0347SÀNG LỌC VI KHUĂN VÙNG RẺ CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG NÁM GÂY BỆNH COLLECTOTRICHUM SP. CHO CÂY ỚT

TR NGă IH CM TP HCM  BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGH P tài: SÀNG L C VI KHU N VÙNG R CÓ KH N NGăKệCHăTHệCHăT NGăTR NG VÀ KHÁNG N M GÂY B NH COLLECTOTRICHUM SP CHO CÂY T KHOA: CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH VI SINH GVHD: ThS Nguy n Thanh Thu n ThS Nguy năV năMinh SVTT: Lê Th Y n Nhi MSSV: 1053010532 Khóa: 2010 ậ 2014 Tp H Chí Minh, Tháng 06 N m 2014 L IC M N hoàn thành đ tài này, em xin g i l i c m n đ n Th y Cô khoa Công Ngh Sinh H c, tr ng i h c M thành ph H Chí Minh gi ng d y truy n đ t ki n th c cho em su t nh ng n m v a qua đ em làm t t đ tài khóa lu n Em xin g i c m n sâu s c t i th y Nguy n V n Minh t n tình h b o em su t th i gian em th c hi n đ tài Em xin c m cô D ng ng d n, ch ng Nh t Linh, i truy n đ t cho chúng em nhi u kinh nghi m quý báu Em xin c m n anh Linh, nh ng ng an Duy Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi ch Nguy n Th M i anh, ng i ch ng h , giúp đ em lúc làm đ tài Bên c nh đó, tơi xin c m n b n c a tôi, b n sinh viên làm đ tài th i gian v i tôi, b n sinh viên h c vi c phịng thí nghi m Công ngh Vi sinh quan tâm, giúp đ tơi q trình th c hi n đ tài Cu i xin c m n Ba, M , c m n gia đình bên con, t o m i u ki n t t nh t đ hoàn thành vi c h c c a B n n m đ i h c k t thúc, nh ng v i tơi v n s k ni m đ p đ i Em xin g i l i chúc s c kh e đ n t t c ng ngh sinh h c, Tr g t hái đ ng i th y, ng i đáng kính khoa Cơng i h c m thành ph H Chí Minh, xin chúc th y ngày c nhi u thành công Tôi xin chúc b n c a s luôn thành công đ c ng hi n tài n ng s c tr cho t ng lai đ t n ng b c vào đ i, c Xin chân thành c m n Sinh viên th c hi n Lê Th Y n Nhi Tháng 06/2014 KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C CH VI T T T CFU Colony forming unit IAA Indole Acetic Acid MS Minimal Salt NA Nutrent Agar NB Nutrient Broth OD Optical Density PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth PGPR Plant Growth Promotion Rhizobacteria TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth SVTH: LÊ TH Y N NHI i KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C HÌNH NH Hình 1.1: Hình nh t bào (a) khu n l c (b)c a vi khu n Bacillussubtilis 13 Hình 2.1: Vòng kháng n m b ng ph ng pháp kh ch tan đ a 37 Hình 3.1: Quan sát đ i th khu n l c mơi tr Hình 3.2 Quan sát vi th vi khu n d Hình 3.3: M t s m u b nh thu th p đ i kính hi n vi x100 55 c 56 Hình 3.4: Quan sát đ i th n m mơi tr Hình 3.5: Bào t n m b nh quan sát d ng NA 53 ng PDA 57 i kính hi n vi quang h c 57 Hình 3.6: Tri u ch ng b nh thán th qu Hình 3.7: Khu n l c ch ng T7 m c môi tr tđ c lây b nh nhân t o 58 ng Ashby 60 Hình 3.8: Ph n ng màu gi a thu c th Nesler’s v i l ng NH3 sinh t ch ng vi khu n 63 Hình 3.9: Ph n ng màu gi a thu c th FeCl3-H2SO4và IAA sinh b i vi khu n 66 Hình 