0526SÀNG LỌC Bacilins VÀ Trichoderma CÓ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ KIẾM SOÁT SINH HỌC NÁM Pyhiun sp. VÀ Fusariuti sp. GÂY BỆNH TRÊN CÂY HỒ TIÊU

TR B GIÁO D C VÀ ÀO T O NG I H C M TP H CHÍ MINH  BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P Tên đ tài: SÀNG L C Bacillus VÀ Trichoderma CÓ HO T TÍNH KÍCH THÍCH T NG TR NG VÀ KI M SOÁT SINH H C N M Pythium sp VÀ Fusarium sp GÂY B NH TRÊN CÂY H TIÊU KHOA CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH – SINH H C PHÂN T GVHD: Ths NGUY N THANH THU N Ths NGUY N V N MINH SVTH: PH M TH THIÊN MSSV: 1053010718 KHÓA: 2010 – 2014 Tp H Chí Minh, tháng n m 2014 L IC M N  tài đ c th c hi n t i phịng thí nghi m Cơng Ngh Vi Sinh, khoa Công Ngh Sinh H c, Tr ng i h c M Tp HCM, d is h ng d n c a Ths Nguy n Thanh Thu n Ths Nguy n V n Minh Kính g i đ n hai Th y l i tri ân sâu s c nh t v s quan tâm, t o m i u ki n c ng nh s h ng d n t n tình đ em có th hồn thành đ tài t t nghi p m t cách t t nh t Con xin g i l i c m n đ n gia đình th đ ng viên giúp có đ ng yêu, quan tâm, ch m sóc, c nh ngày hơm Xin c m n t t c b n phịng thí nghi m Cơng Ngh Vi Sinh tr ng i h c M Tp HCM nhi t tình t n tâm giúp đ v m i m t, đ ng viên chia s bu n vui công vi c c bi t, em mu n bày t lòng c m n đ n ch Võ Ng c Y n Nhi ch Nguy n Th M Linh dành th i gian đ quan tâm, đóng góp nhi u ý ki n quý báu giúp em hoàn thành đ tài t t h n Em c ng xin g i l i c m n sâu s c đ n Quý Th y Cô khoa Công Ngh Sinh H c tr ng i h c M Tp HCM truy n đ t cho em ki n th c quý báu làm n n t ng đ th c hi n đ tài t t nghi p Cu i cùng, xin c m n t t c b n bè, nh ng ng i bên c nh, ng h chia s v i công vi c c ng nh cu c s ng em chúc t t c quý Th y Cô, b n, t t c m i ng i xung quanh luôn vui v , h nh phúc cu c s ng thành công công vi c Xin chân thành c m n! Sinh viên: Ph m Th Thiên KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C HÌNH NH Hình 1.1 Các d ng bào t n m Pythium sp 11 Hình 1.2 Bào t n m Fusarium sp 14 Hình 1.3 Khu n l c hình nhu m Gram Bacillus 26 Hình 3.1 Khu n l c Pythium m t tr c m t sau 45 Hình 3.2 N m Pythium nhu m lactophenel 45 Hình 3.3 Khu n l c Fusarium m t tr c m t sau 46 Hình 3.4 N m Fusarium nhu m lactophenol 47 Hình 3.5 Khu n l c vi khu n m c môi tr ng Ashby 48 Hình 3.6 Khu n l c vi khu n m c môi tr ng Pikovskaya 49 Hình 3.7 K t kh th kh n ng sinh IAA c a ch ng vi khu n 49 Hình 3.8 K t qu đ nh tính kháng n m Pythium c a m t s ch ng Bacillus 50 Hình 3.9 K t qu đ nh tính kháng n m Fusarium c a m t s ch ng Bacillus 51 Hình 3.10 K t qu đ nh tính kháng Pythium c a Trichoderma m t tr c m t sau 52 Hình 3.11 K t qu kháng n m Fusarium c a Trichoderma m t tr c m t sau 52 Hình 3.12 K t qu th nghi m k t h p Bacillus Trichoderma 58 Hình 3.13 K t qu th đ i kháng hai ch ng F33 BD33 m t tr SVTH: PH M TH THIÊN c m t sau 59 i KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C BI U Bi u đ 3.1 Ph n tr m c ch n m Pythium c a ch ng Bacillus 55 Bi u đ 3.2 Ph n tr m c ch n m Fusarium c a ch ng Bacillus 57 SVTH: PH M TH THIÊN ii KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C