0176 nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các dẫn chất 3 phenyl 2h 13 benzoxazine 24(3h) dion

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ HUỲNH GIA BẢO NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA CÁC DẪN CHẤT 3-phenyl-3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC ThS.VÕ THỊ MỸ HƢƠNG Cần Thơ-Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Con cảm ơn cha mẹ sinh ra, nuôi nấng, dạy dỗ để có ngày hơm Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến cô ThS.Võ Thị Mỹ Hƣơng với tri thức tâm huyết tận tình hƣớng dẫn, dìu dắt giúp đỡ em suốt thời gian thực luận văn Cô động viên, quan tâm chia sẻ nhiều kinh nghiệm tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn cách tốt Em xin cảm ơn cô Ts.Phạm Thị Tố Liên – Trƣởng mơn Hóa Dƣợc, Khoa Dƣợc, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ giành nhiều công sức dạy dỗ, giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cám ơn thầy Ds.Huỳnh Trƣờng Hiệp, Cô ThS.Lê Thị Cẩm Tú chị ThS.Trần Lê Uyên, anh Ds.Phạm Duy Toàn giúp đỡ, bảo truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm Em xin gửi lời cám ơn đến chị Bùi Thị Ngọc Hân, anh Lê Việt Hùng tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn Em xin cám ơn liên môn Dƣợc Liệu – Thực Vật Dƣợc – Dƣợc Cổ Truyền, liên mơn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm – Độc Chất tạo điều kiện giúp đỡ trang thiết bị, máy móc q trình thực luận văn Em xin chân thành biết ơn tất thầy cô Khoa Dƣợc – trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ hết lòng dạy dỗ, truyền đạt cho em nhiều kiến thức kỹ suốt năm qua Và cuối cùng, xin cám ơn bạn Võ Thị Thanh Trúc – RHMK36, bạn Nguyễn Trần Anh Thƣ – DBK37 bạn Dƣợc K36, đặc biệt bạn làm đề tài Dƣợc Liệu, Kiểm Nghiệm Công Nghiệp Dƣợc, giúp đỡ suốt thời gian qua LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng Các số liệu kết nghiên cứu khoa học luận văn hoàn toàn trung thực chƣa đƣợc công bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày 15 tháng năm 2015 Huỳnh Gia Bảo i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ v ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BENZOXAZIN 1.2 ACID 5-CLOROSALICYLIC 13 1.3 ANILIN VÀ DẪN CHẤT (2-CLOROANILIN, 3-CLOROANILIN, 4-CLOROANILIN) 15 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 16 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 27 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM 38 Chƣơng BÀN LUẬN 40 4.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 40 4.2 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT .43 4.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 44 4.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN 48 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 13 C-NMR H-NMR Ý nghĩa Chữ nguyên 13 C-Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ carbon H-Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ proton AcOH glc CH3COOH glacial Acid acetic băng Ar Aren Nhân thơm CFU Colony forming unit Đơn vị khuẩn lạc CTPT Công thức phân tử DMF Dimethylformamid Dung môi hữu DMSO Dimethylsulfoxid Dung môi hữu ESI Electronspray ionization Phƣơng pháp ion hóa cách phun sƣơng electron khối phổ EtOH C2H5OH Ethanol HIV Human immunnodificiency virus Virus gây suy giảm hệ miễn dịch ngƣời High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao IR Infrared Hồng ngoại MHA Mueller – Hinton Agar Môi trƣờng thử kháng sinh HPLC vi sinh vật MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật kháng sinh MRSA