TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ GIỐNG VI KHUẨN BACILLUS SPP VÀ PSEUDOMONAS SPP CÓ KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN NGUYỄN THỊ NGỌC SƯƠNG*, NGUYỄN ĐỖ THANH PHƯƠNG**, TRẦN HẢI MY*** TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, tuyển chọ[.]
Nguyễn Thị Ngọc Sương tgk TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐHSP TPHCM _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ GIỐNG VI KHUẨN BACILLUS SPP VÀ PSEUDOMONAS SPP CĨ KHẢ NĂNG HỊA TAN LÂN NGUYỄN THỊ NGỌC SƯƠNG*, NGUYỄN ĐỖ THANH PHƯƠNG**, TRẦN HẢI MY*** TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, tuyển chọn dịng vi khuẩn Bacillus B68 Pseudomonas T15 có số hịa tan lân cao khơng gây độc trồng Môi trường nhân giống cấp 1, cấp chất mang thích hợp cho dịng B68 TSB, RĐ-TB phân hữu Đối với dịng T15, mơi trường nhân giống cấp 1, cấp chất mang thích hợp King’s B, NBRIP-RĐ phân hữu 75% cám gạo 25% Từ khóa: Bacillus, hịa tan lân, Pseudomonas ABSTRACT Establishing procedure of biopreparation from Bacillus spp and Pseudomonas spp having phosphate solubilizing ability In this study, B68 isolate and T15 isolate were showed the highest phostphate solubilisation index and were non-toxic for plants For B68 isolate, the suitable culture medium type I, medium type II and carrier are TSB, molasses - starch, and vermicompost, respectively For T15 isolate, the suitable culture medium type I, medium type II and carrier are King’s B, NBRIP - molasses and 75% vermicompost 25% rice screenings, respectively Keywords: Bacillus, soluble phosphorus, Pseudomonas Mở đầu Lân nguyên tố đa lượng quan trọng sinh trưởng, phát triển trồng yếu tố ảnh hưởng đến suất trồng Tuy nhiên, lân tồn đất dạng khó tan nên trồng khơng thể hấp thu Vì thế, lân thường bổ sung vào đất dạng phân bón hịa tan mà trồng dễ sử dụng lượng lân vơ hịa tan nhanh chóng bị cố định kết tủa thành dạng khơng hịa tan làm trồng khơng hấp thu [7] Hơn nữa, việc sử dụng phân bón hóa học gây ô nhiễm môi trường tổn hại đến sức khỏe người Do đó, diện vi khuẩn hòa tan lân thuộc chi Pseudomonas, Bacillus… đất vùng rễ có vai trò quan trọng hòa tan dạng lân khó tan thành dạng dễ tan mà trồng hấp thu Tiềm * Kĩ sư Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao, TPHCM; Email: ngocsuongnguyen10@gmail.com ** ThS, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao, TPHCM *** Cử nhân, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao, TPHCM ứng dụng vi khuẩn hòa tan lân sản xuất chế phẩm sinh học lớn biện pháp hiệu để tăng suất trồng, giảm lượng phân bón hóa học giảm tác động xấu phân hóa học gây ra, cải thiện đất trồng bảo vệ môi trường Phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên vật liệu Các giống Bacillus spp có nguồn gốc từ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TPHCM sưu tập Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Các giống Pseudomonas spp có nguồn gốc từ Trường Đại học Nông lâm TPHCM sưu tập Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Than bùn, phân hữu (phân trùn quế), cám gạo, rỉ đường 2.2 Môi trường - Môi trường thử hoạt tính: Mơi trường thạch đĩa Pikovskaya’s: Glucose 10 g/L, Ca3(PO4)2 (TCP) g/L, (NH4)2SO4 0,5 g/L, NaCl 0,2 g/L, KCl 0,2g/L, MgSO 4.7H2O 0,1 g/L, yeast extract 0,5 g/L, MnSO4.H2O 0,002 g/L, FeSO4.7H2O 0,002 g/L, agar 15 g/L - Môi trường nhân giống: Môi trường Trypticase Soya Broth (TSB), Nutrient Broth (NB), Lubria - Bertani (LB), King’s B Môi trường NBRIP biến đổi (NBRIP - BĐ) (Nautiyal, 1999): Glucose 20 g/L, Ca3(PO4)2 g/L, MgCl2.6H2O 10 g/L, MgSO4.7H2O 0,25 g/L, KCl 0,2 g/L, (NH4)2SO4 0,1 g/L Môi trường NBRIP rỉ đường (NBRIP - RĐ): Rỉ đường 20g/L, Ca 3(PO4)2 g/L, MgCl2.6H2O 10g/L, MgSO4.7H2O 0,25 g/L, KCl 0,2 g/L, (NH4)2SO4 0,1 g/L Môi trường rỉ đường tinh bột (RĐ-TB): Rỉ đường 120 g/L, KH2PO4 g/L, tinh bột 20g/L Môi trường Tryptone Glucose Yeast Extract hydrolysate g/L, yeast extract g/L, glucose g/L (TGYE): Casein enzymic Môi trường Tryptone yeast extract (TYE): Tryptone 10 g/L, yeast extract g/L, NaCl g/L 2.3 Phương pháp 2.3.1 Tuyển chọn giống vi khuẩn Bacillus spp Pseudomonas spp có khả hịa tan lân khó tan Tuyển chọn giống vi khuẩn có khả hịa tan lân: Các giống vi khuẩn cấy điểm thạch đĩa PKV, ủ nhiệt độ phịng Ghi nhận đường kính vịng phân giải đường kính khuẩn lạc sau ngày ni ủ [10] Thử tính gây độc cho trồng chủng vi khuẩn tuyển chọn được: Ngâm hạt cà chua xử lí bề mặt nước cất vô trùng, cồn 70% nước Javen 50% ủ đến nảy mầm, ngâm hạt nảy mầm với dịch khuẩn có mật độ 108 - 109 CFU/ml 30 phút, sau đặt hạt vào ống thạch MS, ủ điều kiện 16 sáng tối nhiệt độ 28°C Theo dõi tính tỉ lệ chết, biến dị bị bệnh, so sánh với đối chứng không xử lí vi khuẩn sau chủng 7-14 ngày 2.3.2 Nghiên cứu môi trường nhân giống cấp Nuôi cấy lắc (150 vịng/phút) vi khuẩn Bacillus mơi trường: NB, TGYE, TSB 24 48 37°C vi khuẩn Pseudomonas môi trường: NB, TSB, King’s B 24 48 28°C [1], [4], [5] 2.3.3 Nghiên cứu môi trường nhân giống cấp Ni cấy lắc (150 vịng/phút) vi khuẩn Bacillus môi trường: RĐ TB, LB, TYE 24 48 37°C vi khuẩn Pseudomonas môi trường: NBRIP - BĐ, TGYE, NBRIP - RĐ 24 48 28°C [4], [10] 2.3.4 Nghiên cứu chất mang thích hợp cho vi khuẩn Cơng thức thí nghiệm chất mang: than bùn, than bùn (98%) + cám gạo (2%), than bùn (98%) + rỉ đường (2%), than bùn (98%) + phân hữu (2%), phân hữu cơ, phân hữu (70%) + cám gạo (30%) phân hữu (75%) + cám gạo (25%), sau bổ sung sinh khối vi khuẩn cho mật độ cao 1011 CFU/g Ủ nhiệt độ phòng 30 ngày [5], [8] Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm gián tiếp môi trường TSA (đối với Bacillus) King’s B (đối với Pseudomonas); số hòa tan lân (phosphate solubilizing index, SI) [10] Kết thảo luận 3.1 Tuyển chọn giống vi khuẩn Bacillus