1499 nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng trichoderma sp

Phạm Thị Lịch tgk Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐỂ THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA SP PHẠM THỊ LỊCH*, TRẦN THANH THỦY** TÓM TẮT Vi nấm Trichoderma tác nhân kiểm sốt sinh học có hiệu nhờ khả đối kháng với vi nấm gây hại trồng nhiều chế Trong đó, chế tiết enzyme ngoại bào chúng có vai trò quan trọng, đặc biệt hệ enzyme chitinase Đây hệ enzyme thủy phân có khả phân hủy chitin – thành phần cấu tạo vách tế bào loài vi nấm gây hại trồng Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa điều kiện ni cấy để thu nhận chitinase có hoạt tính cao từ chủng Trichoderma sp., làm sở cho việc tạo chế phẩm chitinase ứng dụng phòng trừ bệnh hại trồng Từ khóa: Trichoderma, chitinase, chitin, điều kiện nuôi cấy ABSTRACT A research on the transplanting conditions for the production of antifungalchitinase enzyme from Trichoderma sp Trichoderma species are efficient bio-control factors due to their resistance to pathogenic fungi on plants in various mechanisms One of these is the production of a large variety of cell-wall degrading enzymes, especially chitinase enzymes This kind of enzyme has a highly chitinolytic ability of breaking down the chitin that is responsible for rigidity on cell wall of several plant pathogens In this study, we maximized the transplanting conditions for highly active chitinase from Trichoderma sp., which serves as a base for creating chitinase productions applied in protecting plants from diseases Keywords: Trichoderma, chitinase, chitin, culture conditions Mở đầu Chitinase enzyme phân hủy chitin, vốn thành phần vách tế bào nấm Trong tự nhiên, có nhiều lồi vi khuẩn, nấm có khả tiết chitinase, đáng ý có Tricoderma, lồi nấm đối kháng quan tâm lĩnh vực sản xuất nơng nghiệp [6] Do Trichoderma có khả tiêu diệt vi nấm gây hại trồng nhiều chế kí sinh, sinh kháng sinh, tiết enzyme ngoại bào,… Hệ enzyme ngoại bào Trichoderma đóng vai trị quan trọng đấu tranh sinh học, đặc biệt enzyme chitinase [9] * ** HVCH, Trường Đại học Sư phạm TPHCM TS, Trường Đại học Sư phạm TPHCM Chitinase Trichoderma phân hủy vách tế bào chủ loài nấm gây hại, chitin thành phần cấu tạo vách tế bào vi nấm gây bệnh trồng [9] Vì vậy, mà năm gần có nhiều cơng trình nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase từ chủng Trichoderma Năm 2003, tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu [4] có cơng trình nghiên cứu khảo sát số yếu tố tác động lên trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase chủng nấm mốc Trichodrema Năm 2010, tác giả Lê Thị Huệ khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma Và bước đầu thu chế phẩm enzyme chitianse thô từ Aspergillus để phòng trừ sâu tơ sản xuất glucosamine [4] Năm 2012, tác giả Đinh Minh Hiệp nghiên cứu chitinase β-glucanase từ Trichoderma spp khả kiểm soát sinh học số nấm gây bệnh [3] Việc nghiên cứu để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ chủng Trichoderma ứng dụng phòng trừ bệnh hại trồng việc làm cần thiết lợi ích sức khỏe người môi trường Đây nội dung chúng tơi giới thiệu cơng trình nghiên cứu Vật liệu phương pháp nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: 10/12/2012 – 