Methicillin resistant Chủng Staphylococcus Staphylococcus aureus aureus kháng Methicillin MS Mass spectrometry Khối phổ MSSA Methicillin sensitive Chủng Staphylococcus Staphylococcus aureus aureus nhạy Methicillin iii Chữ viết tắt NB Ý nghĩa Chữ nguyên Nutrient Broth Mơi trƣờng hoạt hóa vi khuẩn PTL Phân tử lƣợng TSA Trypticase soy agar Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Ultra violet λmax Bƣớc sóng hấp thu cực đại ν Dao động hóa trị δ Độ dịch chuyển hóa học 2a 5-clorosalicylanilid 3a 6-cloro-3-phenyl3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion 2b 2-cloro-5-clorosalicylanilid 3b 3-(2-clorophenyl)-6-cloro -3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion 2c 3-cloro-5-clorosalicylanilid 3c 3-(3-clorophenyl)-6-cloro -3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion 2d 4-cloro-5-clorosalicylanilid 3d 3-(4-clorophenyl)-6-cloro3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion Tử ngoại iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý acid 5-clorosalicylic 14 Bảng 1.2 Công thức anilin dẫn chất anilin 15 Bảng 1.3 Tính chất vật lý anilin dẫn chất 15 Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trình nghiên cứu .16 Bảng 2.2 Đỉnh hấp thu IR đặc trƣng số nhóm chức 21 Bảng 2.3 Tín hiệu cộng hƣởng nhóm chức .22 Bảng 3.1 Tính chất dẫn chất 5-clorosalicylanilid hiệu suất phản ứng 28 Bảng 3.2 Nhiệt độ nóng chảy dẫn chất 5-clorosalicylanilid .28 Bảng 3.3 Kết sắc ký lớp mỏng dẫn chất 5-clorosalicylanilid 29 Bảng 3.4 Tính chất dẫn chất 1,3-benzoxazin hiệu suất phản ứng 34 Bảng 3.5 Nhiệt độ nóng chảy dẫn chất 1,3-benzoxazin .34 Bảng 3.6 Kết sắc ký lớp mỏng dẫn chất 5-clorosalicylanilid 35 Bảng 3.7 Kết định tính khả kháng khuẩn, kháng nấm .39 Bảng 3.8 Giá trị MIC (µg/ml) sản phẩm có hoạt tính .39 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 2.1 Cách chấm sắc ký 19 Hình 2.2 Đĩa thạch định tính khả kháng khuẩn, kháng nấm 24 Hình 2.3 Đĩa thạch xác định MIC 25 Hình 3.1 Quy trình tổng hợp dẫn chất 5-clorosalicylanilid 27 Hình 3.2 Quy trình tổng hợp dẫn chất 1,3-benzoxazin 33 Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp 1,3-benzoxazin 17 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ penicillin đời nay, hàng trăm loại kháng sinh thuốc tƣơng tự đƣợc phát minh đƣa vào sử dụng Sự đời kháng sinh đánh dấu kỷ nguyên phát triển y học điều trị bệnh nhiễm khuẩn Đặc biệt, bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hố, đƣờng hơ hấp, bệnh lây truyền qua đƣờng tình dục nhiễm khuẩn bệnh viện, nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc tỉ lệ tử vong cao nƣớc phát triển Việc kiểm soát loại bệnh chịu tác động bất lợi phát triển lan truyền tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Hiện nay, xuất vi khuẩn siêu kháng thuốc kinh hoàng giới chức y tế Các kháng sinh hệ đắt tiền, chí số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” dần hiệu lực Bằng chứng lây lan chủng vi khuẩn kháng carbapenem số quốc gia Châu Âu Châu Á [9],[20][50] Có thể nói rằng, vi khuẩn phơi nhiễm nhiều với kháng sinh “sức ép thuốc” lớn, chủng kháng thuốc có nhiều hội để phát triển lây lan Kháng kháng sinh xuất sớm, gần nhƣ song hành với xuất kháng sinh, nên số lƣợng kháng sinh nhiều nhƣng chƣa đáp ứng nhu cầu điều trị Việc sử dụng kháng sinh bất hợp lý bác sĩ lâm sàng làm cho việc kháng thuốc ngày trầm trọng Chính lý đó, bên cạnh việc sử dụng kháng sinh cách hợp lý, an toàn hiệu cơng tác nghiên cứu phát triển tìm loại kháng sinh nhu cầu cần thiết để đáp ứng nhu cầu điều trị Các nhà khoa học