Khả năng hòa tan lân và đối kháng với nấm fusarium solani của dòng nấm aspergillus niger h4 7 ở điều kiện phòng thí nghiệm

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 5B (2021): 148-161 DOI:10.22144/ctu.jvn.2021.152 KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN VÀ ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM Fusarium solani CỦA DÒNG NẤM Aspergillus niger H4.7 Ở ĐIỀU KIỆN PHỊNG THÍ NGHIỆM Châu Thị Anh Thy, Đặng Thị Yến Nhung Nguyễn Khởi Nghĩa* Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ *Người chịu trách nhiệm viết: Nguyễn Khởi Nghĩa (email: nknghia@ctu.edu.vn) Thông tin chung: Ngày nhận bài: 27/05/2021 Ngày nhận sửa: 26/06/2021 Ngày duyệt đăng: 29/10/2021 Title: Capacity in phosphorous solubilization and antagonism against the Fusarium solani fungal strain of the fungus Aspergillus niger H4.7 under the laboratory condition Từ khóa: Aspergillus niger, đối kháng, Fusarium solani, lân, nấm hòa tan lân Keywords: Antagonistic, Aspergillus niger, Fusarium solani, phosphorous, phosphorous solubilizing fungi ABSTRACT The main objective of this study was to evaluate the capacity in phosphorous solubilization under a number of different environmental conditions and antagonism against the Fusarium solani fungal strain of the fungus Aspergillus niger H4.7 (H4.7), a well organic material decomposer, isolated from the agricultural soil in Soc Trang province under the laboratory condition The experiments for testing a number of different environmental conditions including pH, NaCl salt concentration and the solubilizing ability toward two insoluble phosphate forms (FePO4 and AlPO4) were carried out in NBRIP liquid culture medium while the antagonistic activity test of the strain H4.7 against the plant pathogenic fungus, Fusarium solani was conducted on PDA medium The results showed that the fungal strain H4.7 gave the best result in phosphate solubilization and in biomass formation under the condition of cultural medium like pH=7 and 0% NaCl Moreover, Ca3(PO4)2 was solubilized the most followed by AlPO4 and FePO4 Besides, results also revealed that the fungal strain H4.7 also had a good function in resisting the plant pathogenic fungus, Fusarium solani causing plant root rot diseases, especially, at days of incubation, the antagonistic performance of the fungal strain H4.7 was achieved at 49.2% TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo sát khả hòa tan lân số điều kiện môi trường khác đối kháng với nấm bệnh Fusarium solani dòng nấm Aspergillus niger H4.7 (H4.7) phân lập từ đất nơng nghiệp tỉnh Sóc Trăng điều kiện phòng thí nghiệm Việc khảo sát khả hịa tan lân điều kiện mơi trường gồm pH, nồng độ muối NaCl dạng lân khó tan khác (FePO4 AlPO4) thực môi trường NBRIP lỏng, thí nghiệm khảo sát khả đối kháng dòng nấm H4.7 với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh hại trồng thực môi trường PDA Kết nghiên cứu cho thấy dịng nấm H4.7 có khả hịa tan lân tốt mơi trường ni cấy có pH=7, khơng bổ sung NaCl hòa tan tốt dạng lân khó tan theo thứ tự Ca3(PO4)2 > FePO4 > AlPO4 Ngồi ra, dịng nấm cịn có khả đối kháng tốt với dòng nấm Fusarium solani, đặc biệt thời điểm ngày sau bố trí với hiệu suất đối kháng đạt 49,2% 148 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 5B (2021): 148-161 tuyển chọn hai dòng nấm Penicillium funiculosum B1 Aspergillus tubingensis B10 hoà tan lân đạt 2.104 mg/L 2.618 mg/L sau ngày thí nghiệm GIỚI THIỆU Lân nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu cần thiết cho sinh trưởng phát triển trồng (Reena et al., 2013) Lân đóng vai trị quan trọng tất tiến trình hoạt động sinh lý, sinh hóa chuyển hóa vật chất như: phân chia tế bào, phát triển hệ thống rễ, sử