3.10: Kh n ng phơn gi i Ca3(PO4)2 môi tr ng Pikovskaya 68 Hình 3.11: Ph n ng màu gi a thu c th v i phospho hòa tan t ch ng vi khu n 70 Hình 3.12: Kh n ng kháng n m gây b nh c a ch ng vi khu n vùng r qua ph ng pháp khu ch tán đ a 73 Hình 3.13: K t qu ph n ng Nitate, lên men đ ng, VP c a ch ng B6 77 Hình 3.14: K t qu th đ i kháng ba ch ng vi khu n có ho t tính m nh 78 SVTH: LÊ TH Y N NHI ii KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C Hinh 3.15: So sánh chi u cao c a cơy đ i ch ng v i hai nghiêm th c ph i tr n ch ng vi khu n B21 82 SVTH: LÊ TH Y N NHI iii KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C B NG B ng 2.1: Xây d ng đ ng chu n NH3 29 B ng 2.2: Xây d ng đ ng chu n phospho 31 B ng 2.3: Xây d ng đ ng chu n IAA 34 B ng 3.1:K t qu quan sát đ i th khu n l c 51 B ng 3.2: K t qu quan sát vi th ch ng vi khu n vùng r 53 B ng 3.3: K t qu đ nh tính kh n ng c đ nh đ m 59 B ng 3.4: K t qu đ nh l ng kh n ng sinh NH3c a ch ng 61 B ng 3.5: K t qu đ nh tính kh n ng sinh IAA 63 B ng 3.6: K t qu đ nh l ng IAA c a ch ng 64 B ng 3.7: K t qu đ nh tính kh n ng hịa tan Ca3(PO4)2 67 B ng 3.8: N ng đ phospho ch ng vi khu n hòa tan đ c 68 B ng 3.9: K t qu kh n ng kháng vi n m gây b nh c a vi khu n vùng r 71 B ng 3.10: ng kính vịng kháng n m gây b nh c a vi khu n vùng r t 72 B ng 3.11: K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng T7 74 B ng 1.12: K t qu đ nh danh ch ng T16 75 B ng 3.13: K t qu đ nh danh ch ng B21 75 B ng 3.14: K t qu đ nh danh ch ng B6 76 B ng 3.15: K t qu t ng tr SVTH: LÊ TH Y N NHI ng c a t 78 iv KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C BI Uă Bi u đ 3.1: N ng đ NH3 c a ch ng c đ nh đ m 62 Bi u đ 3.2: N ng đ IAA c a vi khu n 65 Bi u đ 3.3: N ng đ phospho hoà tan c a vi khu n 69 Bi u đ 3.4: ng kính kháng n m gây b nh 72 Bi u đ 3.5: Chi u cao c a nghi m th c 79 Bi u đ 3.6: Kh i l ng t i, kh i l ng khô c a nghi m th c 79 Bi u đ 3.7: Ch s GPE c a nghi m th c theo ph n tr m 80 SVTH: LÊ TH Y N NHI v KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M CăS ă S đ 2.1: B trí thí nghi m 23 S đ 2.2: Quy trình phân l p 24 S đ 2.3: Quy trình đ nh l ng NH3 30 S đ 2.4: Quy trình đ nh l ng phospho 33 S đ 2.5: Quy trình đ nh l ng IAA 35 SVTH: LÊ TH Y N NHI vi KHÓA LU N T T NGHI P M CL C M CL C DANH M C CH VI T T T i DANH M C HÌNH NH ii DANH M C B NG iv DANH M C BI U DANH M CăS ă v .vi M C L C .vii T V Nă PH N T NG QUAN TÀI LI U 1.1 CÂY T VÀ B NHăTHỄNăTH ăTRểNăCỂYă T 1.1.1 S l 1.1.2 B nh thán th cơy t 1.2 M TS c v t VI KHU N VÙNG R 1.2.1 Khái ni m vùng r 1.2.2 M t s ho t tính kích thích t ng tr r 1.2.3 Bacillus 13 1.3 ng tr ng c a vi khu n vùng TÌNH HÌNH NGHIÊN C U VI KHU N VÙNG R HI N NAY 15 1.3.1 Tình hình nghiên c u th gi i 15 1.3.2 Tình hình nghiên c u t i Vi t Nam 17 PH N 2: V T LI UăVẨăPH NGăPHỄP 19 2.1 Aă I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U 20 2.2 V T LI U 20 2.3 THI T B D NG