nghiên cứu hàng loạt hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, số 1,3-benzoxazin Đây nhóm hợp chất có nhiều ứng dụng rộng rãi ngành Dƣợc nhƣ: trị bệnh an thần, tim mạch, thần kinh, kháng virus…[26], [29], [37], [40], [43], [46] Nhóm cịn có tác dụng tốt chủng vi khuẩn phổ biến: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium kanasii, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida ablicans…[13], [22], [38], [43], [42], [48], [49] Hàng loạt nghiên cứu chứng minh hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm dẫn chất 1,3-benzoxazin [12],[13] Từ kết này, nhóm nghiên cứu tiếp tục nghiên cứu phát triển dẫn chất 1,3-benzoxazin, hy vọng tìm chất có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mạnh để phục cho công tác chữa bệnh nâng cao sức khoẻ Với lý đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn thực đề tài “Nghiên cứu tổng hợp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm dẫn chất 3-phenyl-3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion” Đề tài đƣợc thực với mục tiêu sau:  Tổng hợp dẫn chất 1,3-benzoxazin từ acid 5-clorosalicylic anilin, dẫn chất anilin  Tinh chế, xác định độ tinh khiết, xác định cấu trúc hố học thơng số lý hóa đặc trƣng sản phẩm thu đƣợc  Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm hợp chất tổng hợp nhằm chọn chất có tác dụng kháng nấm kháng khuẩn tốt 42 Cơ chế phản ứng OH Cl HCl C O OH O H N Cl pyridin C OC2H5 NCO Cl Cl Cl O O O C2H5OH N HCl Cl O Cl Các yếu tố ảnh hƣởng Dung mơi: pyridin dung mơi đƣợc nhóm nghiên cứu lựa chọn sử dụng có khả hòa tan tốt nguyên liệu 5-clorosalicylanilid trơ với tác nhân tham gia phản ứng nên phản ứng xảy dễ dàng Nhiệt độ: nhiệt độ 80 - 90 oC phản ứng xảy dễ dàng hiệu suất cao nhƣng gần nhiệt độ bay pyridin nên phản ứng phải đun hồi lƣu suốt trình thực Tác nhân phản ứng: ethylcloroformat tác nhân đóng vịng cung cấp nhóm C=O Lƣợng ethylcloroformat cho vào nên gấp - lần số mol tác nhân tham gia phản ứng để đạt hiệu suất cao ethylcloroformat dễ bay phản ứng phải đun hồi lƣu suốt thời gian thực Tất dụng cụ sử dụng phải đƣợc sấy khơ dung mơi pyridin phải đƣợc làm khan hồn tồn ethylcloroformat dễ bị phân thủy nƣớc Các lƣu ý tiến hành phản ứng Khi thêm ethylcloroformat vào hỗn hợp phản ứng tỏa nhiệt mãnh liệt nên cần làm lạnh hỗn hợp Pyridin ethylcloroformat chất độc dễ gây kích ứng da nên cần tiến hành tủ hốt Các dẫn chất 5-clorosalicylanilid cần đƣợc hịa tan hồn tồn để phản ứng xảy dễ dàng 43 Các dẫn chất 1,3-benzoxazin bền môi trƣờng kiềm nên sử dụng lƣợng dung dịch NaOH vừa đủ Nhận xét Phản ứng xảy dễ dàng, hiệu suất cao 50 – 60%, cần đảm bảo đủ thời gian tổng hợp cho phản ứng xảy hoàn toàn, thuận lợi cho việc tinh chế sản phẩm Kết thu đƣợc sản phẩm dẫn chất 3-phenyl-2H-1,3-benzoxazin2,4(3H)-dion  6-cloro-3-phenyl- 2H-1,3-benzoxazin-2,4-dion  3-(2-clorophenyl)-6-cloro-2H-1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dion  3-(3-clorophenyl)-6-cloro-2H-1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dion  3-(4-clorophenyl)-6-cloro-2H-1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dion 4.2 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT Sản phẩm đƣợc kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng hệ dung môi có độ phân cực khác Sắc ký đồ thu đƣợc hệ dung môi sản phẩm vết trịn, gọn khơng kéo Điều sơ giúp ta đánh giá sản phẩm tinh khiết Các sản phẩm sau đạt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng, đƣợc tiếp tục xác định độ tinh khiết phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm lần đo chênh lệch không 0,5 oC, sản phẩm tinh khiết Sản phẩm đƣợc tiếp tục đƣợc khảo sát phổ UV, IR, MS, NMR Mẫu phải thật tinh khiết, độ tinh khiết >95%, tinh khiết việc xác định cấu trúc xác Phổ 1H-NMR 13 C-NMR có mũi cộng hƣởng phù hợp với cấu trúc sản phẩm khơng xuất mũi cộng hƣởng lạ, kết luận sản phẩm tinh khiết 44 4.