dụng nguồn carbohydrate, quang hợp, chuyển hóa lượng, sinh tổng hợp tế bào, hô hấp (Khan et al., 2010) Cây trồng hấp thu lân dạng ion hoà tan (Pi) như: HPO42− H2PO4− (Malboobi et al., 2009) Lượng lân dễ tiêu tự nhiên môi trường đất thường thấp, phần lớn dạng đá, khống quặng khó tan (Goldstein, 1994) Khi trồng thiếu lân dẫn đến triệu chứng nhỏ, có màu nâu, thân yếu, dễ bị gãy chậm phát triển (Kannaiyan et al., 2004) Sự tích lũy lân đất hấp phụ lân bề mặt keo đất kết tủa lân với cation đất, đặc biệt với sắt, nhơm calcium Vi sinh vật hịa tan lân có vai trị quan trọng việc khắc phục thiếu lân đất cho trồng hấp thu (Ashrafuzzaman et al., 2009) Dòng nấm Aspergillus niger H4.7 phân lập từ đất nơng nghiệp tỉnh Sóc Trăng sử dụng nghiên cứu có khả hịa tan lân Ca3(PO4)2 mơi trường NBRIP lỏng sau ngày nuôi cấy (NNC) đạt 2.046 mg/L P2O5 Tuy nhiên, khả hòa tan lân dòng nấm số điều kiện môi trường nuôi cấy khác khả đối kháng với dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani dịng nấm chưa khảo sát Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm mục tiêu: (1) Khảo sát số đặc tính sinh lý sinh hóa dịng nấm hịa tan lân Aspergillus niger H4.7 điều kiện phịng thí nghiệm (2) Khảo sát khả đối kháng với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh hại trồng dòng nấm hòa tan lân H4.7 điều kiện phịng thí nghiệm Kết nghiên cứu sở để ứng dụng dịng nấm có khả hịa tan lân vào canh tác nơng nghiệp nhằm sử dụng hiệu tiết kiệm lượng phân bón lân hóa học, đồng thời giúp tăng sinh trưởng suất trồng Trong số vi khuẩn đất có khả hịa tan lân, chi Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium, Enterobacter chi vi khuẩn có khả hòa tan lân mạnh nghiên cứu Ghosh et al (2011), Halder et al (1990), Nguyễn Hữu Hiệp Hà Đức Danh (2009), Sharma et al (2011) Bên cạnh vi khuẩn, nấm có vai trị quan trọng việc hòa tan lân bị cố định đất, nhiên, phụ thuộc nhiều vào tầng đất điều kiện dinh dưỡng (Nahas, 1996) Nấm hòa tan lân đa dạng mặt di truyền, đó, chi nấm Aspergillus, Trichoderma, Fusarium Penicillium chi nấm phổ biến có khả hịa tan lân bị cố định đất (Asea et al., 1988; Flavia et al., 2012) Theo Sudhakara et al (2002), ba dòng nấm phân lập Aspergillus tubingensis hai dòng nấm Aspergillus niger cho kết hịa tan lân có nguồn gốc từ đá phosphate cao Trong đó, dịng nấm Aspergillus tubingensis AT1 có khả hịa tan lân cao đạt 89% ni mơi trường có chứa 2% đá phosphate Ba dịng nấm có tiềm cao việc sử dụng phân bón sinh học phòng trừ sinh học nấm Fusarium oxysporum sản xuất măng tây hữu (Ruangsanka, 2014) Công bố Phạm Thị Ngọc Lan Hoàng Dương Thu Hương (2014) phân lập tuyển chọn hai chủng nấm mốc hịa tan lân vơ từ đất rừng ngập mặn Thừa Thiên Huế định danh Aspergillus oryzae M33 Aspergillus japonicas M72 Nghiên cứu Trần Thị Phương Thu Nguyễn Khởi Nghĩa (2018) phân lập VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Dòng nấm Aspergillus niger H4.7 (H4.7) phân lập từ đất nông nghiệp tỉnh Sóc Trăng (Quách Thị Trúc Ly, 2019) Dịng nấm lưu giữ Phịng thí nghiệm Sinh học Đất, Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ Dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani phân lập bảo quản phịng thí nghiệm Sinh học Đất, Bộ môn Khoa học Đất, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ Môi trường PDA dùng để nuôi cấy nấm Thành phần môi trường PDA L dung dịch gồm: extract potatoes, g; dextrose, 20 g agar, 15 g hòa tan L nước cất sau tiệt trùng 121oC 20 phút Môi trường NBRIP lỏng dùng để đánh giá khả hịa tan lân nấm Thành phần mơi trường NBRIP lỏng L dung dịch gồm: glucose 10 g, Ca3(PO4)2 g, MgSO4 0,25 g, KCl 0,2 g, (NH4)2SO4 0,1 g, MgCl2.6H2O g, hòa tan L nước cất sau tiệt trùng 121oC 20 phút 149 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 