05/4/2013 Địa điểm: Phịng Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TPHCM 2.1 Vật liệu Các giống vi si vật (VSV) sử dụng Chủng Trichoderma spp nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới Phòng Thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, Trường Đại học Sư phạm TPHCM Các môi trường (MT) nghiên cứu sử dụng MT1 (YEA): Cao nấm men 4g; glucose 20g; agar 20g; nước cất 1000ml [1] MT2: NaNO3 3,5g; KH2PO4 1,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7H2O 0,01g (vết); chitin 10g; agar 20g; nước cất 1000ml [1] MT3: Trấu 50g; cám 40g; MgSO4.H20 0,2g; K2HPO4 1g; KCl 0,2g; NH4NO3 1,0g; FeSO4.7H2O 0,002g; MnSO4 0,002g; bột chitin 10g; pH = – 6, nước cất 50 60% [7] MT4: Trấu 50g; cám 40g; pepton 1g; urea 0,3g; KH2PO4 0,2g; CaCl2 0,3g; Tween 80 1,2g; (NH4)2SO4 0,4g; MgSO4.H20 0,3g; bột chitin 10g; pH = – 6; nước cất 50 - 60% [10] MT5: Trấu 50g; cám 40g; pepton 0,5g, cao nấm men 0,5g; glucose 1,0g; KH 2PO4 0,3g; K2HPO4 0,7g; MgSO4.H20 0,5g; FeSO4.H20 0,5g; ZnSO4 0,001g; bột chitin 10g; pH = – 6; nước cất 50 - 60% [8] 2.2 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng Sau tuyển chọn chủng Trichoderma sp có khả tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao; tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy bước đầu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô theo phương pháp sau: - Xác định họat tính enzyme ngoại bào nấm sợi (NS)bằng phương pháp khuếch tán MT thạch [1] - Nuôi cấy NS thu nhận chitinase MT bán rắn [5] - Tách chiết thu nhận CPE chitinase thô từ MT nuôi cấy NS [5] - Khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt độ chitinase CPE [5] - Thẩm tích CPE qua màng cellophane [5] - Xác định hàm lượng glucosamine phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrobenzoic acid) [11] - Xác định hoạt độ enzyme chitinase theo phương pháp Elson- Morgan [11] Kết biện luận 3.1 Kết tuyển chọn chủng Trichodermacó hoạt độ chitinasecao Chúng tơi tiến hành khảo sát sơ khả tổng hợp enzyme chitinase chủng Trichoderma spp cách xác định đường kính vịng phân giải Kết trình bày Bảng minh họa Hình Bảng Đường kính vịng phân giải chitin chủng Trichoderma Kí hiệu chủng Trichoderma Đường kính vịng phân giải chitin, D-d (cm) BL1 BL2 BL1 BL2 BL3 BL4 4,9±0,24 6,1±0,31 3,4±0,20 2,5±0,17 BL3 BL4 Hình Khả phân giải chitin chủng Trichoderma Kết cho thấy, tất chủng Trichoderma có khả tổng hợp enzyme chitinase phân giải chitin Trong đó, enzyme chitinase chủng BL4 có khả phân giải chitin yếu nhất; enzyme chitinase chủng BL1, BL2, BL3 có khả phân giải chitin mạnh; mạnh chủng BL2 Vì vậy, chúng tơi định chọn chủng Trichoderma BL2 để tiếp tục nghiên cứu Hình Hình thái đại thể chủng BL2 Hình Hình thái vi thể chủng BL2 3.2 Ảnh hưởng MT điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma BL2 Các điều kiện nuôi cấy thành phần MT, nhiệt độ, pH, độ ẩm,… có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, tạo bào tử khả tạo enzyme NS Do đó, việc nghiên cứu tìm điều kiện ni cấy thích hợp thu chitinase điều cần thiết 3.2.1 Ảnh hưởng MT lên men bán rắn Để chọn MT thích hợp cho chủng Trichoderma BL2 sinh tổng hợp chitinase, tiến hành xác định hoạt độ chitinase chủng NS nghiên cứu MT3, MT4 MT5 168h Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168h