu n n i sinh t mu ng trâu 52 B ng 3.9 ng kính vịng kháng n m gây b nh c a vi khu n n i sinh t mu ng trâu 54 B ng 3.10 K t qu đ nh tính kh n ng kháng vi n m gây b nh c a vi n m n i sinh t mu ng trâu 56 B ng 3.11 ng kính vịng kháng vi n m gây b nh c a vi n m n i sinh t mu ng trâu 58 B ng 3.12 K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng R5 59 B ng 3.13 K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng L10 59 SVTH: PH M TH NGUY T H NG ii KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C BI U Bi u đ 3.1 So sánh đ ng kính vịng kháng Salmonella Typhi c a ch ng vi khu n th nghi m 49 Bi u đ 3.2 So sánh đ ng kính vịng kháng Pseudomonas aeruginosa c a ch ng vi n m th nghi m 52 Bi u đ 3.3 So sánh đ ng kính vịng kháng Candida albicans c a ch ng vi khu n th nghi m 55 Bi u đ 3.4 So sánh đ ng kính vịng kháng Trichophyton rubrum c a ch ng vi khu n th nghi m 56 SVTH: PH M TH NGUY T H NG iii KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C CÁC T VI T T T ANOVA One-way analysis of variance C albicans Candida albicans Cs C ng s E.coli Escherichia coli M gypseum Microsporum gypseum NA Nutrient Agar P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PDA Potato Dextrose Agar S aureus Staphylococcus aureus S.typhi Salmonella typhi T mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes T rubrum Trichophyton rubrum TSA Trypticase Soy Agar SVTH: PH M TH NGUY T H NG iv KHÓA LU N T T NGHI P M CL C M CL C DANH M C HÌNH NH i DANH M C B NG .ii DANH M C BI U iii DANH M C CÁC T VI T T T iv M C L C v TV N PH N 1: T NG QUAN TÀI LI U VI SINH V T N I SINH VÀ CÂY MU NG TRÂU (Cassia alata L.) 1.1 S l c v vi sinh v t n i sinh 1.2 Tình hình nghiên c u th gi i 1.3 Tình hình nghiên c u n 1.4 S l c c v mu ng trâu (Cassia alata L.) T NG QUAN V VI KHU N GÂY B NH TRểN NG I 2.1 Staphylococcus aureus 2.2 Escherichia coli 2.3 Salmonella typhi 10 2.4 Pseudomonas aeruginosa 11 T NG QUAN V VI N M GÂY B NH TRểN NG I 12 3.1 Candida albicans 12 3.1.1 Phân lo i 12 3.1.2 c tính sinh lý c a Candida albicans 13 SVTH: PH M TH NGUY T H NG v KHÓA LU N T T NGHI P 3.1.3 M CL C B nh n m Candida gây 14 3.2 Dermatophytes 14 3.3 Microsporum gypseum 15 3.4 Trichophyton 16 PH N 2: V T LI U VẨ PH NG PHÁP NGHIểN C U 18 A I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U 19 1.1 V t li u 19 1.2 Thi t b , d ng c , môi tr ng 19 1.2.1.Thi t b 19 1.2.2 D ng c 19 1.2.3 Môi tr PH ng hóa ch t 20 NG PHÁP THệ NGHI M 20 2.1 B trí thí nghi m 20 2.2 Ph ng pháp 22 2.2.1 L y m u 22 2.2.2 X lý m u phân l p 22 2.2.3 Làm thu n 23 2.2.4 Xác đ nh kh n ng đ i kháng vi khu n, vi n m gây b nh c a vi sinh v t n i sinh 24 2.2.5 nh danh 31 2.2.6 Ph ng pháp th ng kê s li u 38 PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 39 K T QU PHÂN L P VI SINH V T N I SINH VÀ TH O LU N 40 SVTH: PH M TH NGUY T H NG vi KHÓA LU N T T NGHI P M CL C 3.1 Quan sát đ i th 40 3.1.1 Vi khu n n i sinh 40 3.1.2 Vi n m n i sinh 41 3.2 Quan sát vi th 44 3.3 K t qu th đ i kháng gi a vi sinh v t n i sinh vi khu n gây b nh 46 3.3.1 trâu K t qu th ho t tính kháng khu n c a vi khu n n i sinh t mu ng 46 3.3.2 K t qu th ho t tính kháng khu n c a vi n m n i sinh t mu ng trâu 49 3.4 