B NG B ng 3.1 Ph n tr m c ch c a ch ng Bacillus đ i v i Pythium sp 53 B ng 3.2 Ph n tr m c ch c a ch ng Bacillus đ i v i Fusarium sp 55 B ng 3.3 Kh n ng kháng n m Trichoderma viride c a ch ng Bacillus ch n l c 57 B ng 3.4 K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng Bacillus sp F33 59 B ng 3.5 K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng Bacillus sp BD33 60 SVTH: PH M TH THIÊN iii KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C T VI T ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming u IAA Indole Acetic Acid NA Nutren Agar NB Nutren Broth PDA Potato Dextrose Agar nti PTN Phòng Thí nghi m SDA Sabouraud Dextrose Agar TSB Trypticase Soy Broth TSB Trypticase Soy Broth MS Minimal Salt SVTH: PH M TH THIÊN iv KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C M CL C DANH M C HÌNH NH I DANH M C BI U II DANH M C B NG III DANH M C T IV VI T M CL C v TV N CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.1 T ng quan v h tiêu 1.1.1 Ngu n g c l ch s phát tri n 1.1.2 c tính th c v t h c 1.1.3 Tình hình s n xu t tiêu th h t tiêu th gi i Vi t Nam 1.1.4 M t s b nh th ng g p tiêu 1.2 T ng quan v Pythium sp Fusarium sp 10 1.2.1.T ng quan v Pythium sp 10 1.2.2 T ng quan v Fusarium sp 14 1.3 N m đ i kháng Trichoderma viride 15 1.3.1 V trí, phân lo i 15 1.3.2 c m hình thái 16 1.3.3 c m sinh lý, sinh hóa 17 1.3.4 C ch kh n ng đ i kháng c a n m Trichoderma viride 18 1.3.5 M t s nghiên c u ng d ng vi n m Trichoderma viride 20 1.4 Vi khu n Bacillus 23 1.4.1 Hình d ng kích th 1.4.2 Dinh d ng t ng tr c 24 ng 24 1.4.3 Sinh s n 25 1.4.4 Ch t kháng n m Bacillus ti t 25 CH 27 NG 2: V T LI U VÀ PH SVTH: PH M TH THIÊN NG PHÁP v KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C 2.1 Th i gian đ a m nghiên c u 28 2.2 V t li u 28 2.3 D ng c thi t b 28 2.4 Hóa ch t, thu c nhu m 29 2.5 Môi tr 29 2.6 Ph ng ng pháp nghiên c u 29 2.6.1 Phân l p n m b nh 2.6.2 Xác đ nh m t s ho t tính kích thích t ng tr 29 ng tr ng c a ch ng Bacillus 30 2.6.3 Kh o sát kh n ng đ i kháng n m b nh Pythium Fusarium c a ch ng Bacillus 31 nh tính kh n ng kháng n m Pythium Fusarium c a n m đ i 2.6.4 kháng Trichoderma viride 33 2.6.5 Kh o sát kh n ng k t h p c a Trichoderma viride ch ng Bacillus34 2.6.6 Th kh n ng t cao nh t b ng ph 2.6.7 ng pháp c y v ch vng góc 35 nh danh 2.6.8 Ph CH ng thích ch ng Bacillus có ho t tính kháng n m 35 ng pháp th ng kê s li u 42 NG 3: K T QU VÀ TH O LU N 43 3.1 K t qu phân l p n m b nh 44 3.1.1 K t qu phân l p n m Pythium 44 3.1.2 K t qu phân l p n m Fusarium 45 3.2 K t qu xác đ nh ho t tính kích thích t ng tr ng tr ng c a ch ng Bacillus 46 3.3 K t qu đ nh tính kh n ng kháng n m Pythium Fusarium c a ch ng Bacillus 50 3.3.1 K t qu đ nh tính kh n ng kháng n m Pythium c a ch ng Bacillus50 3.3.2 K t qu đ nh tính kh n ng kháng n m Fusarium c a ch ng Bacillus50 3.4 K t qu xác đ nh kh n ng kháng n m Pythium Fusarium c a n m đ i kháng Trichodermav viride 51 SVTH: PH M TH THIÊN vi KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C 3.4.1 K t qu xác đ nh kh