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 4.3.1 Cấu trúc dẫn chất 5-clorosalicylanilid 4.3.1.1 Phổ tử ngoại Phổ đồ sản phẩm cho cực đại hấp thu đặc trƣng với λmax bƣớc sóng khác với nguyên liệu acid 5-clorosalicylic có λmax 310,5 nm Điều chứng tỏ phản ứng xảy tạo thành chất 4.3.1.2 Phổ hồng ngoại Trong phổ hồng ngoại dẫn chất 5-clorosalicylanilid (2a – 2d) xuất băng sóng đặc trƣng cho nhóm liên kết phân tử nhƣ nhóm OH phenol vùng 3300 – 3600 cm-1, nhóm NH amid vùng 3200 – 3450 cm-1 Băng sóng vùng 1650 – 1750 cm-1 đặc trƣng dao động hóa trị liên kết C=O amid Các băng sóng vùng 1400 – 1600 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị C=C nhân thơm Trên phổ đồ cho thấy băng sóng vùng 500 – 700 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị liên kết C-Cl Tuy nhiên, tín hiệu nhóm NH amid yếu nên không xuất sản phẩm 2b 4.3.1.3 Phổ NMR Phổ 1H-NMR phổ 1Hex- NMR Trong phổ 1H-NMR dẫn chất 5-clorosalicylanilid (2a – 2d) có tín hiệu proton phân tử xuất vùng rõ rệt: proton nhân thơm có độ dịch chuyển hóa học nằm vùng – ppm Nguyên tử hydro nhóm OH phenol cho tín hiệu nằm vùng trƣờng thấp khoảng 10 – 11 ppm Trong đó, proton nhóm NH amid cho tín hiệu yếu vùng từ trƣờng thấp khoảng 11,5 – 12,5 ppm Ở sản phẩm 2d tín hiệu q yếu khơng ghi nhận đƣợc Các giá trị tích phân phổ đồ cho thấy số proton với số hydro công thức dự kiến Trên phổ đồ không xuất mũi cộng hƣởng lạ kết luận sản phẩm tinh khiết 45 Phổ 13C-NMR Trên phổ 13C-NMR dẫn chất 5-clorosalicylanilid có tín hiệu nguyên tử carbon nhóm liên kết, có phân vùng rõ rệt: tín hiệu cộng hƣởng carbon nhóm C=O amid nằm vùng 162 – 165 ppm Nguyên tử carbon C2 liên kết với nhóm OH nên chuyển dịch vùng trƣờng thấp 155 – 157 ppm Các mũi cộng hƣởng lại nằm vùng dịch chuyển carbon nhân thơm phù hợp với độ dịch chuyển lý thuyết tính tốn Các carbon bậc cho tín hiệu cộng hƣởng yếu số lần quét không đủ nên carbon bậc bị trùng với đƣờng Do đó, phổ đồ sản phẩm 2c thiếu carbon bậc Phổ 13C-NMR-DEPT Trên phổ DEPT 90 sản phẩm cho số tín hiệu (=CH-) phù hợp với số carbon (=CH-) công thức dự kiến Sản phẩm 2a 2d có cặp carbon tƣơng đƣơng từ, độ dịch chuyển hóa học nên số mũi cộng hƣởng xuất đỉnh công thức dự kiến Phổ DEPT 135, ngồi mũi phổ DEPT 90, khơng xuất thêm mũi cộng hƣởng âm mũi cộng hƣởng dƣơng trùng khớp vị trí mũi cộng hƣởng phổ DEPT 90 Kết hợp phổ DEPT phổ 13C-NMR cho thấy phản ứng ghép xảy nhƣ dự đốn, phổ đồ cho tín hiệu vùng trƣờng thấp >C=O amid, mũi lại nằm vùng dịch chuyển carbon nhân thơm 4.3.1.4 Khối phổ Phổ MS sản phẩm cho thấy khối lƣợng phân tử đo đƣợc phù hợp với công thức dự kiến Tuy nhiên, đỉnh phổ đồ cịn xuất đỉnh có cƣờng độ thấp m/z lớn đỉnh Nguyên nhân tự nhiên cloro tồn dƣới đồng vị 35 Cl 37 Cl với tỷ lệ 3:1 theo số lƣợng, nguyên tử lƣợng trung bình 35,5 Đỉnh cao chứa 35Cl đỉnh thấp sản phẩm chứa 37Cl 46 Qua đối chiếu phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR MS kết luận sản phẩm thu đƣợc có cấu trúc giống nhƣ dự kiến, dẫn chất 5-clorosalicylanilid 4.3.2 Cấu trúc dẫn chất 1,3-benzoxain 4.3.2.1 Phổ tử ngoại Cực đại hấp thu sản phẩm khác với cực đại nguyên liệu nằm vùng tử ngoại tất chất không mang màu 4.3.2.2 Phổ hồng ngoại Trên