K t qu th đ i kháng gi a vi sinh v t n i sinh vi n m gây b nh 52 3.4.1.K t qu th ho t tính kháng vi n m c a vi khu n n i sinh t mu ng trâu 52 3.4.2.K t qu th ho t tính kháng vi n m c a vi n m n i sinh t mu ng trâu 56 3.5 K t qu đ nh danh sinh hóa 58 3.5.1 Ch ng R5 58 3.5.2 Ch ng L10 59 3.6 K t qu đ nh danh s b ch ng vi n m NR1 60 3.7 Th o lu n 60 PH N 4: K T LU N VÀ KI N NGH 62 K T LU N VÀ KI N NGH 63 4.1 K t lu n 63 4.2 Ki n ngh 63 TÀI LI U THAM KH O 65 PH L C 70 SVTH: PH M TH NGUY T H NG vii TV N KHÓA LU N T T NGHI P TV N SVTH: PH M TH NGUY T H NG KHÓA LU N T T NGHI P TÀI LI U THAM KH O from industry”, In Microbial ecology of leaves Springer-Verlag, London, United Kingdom, pp 401ậ411 [19] Feltham R K A., Barrow G I (2004), ắCowan and Steel's manual for the identification of medical bacteriaẰ, Cambridge university press, pp.302 [20] Jalgaonwala R E cs (2010), ắEvaluation of Endophytes for their Antimicrobial activity from Indigenous Medicinal Plants belonging to North Maharashtra region IndiaẰ, International Journal on Pharmaceutical and Biomedical Research (IJPBR), Vol 1(5), 2010, 136-141 [21] Harari A., Kigel J and Okon Y (1988), ắInvolvement of IAA in the interaction between Azospirillum brasilense and Panicum miliaceum rootsẰ, Plant and Soil 110, pp.275ậ282 [22] Holt J G., Krieg N R., Sneath P H A., Staley J T and Williams S T (2000), Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, ninth Edition, Williams and Wilkins Baltimore, Maryland, 21202, USA, 605-649 [23] Kafur A., Khan A B (2011), ắIsolation of endophytic actinomycetes from Catharanthe soseus (L.) G Don leaves and their antimicrobial activityẰ, Iranian journal of Biotechenology.vol 9, No 4, pp.302-305 [24] Khan R (2007), Isolation, Identification and Cultivation of Endophytic Fungi from Medicinal Plants for the Production and Characterization of Bioactive fugal Metabolites, Department of Microbiology, University of Karachi, Pakistan [25] Maheshwari D K (2010), ắPlant growth and health promoting baceriaẰ, Heidelberg: Springer, 16, pp 445 [26] MacFaddin J F (2000), Biochemical test for identification of medical bacteria, Lippincott Williams and Wilkins, pp.150-376 SVTH: PH M TH NGUY T H NG 67 KHÓA LU N T T NGHI P TÀI LI U THAM KH O [27] Molina de Diego A (2011), ắClinical, diagnostic and therapeutic aspects of dermatophytosisẰ, Enferm Infecc Microbiol Clin, 29(3), pp 33-39 [28] Orole O O., Adejumo T O (2009), ắActivity of fungal endophytes against four maize wilt pathogensẰ, African Journal of Microbiology Research, 12(3), pp 969973 [29] Pati U S Kurade N P (2009), ắAntibacterial screening methods for evaluation of natural products, Regional stationẰ, Indian Veterinary Research Institude, Palampur [30] Pavithra N., Sathish L., Ananda K (2012), ắAntimicrobial and Enzyme Activity of Endophytic Fungi Isolated from Tulsi”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Sciences (JPBMS), Vol 16, Issue 16, pp.1-6 [31] Rosenblueth M and Martínez-Romero E (2006), ắBacterial endophytes and their interactions with hostsẰ, Am Phytopathol Soc 19, 827-837 [32] Roy S., Banerjee D (2010), ắResearch article isolation of antimicrobial combound by