Đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo dược đối với vi khuẩn pseudomonas spp gây bệnh lở loét trên cá bông bớp (bostrichthys sinensis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH ÉP MỘT SỐ LOẠI THẢO DƢỢC ĐỐI VỚI VI KHUẨN Pseudomonas spp GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ BỐNG BỚP (Bostrichthys sinensis) LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60.42.30 Người thực : Đinh Thị Vân Chung Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Ngọc Hùng Vinh - 2012 LỜI CẢM ƠN! Để hồn thành tốt khóa luận này, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Ngọc Hùng – giảng viên khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh, người định hướng hướng dẫn nhiệt tình, chu đáo suốt thời gian tơi thực đề tài tốt nghiệp Đồng thời xin chân thành cảm ơn ThS Trương Thị Thành Vinh, ThS Nguyễn Thị Kim Chung cán phịng thí nghiệm khoa Nơng Lâm Ngư, nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban chủ nhiệm khoa thầy, giáo Phịng Đào tạo Sau đại học - Đại học Vinh trang bị tảng kiến thức giúp đỡ năm học qua.n Cuối cùng, xin cảm ơn tới khoa Sinh học, phòng ban trường Đại Học Vinh gia đình, bạn bè đồng nghiệp, tập thể lớp CH18- SHTN quan tâm, động viên suốt trình học tập thời gian thực đề tài Vinh, tháng năm 2012 Tác giả Đinh Thị Vân Chung MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một vài đặc điểm sinh học đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm sinh học cá Bống bớp (Bostrichthys sinesis Lecepede, 1801) 1.1.2 Chủng vi khuẩn Pseudomonas spp 1.1.3 Các loại thảo dƣợc 1.2 Những hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh phòng trị bệnh cho thủy sản 14 1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dƣợc 16 1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dƣợc giới 16 1.3.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dƣợc nƣớc 19 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 23 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phƣơng pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn 24 2.4.2 Phƣơng pháp xác định mật độ vi khuẩn 27 2.4.3 Phƣơng pháp thu dịch ép từ thảo dƣợc 28 2.4.4 Phƣơng pháp thử kháng sinh đồ 28 2.4.5 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 29 2.4.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 2.4.7 Thời gian địa điểm nghiên cứu 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết phân lập định danh vi khuẩn gây bệnh lở loét cá Bống bớp 35 3.2 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp dịch ép loại thảo dƣợc 36 3.3 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép khác 38 3.3.1 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp thảo dƣợc nồng độ dịch ép khác 38 3.3.2 Khả kháng khuẩn dịch ép Cỏ mực chủng Pseudomonas spp 40 3.3.3 Khả kháng khuẩn dịch ép củ Gừng chủng Pseudomonas spp 42 3.3.4 Khả kháng khuẩn dịch ép củ nghệ chủng Pseudomonas spp 43 3.3.5 Khả kháng khuẩn dịch ép Cỏ lào chủng Pseudomonas spp ` U 3.3.6 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 45 3.4 Nghiên cứu khả kháng khuẩn hỗn hợp thảo dƣợc Tỏi Gừng với tỷ lệ khác 50 3.