spp Pseudomonas spp có khả hịa tan lân khó tan Qua q trình tuyển chọn, giống vi khuẩn có khả hịa tan lân tốt dựa hai tiêu số hịa tan lân tính gây độc cho trồng, kết trình bày Bảng Bảng Khả hịa tan lân tính gây độc cho trồng Bacillus spp Chủng Chỉ số hòa tan lân Tỉ lệ chết (%) C6 A18 A30 2,19 d 2,34 c 2,51 b 100 100 B68 2,84 a A76 2,32 c BS1 - BS5 - BS8 - BS9 - B78 - Các số trung bình theo cột có kí tự kèm theo khơng khác biệt có ý nghĩa mức xác suất p < 0,05 * Tỉ lệ chết, bị bệnh lô đối chứng 0% Bảng Khả hịa tan lân tính gây độc cho trồng Pseudomonas spp Chủng Chỉ số hòa tan lân Tỉ lệ chết (%) T13 3,64 b 100 T14 3,15 d T15 3,98 a T21 3,45 c T6 3,50 bc 100 T1 T12 T17 T18 T5 Các số trung bình theo cột có kí tự kèm theo khơng khác biệt có ý nghĩa mức xác suất p < 0,05 * Tỉ lệ chết, bị bệnh lô đối chứng 0% Trong 20 chủng vi khuẩn thí nghiệm, có chủng Bacillus C6, A18, A30, B68 A76 chủng Pseudomonas T13, T14, T15, T21 T6 có khả hịa tan lân Tuy nhiên, có chủng A18, B68, A76, T14, T15 T21 không gây độc cho trồng Trong đó, chủng Bacillus B68 (SI = 2,84) chủng Pseudomonas T15 có số hịa tan lân cao (SI = 3,98) Theo nghiên cứu Tripti cs (2012), chủng Bacillus có số hịa tan lân cao 3,1 chủng Pseudomonas [10] Rath cs (2013) nghiên cứu khả hòa tan lân số chủng vi khuẩn, chủng Bacillus có hoạt tính hịa tan lân cao có SI từ 1,22 đến 1,26, chủng Pseudomonas 1,93 [6] Sinha cs (2013) phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả hịa tan lân, đó, chủng Bacillus JPSB16 có số SI cao (3,14) chủng Pseudomonas có số SI cao 2,83 [9] Như vậy, nói chủng Bacillus B68 chủng Pseudomonas T15 có số hịa tan lân cao, có tiềm ứng dụng cao cho việc hịa tan lân khó tan đất Hình Khả hịa tan lân mơi trường thạch đĩa Pikovskaya’s số chủng vi khuẩn Bacillus Pseudomonas sau ngày ủ A30 B68: chủng Bacillus; T6, T13, T15, T14, T21 T1: chủng Pseudomonas Hình Tính gây độc cho trồng chủng Bacillus Pseudomonas có khả hịa tan lân thời điểm 10 ngày ĐC: Đối chứng; A30, C6, A18, A76 B68: chủng Bacillus; T6, T13, T14, T21 T15: chủng Pseudomonas 3.2 Nghiên cứu môi trường nhân giống cấp Sau nhân giống mơi trường thí nghiệm, vi khuẩn B68 cịn khả hòa tan lân với số hòa tan lân 2,85; 2,84 2,86 Như vậy, mơi trường khơng có ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính phân giải lân vi khuẩn Bacillus B68 Bảng Mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus B68 sau 24 48 nuôi cấy môi trường nhân giống cấp Mật độ tế bào (CFU/mL) Môi trường 24 48 NB TGYEB 1,54 x 1010 a 2,07 x 109 b 1,78 x 109 a 1,74 x 109 a TSB 2,03 x 1010 a 8,75 x 109 a Các số trung bình theo cột có kí tự kèm theo khơng khác biệt có ý nghĩa mức p < 0,01 Từ Bảng cho thấy sau 24 nuôi cấy môi trường TSB, vi khuẩn Bacillus B68 đạt mật độ trung bình cao (2,03 x 10 10 CFU/mL) Tuy nhiên, mật độ vi khuẩn trung bình mơi trường TSB khơng có khác biệt mặt thống kê (p