C MỌIăTR NG 20 2.3.1 Thi t b 20 2.3.2 D ng c 21 2.3.3 Môi tr SVTH: LÊ TH Y N NHI ng hóa ch t 21 vii KHÓA LU N T T NGHI P PH 2.4 M CL C NGăPHỄPăNGHIểNăC U 22 2.4.1 B trí thí nghi m 22 2.4.2 Ph 2.4.3 Ti n hƠnh quan sát đ i th vi th 25 2.4.4 Xác đ nh ho t tính kích thích t ng tr ng pháp l y m u làm thu n 23 ng c a vi khu n vùng r 28 2.4.5 2.4.6 2.4.7 Ph ng pháp th ng kê s li u 38 nh danh 38 Thí nghi m kh o xác kh n ng kích thích t ng tr ng t 46 PH N 3: K T QU VÀ TH O LU N 50 3.1 K T QU PHÂN L P 51 3.1.1 Quan sát đ i th 51 3.1.2 Quan sát vi th 53 3.1.3 K t qu phân l p lây b nh nhân t o n m Collectotrichum sp t 3.2 56 K T QU KH N NGăKệCHăTHệCHăT NGăTR NG 58 3.2.1 Kh n ng c đ nh nit phơn t 59 3.2.2 Kh n ng sinh IAA 63 3.2.3 Kh n ng hòa tan Ca (PO ) 66 3.2.4 K t qu đ nh tính kh n ng kháng vi n m gây b nh c a vi khu n vùng r t t 70 3.3 K T QU NH DANH SINH HÓA 74 3.3.1 Ch ng T7 74 3.3.2 Ch ng T16 74 3.3.3 Ch ng B21 75 3.3.4 Ch ng B6 76 3.4 K T QU TH C NGHI M 77 SVTH: LÊ TH Y N NHI viii KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 0.4 y = 0.0021x + 0.1357 R² = 0.9915 0.35 OD600nm 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 20 40 60 80 100 120 N ngăđ ăphosphoă(ppm) Bi u đ 1: th t ng quan gi a m t đ quang n ng đ phospho chu n 2.3 B ng k t qu đo OD đ l ng chu n, đ th đ ng chu n v trình đ nh ng IAA (Indol Acetic Acid) B ng Giá tr OD c a đ th đ ng chu n IAA N ng đ IAA chu n 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,01 0,03 0,04 0,05 0,07 0,09 0,11 0,1 0,17 0,18 (ppm) OD530n m B ng K t qu OD530nm xác đ nh IAA d ch nuôi c y STT SVTH: LÊ TH Y N NHI K t qu đo OD Mã ch ng L n1 L n2 L n3 T2 0.312 0.3713 0.309 100 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C T3 0.211 0.209 0.209 T4 0.148 0.153 0.149 T6 0.314 0.314 0.315 T9 0.289 0.279 0.289 T14 0.091 0.0903 0.0912 T15 0.164 0.169 0.2723 B1 0.2833 0.283 0.283 B3 0.279 0.269 0.279 10 B11 0.121 0.13167 0.122 11 B19 0.312 0.313 0.313 12 B21 0.491 0.486 0.492 13 B22 0.457 0.488 0.487 14 B25 0.192 0.193 0.182 Các s li u đư tính tốn tr cho nghi m th c đ i ch ng 15 SVTH: LÊ TH Y N NHI i ch ng 0,226 0,225 0,235 101 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 0.2 y = 0.0018x - 0.0062 R² = 0.9783 OD530nm 0.15 0.1 0.05 -0.05 20 40 60 80 100 120 N ngăđ ăIAAăµg/mL Bi u đ th t ng quan gi a m t đ quang n ng đ IAA chu n PH L C 3: K T QU X LÝ TH NG KÊ ANOVA 3.1 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ng sinh NH3 so sánh s khác bi t Ủ ngh a b ng ki m đ nh Ducan c a ch ng vi khu n th nghi m: Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum T3 20.73636 6.912121 1.283395 T6 20.87727 6.959091 3.296116 T7 33.52273 11.17424 1.155916 T8 28.85455 9.618182 0.333657 T11 18.15 T13 23.23182 7.743939 9.807052 SVTH: LÊ TH Y N NHI Average 6.05 Variance 3.985537 102 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C T14 12.26818 4.089394 6.073581 B1 22.35 B2 19.07273 