phổ IR không thấy xuất dải hấp thụ đặc trƣng cho dao động hóa trị liên kết OH vùng 3300 – 3600 cm-1 liên kết NH vùng 3200 – 3450 cm-1 Thay vào xuất vân vùng 1650 – 1750 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị liên kết C=O amid C=O lacton Đỉnh hấp thụ đặc trƣng nhóm C=O lacton bị chồng lẫn với băng hấp thụ nhóm C=O amid Các vân phổ vùng 1400 – 1600 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị C=C nhân thơm vùng 500 – 700 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị C-Cl Các thay đổi dải hấp thụ vùng 3300 – 3600 cm-1 3200 – 3450 cm-1 chứng tỏ nhóm OH phenol NH amid tham gia phản ứng Sự tăng cƣờng độ vùng vân phổ 1650 – 1750 cm-1 nhóm C=O cho thấy phản ứng xảy theo dự kiến 4.3.2.3 Phổ NMR Phổ 1H-NMR 1Hex-NMR Trên phổ 1H-NMR sản phẩm (3a – 3d) tất tín hiệu proton nằm khoảng – ppm tƣơng ứng với proton nhân thơm Tại vùng từ trƣờng thấp khoảng 11 – 13 ppm, khơng cịn mũi cộng hƣởng đặc trƣng nhóm NH amid nhóm OH phenol Điều chứng tỏ nhóm OH NH tham gia đóng vịng Các giá trị tích phân phổ đồ cho thấy số proton với số hydro có công thức dự kiến Trên phổ đồ không thấy xuất mũi cộng hƣởng lạ kết luận sản phẩm tinh khiết 47 Phổ 13C-NMR Phổ 13C-NMR cho tín hiệu carbon phân tử với cấu tạo chất nhƣ dự kiến Nguyên tử carbon nhóm C=O amid C=O lacton cho tín hiệu nằm vùng trƣờng thấp khoảng 145 – 160 ppm Mũi cộng hƣởng nguyên tử carbon C9 liên kết trực tiếp với nguyên tử oxy nên dịch chuyển vùng trƣờng thấp khoảng 150 – 152 ppm (downfield) Các mũi cộng hƣởng lại nằm vùng dịch chuyển carbon nhân thơm phù hợp với độ dịch chuyển hóa học lý thuyết Phổ đồ sản phẩn 3a 3d cho số tín hiệu đơn vị so với số carbon công thức dự kiến công thức phân tử có cặp carbon tƣơng đƣờng từ nên có độ dịch chuyển hóa học Trên phổ 13 C-NMR 3c thiếu carbon bậc Nguyên nhân carbon bậc cho tín hiệu cộng hƣởng yếu số lần quét nên tín hiệu carbon bậc bị trùng với đƣờng Phổ 13C-NMR-DEPT Phổ DEPT 90 sản phẩm cho số mũi tín hiệu (=CH-) phù hợp với cơng thức dự kiến Sản phẩm 3a 3d có cặp carbon tƣơng đƣơng từ, độ dịch chuyển hóa học nên số mũi cộng hƣởng xuất đỉnh công thức dự kiến Trên phổ DEPT 135 sản phẩm không xuất mũi cộng hƣởng âm mũi cộng hƣởng dƣơng trùng với vị trí mũi cộng hƣởng phổ DEPT 90 Kết hợp phổ DEPT phổ 13C-NMR cho thấy phản ứng đóng vịng xảy nhƣ dự đốn, cơng thức tăng thêm carbon bậc vùng từ trƣờng thấp khoảng 146 – 147 ppm, tín hiệu carbon nhóm C=O 4.3.2.4 Khối phổ Trên phổ đồ sản phẩm cho thấy, đỉnh [M+Na]+ cho khối lƣợng phân tử phù hợp với công thức dự kiến Tuy nhiên, đỉnh phổ đồ cịn xuất đỉnh có cƣờng độ thấp m/z lớn đỉnh Nguyên nhân phân tử sản phẩm có 48 chứa nguyên tố cloro, tự nhiên cloro có đồng vị 35Cl 37Cl với tỷ lệ 3:1 số lƣợng Do đó, ngồi đỉnh sản phẩm chứa 35Cl cịn có đỉnh thấp chứa 37Cl Kết kiểm nghiệm cho thấy, sản phẩm thu đƣợc có cấu trúc phù hợp với công thức dự kiến hoàn toàn tinh khiết 4.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN Kết khảo sát hoạt tính sinh học sản phẩm tổng hợp cho thấy chất khảo sát có chất có hoạt tính kháng vi sinh vật Các chất hoạt tính dịng vi khuẩn gram (-) nhƣng cho kết khả quan dòng vi khuẩn gram (+) Sản phẩm 3b, 3c, 3d có khả kháng mạnh dòng: Streptococcus faecalis, MSSA, MRSA Trong đó, MIC 3b chủng 32 (µg/ml) (µg/ml) MIC 3d MSSA MRSA Đặc biệt, 3c thể hiện khả kháng khuẩn mạnh với MIC = (µg/ml) MSSA MRSA So sánh gía trị MIC 3c với MIC Levofloxacin (MIC  (µg/ml)) Ampicillin (MIC  (µg/ml)) cho thấy dẫn chất 3c chất có tiềm cần đƣợc nghiên cứu đầy đủ tác dụng kháng vi sinh vật, dƣợc lực, độc