endophytic bacteria from Vinca roseaẰ, International Journal of Current Research Vol 5,pp.047-051 [33] Ryan R P., Germaine K., Franks A., Ryan D J., Dowling D N (2007), Bacterial endophytes: recent developments andapplications, FEMS Microbiol, Lett, 278, 1ậ9 [34] Strobel G A., Daisy B (2003), Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products, Microbiology and Molecular Biology Reviews, p.491ậ 502 [35] Xu H., Griffith M., Patten C L and Glick B R (1998), ắIsolation and characterization of an antifreeze protein with ice nucleation activity from the plant growth promoting rhizobacterium 0T2T Pseudomonas putida 0T2T GR12-2Ằ, Can J Microbiol 0T4T , 44, 0T4T 64ậ73 SVTH: PH M TH NGUY T H NG 68 KHÓA LU N T T NGHI P TÀI LI U THAM KH O [36] Zinniel D K., Lambrecht P., Harris N B., Feng Z., Kuezmarski D., Highley P., Ishimaru C., Arunakumari A., Barletta G R and Vidaver A K 2002, ắ Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plantsẰ, Appl Environ, Microbiol, 59, 2198-2208  Tài li u internet [37] [38]. [39] [40]. [41] [42] Tr n Nam, ắCơy mu ng trâu ch a b nh da làm thu c nhu n trƠngẰ, 2012 [43] [44] [45] SVTH: PH M TH NGUY T H NG 69 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C PH L C PH L C Môi Tr ng  Môi tr ng SDA (Sabourard Dextrose Agar) b sung Cloramphenicol Peptone Dextrose Cloramphenicol Agar N cc t  Môi tr ng NA (Nutrient agar) 10g 20g 0,05g 20g 1000 mL Cao th t Peptone NaCl Agar N cc t  Môi tr ng TSA (Trypticase Soy Agar) 5g 10g 5g 15g 1000 mL Trypticase pepton Thytone pepton NaCl Agar N cc t pH = 7,3  Môi tr ng PDA 15 g 5g 5g 18g 1000 mL Khoai tây Glucose Agar N cc t pH= 6.5  N 200 g 20 g 20 g 1000 mL c mu i 0,85% NaCl N cc t  Môi tr ng NB SVTH: PH M TH NGUY T H NG 8,5 g 1000 mL 70 KHÓA LU N T T NGHI P Nutrient broth N cc t  Môi tr ng MHA Mueller Hinton Broth Agar N cc t PH L C 13 g 1000 mL 21,5 g 20 g 1000 ml Hóa ch t ậ Thu c nhu m  Crystal violet: a) Crystal violet C n 96o b) Phenol N cc t 0,4 g 10 mL 1g 100 mL L u ý: tr n hai dung d ch a b l i v i nhau, khu y cho hòa tan đ u r i đem l c B o qu n chai màu tránh ánh sáng  Lugol KI 2g Iod tinh th 1g N cc t 300 mL L u Ủ: hòa tan 2g KI vƠo mL n c c t, sau đ́ thêm 1g Iod Ch cho Iod tan h t m i them n c v a đ 300 mL  Safranin O Safranin O (dung d ch 2% c n 96o) N cc t L u Ủ: B o qu n chai màu SVTH: PH M TH NGUY T H NG 25 mL 75 mL 71 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C PH L C K t qu đ nh danh 2.1 2.2 nh danh Bacillus sp theo khóa phân lo i Cowan and Steel Hình nh đ nh danh ch ng R5 SVTH: PH M TH NGUY T H NG 72 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Th nghi m catalase + (A), oxidase + (B) Các th nghi m lên men đ Th nghi m di đ ng SVTH: PH M TH NGUY T H NG ng Th nghi m nitrate 73 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Th nghi m citrate Th nghi m VP Th nghi m kh n ng ch u mu i Th nghi m phân gi i tinh b t 2.3 Hình nh đ nh danh ch ng L10 Th nghi m catalase + (A), oxidase + (B) SVTH: PH M TH NGUY T H NG 74 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Các th nghi m lên men đ Th nghi m di đ ng Th nghi m citrate Th nghi m VP SVTH: PH M TH NGUY T H NG ng Th nghi m nitrate Th nghi m phân