6.357576 0.844222 B3 7.454545 2.484848 2.79885 B7 22.19091 7.39697 B8 24.8 B20 9.945455 3.315152 10.29096 B11 18 B21 15.19545 5.065152 20.77323 SS df 7.45 5.75314 0.425833 8.266667 7.200916 5.04093 ANOVA Source of MS F 218.4224 14 15.6016 2.959957 Groups 158.1267 30 5.270889 Total 376.5491 44 Variation Between Groups Within SVTH: LÊ TH Y N NHI 103 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C \ 3.2 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ng sinh IAA so sánh s khác bi t Ủ ngh a b ng ki m đ nh Ducan c a ch ng vi khu n th nghi m: Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Standard Error Nong IAA T2 1011.0094 337.0031333 1222.3485 20.18537837 337±20.18 T3 649.019 216.3396667 1.333333333 0.666666667 216.33±0.66 T4 467.9486 155.9828667 7.081396163 1.536380613 155.98±1.53 T6 960.9513 320.3171 0.28173663 0.306450991 320.31±0.30 SVTH: LÊ TH Y N NHI 104 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C T9 875.4563 291.8187667 33.65165166 3.349211433 291.81±3.34 T14 291.06137 97.02045667 0.310817097 0.321878391 97.02±0.32 T15 623.5743 207.8581 3756.048161 35.38383888 207.8535.38 B1 867.0396 289.0132 0.00029403 0.0099 289.01±0.01 B3 847.025 282.3416667 33.29334533 3.331333333 282.34±3.33 B11 393.022 131.0073333 33.29334533 3.331333333 131.00±3.33 B19 954.029 318.0096667 1.320033333 0.663333333 318.00±0.66 B21 1488.039 496.013 8.2668 1.66 496.01±1.66 B22 1450.3184 483.4394667 303.0230702 10.05025821 483.43±10.05 B25 586.0397 195.3465667 36.78541326 3.50168594 195.34±5.50 Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 544158.6 13 41858.35555 107.7823971 2.38906E-20 2.088929347 Within Groups 10874.08 28 388.3598499 Total 555032.7 41 ANOVA Source of SVTH: LÊ TH Y N NHI 105 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 3.3 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ng phân gi i phosphate so sánh s khác bi t Ủ ngh a b ng ki m đ nh Ducan c a ch ng vi khu n th nghi m: Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Standard Error Nong lan T1 183.53 61.17667 0.614033 0.452413282 61.17± 0.452 T9 206.23 68.74333 0.032933 0.104774891 68.74±0.104 T11 162.9 54.3 12.4672 2.038561584 54.3±2.03 T12 159.679 53.22633 0.08392 0.167252637 53.22±0.167 T16 313.68 104.56 7.5621 1.587671251 104.56±1.587 B10 110.53 36.84333 0.670033 0.472593318 36.84±0.472 B11 135.08 45.02667 5.151033 1.310347706 45.027±1.310 B14 145.98 48.66 0.2299 0.276827263 48.66±0.276 Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 9071.582 1295.94 386.6869 1.24614E-16 2.6571966 Within Groups 53.62231 16 3.351394 Total 9125.205 23 ANOVA Source of SVTH: LÊ TH Y N NHI 106 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Anova: Single Factor SUMMARY Groups Phoi tron T16 B21 T7 Doi chung ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Count 3 3 SS Sum Average Variance 31 10.33333 0.333333 21.6 7.2 0.37 23.5 7.833333 