tính… dùng làm “lead compound” nghiên cứu tổng hợp phát triển thành thuốc điều trị bệnh nhiễm khuẩn Từ đó, đánh giá sơ mối liên hệ hoạt tính cấu trúc dẫn chất 3H-1,3-benzoxazin-2,4-dion Khi thay đổi vị trí ngun tử cloro nhóm phenyl dẫn chất có hoạt tính sinh học khác Nếu nguyên tử cloro vị trí ortho, sản phẩm (3b) có khả kháng đƣợc nhiều loại vi khuẩn nhƣng MIC cao vị trí khác Tƣơng tự, nguyên tử cloro vị trí meta, sản phẩm (3c) có khả kháng MSSA MRSA mạnh MIC = (µg ml) nhƣng lại khơng thể hoạt tính chủng Streptococcus faecalis Trong đó, diện nguyên tử cloro vị trí para (3d) làm mở rộng phổ kháng khuẩn cƣờng độ kháng khuẩn, MIC = (µg/ml) Streptococcus faecalis MIC = (µg/ml) cho MSSA MRSA 49 KẾT LUẬN Trong thời gian thực luận văn, nhóm nghiên cứu tổng hợp thành cơng dẫn chất 1,3-benzoxazin-2,4(3H)-dion từ chất đầu acid 5-clorosalicylic Các dẫn chất đƣợc đo nhiệt độ nóng chảy xác định cấu trúc thơng qua phân tích phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR DEPT-NMR) với thông số nhƣ sau: (3a): 6-cloro-3-phenyl-3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion CTPT: C14H8O3NCl PTL: 273,01 tonc: 281,2 oC (3b): 3-(2-clorophenyl)-6-cloro-3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion CTPT: C14H7O3NCl2 PTL: 306,98 tonc: 172,6 oC (3c): 3-(3-clorophenyl)-6-cloro-3H-benzo[e][1,3]oxazin-2,4-dion CTPT: C14H7O3NCl2 PTL: 306,98 tonc: 245,9 oC (3d): 3-(4-clorophenyl)-6-cloro-3H-benzoxazin[e][1,3]-2,4-dion CTPT: C14H7O3NCl2 PTL: 306,98 tonc: 220,6 oC Đánh giá khả kháng khuẩn, kháng nấm chất tổng hợp đƣợc thu đƣợc kết nhƣ sau: - Cả chất hoạt tính kháng khuẩn dịng vi khuẩn kiểm định: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa - Có chất có khả kháng Staphyloccocus aureus, Meticillin Resistant Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis 3b, 3c, 3d Đặc biệt, 3c 3d có khả kháng MRSA MSSA với MIC thấp  (µg/ml) - Kết kháng nấm chƣa ổn định 50 KIẾN NGHỊ  Tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng nấm  Thử khả kháng khuẩn in vivo thử nghiệm độc tính cấp viễn trƣờng diễn cho sản phẩm có kết kháng khuẩn tốt  Khảo sát khả ứng dụng lâm sàng chất sàng lọc đƣợc  Tiếp tục tiến hành tổng hợp khảo sát với nhóm halogen khác, nhằm có đánh giá sâu rộng ảnh hƣởng cấu trúc tới hoạt tính dẫn chất benzoxazin để có định hƣớng cho việc xây dựng cấu trúc chất tổng hợp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Bộ Y Tế Vụ Khoa Học Và Đào Tạo (2006), Hoá Hữu Cơ Hợp Chất Hữu Cơ Đơn Chức Và Đa Chức, NXB Y Học [2] Phan Đình Châu (2008), Các trình tổng hợp hoá hữu cơ, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [3] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục Hà Nội, Hà Nội [4] Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2005), “Xây dựng mơ hình đánh giá chất có tiềm kháng khuẩn”, Tạp chí Y học, 6(1), tr 309-313 [5] Võ Thị Bạch Huệ, Vĩnh Định (2008), Hố phân tích, tập II, NXB Y học, tr 58-106, 177-205, 250 [6] Cao Hoàng Hiếu (2012), Tổng hợp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm dẫn chất 1,3-benzoxazin, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ [7] Nguyễn Viết Kình (2005), Các phương pháp sắc ký ứng dụng nghiên cứu hố thực vật, Bộ mơn Dƣợc liệu, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, tr.30 [8] Trƣơng Thế Kỷ (2004), Hoá hữu cơ, NXB Y học, Hà Nội [9] Nguyễn Viết Kình (2010), “Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam”, GARP- Việt Nam, CDDEP [10] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ MS sử dụng phân tích hữu