nuôi cấy tiến hành xác định hoạt độ chitinase Kết trình bày Hình Hình Đồ thị ảnh hưởng thành phần MT bán rắn đến hoạt độ chitinase chủng Trichoderma BL2 theo thời gian Kết cho thấy: Ở MT3, hoạt tính chitinase tăng nhanh giai đoạn đầu nuôi cấy, đạt cao 48h ni cấy; sau hoạt tính chitinase bắt đầu giảm dần đến 168h sau Sự gia tăng hoạt tính chitinase giai đoạn đầu ni cấy chứng tỏ giai đoạn tế bào vi nấm Trichoderma tổng hợp chitinase để phân giải chitin, nguồn cacbon MT nuôi cấy, tạo sản phẩm trao đổi phục vụ cho q trình đồng hóa nhờ tăng cường khả trao đổi chất tế bào MT Sau 48h, lượng sinh khối Trichoderma MT tăng cao thúc đẩy mạnh trình tổng hợp chitinase để phân giải nguồn chitin MT Sau hệ enzyme chitinase hoạt động mức cao có xu hướng giảm MT khơng cịn chitin, tế bào NS lúc chuyển sang pha sinh trưởng chậm dần Ở MT4, hoạt tính chitinase có thay đổi rõ rệt theo thời gian nuôi cấy Sau 48h ni cấy, hoạt tính chitinase tăng mạnh Điều chứng tỏ pepton có MT nguồn dinh dưỡng dễ hấp thu, mà chủng Trichoderma BL2 sử dụng pepton để gia tăng sinh khối thời gian ngắn Khi lượng sinh khối tăng cao, đồng thời với cạn kiệt pepton MT đẩy nhanh tổng hợp enzyme chitinase để phân giải chitin thành sản phẩm đơn giản phục vụ cho tăng trưởng Vì vậy, mà thời điểm 72h ni cấy, hoạt tính chitinase đạt cao nhất, sau giảm dần nguồn chitin MT bắt đầu giảm Ở MT5, hoạt tính chitinase thay đổi rõ rệt theo thời gian nuôi cấy Tăng mạnh sau 24h nuôi cấy đạt cực đại 72h, đến 96h hoạt tính giảm dần Điều chứng tỏ, thời gian đầu chủng NS nghiên cứu đồng hóa mạnh nguồn cacbon nitơ dễ hấp thu để gia tăng sinh khối Sau 48h lượng sinh khối MT tăng nhiều, mà nguồn dinh dưỡng dễ hấp thu cạn kiệt, thúc đẩy chủng Trichoderma BL2 tiếp tục tổng hợp chitinase để phân giải nguồn chitin có MT sau 72h ni cấy hoạt độ chitinase ghi nhận cao Sau đó, nguồn chitin MT bị phân cắt hết đồng thời sản phẩm cuối N-acetyl-D glucosamine có nhiều MT gây ức chế ngược lại q trình sinh tổng hợp chitinase nên hoạt tính chitinase có xu hướng giảm So sánh hiệu tổng hợp hoạt độ chitinase chủng Trichoderma BL2 MT nhận thấy MT nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ chitinase Mặc dù, thời gian để chủng NS nghiên cứu tổng hợp chitinase nhiều hoạt độ cao MT3 nhanh nhất, hoạt độ lại không cao, nên không chọn MT3 làm MT nuôi cấy MT4 MT giàu dinh dưỡng, không thuận lợi cho tăng trưởng sinh khối Trichoderma mà tạo điều kiện cho chủng sinh tổng hợp loại enzyme thủy phân để sử dụng nguồn dinh dưỡng MT, có chitinase So sánh biến thiên hoạt độ chitinase MT4 5, nhận thấy tốc độ thời gian gia tăng hoạt tính chitinase MT tương đối giống nhau; MT5 giá trị hoạt độ chitinase đạt cao Vì thế, chúng tơi định chọn MT5 thời gian ban đầu để thu nhận enzyme chitinase 72h cho thí nghiệm (TN) sau 3.2.2 Ảnh hưởng chất cảm ứng Nuôi chủng Trichoderma BL2 MT5, sử dụng chất cảm ứng thay đổi bột vỏ tôm, bột vỏ cua, bột chitin, chitin huyền phù 1% Sau ngày thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase, kết thể Hình Hình Biểu đồ ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng đến hoạt độ chitinase chủng NS nghiên cứu Kết biểu đồ cho thấy: Đối với chất cảm ứng bột vỏ tôm, bột vỏ cua hoạt độ chitinase chủng nghiên cứu thấp