n ng kháng n m Pythium c a n m đ i kháng Trichoderma viride 51 3.4.2 K t qu xác đ nh kh n ng kháng n m Fusarium c a n m đ i kháng Trichoderma viride 3.5 K t qu đ nh l 51 ng kh n ng kháng n m Pythium Fusarium c a ch ng Bacillus 52 3.6 K t qu th c nghi m k t h p Trichoderma viride Bacillus 56 3.7 K t qu th nghi m kh n ng t ng thích gi a ch ng Bacillus đ c l a ch n 57 3.8 K t qu đ nh danh sinh hóa 58 CH NG K T LU N VÀ NGH 61 4.1 K t lu n 61 4.2 Ki n ngh 61 TÀI LI U THAM KH O 63 PH L C: 67 SVTH: PH M TH THIÊN vii KHÓA LU N T T NGHI P TV N TV N SVTH: PH M TH THIÊN KHÓA LU N T T NGHI P PH L C pH= 6,8-7,0 3.6 Môi tr ng Clark Lubs Pepton 7g Glucose 5g K2HPO4 5g N cc t 1000 mL pH : 6,9 ± 0,2 3.7 Môi tr Môi tr ng Ure: ng c b n: Pepton 1g NaCl 5g Glucose 1g KH2PO4 2g Phenol red 0,012 g N 900 mL cc t Hòa tan t t c thành ph n 900mL n c H p 121oC/15 phút, đ ngu i đ n 50 – 55oC Dung d ch urê Urea N 20 g cc t 100 mL pH 6.8 ± 0.1 Hòa tan urê 100mL n c c t, l c vô trùng, thêm vào môi tr ng c b n làm ngu i 3.8 Môi tr ng Simmon’s Citrate Sodium citrate SVTH: PH M TH THIÊN 2g 69 KHÓA LU N T T NGHI P K2HPO4 PH L C 1g MgSO4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18 g pH = 6,9 – em h p kh trùng 3.9 Môi tr 121oC (1atm) / 15 – 20 phút ng Kh Nitrate: NB 8g KNO3 (NaNO3) 2g N 1000 mL cc t pH = 7.2 3.10 Môi tr ng lên men đ ng: NB 8g ng 10 g Phenol red 0,01 g N 1000 mL cc t pH = 7.4 em h p kh trùng 1100C/15 – 20 phút Dung d ch Phenol red 0,1% : 0,1g 100 mL c n 200 3.11 Môi tr ng NA % tinh b t NA 23g Tinh b t tan 10g N 1000mL cc t pH= 6.8 – 7.0 SVTH: PH M TH THIÊN 70 KHÓA LU N T T NGHI P 3.12 Môi tr Môi tr PH L C ng NA % casein ng c b n NB 8g Agar 20 g Casein 0,1 g N 1000 mL cc t Dung d ch Casein 1% Casein tinh t 1g NaOH 0,1N 15mL Hòa casein vào NaOH 0,1N đun cách th y cho tan Sau thêm t n t HCl 0,1N đ trung hòa cho t i đ t pH mong mu n d ng (pH = -8) Thêm n cc t cho đ 100 mL 3.12 Môi tr ng NB Cao th t 5g Pepton b t 10g NaCl 5g N 1000 mL cc t pH = 7,4-7,6 3.13 Môi tr Môi tr ng chiristensen’s urea ng c b n: Pepton 1g NaCl 5g Glucose 1g KH2PO4 2g Phenol red 0,012 g N 900 mL cc t SVTH: PH M TH THIÊN 71 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Hòa tan t t c thành ph n 900mL n c H p 121oC/15 phút, đ ngu i đ n 50 – 55oC Dung d ch urê Urea N 20 g cc t 100 mL pH 6.8 ± 0.1 Hòa tan urê 100mL n c c t, l c vô trùng, thêm vào môi tr ng c b n làm ngu i 4.THU C TH - THU C NHU M 4.1 Thu c th tricloroacetic acid (TCA) TCA N 5g cc t 100 ml 4.2 Thu c th KOH 40% KOH N 40 g c c t 100 m 4.3 Thu c th – naphtol 5% – naphtol Ethanol 96o đ 5g 100 mL 4.4 Thu c th Kovac’s Isoamyl alcohol (butyl alcohol) p-Dimethylaminobenaldehyde HCl đ m đ c 150 mL 10 g 50 mL 4.5 Thu c th Gress A Sulfanilic acid Acid acetic (glacial) 30% đ SVTH: PH M TH THIÊN 8,0 g 1000 mL 72 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 4.6 Thu c th Gress B -naphthylamine: Acid acetic (glacial) 30% đ 6,0 g 1000 mL 4.7 Thu c th H2O2 5% H2O2 5mL H2O 100mL 4.8 Thu c nhu m Crystal violet Dung d ch Crystal violet C N 96O 2g 20ml Dung d ch Ammonium oxalate