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ bảo quản thời gian bảo quản đến khả kháng khuẩn số thảo dƣợc (củ Tỏi) 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC VIẾT TẮT Viết tắt TT Viết đầy đủ CN Công nghệ CTV Cộng tác viên KH Thạc sĩ KHCN Khoa học công nghệ NA Nutrien Aga NCNTTS Công nghệ nuôi trồng thủy sản NN&PTNT Nông nghiệp phát triển nông thôn NXB Nhà xuất NTTS Nuôi trồng thủy sản 10 ThS Thạc sĩ 11 TS Tiến Sĩ 12 TW Trung ương DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết định danh vi khuẩn phân lập từ cá Bống bớp bệnh lở loét 35 Bảng 3.2 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn dịch ép loại thảo dƣợc 36 Bảng 3.3 Khả kháng khuẩn dịch ép từ củ Tỏi Pseudomonas spp 38 Bảng 3.4 Khả kháng khuẩn dịch ép từ Cây Cỏ mực Pseudomonas spp 40 Bảng 3.5 Khả kháng khuẩn dịch ép từ củ Gừng Pseudomonas spp 42 Bảng 3.6 Khả kháng khuẩn dịch ép từ củ nghệ Pseudomonas spp 43 Bảng 3.7 Khả kháng khuẩn dịch ép từ Cỏ lào Pseudomonas spp 44 Bảng 3.8 Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 100% 45 Bảng 3.9 Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 75% 47 Bảng 3.10 Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 50% 48 Bảng 3.11 Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 25% 49 Bảng 3.12 Khả kháng khuẩn hỗn hợp Tỏi - Gừng Pseudomonas spp 50 Bảng 3.13 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp dịch ép củ Tỏi điều kiện nhiệt độ bảo quản thời gian bảo quản khác 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu phân lập vi khuẩn 25 Hình 2.2 Đƣờng cấy vi khuẩn đĩa lồng 25 Hình 2.3 Các bƣớc pha lỗng nồng độ vi khuẩn 28 Hình 3.1 Dấu hiệu cá bị bệnh 35 Hình 3.2 Khuẩn lạc mọc NA (cấy tăng sinh) 36 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc nhuộm gram 36 Hình 3.4 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn loại thảo dƣợc thuốc kháng sinh chủng Pseudomonas spp 37 Hình 3.5 Vịng vơ khuẩn Tỏi thuốc kháng sinh 37 Hình 3.6 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn dịp ép củ Tỏi nồng độ khác chủng Pseudomonas spp 38 Hình 3.7 Vịng vô khuẩn dịch ép củ Tỏi 40 Hình 3.8 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch ép Cỏ mực chủng Pseudomonas spp 41 Hình 3.9 Vòng kháng khuẩn Cỏ mực 41 Hình 3.10 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch ép củ Gừng chủng Pseudomonas spp 42 Hình 3.11 Vịng kháng khuẩn Gừng 43 Hình 3.12 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch ép củ nghệ chủng Pseudomonas spp 43 Hình 3.13 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn dịch ép Cỏ lào chủng Pseudomonas spp 44 Hình 3.14 Vòng kháng khuẩn Cỏ lào 100% 45 Hình 3.15 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 100% 46 Hình 3.16 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 75% 48 Hình 3.17 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 50% 49 Hình 3.18 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn loại thảo dƣợc nồng độ dịch ép 25% 50 Hình 3.19 Đƣờng kính vịng vơ khuẩn hỗn hợp dịch ép từ Tỏi Gừng Pseudomonas spp 51 Hình 3.20 Vịng kháng khuẩn hỗn hợp dịch ép từ củ Tỏi củ Gừng 51 Hình 3.21 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn dịch ép củ Tỏi nhiệt độ bảo quản thời gian bảo quản khác 53 MỞ ĐẦU Cá Bống bớp (Bostrichthys sinensis) sống chủ yếu dải nước lợ ven bờ biển Việt Nam, chúng thường phân bố tập trung nhiều vùng cửa sơng, rừng ngập mặn nơi có đáy đất phù sa, bùn pha cát, có nhiều sinh vật đáy động vật giáp xác sinh sống Là lồi cá có giá trị kinh tế cao thịt thơm ngon, bổ dưỡng, giá hấp dẫn nên tiêu thụ rộng rãi thị trường nước Bởi mà cá Bống bớp bị khai thác mức, với tàn phá môi trường sinh thái môi trường sống từ việc chuyển đổi rừng ngập mặn sang nuôi trồng thủy sản hoạt động kinh tế khác người làm cho sản lượng cá Bống bớp nước ta bị giảm sút nghiêm trọng có nguy bị tiêu diệt Chính thế, ni cá Bống bớp phong trào mạnh mẽ số tỉnh ven biển có điều kiện phù hợp Hải Phịng, Thanh Hóa, Nghệ An Trong Nghệ An phát triển ni cá Bống bớp ao Tuy nhiên nuôi cá Bống bớp Nghệ An gặp nhiều khó khăn ảnh hưởng đến suất sản lượng nghề nuôi nguồn cung cấp