Nguyên nhân bột vỏ tôm, bột vỏ cua nguồn chất khó phân giải, thành phần cấu tạo chúng ngồi chitin, cịn có nhiều tạp chất khoáng chất khác CaCO 3, protein, lipit, chất hữu cơ… nên enzyme chitinase Trichoderma BL2 tổng hợp MT khơng thể phân giải hồn toàn để tạo sản phẩm cuối N-acetyl-D glucosamine Đối với chất cảm ứng bột chitin, chitin huyền phù hoạt độ enzyme chitinase cao đáng kể Bởi thành phần chitin loại bỏ tạp chất khó thủy phân, cấu trúc chitin chủ yếu kiên kết hyhro, khơng cịn dạng phức hợp liên kết với chất khác bột vỏ tôm, cua thô Tuy nhiên, sử dụng chất chitin dạng huyền phù hoạt độ chitinase đạt giá trị cực đại Điều chứng tỏ chitin cấu trúc bền vững, khó tan nước, dung dịch acid hay kiềm lỗng Do đó, tạo dạng chitin huyền phù acid HCl đậm đặc phá vỡ phần liên kết mạch chitin Nhờ mà enzyme chitinase dễ dàng thực phản ứng phân cắt Kết phù hợp với nghiên cứu Ulhoa C J (1991) [12] xác định chitin huyền phù nguồn chất thích hợp để Trichoderma sinh tổng hợp chitinase có hoạt độ cao thống với kết luận El-Katatny et al (2001) chọn chitin huyền phù làm chất để thu chitinase từ chủng T harzianum Do đó, chúng tơi chọn chitin huyền phù làm nguồn chất cảm ứng cho TN 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng Tiến hành nuôi chủng Tri BL2 MT5 thay đổi nồng độ chitin huyền phù từ 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0% Sau ngày nuôi cấy, tiến hành xác định hoạt độ chitinase Kết minh họa Hình Hình Đồ thị ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt độ chitinase Trichoderma BL2 Kết cho thấy, khơng có bổ sung 0,5% chitin huyền phù vào MT hoạt độ chitinase thấp Điều chứng tỏ, khơng có nồng độ q thấp lượng chất không đủ để Trichoderma BL2 vừa tăng sinh khối vừa tổng hợp enzyme Khi tăng nồng độ chất vào MT hoạt tính chitinase tăng lên rõ rệt Tuy nhiên, nồng độ 2%, hoạt độ chitinase giảm mạnh, điều cho thấy tăng lượng chất vào MT cao, pha tăng trưởng NS kéo dài hơn, sản phẩm cuối thứ cấp tích tụ nhiều gây ức chế tổng hợp chitinase Trong đó, nồng độ chitin huyền phù từ 1,0% đến 1,5% khoảng thích hợp cho enzyme chitinase với hoạt độ cao Tác giả Lê Thị Huệ (2010) [4], nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase Aspergillus Trichoderma kết luận nồng độ chitin khoảng 1,0 – 1,5% hoạt độ chitnase đạt mức cao, thích hợp nồng độ 1,0% Tác giả Đinh Minh Hiệp (2013) [3] nghiên cứu nồng độ chất cảm ứng bổ sung vào MT nuôi cấy Trichoderma để thu chitinase kết kuận nồng độ chitin huyền phù 1,0% thích hợp cho q trình tăng trưởng sinh tổng hợp enzyme Trichoderma Xem xét nghiên cứu tác giả, so sánh giá trị hoạt độ chitinase đạt nồng độ TN trên, đồng thời nhằm tiết kiệm nguyên liệu định chọn nồng độ chitin huyền phù 1,0% để tiến hành TN sau 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Kết trình bày Bảng Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ chitinase Trichoderma BL2 Nhiệt độ (oC) 20 25 30 35 40 Hoạt độ chitinase (UI/ml) 15,841 ± 0,059 25,236 ± 0,076 31,836 ± 0,214 26,054 ± 0,37 14,273 ± 0,284 Kết cho thấy chủng Tri BL2 sinh tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao tất điều kiện nhiệt độ khảo sát Trong đó, chủng sinh enzyme chitinase hoạt độ cao khoảng nhiệt độ từ 25 – 35 oC, cao 30oC Kết phù hợp với nghiên cứu Lê