N cc t 0.8g 80ml 4.9 Thu c nhu m lugol I2 1g KI2 2g N cc tđ 300 ml 4.10 Thu c nhu m Safranin O Safranin O (dung d ch 2% c n 96o0.25g Ethanol 10ml N 90 ml cc t SVTH: PH M TH THIÊN 73 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C PH L C nh danh Bacillus sp theo khóa phân lo i Cowan and Steel`s SVTH: PH M TH THIÊN 74 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C M t s hình nh test sinh hóa SVTH: PH M TH THIÊN 75 KHÓA LU N T T NGHI P SVTH: PH M TH THIÊN PH L C 76 KHÓA LU N T T NGHI P SVTH: PH M TH THIÊN PH L C 77 KHÓA LU N T T NGHI P SVTH: PH M TH THIÊN PH L C 78 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C ANOVA X PH L C LÍ S LI U TH NG KÊ Ph l c 3.1 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ng kháng n m Pythium c a ch ng Bacillus Nghi m th c L1 L2 L3 Pythium sp 0 Pythium sp F33 55.56 53.33 54.44 Pythium sp T3 48.89 48.89 47.78 Pythium sp S29 41.11 44.44 50 Pythium sp BD68 42.22 38.89 35.56 Pythium sp T3p 33.33 31.11 33.33 Pythium sp T16p 36.67 35.56 35.56 Pythium sp BD33 50 52.22 48.89 Pythium sp K4 42.22 40 36.67 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Pythium sp 3.00 0.00 0.00 0.00 Pythium sp F33 3.00 163.33 54.44333 1.243233 Pythium sp T3 3.00 145.56 48.52 0.4107 Pythium sp S29 3.00 135.55 45.18333 20.17243 Pythium sp BD68 3.00 116.67 38.89 11.0889 Pythium sp T3p 3.00 97.77 32.59 1.6428 SVTH: PH M TH THIÊN 79 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Pythium sp T16p 3.00 107.79 35.93 0.4107 Pythium sp BD33 3.00 151.11 50.37 2.8749 Pythium sp K4 3.00 118.89 39.63 7.8033 ANOVA Source of Variation SS df 1220.41 MS F P-value 174.3442 30.55525 4.17E - 08 Between Groups F crit 2.65719 Within Groups 91.29393 16 5.705871 Total 1311.704 23 SVTH: PH M TH THIÊN 80 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C CV% = 5,53 % Ph l c 3.2 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ng kháng n m Fusarium c a ch ng Bacillus SVTH: PH M TH THIÊN 81 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Nghi m th c L1 L2 L3 Fusarium sp 0.00 0.00 0.00 Fusarium sp F33 73.33 71.11 66.67 Fusarium sp BD33 53.33 55.56 51.11 Fusarium sp S29 51.11 48.89 44.44 Fusarium sp K4 44.44 46.67 51.11 Fusarium sp T3 42.22 46.67 48.89 Fusarium sp BD68 44.44 42.22 48.89 Fusarium sp T3p 46.67 51.11 42.22 Fusarium sp T16p 48.89 46.67 40 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance Fusarium sp 3.00 0.00 0.00 0.00 Fusarium sp F33 3.00 211.11 70.37 11.4996 Fusarium sp BD33 3.00 160 53.33333 4.950633 Fusarium sp S29 3.00 144.44 48.14667 11.53663 Fusarium sp K4 3.00 142.22 47.40667 11.52923 Fusarium sp T3 3.00 137.78 45.92667 11.53663 Fusarium sp BD68 3.00 135.55 45.18333 11.53663 Fusarium sp T3p 3.00 140 46.66667 19.75803 Fusarium sp T16p 3.00 135.56 45.18667 21.40823 SVTH: PH M TH THIÊN 82 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C ANOVA Source of Variation SS Between Groups df MS F P-value F crit 1528.991 218.4273 16.84168 2.79E-06 2.657197 Within Groups 207.5113 16 12.96945 Total 1736.503 23 CV% = 7,16 % SVTH: PH M TH THIÊN 83