5B (2021): 148-161 2.2 Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện môi trường ni cấy khác lên khả hịa tan lân sinh khối dòng nấm H4.7 điều kiện phịng thí nghiệm 2.2.1 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng mức pH môi trường nuôi cấy khác lên khả hòa tan lân dòng nấm H4.7 2.2.2 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nồng độ muối NaCl khác môi trường nuôi cấy lên khả hòa tan lân dòng nấm H4.7 − Mục tiêu: Nhằm tìm nồng độ muối NaCl thích hợp mơi trường ni cấy mà dịng nấm H4.7 có khả hịa tan lân tốt mơi trường ni cấy lỏng điều kiện phịng thí nghiệm đồng thời đánh giá xem ngưỡng chịu mặn dịng nấm nấm H4.7 Bên cạnh đó, nghiên cứu hướng đến việc ứng dụng dòng nấm H4.7 canh tác trồng đất nhiễm mặn nhằm giúp cung cấp lượng lân hữu dụng vốn bị bất động đất cho trồng sinh trưởng phát triển tốt − Mục tiêu: Nhằm tìm mức pH mơi trường ni cấy phù hợp để giúp dịng nấm H4.7 hịa tan lân tốt mơi trường ni cấy lỏng điều kiện phịng thí nghiệm − * Chuẩn bị nguồn nấm: Trước tiến hành bố trí thí nghiệm, dịng nấm H4.7 ni cấy mơi trường PDA ngày điều kiện phịng thí nghiệm để dịng nấm gia tăng sinh khối hệ sợi nấm để chuẩn bị nguồn cho thí nghiệm (a) − Chuẩn bị nguồn nấm: Tương tự mục a − Bố trí thí nghiệm: Tồn qui trình cách bố trí thí nghiệm thực tương tự thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy lên khả hịa tan lân dịng nấm H4.7 mục 2.2.1 Tuy nhiên, mơi trường NBRIP lỏng thí nghiệm có bổ sung nồng độ NaCl khác nhau: 0, 1, 10% pH môi trường NBRIP nuôi cấy hiệu chỉnh dựa vào kết thí nghiệm đánh giá pH mơi trường mục 2.2.1 Mỗi nghiệm thức có lặp lại tương ứng với bình tam giác Hàm lượng lân hịa tan mơi trường ni cấy xác định sau 1, 3, 5, 7, 10 12 ngày bố trí thí nghiệm Phương pháp phân tích hàm lượng lân hịa tan mơi trường ni cấy lỏng phương pháp màu Molybdate phương pháp xác định sinh khối khô nấm thực mục 2.2.1 2.2.3 Thí nghiệm đánh giá khả hòa tan hai dạng lân khó tan khác (FePO4 AlPO4) dịng nấm H4.7 mơi trường ni cấy lỏng điều kiện phòng thí nghiệm − Bố trí thí nghiệm: Dùng pasteur pipet có đường kính 0,6 cm tiệt trùng để cắt khối agar có sợi nấm phát triển tốt chuẩn bị sẵn mục a cho khối agar chứa nấm vào bình tam giác 100 mL chứa sẵn 50 mL môi trường NBRIP lỏng khử trùng hiệu chỉnh mức pH môi trường nuôi cấy khác tương ứng với nghiệm thức thí nghiệm gồm: 3, 5, Mỗi nghiệm thức có lặp lại tương ứng với bình tam giác Nghiệm thức đối chứng tương ứng với mức pH môi trường khác thực tương tự không chủng nấm vào Các bình tam giác đặt máy lắc trịn với tốc độ 120 vịng/phút điều kiện mơi trường phịng thí nghiệm Hàm lượng lân hịa tan môi trường nuôi cấy xác định sau 1, 3, 5, 7, 10 12 ngày bố trí thí nghiệm Phân tích lân hịa tan mơi trường ni cấy lỏng phương pháp màu Molybdate (Murphy & Riley, 1962; Novozamsky et al., 1984) Mẫu đo máy so màu quang phổ (Spectrometer Thermo Scientific, Multiskan Spectrum) bước sóng 880 nm Đồng thời, sinh khối nấm thu nhận thời điểm 12 ngày bố trí thí nghiệm Xác định sinh khối khơ nấm bình tam giác ni cấy lỏng phương pháp cân trọng lượng khơ: Tồn mơi trường ni cấy lỏng gồm sinh khối nấm cho qua phểu thủy tinh có chứa giấy lọc đặt lên phểu đặt beaker Để khô tự nhiên 10 phút, sau đặt giấy lọc chứa sinh khối nấm vào tủ sấy nhiệt độ 105oC 24 để xác định sinh khối khô nấm − Mục tiêu: Nhằm đánh giá khả hòa tan lân có nguồn gốc từ lân khó tan FePO4 AlPO4 mơi trường ni cấy lỏng điều kiện phịng thí nghiệm dịng nấm H4.7 Nghiên cứu sử dụng hai nguồn lân khó tan FePO4 AlPO4 lân bị liên kết với Fe Al đất phổ biến khu vực Đồng sông Cửu Long, đặc biệt vùng đất phèn Vì vậy, việc sử dụng dịng nấm H4.7 có khả hịa tan lân khó tan bị cố định lượng Fe Al đất phèn có ý nghĩa quan trọng việc giúp trồng vượt qua bất lợi thiếu hụt lân 150 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 5B (2021): 148-161 đối kháng (%) dòng nấm H4.7 theo cơng thức 2.1 Thí nghiệm thực với lần lặp lại cho nghiệm thức lặp lại tương ứng với đĩa petri Nghiệm thức đối chứng chứa dòng nấm H4.7 dòng nấm Fusarium solani − Chuẩn bị nguồn nấm: Tương tự mục a − Bố trí thí nghiệm: Toàn qui trình cách bố trí thí nghiệm thực tương tự thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy lên khả hịa tan lân dòng nấm H4.7 mục 2.2.1 Tuy nhiên, mơi trường NBRIP lỏng thí nghiệm bố trí với ba dạng lân khác nhau: Ca3(PO4)2, FePO4 AlPO4 (môi trường NBRIP lỏng bổ sung 0,5% nguồn lân khó tan) Mơi trường NBRIP lỏng chứa ba dạng lân khác hiệu chỉnh dựa vào kết thí nghiệm đánh giá pH mục 2.2.1 nồng độ muối NaCl mục 2.2.2 Mỗi nghiệm thức có lặp lại tương ứng với bình tam giác Hàm lượng lân hịa tan mơi trường ni cấy xác định sau 1, 3, 5, 7, 10 12 ngày bố trí thí nghiệm Phương pháp phân tích hàm lượng lân hịa tan mơi trường ni cấy lỏng phương pháp màu Molybdate phương pháp xác định sinh khối khô nấm thực mục 2.2.1 2.3 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ cam sành dòng nấm hòa tan lân H4.7 điều kiện phịng thí nghiệm 2.3.1 Chuẩn bị nguồn nấm Hiệu suất đối kháng nấm (Percent inhibition - PI) tính theo cơng thức sau: PI (%) = (R - r)/R x 100 (2.1) Trong đó: nấm (%) PI: Hiệu suất đối kháng dòng R: Bán kính tản nấm dịng nấm gây bệnh nghiệm thức đối chứng (mm) r: Bán kính tản nấm dịng nấm gây bệnh nghiệm thức thí nghiệm (mm) Trước tiến hành bố trí thí nghiệm, hai dịng nấm H4.7 dịng nấm Fusarium solani ni cấy trước đĩa petri chứa môi trường PDA ngày điều kiện phịng thí nghiệm để hai dòng nấm gia tăng sinh khối hệ sợi nấm để chuẩn bị nguồn cho thí nghiệm 2.3.2 Bố trí thí nghiệm Hình Sơ đồ bố trí khảo sát khả đối kháng dòng nấm H4.7 với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ trồng môi trường PDA Việc khảo sát khả đối kháng với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ trồng thực theo phương pháp Komy et al (2015) Cách thực sau: Trước tiên, dùng bút lông chia đĩa môi trường làm phần nhau; tiếp đó, dùng pasteur pitette tiệt trùng có đường kính 0,6 cm để cắt khối agar chứa hệ sợi hai dòng nấm H4.7 dòng nấm Fusarium solani gây bệnh trồng phát triển tốt chuẩn bị sẵn, đặt hai khối agar chứa hai dịng nấm vào vị trí 1/3 thứ vào vị trí 1/3 thứ hai đĩa petri chứa môi trường ni cấy PDA (Hình 1); sau cùng, dán parafilm bên đĩa petri chứa nấm đặt vào tủ ủ cho nấm phát triển ngày Sự phát triển dòng nấm Fusarium solani gây bệnh trồng đĩa petri đo bán kính tản nấm sau: 1, 3, ngày sau nuôi cấy nghiệm thức thí nghiệm nghiệm thức đối chứng Tính hiệu suất 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thí nghiệm tổng hợp, tính toán phần mềm Microsoft Excel kiểm định thống kê ANOVA phần mềm Minitab 16.2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng số điều kiện môi trường nuôi cấy khác lên khả hòa tan lân sinh khối dòng nấm H4.7 điều kiện phịng thí nghiệm 3.1.1 Ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy a Khả hịa tan lân Kết khảo sát khả hòa tan lân dịng nấm Aspergillus niger H4.7 mơi trường NBRIP lỏng mức pH khác sau 12 NNC 151 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 57, Số 5B (2021): 148-161 cùng, nghiệm thức pH=3 pH=9 có hàm lượng lân hịa tan đạt 2.031 mg/L P2O5 2.049 mg/L P2O5 Ở thời điểm 10 NNC, nghiệm thức pH=7 nghiệm thức có hàm lượng lân hòa tan cao đạt 2.674 mg/L P2O5, cao khác biệt ý nghĩa thống kê (p0,05) Tại thời điểm 12 NNC, hàm lượng lân hòa tan nghiệm thức có xu hướng giảm dần Cụ thể, hàm lượng lân hòa tan nghiệm thức pH=7 đạt 2.486 mg/L P2O5 cao khác biệt ý nghĩa thống kê (p