Thị Huệ [4] khoảng nhiệt độ tối ưu cho Trichoderma tổng hợp chitinase 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trườngban đầu: Kết minh họa Hình Hình Đồ thị ảnh hưởng pH ban đầu MT ban đầu đến hoạt độ chitinase Kết cho thấy chủng Trichoderma BL2 có khả sinh enzyme chitinase mạnh hầu hết điều kiện pH khảo sát Trong đó, chủng sinh enzyme chitinase hoạt độ cao pH Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Tô Duy Khương (2007) [4], Lê Thị Huệ (2010) [4] xác định pH MT ban đầu thích hợp cho Trichoderma spp sinh tổng hợp chitinase hoạt độ cao khoảng pH – Kết thống với tác giả Đinh Minh Hiệp (2012) [3] nghiên cứu chitinase βglucanase từ Trichoderma spp khả kiểm soát sinh học số nấm gây bệnh, xác định pH ban đầu MT thích hợp cho hoạt độ chitinase cao 5.0 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm Tiến hành khảo sát ảnh hưởng độ ẩm MT lên hoạt độ chitnase chủng Trichoderma BL2 Nuôi chủng MT5, chất cảm ứng chitin huyền phù 1,0% nhiệt độ 30oC, pH 5, với độ ẩm MT thay đổi 50, 55, 60, 65, 70, 75% Sau ngày nuôi cấy, tiến hành xác định hoạt độ chitinase Kết thể Hình Hình Biểu đồ ảnh hưởng độ ẩm MT ban đầu đến hoạt độ chitinase Kết cho thấy khoảng độ ẩm MT ban đầu thích hợp cho chủng Tri BL2 tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao 55 – 65%, đạt cao mức 60% Độ ẩm MT 70% hoạt độ chitnase giảm mạnh đáng kể Qua kết chọn độ ẩm MT nuôi cấy ban đầu 60% cho TN sau 3.2.7 Động thái trình sinh tổng hợp chitinase Trichoderma BL2 Nuôi chủng Trichoderma BL2 MT5, chất cảm ứng chitin huyền phù 1,0% nhiệt độ 30oC, pH 5, độ ẩm MT 60% Sau 12 thu mẫu lần, để tiến hành xác định độ ẩm MT pH dịch lên men, sau xác định hoạt độ chitinase chủng này, kết minh họa Hình Hình Đồ thị động thái trình sinh tổng hợp chitinase Trichoderma BL2 Từ kết nhận thấy, khoảng thời gian đầu, pH môi trường nuôi tăng chậm Điều giải thích thời gian đầu chủng Trichoderma BL2 bắt đầu sinh trưởng tạo sản phẩm trao đổi chất trung gian acid hữu cơ, đồng thời bắt đầu sinh tổng hợp loại để phân giải nguồn chất glucose, pepton, cao nấm men để sinh trưởng Chính có mặt sản phẩm trao đổi chất q trình phân giải làm pH mơi trường có xu hướng tăng dần pH mơi trường bắt đầu tăng nhanh từ 6,10 đến 7,29 sau 60h nuôi cấy; sau pH mơi trường tiếp tục tăng ổn định Đồng thời, suốt trình lên men chủng Trichoderma BL2 thực trình oxi hóa phân giải chất tạo sản phẩm, tổng hợp enzyme làm độ ẩm MT ngày tăng Qua đó, ta thấy pH độ ẩm MT nuôi cấy tăng tỉ lệ thuận với biến thiên hoạt độ chitinase Hoạt độ chitinase chủng bắt đầu tăng dần từ thời điểm 12h, đến thời điểm 48h nuôi cấy sinh khối NS nghiên cứu tăng cao, nguồn dinh dưỡng dễ hấp thu glucose, pepton… dần cạn kiệt, thúc đẩy tổng hợp enzyme chitinase chủng Trichoderma BL2 Khi chitinase tổng hợp nhiều tăng cường hoạt động phân cắt chitin, song song hoạt độ chitinase đạt giá trị cực đại Như vậy, sau 60h hoạt độ chitinase đạt giá trị cao Sau 72h hoạt độ enzyme bắt đầu giảm Kết thời gian thay đổi so với kết khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hoạt độ chitinase ban đầu Nguyên nhân tập trung điều kiện tối ưu lại yếu tố MT tác động đồng thời lên chủng Trichoderma BL2 làm thời gian thu chitinase có hoạt độ cao rút ngắn Như vậy, để thu nhận chitinase thơ từ chủng Trichoderma BL2 tiến hành nuôi cấy đến thời điểm 48h – 72h, tốt 60h MT có pH mơi trường ban đầu 5,0 độ ẩm MT ban đầu 60% 3.3 Chiết tách enzyme tạo chế phẩm enzyme (CPE) chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt tính CPE chitinase Sau ni chủng Trichoderma BL2 MT5 với điều kiện thích hợp để sinh chitinase cao nhất, tiến hành tủa enzyme với tác nhân tủa tương ứng Sử dụng CPE thu sau tủa để xác định hoạt độ chitinase Kết trình bày Bảng Bảng Ảnh hưởng tác nhân tủa lên hoạt tính CPE chitinase Tác nhân tủa Tỉ lệ (TL) enzyme/ tác nhân tủa TL1- 1:2 Acetone Ethanol 960 Muối (NH4)2SO4 Hoạt độ chitinase (UI/gCPE) 33,401 ± 0,116 TL2 - 1:3 27,065 ± 0,146 TL3 - 1:4 26,964 ± 0,143 TL1 - 1:2 28,392 ± 0,186 TL2 - 1:3 60,409 ± 0,186 TL3 - 1:4 36,905 ± 0,140 TL1 - 60% 36,367 ± 0,227 TL2 - 70% 66,964 ± 0,124 TL3 - 80% 48,149 ± 0,140 Kết cho thấy: Đối với tác nhân tủa acetone, hoạt độ chitinase cao tỉ lệ dịch chiết enzyme dung môi 1:2 Đối với tác nhân tủa ethanol, hoạt độ chitinase cao tỉ lệ dịch chiết enzyme dung môi 1:3 So sánh tác nhân tủa dung mơi hoạt độ chitinase CPE tủa ethanol 960 cao so với tác nhân acetone CPE tủa muối (NH4)2SO4 có hoạt độ cao hầu hết tỉ lệ % độ bão hòa Hoạt độ chitinase CPE cao (66,964 UI/gCPE) tỉ lệ độ bão hòa 70% So sánh tác nhân tủa, CPE thu tủa muối (NH 4)2SO4 có hoạt độ cao Tuy nhiên, trước chọn tác nhân tủa chúng tơi tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi CPE phương pháp thẩm tích enzyme qua màng cellophane Cho dung dịch enzyme vào cellophane, sau đặt túi vào nước cất dung dịch đệm pha lỗng Màng cellophane màng bán thấm, có kích thước lỗ cho chất có phân tử nhỏ xuyên qua vào dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán Còn lại màng enzyme – protein có phân tử lớn Kết trình bày Bảng Bảng Hiệu suất thu nhận CPE tương ứng tác nhân tủa Khối lượng CPE trung bình thu sau tủa (g) Tác nhân tủa Aceton 0,24 g/100ml o Ethanol 96 (NH4)2SO4 0,59 g/100ml Trước thẩm tích Sau thẩm tích 5,54 g/100ml 0,35 g/100ml Từ kết Bảng 4, định chọn tác nhân tủa để thu hồi CPE dung môi ethanol, dù hoạt độ CPE tủa ethanol không cao muối khối lượng CPE thu ethanol cao nhiều so với muối Điều đáp ứng nhu cầu đề tài tạo CPE phòng thí nghiệm 3.3.2 Thu nhận CPE chitinase thơ từ chủng Trichoderma BL2 * Nuôi Trichoderma BL2 MT bán rắn Tiến hành nuôi Trichoderma BL2 MT5 với điều kiện tối ưu xác định, sau 60h thu dịch enzyme thô Chúng nhận thấy, sau 36h nuôi cấy bào tử màu xanh chủng nghiên cứu bắt đầu hình thành bao phủ bề mặt chất MT Kết minh họa Hình 10 (a) Sau 12h ni cấy (b) Sau 36h ni cấy Hình 10 Nuôi Trichoderma BL2 MT bán rắn * Thu nhận chế phẩm enzyme Sau 60h nuôi cấy, tiến hành chiết dịch enzyme nước cất vô trùng Dịch chiết enzyme lọc, li tâm lạnh để loại bỏ bào tử tơ nấm, ta thu dịch enzyme thô màu vàng chứa chitinase, nước chất hịa tan khác Sau đó, sử dụng ethanol làm tác nhân tủa, ủ lạnh khoảng 12h, li tâm để thu tủa, sấy nhiệt độ 35 – 40oC khô, xay mịn ta CPE chitinase thơ dạng bột Kết minh họa Hình 11 12 Hình 11 Tủa enzyme chitinase sau li tâm Hình 12.CPE enzyme chitinase thơ Sau đó, tiến hành kiểm tra lại hoạt độ chitinase CPE (60,418 UI/gCPE) bảo quản CPE điều kiện nhiệt độ lạnh từ – 8oC Kết luận Sau trình nghiên cứu, chúng tơi đưa số