1.083333 20.1 6.7 1.17 14.5 4.833333 3.523333 df MS F P-value F crit 47.724 12.96 10 11.931 9.206019 0.002191 3.47805 1.296 60.684 14 3.4 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ng c ch n m b nh so sánh s khác bi t Ủ ngh a b ng ki m đ nh Ducan c a ch ng vi khu n th nghi m: Anova: Single Factor SUMMARY Groups SVTH: LÊ TH Y N NHI Count Sum Average Variance 107 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C T1 63 21 T10 64 21.33333 1.333333 T11 77 25.66667 0.333333 B2 88 29.33333 1.333333 B3 44 14.66667 0.333333 B6 104 34.66667 0.333333 B10 33 B17 32 SS df MS F 1574.958 224.994 257.1361 14 16 0.875 1588.958 23 11 1 10.66667 1.333333 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total SVTH: LÊ TH Y N NHI Pvalue 3.16E15 F crit 2.657197 108 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 3.5 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v chi u cao, tr ng l ng t i, tr ng l ng khô GPE th c nghi m kh n ng kích thích t ng tr ng t c a ba ch ng phân gi i phosphate, c đ nh đ m, sinh IAA ph i ch ng c a chúng So sánh s khác bi t Ủ ngh a b ng ki m đ nh LSD c a ch ng vi khu n th nghi m:  Chi u cao Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Phoi tron 3.00 31.00 10.33 0.33 T16 3.00 21.60 7.20 0.37 B21 3.00 23.50 7.83 1.08 T7 3.00 20.10 6.70 1.17 Doi chung 3.00 14.50 4.83 3.52 Source of Variation SS df MS F Pvalue F crit Between 47.72 4.00 11.93 9.21 0.00 3.48 ANOVA SVTH: LÊ TH Y N NHI 109 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Groups Within Groups 12.96 10.00 Total  Tr ngăl 1.30 60.68 14.00 ngăt SVTH: LÊ TH Y N NHI i 110 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Phoi tron 3.00 T16 3.00 B21 3.00 T7 3.00 Doi chung 3.00 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total SVTH: LÊ TH Y N NHI Sum 1.01 0.50 0.49 0.41 0.20 Average Variance 0.34 0.00 0.17 0.00 0.16 0.00 0.14 0.00 0.07 0.00 SS df MS F Pvalue F crit 0.12 4.00 0.03 352.68 0.00 3.48 0.00 10.00 0.00 0.12 14.00 111 KHÓA LU N T T NGHI P  Tr ngăl PH L C ng khô Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Phoi tron 3.00 T16 3.00 B21 3.00 T7 3.00 Doi chung 3.00 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total SVTH: LÊ TH Y N NHI Sum 0.14 0.10 0.10 0.05 0.04 Average Variance 0.05 0.00 0.03 0.00 0.03 0.00 0.02 0.00 0.01 0.00 SS df MS F Pvalue F crit 0.00 4.00 0.00 28.67 0.00 3.48 0.00 10.00 0.00 0.00 14.00 112 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C  %GPE Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Phoi tron 3.00 T16 3.00 B21 3.00 T7 3.00 Doi chung 3.00 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sum Average Variance 240.29 80.10 11.94 177.80 59.27 88.77 176.22 58.74 44.69 152.52 50.84 27.11 0.00 0.00 0.00 SS df MS F Pvalue F crit 10705.68 4.00 2676.42 77.58 0.00 3.48 345.01 10.00 34.50 11050.69 14.00 SVTH: LÊ TH Y N NHI 113 KHÓA LU N T T NGHI P SVTH: LÊ TH Y N NHI PH L C 114