gi i tinh b t Th nghi m phân gi i casein (+) 75 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C PH L C K t qu x lý th ng kê K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t v kh n ng kháng khu n c a ch ng vi khu n n i sinh cơy mu ng trâu b ng ph n m m STATGRAPHICS Plus 3.0 Excel 2010 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Row 38 12,66667 0,333333 Row 36 Row 3 43 14,33333 0,333333 12 ANOVA Source of Variation SS df MS Between Groups 8,666667 4,333333 Within Groups 3,333333 0,555556 SVTH: PH M TH NGUY T H NG F P-value F crit 7,8 0,021433 5,143253 76 KHÓA LU N T T NGHI P Total PH L C 12 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t v kh n ng kháng khu n c a ch ng vi n m n i sinh cơy mu ng trâu b ng ph n m m STATGRAPHICS Plus 3.0 Excel 2010 Anova: Single Factor SUMMARY Groups NR1 NR7 NT8 ANOVA Source of Variation Count Sum Average Variance 81 27 81.5 27.16667 0.083333 111.5 37.16667 1.083333 SS df MS F Between Groups Within Groups 203.3889 4.333333 101.6944 140.8077 0.722222 Total 207.7222 SVTH: PH M TH NGUY T H NG P-value F crit 9.08E06 5.143253 77 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t v kh n ng kháng vi n m T.rubrum c a ch ng vi khu n n i sinh cơy mu ng trâu b ng ph n m m STATGRAPHICS Plus 3.0 Excel 2010 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Column 88 29,33333 0,333333 Column 92 30,66667 4,333333 Column 3 112 37,33333 4,333333 Column 72 24 SVTH: PH M TH NGUY T H NG 78 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C ANOVA Source of Variation SS Between Groups MS F P-value F crit 36,08889 5,36E-05 4,066181 270,6667 90,22222 20 2,5 290,6667 11 Within Groups Total df K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t v kh n ng kháng vi n m C.albicans c a ch ng vi khu n n i sinh mu ng trâu b ng ph n m m STATGRAPHICS Plus 3.0 Excel 2010 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum SVTH: PH M TH NGUY T H NG Average Variance 79 KHÓA LU N T T NGHI P Column Column Column Column PH L C 3 3 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 286.9167 88 Total 374.9167 99 33 110 36.66667 22.33333 125 41.66667 0.333333 85 28.33333 12.33333 SS df MS F 95.63889 8.694444 11 P-value F crit 0.00673 4.066181 11 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t v kh n ng kháng vi n m Trichophyton rubrum c a ch ng vi n m n i sinh cơy mu ng trâu b ng ph n m m STATGRAPHICS Plus 3.0 Excel 2010 SUMMARY Groups Row Count Sum SVTH: PH M TH NGUY T H NG 173 Average 57.6666 Variance 14.8233 80 KHÓA LU N T T NGHI P ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups SS 2882.04 37.8133 Total 2919.85 PH L C df MS 2882.04 9.45333 F 304.870 P-value 6.32E-05 F crit 7.70864 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t v kh n ng kháng vi n m Microsporum gypseumc a ch ng NR1 n i sinh mu ng trâu b ng ph n m m STATGRAPHICS Plus 3.0 Excel 2010 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row ANOVA Source of Variation Count Sum Average Variance 209.2 69.73333 5.293333 0 SS df MS Between Groups Within Groups 7294.107 10.58667 7294.107 2.646667 Total 7304.693 SVTH: PH M TH NGUY T H NG F 2755.96 P-value F crit 7.88E07 7.708647 81