lết luận sau: - Tuyển chọn chủng Trichoderma BL2 có khả tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao chủng khảo sát - Đã xác định điều kiên ni cấy thích hợp thu enzyme chitinase hoạt độ cao từ chủng Trichoderma BL2 là: Trấu 50g; cám 40g; pepton 0,5g, cao nấm men 0,5g; glucose 1g; KH2PO4 0,3g; K2HPO4 0,7g; MgSO4.H20 0,5g; FeSO4.H20 0,5g; ZnSO4 0,001g; chitin huyền phù 1,0%; pH 5; độ ẩm 60%, thời gian nuôi cấy 60h - Đã xác định tác nhân tủa để thu CPE chitinase ethanol 96o - Hoạt độ chitinase CPE sau tủa ethanol 96oxác định 60,418(UI/gCPE) Kiến nghị: Tiếp tục khảo sát đặc tính lí hóa CPE chitinase từ chủng Trichoderma BL2 thử nghiệm CPE việc phòng trừ vi nấm gây bệnh trồng TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, (3), Nxb Khoa học Kĩ thuật Hà Nội, tr.115-140 Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kĩ thuật sinh hóa, Tủ sách trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tr.98-115 Đinh Minh Hiệp (2012), Nghiên cứu chitinase β-glucanase từ Trichoderma spp khả kiểm soát sinh học số nấm bệnh gây hại, Luận án Tiến sĩ, Viện Sinh học Nhiệt đới Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm TPHCM Lương Đức Phẩm (2011), Sản xuất sử dụng chế phẩm sinh học nông nghiệp, Nxb Giáo dục Việt Nam, tr.209-215 Brameld A Ken, William D Shrader, Imperiali Barbara and Goddard III A (1998), “Substrate assistance in the Mechanism of family 18 chitinase: Theoretical studies of potential intermediates and inhibitors”, J Mol Biol, Vol 280, pp.923-933 El-Katatny et al (2000), “Production of Chitinase and -1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for control of the phytopathogenic fungus Sclerotium rolfsii”, Food technol Biotechnol, 38(3), pp.173–180 Guoqing et al (2001), “A novel chitinase having a unique mode of action from Aspergillus fumigatus YJ-407”, Eur J Biochhem, 268, pp.4079-4085 Harmen G E, Howell C R, Viterbo A, Chet I and Lorito M (2004), “Trichoderma species – opportunistic, avirulent plant symbionts”, Nature Reviews Microbiology, 2, pp.43-56 10 Hirohi Ihui, Hirano S., Kosaki H., Uno Y., Toda T (1994), “Biotechnology and bioactive polymers”, International Journal of Science, 2, pp.34-35 11 Matroudi et al (2009), “Antagonistic effects of three species pf Trichoderma sp on Slerotinia slerotiorum, the causal agent of canola stem rot”, Egytian Journal of Biology, 11, pp.37-44 12 Ulhoa C J., Peberdy J F (1991), “Regulation of chitinase synthesis in Trichoderma harzianum”, Journal of General Microbiology, 137, pp.2163-2169 (Ngày Tòa soạn nhận bài: 26-8-2013; ngày phản biện đánh giá: 23-9-2013; ngày chấp nhận đăng: 14-10-2013) ... 3.3.2 Thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 * Nuôi Trichoderma BL2 MT bán rắn Tiến hành nuôi Trichoderma BL2 MT5 với điều kiện tối ưu xác định, sau 60h thu dịch enzyme thô Chúng nhận. .. 2.2 Các phương pháp nghiên cứu sử dụng Sau tuyển chọn chủng Trichoderma sp có khả tổng hợp enzyme chitinase hoạt độ cao; tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy bước đầu tạo chế phẩm enzyme chitinase. .. tách enzyme tạo chế phẩm enzyme (CPE) chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng tác nhân tủa đến hoạt tính CPE chitinase Sau nuôi chủng Trichoderma BL2 MT5 với điều kiện