cơ, NXB Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [11] Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng phân tích hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh [12] Trƣơng Phƣơng, Trƣơng Thuý Quỳnh, Lê Thị Thanh Thảo (2008), “Tổng hợp hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn số dẫn chất benzoxazin từ anilin thế”, Tạp chí Dược học, 386, tr 14-19 [13] Trƣơng Phƣơng, Nguyễn Bảo Trân, Lê Thị Thanh Thảo (2006), “Tổng hợp thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm số dẫn chất 1,3- benzoxazin-2,4dion”, Tạp chí Dược học, 357, tr 14 [14] Pilipenko, A.T., Pochinoc, V.Ia, Xereda, I.P., Sepchenko (2002), Sổ tay hóa học sơ cấp, NXB Giáo dục, Hà Nội [15] Đỗ Đình Rãng, Đặng Bình Bạch, Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Mạnh Hà, Nguyễn Thị Thanh Phong (2012), Hóa học hữu 3, NXB Giáo dục, tr 1- 28 [16] Lê Ngọc Thạch (1999), Sổ tay dung môi, NXB Giáo dục, Hà Nội [17] Nguyễn Minh Thảo (2004), Hoá Họ Các Hợp Chất Dị Vòng, NXB Giáo dục [18] Đỗ Châu Minh Thọ, Nguyễn Thị Ngọc Vân, Vĩnh Định (2014), Giáo trình Hố Phân Tích Phân Tích Dụng Cụ, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ, tr 127144 [19] Phạm Duy Toàn, Võ Thị Mỹ Hƣơng (2014), “Tổng hợp thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn số dẫn chất 2-iodophenylimino-5-aryliden-4thiazolidion”, Tập san Nghiên cứu khoa học, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ [20] Phạm Hùng Vân (2010), “Nghiên cứu đa trung tâm tình hình đề kháng Imipenem Meropenem trực khuẩn Gram (-) dễ mọc kết 16 bệnh viện Việt Nam”, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI [21] Abibuli Z., Wang Y., Tu H., Zhang X (2012), “Facile Synthesis and Herbicidal Evaluation of 4H-3,1-Benzoxazin-4-ones and 3H-Quinazolin-4-ones with 2-Phenoxymethyl Substituents”, Journal of molecules, 17, pp 3181-3201 [22] Al-Qahtanti A A ,Al-turki T., Khan M Hamad A Z H (2012), “Simple and Selective Synthesis of 1,3-Benzoxazine Derivatives”, Oriental Journal of Chemistry, 28(1), pp 287-295 [23] Archana Y V., Sayyad M A., Mokle S S., Khansole S.V., (2009), “Synthesis and antibacterial evaluation of some new 1,3-benzoxazines”, Scholars Research Library, 2(1), pp 86-91 [24] Bakker C., An (2002),“8-{4-[3-(5-fluoro-1H-indol-3yl)propyl]-piperrazin-1- yl}-2-methyl-4H-benzol[1,4]oxazin-3-one mesylate with high affinity for the dopamine d2 receptor and the serotonin reuptake site” [25] Boontheung P., Perlmetter P (1998), “A Highly-Efficient Synthesis of Benzoxazine-2,4-diones”, Tetrahedron Letter, 39, pp 2629-2630 [26] Chang L., Ji-Lia T., Su-Yi X., Liao et al (2014), “1,4-Benzoxazine-3(4H)- ones as Potent Inhibitors of Platelet Aggregation: Design, Synthesis and Structure –Activity Relations”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 62(9), pp 915-920 [27] El-Mekabaty A (2013), “Chemistry of 4H-3,1-Benzoxazin-4-ones”, International Journal of Modern Organic Chemistry, 2(2), pp 81-121 [28] Gabbas A U., Mohammed A., Ahmad M B (2014), “An Alternative Synthetic Approach For 1,3-Benzoxazine Derivatives”, International Journal of Scientific & Technology Research, 3(6), pp 46-48 [29] Giusepe C., Paolo G., Elisa P., Vincenzo S., (1998), “Synthesis, biological activity and conformational study of 1,4-benzoxazine derivatives as a potassium chanel modulators”, European Journal of Medicinal Chemistry, 33, pp 957-967 [30] Gutshow M Neumann U (1997), “Inhibition of cathepsin G by 4H- 3,1- benzoxazin- 4- ones”, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 5(10), pp 1935-1942 [31] Hollas M J (2004), Modern Spectroscopy, John Wiley & Sons Ltd, USA, pp.138-179.o [32] Hu Q., Xia Z., Fan L., et al (2012), “Copper-catalyzed one-pot synthesis of 2H-1,4-benzoxazin-3-(4H)-ones from 2-(o-haloaryloxy)acyl chlorides and primary amines”, Zhejiang Normal University, pp.14-15 [33] Keeler J (2005), Understanding NMR Spectrocopy, John Wiley & Són, USA [34] Kern J C et al (2006), “SAR studies of 6-(Arylamino)-4,4-disubstituted-1- methyl-1,4-dihydro-benzo[d][1,3]oxazin-2-ones as nonsteroidal reaceptor antagonists”, Bioorgranic & Medicinal Chemistry Letters progesterone [35] Largeron M., Lockhart B., Pfeiffer B et al (1999), “Synthesis and in Vitro Evaluation of New 8-Amino-1,4-benzoxazine Derivatives as Neuroprotective Antioxidants”, Journal of Medicinal Chemistry, 42(24), pp 5043-5052 [36] Mandey F., (2002), “Studies on “ one-pot” synthesis of an oxo-aza and di-aza cyclic molecules and its application to the asymmetric catalyst”, Hasanuddin University.riec [37] Matsouka H., Ohi N., Mihara M., et al (1997), “Antirheumatic Agents: Novel Methotrexate Derivatives Bearing a Benzoxazine or Benzothiazine Moiety”, Journal of Medicinal Chemistry, 40(1), pp 105-111 [38] Nemcecek P., Mocak J., Waisser K., (2013), “Prediction of anti-tuberculosis activity of 3-phenyl-2-1,3-benzoxazine-2,4(3H)-dione derivatives”, Chemical Papers, 67(3), pp 305-312 [39] Neuman U., Sturzebecher J., Leistnr S., Viewege H (1991), “Inhibition of Chymotrypsin and Pancreatic Elastase by 4H-3,1-Benzox azin-4-Ones”, Journal of Enzyme Inhibition, 4, pp 227-232 [40] Pei W H., Fang R C., Cheng H C (2004), “2-Substituted benzoxazinone analogues as anti-human coronavirus (anti-HCoV) and ICAM-1 expression inhibition agents”, Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 14, pp 4751-4754 [41] Seckin O., Aydin M O., Hakan G (2000), “Synthesis and antimicronial activity of some new 4-hydroxy- 2H-1,4- benzoxazin- 3(4H)- ones”, Il Farmaco, 55(11-12), pp715-718 [42] Sethofer S., Zhang L (2006), “US Patent Application 20060106012- Benzoxazine and quinoxazine derivatives and uses thereof” [43] Siddiqiu N., Ali R., M., Alam M S., Ahsan W (2010), “Pharmacological Profile of Benzoxazines: A Short Review”, Journal of Chemical Pharmaceutical and Research, 4(2), pp.309-316 [44] Stuart B (2004), Infrared Spectrocopy: Fundamentals and Applications John Wiley & Sons, Ltd, pp 74-95 [45] Tahri, et al (2008), “(1,10b-dihydro-2- (aminalkyl- phenyl)- 5H- pyrazolo [1,5c] [1,3]benzoxaizn- 5-yl)phenyl methanone dertivatives as HIV viral replication inhibitors” [46] Tauzeau F., Arrault A., Guillaumet G., et al (2003), “Synthesis and Biological Evaluation of New 2-(4,5-Dihydro-1H-imidazol-2-yl)-3,4-dihydro-2H1,4-benzoxazine Derivatives”, Journal of Medicinal Chemistry, 46(10), pp 19621979 [47] Tang Z., Zhua Z., Xia.Z, et al (2012), “Synthesis and Fungicidal Activity of Novel 2,3-Disubstituted-1,3-benzoxazines”, Journal of molecules, 12, pp 81748185 [48] Waisser K., Cizmari J., Petrlikova J., Kunes E., Kaustova (2009), “Antimycobacterial 3-(4-ethoxythiocarbonylphenyl)-4-thioxo-2H-1,3-benzoxazine2,4(3H)-dithiones”, Acta Facultatis Pharmaceuticae Universitatis Comenianae, Tomus LVI [49] Waisser K., Maktyk J., Divisova H et al (2007), “The Oriented Development of Antituberculotics (Part II): Halogenated 3-(4-Alkylphenyl)-1,3-benzoxazine-2,4(3H)-diones”, Arch Pharm Chem Life Sci, 340, pp 264–267 [50] World Health Organization (2014), ANTIMIC ROBIAL RESISTANCE Global Report on Surveillance, pp 16-19