giống, thức ăn, dịch bệnh Đặc biệt cá Bống bớp xuất bệnh lở loét vi khuẩn Pseudomonas spp Trong ni trồng thủy sản, với nhóm bệnh vi khuẩn, thông thường sử dụng kháng sinh tổng hợp đem lại hiệu cao dùng thuốc, liều, thời điểm Tuy vậy, kháng sinh tổng hợp dao hai lưỡi, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe động vật sử dụng có tác động khơng nhỏ tới môi trường sinh thái, dùng kháng sinh tổng hợp tùy tiện thiếu hiểu biết có khả tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc Mặt khác, dư lượng kháng sinh sản phẩm nuôi ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng tác động xấu tới việc tiêu thụ sản phẩm, đặc biệt mặt hàng xuất Trước tình hình việc nghiên cứu sử dụng loại thảo dược phòng điều trị bệnh nhiễm khuẩn cho đối tượng ĐVTS coi hướng mới, vừa đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, vừa thân thiện với môi trường sinh thái Trên giới, số nước như: Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh, Thái lan, Thổ Nhĩ Kỳ có nghiên cứu thử nghiệm tác dụng thảo dược số tác nhân gây bệnh động vật thủy sản Ở nước ta, năm gần nhà khoa học có nghiên cứu tác dụng thảo dược như: Trầu không, Hẹ, Tỏi, Xoan, Húng… phòng trị bệnh cá Chép, tôm Sú, cá Trắm cỏ, cá Rô phi vằn, cá Bống bớp…Trong giới Việt Nam chưa có cơng bố cụ thể đánh giá khả kháng khuẩn dịch ép số loại thảo dược bệnh lở loét cá Bống bớp vi khuẩn Pseudomonas spp Bởi người nuôi biết dựa vào kinh nghiệm để chữa trị, có lúc hiệu nên thiệt hại kinh tế khơng nhiều, có lúc khơng hiệu nên thiệt hại kinh tế lớn cho người nuôi Từ yêu cầu thực tế đặt ra, tiến hành đề tài “Đánh giá khả kháng khuẩn dịch ép số loại thảo dƣợc vi khuẩn Pseudomonas spp gây bệnh lở loét cá Bống bớp (Bostrichthys sinensis) ” Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp dịch ép loại thảo dược (Tỏi, Cỏ mực, Gừng, Nghệ, Cỏ lào) điều kiện nồng độ, nhiệt độ sử dụng bảo quản, thời gian bảo quản công thức kết hợp khác 46 Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) 30 25.15 25 20 15 12.45 14.32 10 6.62 3.87 Tỏi Cỏ mực Gừng Nghệ Cỏ lào Các thảo dược Hình 3.15 Đường kính vịng kháng khuẩn loại thảo dược nồng độ dịch ép 100% Ta dễ dàng nhận thấy nồng độ dịch ép 100%, Tỏi có mức kháng khuẩn cao Cỏ mực Gừng có mức kháng khuẩn trung bình Gừng có hiệu lực kháng khuẩn cao Nghệ Cỏ lào có mức kháng khuẩn (sai khác khơng có ý nghĩa thống kê với P ≥ 0,05)) Đồn Chí Thanh nhóm tác giả nghiên cứu khả kháng vi khuẩn Aeromonas sp hợp chất Tỏi + nước, Tỏi + cồn 75% số loại thảo dược khác Và cho kết số loại thảo dược nghiên cứu Tỏi có tính kháng khuẩn cao Tương tự thử nghiệm Nguyễn Anh Tuấn cho thấy dịch chiết từ Tỏi có khả kháng vi khuẩn Aeromonas sp cao số loại thảo dược nghiên cứu [23] Như kết nghiên cứu trước (trên chủng vi khuẩn khác) tương ứng với kết nghiên cứu chúng tơi Điều cho thấy dịch ép từ Tỏi có hiệu lực kháng khuẩn cao nhiều lồi vi khuẩn khác Trong thí nghiệm chúng tơi dịch ép từ Gừng có tác dụng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp mức trung bình nồng độ thảo dược 100% (14,32mm) Cũng theo nghiên cứu Đoàn Chí Thanh nhóm tác giả cho 47 thấy hiệu lực kháng khuẩn Cỏ mực vi khuẩn Aeromonas sp mức (6,8-7,2mm) [20] Còn kết thử nghiệm vi khuẩn Pseudomonas spp cho thấy hiệu lực kháng khuẩn dịch ép Cỏ mực mức trung bình tùy vào nồng độ thảo dược (7,5812,45mm) Như thấy Cỏ mực có hiệu lực kháng khuẩn trung bình vi khuẩn Pseudomonas spp, Streptococcus spp Trong nghiên cứu dịch ép Cỏ lào có tác dụng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp mức Với Nghệ nghiên cứu có tác dụng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp mức (6,62mm) Điều lí giải chất curcumin Nghệ có khả kháng mạnh với số chủng vi khuẩn định Còn vi khuẩn Pseudomonas spp có tính kháng khuẩn yếu 3.3.6.2 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng dịch ép 75% Bảng 3.9 Đường kính vòng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dược nồng độ dịch ép 75% Mức kháng khuẩn (theo Tên thảo Đƣờng kính vịng vơ dƣợc khuẩn (mm) Tỏi 19,15 ± 1,07a Trung bình Cỏ mực 10,05 ± 1,02b Trung bình Gừng 11,34 ± 0,95b Trung bình Nghệ 4,33 ± 1,75c Kém Cỏ lào 3,83 ± 2,08d Kém tiêu chuẩn Bauer – Kirby, 1997) (Các chữ cột khác biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)) 48 Đường kính kháng khuẩn (mm) 25 20 19.15 15 10.05 11.34 10 4.33 3.83 Nghệ Cỏ lào Tỏi Cỏ mực Gừng Các thảo dược Hình 3.16 Đường kính vịng kháng khuẩn loại thảo dược nồng độ dịch ép 75% Ở nồng độ dịch ép 75% Tỏi, Gừng Cỏ mực có mức kháng khuẩn trung bình Tỏi có hiệu lực kháng khuẩn cao so với Gừng Cỏ mực (sai khác có ý nghĩa thống kê với P < 0,05), Cỏ lào Nghệ có mức kháng khuẩn Như nồng độ dịch ép giảm xuống hiệu lực kháng khuẩn loại thảo dược giảm xuống đồng thời 3.3.6.3 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng dịch ép 50% Bảng 3.10 Đường kính vịng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dược nồng độ dịch ép 50% Mức kháng khuẩn (theo Tên thảo Đƣờng kính vịng vơ dƣợc khuẩn (mm) Tỏi 17,89 ± 1,04a Trung bình Cỏ mực 8.37 ± 0.73b Kém Gừng 7,47 ± 0,78b Kém Nghệ 0,59 ± 1,83c Kém Cỏ lào 0,97 ± 1,83c Kém tiêu chuẩn Bauer – Kirby, 1997) (Các chữ cột khác biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)) Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) 49 20 17.89 15 10 7.58 7.47 0.97 0.59 Tỏi Cỏ mực Gừng Nghệ Cỏ lào Các thảo dược Hình 3.17 Đường kính vòng kháng khuẩn loại thảo dược nồng độ dịch ép 50% Ở nồng độ dịch ép 50%, Tỏi có mức kháng khuẩn trung bình, Cỏ mực, Gừng có mức kháng khuẩn kém, Nghệ Cỏ lào gần khơng có khả kháng khuẩn (sai khác khơng có ý nghĩa thống kê (P ≥0,05)) Như nồng độ dịch ép giảm xuống hiệu lực kháng khuẩn loại thảo dược giảm xuống đồng thời 3.3.6.4 Khả kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dƣợc nồng dịch ép 25% Bảng 3.11 Đường kính vịng kháng vi khuẩn Pseudomonas spp loại thảo dược nồng độ dịch ép 25% Mức kháng khuẩn (theo Tên thảo Đƣờng kính vịng vơ dƣợc khuẩn (mm) Tỏi 13,43 ± 1,15a Trung bình Cỏ mực 2,05 ± 0,4b Kém Gừng 2,92 ± 2,6b Kém Nghệ Không Cỏ lào Không tiêu chuẩn Bauer – Kirby, 1997) (Các chữ cột khác biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)) Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) 50 16 14 13.43 12 10 2.05 2.92 0 Tỏi Cỏ mực Gừng Nghệ Cỏ lào Các loại thảo dược Hình 3.18 Đường kính vịng kháng khuẩn loại thảo dược nồng độ dịch ép 25% Ở nồng độ dịch ép 25% Tỏi có mức kháng khuẩn trung bình, Cỏ mực, Gừng có mức kháng khuẩn kém, cịn Nghệ Cỏ lào khơng có khả kháng khuẩn Kết giải thích tương tự kết thí nghiệm 3.4 Nghiên cứu khả kháng khuẩn hỗn hợp thảo dƣợc Tỏi Gừng với tỷ lệ khác Trong trình tiến hành thí nghiệm chúng tơi thử nghiệm kết hợp loại thảo dược với nhiên hợp chất Tỏi Gừng tạo kích thước vịng vơ khuẩn lớn Trên sở thử nghiệm hợp chất Tỏi Gừng tỷ lệ phối trộn khác nhằm tìm cơng thức có khả ngăng tiêu diệt vi khuẩn mạnh Kết thu sau: Bảng 3.12 Khả kháng khuẩn hỗn hợp Tỏi - Gừng Pseudomonas spp Nồng độ pha lỗng Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) 50% :50% 25,16± 0,42 b Mức kháng khuẩn (theo tiêu chuẩn Bauer – Kirby, 1997) Cao 75%: 25% 25,85± 0,54 a Cao 25% : 75% 17,45 ± 0,42 c Trung bình (Ghi chú: Các chữ cột khác biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê (P