0335NGHIÊN CỨU TÓI ƯU HÓA QUY TRÌNH THỦY PHÂN CÁ TẠP ĐẺ SẲN XUẤT CHẺ PHÁM SINH HỌC SỬ DỰNG LÀM THỨC ĂN CHO CÁ LÓC BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

ng m c (bên trái) và b m t đáp ng (bên ph i) c a t ng c p y u

Tình hình nuôi cá lóc t i Vi t Nam

1.1.1 Gi i thi u cá lóc Channa striata

Theo phân loại học, họ cá lóc (Channidae) bao gồm hai chi chính là Parachanna và Channa Chi Channa có 27 loài, phân bố chủ yếu ở các nước Châu Á, trong khi chi Parachanna chỉ có 3 loài và chủ yếu tập trung ở khu vực Châu Phi Trong họ Channidae, tại Việt Nam có 4 loài cá lóc đáng chú ý: Channa gachua (cá chành dừa), Channa lucius (cá dày), Channa striata (cá lóc đen) và Channa micropeltes (cá lóc bông).

Cá lóc đen và cá lóc bông là hai loài cá lóc chính được nuôi tại BSCL Trong đó, cá lóc đen được nuôi phổ biến hơn so với cá lóc bông.

Vì v y, cá lóc đen đ c ch n làm đ i t ng nghiên c u chính c a đ tài (Lê Xuân Sinh và Minh Chung, 2009)

1.1.1.2 Phân lo i cá lóc đen

Theo d li u c a NCBI, cá lóc đen có tên ti ng Anh là Snakehead murrel, m t s tên khác là Ophiocephalus striatus, Ophiocephalus vagus, Snakehead fish và có phân lo i:

H : Channidae Chi: Channa Loài: Channa striata

Hình 1.1 Cá lóc đen Channa striata (Bloch, 1793)

Trên th gi i: chúng tìm th y các khu v c nhi t đ i châu Á tr i dài t Pakistan đ n mi n nam Trung Qu c, đ c bi t là Trung Qu c, Tri u Tiên, Sri Lanka, Vi t Nam

T i Vi t Nam: cá lóc đen phân b trên c ba mi n (S Nông nghi p và Phát tri n nông thôn t nh Th a Thiên Hu , 2011)

Cá có hình dạng thuôn dài, đầu dẹp và đuôi tròn So với thân, tỉ lệ đầu ngắn và dài giống như đầu rắn, gãy khúc, miệng có răng, và vây lưng Vây lưng có 40 – 46 vây, vây hậu môn có 28 – 30 tia vây, và vây đuôi bên có 41 – 55 cái Màu sắc của cá là nâu xám xen lẫn với những chấm màu xám nhạt Lưng và hai bên hông có màu đen ánh nâu với những đốm đen và màu vàng trắng Lưng mang dạng hình núm Thực quản ngắn, vách dày, bên trong thực quản có nhiều nếp nhăn Dạ dày to hình chữ Y (Dũng Nhật Long, 2003)

Cá lóc là loài cá sống trong môi trường nước ngọt, có khả năng thích nghi tốt với các điều kiện sống khác nhau Chúng thường sinh sống ở độ sâu từ 0 đến 30 mét trong các sông, suối, ao, hồ, và các vùng ngập lụt, cũng như trong các ao nuôi nhân tạo Cá lóc thích hợp với vùng nước có pH từ 7 đến 8, độ mặn 20, và nhiệt độ từ 23 đến 27 độ C Chúng thường tìm thấy trong các ao hồ có nhiều rong và nước đục, và có khả năng sống trong môi trường nước thiếu oxy.

Cá lóc có khả năng thích nghi cao với môi trường xung quanh, cho phép chúng hô hấp bằng cách hấp thụ oxy từ không khí Chúng có thể sống lâu trong điều kiện khô hạn nhờ vào khả năng thở qua da và mang, giúp chúng tồn tại trong thời gian dài mà không cần nước.

Cá thường sống ở những vùng nước có rong, cỏ, và đám bèo, nơi chúng dễ dàng rình mồi Vào mùa hè, cá hoạt động mạnh mẽ và bắt mồi liên tục, trong khi mùa đông, chúng thường hoạt động chậm lại và di chuyển xuống vùng nước sâu hơn.

Cá lóc di cư từ sông Mekong vào các vùng nước xung quanh, xâm nhập vào vùng ngập lụt theo mùa và trú ẩn khi mùa khô đến Chúng sống sót qua mùa khô bằng cách chôn mình vào bùn đáy hầm, kênh và đầm lầy, giúp tiết kiệm năng lượng và tiêu thụ chất béo dự trữ trong cơ thể.

Cá là loài động vật có xương sống, sống ở môi trường nước và có hình dạng đa dạng Chế độ ăn của cá chủ yếu bao gồm các loại thực phẩm như cá nhỏ, tôm, ếch nhái, rắn, côn trùng, giun đất, nòng nọc và động vật giáp xác Theo nghiên cứu của Dũng Nhật Long (2003), thành phần thức ăn của cá được phân tích cho thấy cá chiếm 63,01%, tép 35,94%, ếch nhái 1,03%, và 0,02% là bọ, côn trùng và mùn bã hữu cơ.

Theo D ng Nh t Long (2003), cá t ng tr ng t ng đ i nhanh, khi nhi t đ trên 20 O C t ngtr ng nhanh, d i 15 O C t ngtr ng ch m Con l n nh t n ng đ n

5 kg Tr ng l ng trung bình theo tu i (con đ c và cái chênh l ch l n):

• Cá 1 tu i thân dài 19 – 39 cm n ng 95 – 760 g

• Cá 2 tu i thân dài 38,5 – 40 cm, n ng 625 – 1.395 g

• Cá 3 tu i thân dài 45 – 59 cm, n ng 1.467 – 2.031 g

Theo S NN & PTNT t nh Th a Thiên Hu , giai đo n nh , cá t ng ch y u v chi u dài Cá càng l n thì s t ng tr ng càng nhanh

• Trong t nhiên, s c l n c a cá không đ u, ph thu c vào th c n s n có trong th y v c, do v y t l s ng trong t nhiên c a cá th p

• Trong ao nuôi, có th c n đ y đ và ch m sóc t t thì t l s ng c a cá cao và đ t tr ng l ng trung bình 0,5 – 0,8 kg/con sau 6 – 8 tháng

Cá lóc thường sinh sản từ tháng 4 đến tháng 8, với đỉnh điểm vào tháng 4 và 5 Cá thường đẻ vào sáng sớm sau những trận mưa rào kéo dài hai ngày Nhiệt độ lý tưởng cho cá lóc sinh sản là từ 20 đến 35 độ C Sau ba ngày, cá bột sẽ phát triển và sau ba ngày tiếp theo, cá sẽ tiêu hủy noãn hoàng và bắt đầu ăn thức ăn bên ngoài, với luân trùng Brachionus plicatilis là thức ăn đầu tiên Ngoài ra, có thể cho cá bột ăn men, lòng đỏ trứng hoặc thức ăn tổng hợp dạng bột Giai đoạn tiếp theo, cá cần ăn Moina, Daphnia, trùng chỉ hoặc ấu trùng muỗi Giai đoạn cá giống, sâu gạo và dòi là thức ăn ưa thích của cá Một số thí nghiệm cho thấy cá có khả năng sử dụng thức ăn tự nhiên kết hợp với đạm động vật Thức ăn tự nhiên rất cần thiết cho cá bột trong ba tuần đầu Rhizopus arrhizus hay đạm động vật (125 m) được sản xuất từ kỹ thuật lên men sử dụng dầu làm nguồn carbon chính Giai đoạn cá lóc thường diễn ra vào mùa xuân - hè.

1.1.2 L ch s ngh nuôi cá lóc

Nghề nuôi cá lóc trong ao và lồng bè đã trở nên phổ biến tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long (BSCL) từ những năm 1960, đặc biệt tại huyện Châu Thành (An Giang) và huyện Hồng Ngự (Đồng Tháp) Bắt đầu từ mùa lũ, người dân đã tận dụng nguồn thức ăn tự nhiên từ cá và động vật hoang dã để nuôi cá lóc Hiện nay, cá lóc được nuôi theo nhiều hình thức như bán thâm canh, thâm canh và trong các ao đất, lồng bè, hoặc trên ruộng lúa Sản phẩm cá lóc nuôi đã trở thành nguồn thực phẩm thay thế cho cá lóc tự nhiên, do nguồn cá lóc tự nhiên ngày càng giảm Từ năm 1990 đến nay, nghề nuôi cá lóc đen đã phát triển mạnh mẽ, với sản lượng cá lóc nuôi ở vùng BSCL đạt khoảng 40.000 tấn vào năm 2009, tăng 1.000 tấn so với năm 2008, trong đó cá lóc đen chiếm gần 80%.

Ngành nuôi cá lóc tại Hậu Giang đang phát triển mạnh mẽ, với dự kiến năm 2013 toàn tỉnh có khoảng 5 ha nuôi cá lóc theo hình thức thâm canh trong ao và nuôi vèo, sản lượng ước đạt 90.810 tấn Trong đó, sản lượng khai thác là 2.910 tấn và sản lượng nuôi trồng đạt 87.900 tấn (SNN & PTNT Hậu Giang, 2013)

Các v n đ hi n nay

Nghề nuôi cá lóc đang phát triển mạnh mẽ tại Bạc Liêu, với nguồn thức ăn tự nhiên cho cá được cung cấp đầy đủ Tuy nhiên, sự phát triển này cũng gây lo ngại cho người nuôi cá lóc do ảnh hưởng đến các loài thủy sản khác Để thu được 1 kg cá lóc, người nuôi cần tiêu tốn từ 4 đến 4,5 kg thức ăn Với sản lượng cá lóc nuôi trong vùng khoảng 30.000 tấn/năm, cần sử dụng từ 50.000 tấn đến 75.000 tấn thức ăn bổ sung, trong khi tổng sản lượng khai thác nội địa chỉ chiếm khoảng 30%.

12% s n l ng khai thác h i s n h ng n m c a BSCL ó th t s là v n đ l n đáng lo ng i đ i v i ngu n l i th y s n và an ninh th c ph m cho c ng đ ng (H u c, 2011)

1.2.2 V n đ c a ngu n th c n công nghi p kh c ph c tình tr ng thi u ngu n th c n t nhiên, ng i dân đã chuy n sang ngu n th c n công nghi p d i dào và n đ nh Nh ng cá lóc nuôi b ng th c n công nghi p có s c đ kháng kém h n và xu t hi n nhi u d t t Khi nuôi b ng th c n công nghi p, l i x y ra hi n t ng cá lóc b gù l ng do ngu n th c n thi u khoáng ch t, ngu n n c b ô nhi m Th c tr ng trên đã làm nhi u h nuôi cá lóc ph i b ngh vì thua l (Nguy n Kim Ki u, 2012)

Trong ngành nuôi cá lóc, nông dân thường lựa chọn thức ăn công nghiệp có hàm lượng đạm từ 40% trở lên để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cá Theo kinh nghiệm của nông dân An Giang, việc sử dụng thức ăn viên công nghiệp có hàm lượng đạm cao giúp cải thiện hiệu quả nuôi cá lóc trong giai đoạn tăng trưởng.

Hàm lượng đạm trong thức ăn cho cá lóc cần đạt khoảng 40% để đảm bảo sinh trưởng và phát triển tốt trong giai đoạn 3-4 tháng tuổi Mặc dù loại thức ăn có hàm lượng đạm cao thường có giá thành cao hơn, nhưng điều này giúp cải thiện hiệu quả kinh tế Tuy nhiên, theo anh Huỳnh Thanh Như, cá lóc nuôi bằng thức ăn công nghiệp vẫn có thể thiếu một số khoáng chất và vitamin thiết yếu, đặc biệt là vitamin.

C N u cung c p đ y đ khoáng ch t và vitamin C cho cá thì hi n t ng gù l ng trong t ng đàn là không đáng k (Ng c Di p, 2011)

Cá lóc là loài cá sẵn có trong tự nhiên, nhưng khi chuyển sang sản xuất công nghiệp, chúng cần trải qua quá trình thay đổi để giảm kích thước và dễ tiêu thụ hơn Để đạt được điều này, cần thiết phải chuyển cá lóc từ dạng tươi sống sang dạng viên phù hợp với nhu cầu thị trường.

Tác đ ng c a các ho t đ ng kinh t và xã h i làm ô nhi m ngu n n c c a ngành thu s n:

Môi trường nông thôn đang đối mặt với tình trạng suy thoái và ô nhiễm nghiêm trọng do điều kiện vệ sinh kém, việc sử dụng quá nhiều thuốc trừ sâu, và cơ sở hạ tầng yếu kém Các hóa chất này theo hệ thống kênh mương và dòng sông, gây nguy hại cho môi trường và sinh vật Hoạt động công nghiệp cũng góp phần ô nhiễm nguồn nước, ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản và sự sống của các loài sinh vật Nghiên cứu gần đây của Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 cho thấy hàm lượng ô nhiễm trong nước đang ở mức báo động.

BOD, COD, NO 2 trong n c c a nh ng thu v c đ u cao h n tiêu chu n cho phép đ i v i đ i s ng thu sinh v t (Tr nh Ng c Tu n, 2005)

Hiện nay, có rất nhiều loại sản phẩm thuốc, hóa chất và chất phụ gia sinh học được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản trên thế giới Những hóa chất này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe động vật thủy sản khi sử dụng đúng cách Tuy nhiên, việc lạm dụng chúng có thể dẫn đến những hậu quả khôn lường, gây rủi ro cho người lao động, tồn dư các chất độc hại trong sản phẩm thủy sản, làm giảm giá trị thương phẩm và tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc, làm giảm hiệu quả trong điều trị bệnh.

Thành phần lấp bùn trong các đầm, ao nuôi trồng thủy sản chủ yếu bao gồm các chất hữu cơ như protein, lipid, axit béo với công thức chung CH3(CH2)nCOOH, phospholipid, sterol, vitamin D3, hormone, carbohydrate, khoáng chất và vitamin, cùng với xác động vật như tôm.

L p bùn này luôn trong tình tr ng ng p n c, y m khí, các vi sinh v t y m khí phát tri n m nh phân hu các h p ch t trên t o thành các s n ph m là hydrosulphua

H 2 S (hydrosulfide) và NH 3 (amoniac) là những khí có thể gây hại cho sinh vật thủy sinh Nồng độ 1,3 ppm của H 2 S có thể dẫn đến tình trạng tê liệt và thậm chí gây chết tôm Amoniac cũng được sinh ra từ quá trình phân hủy hữu cơ, gây ảnh hưởng trực tiếp đến tôm cá, làm giảm pH của nước và kìm hãm sự phát triển của thực vật phù du (Trịnh Ngọc Tuấn, 2005)

Tóm l i, theo Tr nh Ng c Tu n (2005) các ch t ô nhi m ch y u trong n c th i NTTS bao g m:

• Cacbon h u c (g m th c n, phân bón, ch ph m sinh h c )

• Nit đ c phân hu t các protein

• Phospho phân hu t các protein

Nghiên cứu của Lê Xuân Sinh và Minh Chung (2009) cho thấy tỷ lệ ký sinh trùng trên cá lóc nuôi đạt 85,9%, trong đó bệnh xuất huyết chiếm 55,9% và một số bệnh khác như bệnh tự nhiên 11,8%, bệnh trong mang 8,5%, và bệnh gan thận 7,8%.

Còn theo k t qu kh o sát c a Ph m Minh c và c ng s (2012) có 4 m m b nh vi n m nhi m trên cá lóc nuôi thâm canh là Acremonium (35,7%), Geotrichum

(28,6%), Achlya (21,4%), Fusarium (14,3%) K t qu kh o sát m m b nh vi khu n xác đ nh đ c 4 gi ng v i t n su t xu t hi n c a các gi ng vi khu n Aeromonas, Edwardsiella, Streptococcus và Pseudomonas l n l t là 54,3%, 17,3%, 14,8% và 13,6%

Theo Nguy n Quang Minh (2013) thì b nh cá do nh ng nguyên nhân sau:

Nhiệt độ nước thay đổi từ tháng 12 đến tháng 2, có thể xuống thấp đến 25 – 27 độ C, và tăng cao từ tháng 3 đến tháng 5 hàng năm, đạt mức 30 – 35 độ C Sự biến đổi này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của sinh vật gây bệnh trên cá, dẫn đến tình trạng cá bị bệnh và suy yếu.

- N c ao kém ch t l ng do qu n lý không đúng k thu t ho c ngu n n c c p b ô nhi m hoá ch t đ c, vi khu n, virus

Chất lượng thực phẩm kém, bao gồm thực phẩm công nghiệp và thực phẩm tươi sống, không đảm bảo dinh dưỡng cho sức khỏe con người, tạo điều kiện cho các tác nhân gây bệnh phát triển Điều này dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng và ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng.

 Thi u c n th n khi ch m sóc cá

Các dụng cụ sử dụng trong nuôi trồng thủy sản cần được vệ sinh thường xuyên để đảm bảo an toàn cho môi trường sống của cá Việc di chuyển, bắt cá hay sử dụng thùng chứa có thể gây ra xây xát cho cá trong quá trình thao tác, dẫn đến nguy cơ xâm nhập vi khuẩn và các yếu tố gây hại cho cá nuôi.

 Ngu n gi ng th kém ch t l ng

Cá có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong quá trình nuôi, nhưng chưa được kiểm tra chất lượng từ các cơ quan chuyên môn Việc con vật mang sẵn mầm bệnh mà chưa được xử lý triệt để có thể dẫn đến những thay đổi tiêu cực trong sức khỏe của cá Do đó, việc kiểm tra và xử lý các vấn đề về dịch bệnh là rất quan trọng để đảm bảo sự phát triển bền vững của cá trong môi trường nuôi.

Các ph ng pháp gi i quy t

Nguồn thức ăn tự nhiên cho cá lóc ngày càng khan hiếm, dẫn đến việc khai thác quá mức nguồn tài nguyên này, khiến thức ăn công nghiệp trở thành nguồn dinh dưỡng chính cho cá lóc Tuy nhiên, do những hạn chế của thức ăn công nghiệp, cần bổ sung một loại chất phụ gia để nuôi cá lóc hiệu quả và kinh tế Chất phụ gia này sẽ cung cấp dinh dưỡng, khoáng chất, kích thích sự phát triển và cải thiện môi trường ao nuôi, đồng thời tăng sức đề kháng cho cá.

Nghiên cứu cho thấy các axit amin như taurine, glycine, methionine, glutamine và leucine có tác dụng kích thích quá trình chuyển hóa ở tôm và cá Những axit amin này ảnh hưởng đến các cơ quan cảm giác của tôm, cá, từ đó thúc đẩy sự chuyển hóa (Trần Thế Bé, 2011)

Dịch cá thải phân được sử dụng phổ biến trong chế biến thực phẩm, giúp kích thích sự phát triển của tôm cá Sản phẩm này có màu vàng nâu, chứa nhiều axit amin và peptide, do đó được xem là chất dinh dưỡng quý giá Việc bổ sung dịch cá thải phân vào chế độ ăn giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng cho tôm cá.

1,5% vào th c n c a cá lóc Channa striata có th thay th đ m b t đ u nành cho đ m b t cá trong công th c th c n t ng thêm 20% (Tr n Th Thanh Hi n, 2010)

Bột nhuyễn thể và bột gan mực chứa nhiều axit amin, giúp tăng cường dinh dưỡng cho tôm cá Trong sản xuất thức ăn tôm, bột nhuyễn thể và bột gan mực được sử dụng với tỷ lệ 3 – 5%, nhằm kích thích sự phát triển của tôm (Lê Thanh Hùng, 2008).

Tóm lại, các kết quả nghiên cứu cho thấy vai trò của chất dinh dưỡng có ý nghĩa quan trọng trong nuôi trồng thủy sản Những chất này kích thích cho tôm, cá bắt mồi và sử dụng thức ăn tốt hơn, từ đó tăng trưởng của tôm, cá đạt hiệu quả cao, mang lại lợi ích kinh tế cho người nuôi.

Các loại chất dinh dưỡng này được sản xuất theo phương pháp cổ điển, sử dụng biện pháp vật lý, hóa học hoặc enzym protease để thay phân nguồn nguyên liệu giàu đạm Mặc dù đáp ứng được yêu cầu dinh dưỡng, khoáng chất và kích thích sự phát triển của tôm cá, nhưng vẫn chưa giải quyết triệt để vấn đề môi trường ao nuôi và bệnh cá Hơn nữa, các phương pháp chế biến này khá tốn kém nên giá thành còn cao Trong khi đó, probiotic có thể giải quyết tốt các vấn đề của ngành nuôi trồng thủy sản hiện nay với những lợi ích vượt trội, hiệu quả kinh tế, thân thiện với sức khỏe con người và môi trường.

Probiotic, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là "cho sự sống" Lilley và Stillwell (1965) đã sử dụng thuật ngữ này để mô tả những chất được sản xuất bởi một sinh vật nào đó, có tác dụng kích thích sự tăng trưởng cho một sinh vật khác.

Vào năm 1974, Paker đã định nghĩa probiotic là các sinh vật và hợp chất góp phần vào sự cân bằng vi sinh học trong hệ tiêu hóa Đến năm 1989, Fuller đã chỉnh sửa và định nghĩa lại probiotic là sự bổ sung một loại thực phẩm vi sinh vật sống có tác động tích cực đến vật chủ thông qua việc cải thiện sự cân bằng vi sinh học trong đường ruột của vật chủ Mục đích của việc áp dụng probiotic là nhằm thiết lập lại mối quan hệ hài hòa giữa các vi sinh vật có lợi và các chủng vi sinh vật trong đường ruột.

M probiotics hiệu quả cần có khả năng tồn tại và hoạt động trong một môi trường đa dạng với nhiều hình thức khác nhau Theo Fuller (1989), để đạt được điều này, probiotics phải sở hữu những khả năng nhất định.

 Là m t s n ph m s ng quy mô k ngh

 T o ra tác d ng có l i trên v t ch

 Có kh n ng t n t i và phát tri n trong môi tr ng ru t c a v t ch

 Duy trì n đ nh và t n t i lâu dài đ đ c s d ng sau này trong đi u ki n l u tr và đi u ki n ngoài hi n tr ng

1.3.2.2 Vai trò c a probiotic trong nuôi tr ng th y s n

 Vai trò c i thi n ch t l ng n c trong nuôi tr ng th y s n

Probiotic giúp c i thi n ch t l ng n c trong ao nuôi th y s n, nh kh n ng tham gia chuy n hóa các ch t h u c trong ao c a các vi khu n trong probiotic

Nghiên cứu cho thấy chất lượng nước được cải thiện khi bổ sung probiotic, đặc biệt là Bacillus sp., do vi khuẩn này có hiệu quả cao trong việc chuyển đổi các chất hữu cơ thành CO2 so với vi khuẩn Gram âm Bacillus sp cũng giúp cân bằng sinh học NH3/NO2/NO3, hoạt tính này thuộc nhóm vi khuẩn nitrat hóa.

 Vai trò t ng s c đ kháng, gi m b nh

Theo Phạm Văn Tý và cộng sự (2009), việc sử dụng probiotic có thể gia tăng chất lượng sinh vật làm thực ăn và cải thiện mức dinh dưỡng của các loài thủy sản nuôi Probiotic được định nghĩa là việc bổ sung vi khuẩn sống vào ao nuôi, giúp cải thiện thành phần vi sinh vật trong nước và đáy ao, từ đó nâng cao chất lượng nước Các tác động của probiotic rất quan trọng đối với nuôi trồng thủy sản.

• S n sinh ra các ch t c ch

• C nh tranh hóa ch t / n ng l ng v i nh ng vi khu n khác

• C nh tranh v trí bám dính v i vi khu n có h i

• T ng c ng đáp ng mi n d ch

Probiotic có vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe của vật nuôi thông qua việc cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột Chúng hỗ trợ tiêu hóa và giúp giảm sự tích tụ chất độc, đồng thời tăng cường hiệu quả của kháng sinh trong việc phòng và điều trị bệnh cho tôm cá nuôi (Phạm Văn Tý và cộng sự, 2009)

Hằng ngày, các đầu mối thủy sản và các công ty chế biến thủy sản sản xuất nhiều loại phẩm cá như đầu, vây, đuôi, và nội tạng Tuy nhiên, cũng có nhiều loại cá tạp kém phẩm chất không đạt tiêu chuẩn làm thực phẩm an toàn cho người tiêu dùng.

Trong quá trình chế biến cá tra phi lê xuất khẩu, lượng phẩm gốc thực tế chiếm khoảng 62,7% tổng khối lượng cá nguyên liệu Cụ thể, đầu xương chiếm 23,1%, da 10,9%, phần thịt 10,4%, và mỡ 8%.

Các nhà máy tại BSCL sản xuất hàng ngày khoảng 710 tấn sản phẩm, trong đó 53% được chế biến thành thức ăn chăn nuôi, 42% được sử dụng để chế biến và 5% làm thực phẩm cho con người Cá basa có hàm lượng béo từ 10 – 33% EE và chứa nhiều canxi.

(4 – 13% Ca), hàm l ng protein thay đ i theo nguyên li u (Nguyen Thi Thuy và c ng s , 2007)

Bacillus

Theo khóa phân lo i c a Bergey (Holt, 2000), Bacillus thu c:

Hình 1.2 Bacillus d i kính hi n vi đi n t (Kim và c ng s , 2009)

VC (vegetative cell): t bào sinh d ng

SC (spore coat): áo bào t

Bacillus là nhóm vi khuẩn Gram dương, catalase dương tính, thường xuất hiện trong môi trường có pH biến động cao và có khả năng sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí Thuộc họ Bacillaceae, chúng có thể tồn tại dưới dạng chuỗi hoặc xếp thành cụm Bacillus có khả năng tạo ra bào tử khi gặp điều kiện khắc nghiệt như thiếu dinh dưỡng hoặc nhiệt độ cao, bào tử này có hình oval và có xu hướng phình ra ở một đầu Chúng có tính kháng nhiệt, kháng hóa chất và kháng áp suất cao Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử phát triển thành tế bào sinh dưỡng Qua kính hiển vi, Bacillus có hình dạng giống như những chiếc que, thường được quan sát thấy trong các cụm lớn và đang phát triển mạnh mẽ Một đặc điểm nổi bật của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc) cấu tạo từ polypeptit, giúp vi khuẩn bảo vệ và sinh tồn trong môi trường khắc nghiệt.

Bacillus có kh n ng ch u đ c các đi u ki n kh c nghi t là do bao nh y có kh n ng d tr th c n và b o v vi khu n tránh b t n th ng khi g p khô h n (Tr n

Th Thu Hi n, 2010; Nguy n V n Hi u, 2012)

Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn được Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên vào năm 1872 Loại vi khuẩn này thường phân bố rộng rãi trong đất, nổi bật với khả năng chịu khô, do đó còn được gọi là vi khuẩn chịu khô (Nguyễn Lân Đăng, 1983)

Vi khuẩn Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng hình thành bào tử và tạo thành chuỗi dài hoặc tồn tại dưới dạng các tế bào riêng lẻ Kích thước của vi khuẩn này dao động từ 0,6 đến 0,8 micromet (3 – 5 micromet).

Khu vực nấm lục khô có màu sắc nhạt, thường là màu xám trắng hoặc màu vàng nhạt, tạo thành một lớp màng mịn trên bề mặt thạch Chúng có thể có mép nhẵn hoặc mép lồi lõm, bám chặt vào môi trường xung quanh.

Bacillus subtilis có l p màng nhày giúp vi khu n có kh n ng ch u đ c đi u ki n kh c nghi t Nhi t đ thích h p cho s sinh tr ng c a Bacillus subtilis là 36 – 50

OC, t i đa kho ng 60 O C, là loài a nhi t cao Bào t c a Bacillus subtilis c ng chu đ c nhi t khá cao (Nguy n Lân D ng, 1983)

Bào t có hình dạng bầu dục, kích thước từ 0,6 àm đến 0,9 àm, phân bố không theo nguyên tắc cụ thể mà có thể là tâm, gần tâm nhưng không chính xác Đây là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn sống sót qua các điều kiện sống bất lợi Bào t có thể sống từ vài năm đến vài chục năm Khi gặp điều kiện thuận lợi, những bào t này sẽ phục hồi và tiếp tục chu kỳ sống của mình.

Bacillus subtilis Q111, do Nguy n V n Minh và cộng sự phân lập từ bùn đáy ao nuôi cá tra, được xác định có hoạt tính probiotic cao Loài vi khuẩn này sản sinh ba loại enzym ngoại bào: amylase, protease và cellulase, đồng thời có khả năng điều chỉnh mùi, pH môi trường nuôi, chịu pH acid dày và muối mặn Đặc biệt, Bacillus subtilis Q111 không sinh enzym hemolysin, không kháng thuốc kháng sinh và có khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh E.

Ictaluri (Nguy n Hoàng Tu n Duy và c ng s , 2013; Nguy n V n Minh và c ng s , 2013)

Ch ng Bacillus polyfermenticus, th ng đ c g i là ch ng “Bispan”, đã đ c dùng đ đi u tr dài h n b nh r i lo n đ ng ru t v i kh n ng sinh n i bào t giúp

B Polyfermenticus có th s ng sót t i ru t B polyfermenticus là tr c khu n sinh n i bào t , đ c phát hi n l n đ u tiên b i ti n s Terakado n m 1933, có kh n ng kháng Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Shigella và V cholera Nhi u nghiên c u cho th y là các B polyfermenticus gi ng h t B subtilis v c hình thái h c và sinh hóa Tuy nhiên, B polyfermenticus v n khác bi t so v i các dòng B subtilis, b i kh n ng chuy n hóa lactose và s n sinh m t l ng axit acetic và axit lactic t ng ng t glucose và lactose l n h n các dòng khác (Lee và c ng s , 2000)

Chủng Bacillus polyfermenticus F27, do Nguyễn Văn Minh và cộng sự phân lập từ trùn quế, được xác định có hoạt tính probiotic cao và khả năng kháng nhiều vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản Chủng này có khả năng sinh enzym ngoại bào, chịu được pH môi trường khắc nghiệt, đặc biệt là pH axit dày dày và mùi mặn, đồng thời không sinh enzym hemolysin và không có kháng kháng sinh.

1.5.3 Kh n ng sinh enzym c a Bacillus

Theo nghiên cứu của Nguyễn Trọng Cần (1998), các chủng vi khuẩn Bacillus như Bacillus subtilis, B mesentericus và B thermoproteolyticus có khả năng tổng hợp enzyme protease Những vi khuẩn này thường tổng hợp các protease hoạt động hiệu quả trong môi trường có pH trung tính và kiềm yếu.

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động hiệu quả trong khoảng pH 5 – 8 và có khả năng chịu nhiệt tốt Chúng phân hủy protein thực phẩm ít hiệu quả hơn so với protease động vật, nhưng lại có giá trị dinh dưỡng cao hơn Ngoài ra, các protease này còn có khả năng ái lực cao đối với các axit amin và axit béo.

Protease C từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens có trọng lượng phân tử từ 20.000 đến 30.000 dalton, hoạt động hiệu quả trong khoảng pH từ 6 đến 12, với pH tối ưu từ 7 đến 12 Enzym này có khả năng chịu nhiệt và pH cao trong thời gian dài, cho phép hoạt động hiệu quả trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt như dung môi và chất oxy hóa.

Trong các ch ng Bacillus thì sinh protease m nh nh t là Bacillus subtilis H enzym c a Bacillus subtilis r t phong phú và đa d ng g m protease (Rappaport,

Bacillus subtilis là một vi khuẩn có ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp, đặc biệt là trong sản xuất enzym như protease, amylase và nhiều loại enzym khác như glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly các chất có lợi từ thực vật và cây thuốc, góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng và ứng dụng trong ngành thực phẩm.

1.5.4 Các y u t nh h ng đ n quá trình sinh enzym t Bacillus

H u h t các ch ng vi khu n Bacillus có khả năng sản xuất protease khi được cung cấp các loại đường như glucose, lactose và maltose Tuy nhiên, quá trình tổng hợp protease sẽ bị ức chế trong môi trường nuôi cấy có nồng độ các đường này cao.

Các ion kim loại như Ca²⁺, Co²⁺ và Mg²⁺ là yếu tố cần thiết cho quá trình tổng hợp protease kiềm Mối kali phosphat được sử dụng làm nguồn cung cấp phospho, điều chỉnh nồng độ môi trường ở mức tối ưu là 2 g/L Nếu nồng độ vượt quá 2 g/L, có thể gây cản trở quá trình tổng hợp protease kiềm.

Sự phát triển của tế bào và quá trình sinh enzym của các vi sinh vật phụ thuộc vào giá trị pH môi trường, trong đó pH cần duy trì trên 7,5 trong suốt quá trình lên men để tối ưu hóa sự sinh tổng hợp protease Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sinh tổng hợp protease của vi sinh vật Nghiên cứu của Frankence cho thấy, khi điều chỉnh nhiệt độ nuôi và nồng độ oxy, sẽ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym và trao đổi năng lượng của nhóm vi khuẩn Bacillus Nhiệt độ cao làm giảm nồng độ oxy hòa tan trong môi trường, trong khi nhiệt độ tối ưu cho quá trình tổng hợp protease của vi sinh vật Bacillus là từ 28 đến 45 °C.

Trong su t quá trình lên men, s c khí gián ti p và tr c ti p s cung c p l ng oxy hòa tan ph c v quá trình sinh tr ng và sinh t ng h p protease c a vi sinh v t

Tình hình nghiên c u hi n nay

Nghiên cứu của Hammoumi và cộng sự năm 1998 đã sử dụng cá mòi làm nguồn đạm probiotic cho gia cầm bằng cách xay nhuyễn, thêm 15% mật rỉ và vi khuẩn Lactobacillus plantarum trong 20 ngày ở 22°C Kết quả cho thấy một số gia cầm tăng trọng lượng đáng kể khi được cho ăn thức ăn chua cá bổ sung với bột lúa mạch và cám.

N m 2003, nghiên c u c a Kim và c ng s thu h i đ m t phi lê cá b ng các thêm axit (pH 2 – 3) thêm ki m (pH 10,5 – 12) k t qu cho protein thu đ c cao nh t (80%) pH 12 Ho t l c enzym cao nh t pH 2 và 11

Nghiên c u c a Martone và c ng s n m 2005, t th y phân cá th i nhi t đ 60

OC sau khi đã xay nhuy n và tr n đ u v i n c K t qu cho ra s n ph m có 80% protein, t l axit amin t do th p ng d ng làm c ch t đ nuôi c y vi khu n

Nghiên cứu của Esteban và cộng sự năm 2006 cho thấy, việc chế biến cá (đầu, xương, da, nội tạng, nguyên con) ở nhiệt độ 65 – 150 độ C trong 12 giờ giúp giảm 10 - 12% lượng sản phẩm, nhưng vẫn tạo ra sản phẩm giàu khoáng chất với 58% protein, 19% chất béo và không chứa chất độc hại Sản phẩm này có thể được sử dụng để làm nguội protein thay thế trong thực phẩm.

Năm 2007, nghiên cứu của Trần Thanh Dũng về điều kiện thay phân phẩm cá tra trực tiếp bằng Bacillus subtilis đã cho thấy kết quả đáng khích lệ Đặc biệt, hàm lượng đạm thu được đạt 49,88 g/kg chất khô và đạm amoniac 5,0 g/kg chất khô vào ngày thứ 10 Phân vi khuẩn bổ sung 1,4%, tỉ lệ muối bổ sung 7% và pH điều chỉnh ban đầu là 5,2 Kết quả cho thấy cây H đạt năng suất và hàm lượng nitrat trong cây H đáp ứng tiêu chuẩn rau sạch, vượt trội so với các loại phân bón khác.

Năm 2009, nghiên cứu của Trần Thị Hằng Nghĩa đã chỉ ra rằng enzyme protease từ Bacillus subtilis có khả năng phân hủy phụ phẩm cá tra Việc sử dụng enzyme này mang lại nhiều ưu điểm, như quá trình phân hủy diễn ra nhanh chóng, hiệu suất cao, khả năng thu hồi nhiều sản phẩm khác nhau và chi phí tổng thể thấp Tuy nhiên, vẫn còn một số vấn đề tồn tại, bao gồm mùi hôi và sự xuất hiện của nhiều tạp chất, làm giảm chất lượng của sản phẩm cuối cùng.

T i u hóa b ng ph ng pháp quy ho ch th c nghi m

1.7.1 Ph ng pháp quy ho ch th c nghi m

Quy hoạch thể chế nghiên cứu là tập hợp các tác động nhằm xây dựng chiến lược thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu định tính Nó bao gồm việc thu thập thông tin mô phỏng để tạo ra mô hình toán và xác định các điều kiện tiêu chí, trong đó đã học và chứa hiểu biết đầy đủ về các chức năng của đề tài nghiên cứu.

 i t ng i t ng c a quy ho ch th c nghi m trong các ngành công ngh : là m t quá trình ho c hi n t ng nào đó có nh ng tính ch t, đ c đi m ch a bi t c n nghiên c u

Người nghiên cứu có thể hiểu biết về đối tượng, nhưng đã có một số thông tin tiên nghiệm mặc dù chỉ là số liệu thống kê, vì những thông tin này biến đổi theo hướng đến tính chất đối tượng Có thể hình dung chúng như một “hộp đen” trong hệ thống điều khiển, nhận các tín hiệu đầu vào và đầu ra.

S đ 1.1 i t ng nghiên c u c a ph ng pháp quy ho ch th c nghi m

- Các tín hi u đ u vào đ c chia thành ba nhóm:

1) Các bi n ki m tra đ c và đi u khi n đ c, mà ng i nghiên c u có th đi u ch nh theo d đnh, bi u di n b ng vect :

2) Các bi n ki m tra đ c nh ng không đi u khi n đ c, bi u di n b ng vect :

3) Các bi n không ki m tra đ c và không đi u khi n đ c, bi u di n b ng vect :

Các tín hiệu đầu ra dùng để đánh giá đầu tiên là vect Y = (y1, y2, , yq), thường được gọi là các hàm mục tiêu Biểu diễn hình học của hàm mục tiêu được gọi là bề mặt đáp ứng Phương pháp toán học trong xử lý số liệu thống kê cho thực nghiệm là phương pháp thống kê Do đó, các mô hình biểu diễn hàm mục tiêu chính là các mô hình thống kê thực nghiệm, và các mô hình này nhận được khi có công thức nhiều ngẫu nhiên.

Trong các mô hình thống kê, mô hình hồi quy là một trong những mô hình quan trọng nhất Mô hình hồi quy được biểu diễn bằng quan hệ tổng quát, cho phép phân tích mối quan hệ giữa các biến số.

Trong đó = ( 1 , 2 , , k ) là vect tham s c a mô hình

Để xác định các tham số của một thống kê thực nghiệm, cần thực hiện các thí nghiệm theo kế hoạch đã định Nghiên cứu chính của lý thuyết quy hoạch thí nghiệm là các thí nghiệm tích cực, bao gồm các yếu tố đầu vào thuộc nhóm Z, trong đó người thực nghiệm sẽ điều chỉnh chúng theo kế hoạch thí nghiệm đã được thiết lập.

Các ph ng pháp quy ho ch th c nghi m :

- Th c nghi m sàng l c: là th c nghi m mà nhi m v c a nó là tách nh ng y u t nh h ng đáng k ra kh i nh ng y u t đ u vào đ ti p t c nghiên c u chúng trong các th c nghi m c n thi t

Thực nghiệm mô phỏng là một phương pháp nghiên cứu liên quan đến việc tái tạo hiện tượng trong môi trường kiểm soát Có nhiều dạng mô phỏng, tuy nhiên, bài viết này sẽ tập trung vào dạng thực nghiệm đặc biệt hoàn toàn bằng mô hình hồi quy đa thức.

- Th c nghi m c c tr : là th c nghi m đ c phát tri n t th c nghi m mô ph ng

Nhiệm vụ của nó là xây dựng mô hình toán học thực nghiệm, nhằm xác định giá trị tối ưu của hàm mục tiêu và các tham số đầu vào của hàm Cụ thể, điều này có nghĩa là xác định bậc tối hợp giá trị các yếu tố mà tại đó hàm mục tiêu đạt được giá trị tối ưu.

1.7.2 Thi t k tìm y u t nh h ng c a Plackett – Burman

Xác đnh các “y u t quan tr ng” nh h ng đ n quá trình m c tiêu (Plackett và Burman, 1946)

Bảng thiết kế Plackett-Burman sử dụng ma trận đầy đủ để phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả, giúp xác định các tác động không có sự tương tác đáng kể Thiết kế này cho phép tối ưu hóa quy trình nghiên cứu bằng cách giảm thiểu số lượng thí nghiệm cần thực hiện, trong khi vẫn đảm bảo thu thập đủ thông tin về các yếu tố chính.

Thiết kế Plackett-Burman đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các tương tác chính trong ma trận thí nghiệm Tuy nhiên, điều này không có nghĩa là thông tin về các tương tác không xác định trong thiết kế Plackett-Burman là không có giá trị.

V i m t thi t k Plackett – Burman g m n thí nghi m (v i n là b i s c a 4, n ≤

100, ngo i tr n = 92 là ch a th xác đ nh) v i s y u t k ≤ (n - 1)

Thiết kế Plackett-Burman là một phương pháp tối ưu hóa thời gian và hiệu quả nhất để khảo sát các yếu tố có ảnh hưởng lớn Phương pháp này không thể thiếu trong nghiên cứu, giúp xác định các yếu tố quan trọng đã được khảo sát một cách rõ ràng.

Vi c ch n các ma tr n s ph thu c vào s y u t thí nghi m trên c ng v i các ph ng pháp l a ch n đ xác đnh sai s thí nghi m (Plackett và Burman, 1946)

Có nhi u cách đ xác đnh sai s thí nghi m nh :

• Ch n đi m trung tâm và cho m t s thí nghi m t i đi m đó

• L p l i toàn b ma tr n thí nghi m

• Th c hi n nhi u phép đo đ c l p trong t h p

B ng 1.1 Thi t k thí nghi m Plackett – Burman v i 11 y u t

 Phân tích k t qu thí nghi m

Sau khi tiến hành thí nghiệm, dữ liệu thu thập được sẽ được sử dụng để tính toán các hiệu ứng và xác định ý nghĩa thống kê của những hiệu ứng này Các hiệu ứng sẽ được tính toán bằng cách nhập các giá trị trung bình vào ma trận Tiếp theo, sẽ so sánh sự khác biệt giữa các đáp ứng trung bình cao và đáp ứng trung bình thấp Các nhịp của yếu tố luôn luôn thay đổi trong các phản ứng khi đi từ cấp độ thấp đến cấp độ cao.

Xác đ nh đ c m c đ đ thi t l p các y u t ph thu c vào m c tiêu th nghi m:

N u m c đích là đ t i đa hóa m t ph n ng, t t c các y u t có tác đ ng tích c c s đ c thi t l p đ ho t đ ng m c đ cao và t t c các y u t có tác đ ng tiêu c c s đ c thi t l p đ ho t đ ng m c th p

N u m c tiêu là đ gi m thi u các ph n ng, t t c các y u t có tác đ ng tích c c s đ c thi t l p m c th p và t t c đ u có m t tác đ ng tiêu c c s đ c thi t l p m c cao

N u nh nh h ng c a các y u t đ c ki m tra có ý ngh a th ng kê thì y u t đó là 1 y u t quan tr ng (Plackett và Burman, 1946)

1.7.3 T i u hóa b ng ph ng pháp b m t ch tiêu

Mục đích chính của quy hoạch thực nghiệm trong kỹ thuật là tìm giá trị cực trị hoặc vùng tối ưu cho một quá trình hoặc các điều kiện tối ưu về vận hành một hệ thống Lập các bài toán nghiên cứu thực nghiệm về vấn đề tối ưu thường được biết đến với tên gọi "phương pháp bề mặt phản hồi" (Response Surface Methods – RSM).

N i dung chính c a RSM là s d ng m t chu i các thí nghi m đ c thi t k v i các m c đích:

• Ch ra t p giá tr các bi n đ u vào sao cho t o ra đáp ng c a hàm m c tiêu là t t nh t

• Tìm ki m giá tr các bi n đ u vào nh m đ t đ c các yêu c u c th v đáp ng c a hàm m c tiêu

• Xác đ nh các đi u ki n v n hành m i đ m b o c i thi n ch t l ng ho t đ ng c a đ i t ng so v i tình tr ng c

• Mô hình hóa quan h gi a các bi n đ u vào v i đáp ng c a đ i t ng nghiên c u, dùng làm c s d đoán hay đi u khi n quá trình hay h th ng

T i u hóa b ng RSM th ng g m 3 giai đo n: thí nghi m kh i đ u, leo d c tìm vùng c c tr và thí nghi m b m t ch tiêu (Nguy n V n D và c ng s , 2011)

Sau khi thực hiện thí nghiệm sàng lọc, mô hình hồi quy bậc nhất được xây dựng dựa trên các biến nhánh chính và các biến không nhánh có ảnh hưởng đáng kể đến hàm mục tiêu, nhằm tối ưu hóa mô hình.

Thí nghiệm khối điều xây dựng một số thí nghiệm với các biến ảnh hưởng chính, bổ sung thêm các điểm thí nghiệm trung tâm nhằm đánh giá mức độ phù hợp của mô hình bậc nhất Điều này cho phép kiểm tra được vùng khảo sát đã bao trùm các biến lân cận hay chưa.

M c đ không phù h p c a mô hình đ c ki m đnh d a trên hai gi thuy t th ng kê:

• Gi thuy t đ o: mô hình kh p v i d li u th c nghi m

Giới thiệu về mô hình không khớp với dữ liệu cho thấy rằng mô hình có thể được đánh giá dựa trên mức độ phù hợp của nó với dữ liệu thực nghiệm Mỗi biến trong một kế hoạch thí nghiệm cần nhận được ba mức giá trị Nếu kiểm tra hai giá trị của biến, mô hình được đánh giá là phù hợp với dữ liệu và như vậy, không có khả năng phát hiện khi nào mô hình này không còn phù hợp.

C ng nh các phép ki m đnh th ng kê khác, thông s đ ch p nh n hay lo i b gi thuy t đ o là giá tr p (p – value)

• N u giá tr p nh h n m c ý ngh a , ta lo i b gi thuy t đ o

• N u giá tr p l n h n m c ý ngh a , mô hình đã d ng là phù h p đ mô t d li u

Th i gian và đ a đi m nghiên c u

- a đi m: Phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh, tr ng i h c M Thành ph

V t li u nghiên c u

Ph ph m cá (đ u, vây, mang, v y, n i t ng…) và cá t p mua t ch đ u m i nông s n th c ph m Bình i n, Qu n 8, TP.HCM và ch Th D u M t, Ph ng Phú C ng, TP.TDM, Bình D ng

Hai chủng Bacillus, bao gồm Bacillus subtilis Q111 và Bacillus polyfermenticus F27, đã được chứng minh có hoạt tính probiotic trong nuôi trồng thủy sản Các chủng này được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học MTP.HCM.

2 ch ng vi khu n Pseudomonas aeruginosa và Streptococcus agalactiae phân l p t cá lóc b nh đ c cung c p t phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh, Tr ng i h c M TP.HCM

2.2.2 Môi tr ng – Hóa ch t

- Môi tr ng NA b sung 5% s a g y (ph l c 1)

- B nhu m Gram: crytal violet, lugol, c n 96 O , safranin O

Thi t b - D ng c

- N i h p ti t trùng SA – 300VF, STURDY – ài Loan

- Kính hi n vi Olympus CK – 30 – Nh t

- Máy vortex Velp, model: ZX3 – Italia

- M t s thi t b khác trong phòng thí nghi m Công ngh vi sinh

Mỗi phòng thí nghiệm vi sinh đều cần trang bị một số dụng cụ thiết yếu như que cấy, que truyền, đèn cồn, ống Eppendorf, micropipet với các dung tích khác nhau (0,5 – 10 µL, 10 – 100 µL, 20 – 100 µL, 100 – 1000 µL), đầu típ các loại, bình Christ, giếng nhựa 96 lỗ, ống đong, ống Falcon, bình tam giác, các thiết bị thủy tinh, đĩa petri, tăm bông vô trùng, bình tia, giấy thấm, kéo, kẹp, bông thấm, bông không thấm, giấy bọc, và găng tay cao su.

S đ thí nghi m

D a vào m c tiêu đ tài, chúng tôi ti n hành thí nghi m theo s đ 2.1

Ch ng vi sinh v t đ c cung c p t phòng thí nghi m

Th s t ng tích gi a 2 ch ng thí nghi m

Th nghi m kh n ng sinh enzym protease c a 2 ch ng thí nghi m

Nguyên li u cá t p đ c mua t các ch

Quan sát đ i th , vi th c a 2 ch ng thí nghi m

Xác đ nh và t i u hóa các y u t nh h ng quá trình th y phân và m t đ VSV có l i sau th y phân:

Ho t hóa các ch ng vi khu n đ c cung c p

Th nghi m kh n ng đ i kháng v i

VSV gây b nh c a 2 ch ng thí nghi m

Ph ng pháp xác đ nh m t đ vi sinh v t

2.5.1 Xác đnh tr c ti p m t đ b ng ph ng pháp đ m trên bu ng đ m h ng c u

Buồng đệm hàng cự thang là một phiến kính dày 2 – 3 mm, có mặt vùng đệm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một bề mặt rãnh Đệm phải phù hợp với bề mặt của phiến kính không lệch quá 1/10 mm và có hình tròn, đảm bảo khi được phẳng lên bề mặt kính, độ sâu của đệm sẽ đồng đều Vùng đệm có diện tích 1 mm², được chia thành 25 ô vuông lớn, mỗi ô có diện tích 1/25 mm² và 400 ô vuông nhỏ, mỗi ô có diện tích 1/400 mm² (Nguyễn C Long, 2011)

Pha loãng m u c n đ m cần đảm bảo trong mỗi ô nh c a bu ng đ m có khoảng 5 - 10 t bào vi sinh v t Để đạt được n i u này, cần phải c l ng đ c s l ng vi sinh v t trong m u và thực hiện nhiều lần trong quá trình pha loãng T m t gi t m u đ c pha loãng vào vùng đ m trên bu ng đ m khu v c bu ng đ m.

Chỉnh thể trường sao cho mỗi trường chỉ chứa trên một ô lân (4 × 4 = 16 ô nh) Mỗi số bảo hiểm di chuyển trong một ô lân Sau đó, chỉnh thể trường tìm một ô lân khác Mỗi số bảo hiểm cần có ít nhất 5 ô lân Lấy trung bình (Nguyễn C Lăng, 2011)

S l ng t bào trong 1 mL m u: (Nguy n c L ng, 2011)

• a: s t bào trong 5 ô vuông l n (80 ô vuông nh )

• B: s ô vuông nh trong 5 ô vuông l n (16 × 5 = 80 ô vuông nh )

• 400: t ng s ô vuông nh trong ô trung tâm

• 0,1: th tích d ch t bào (mm 3 ) ch a trên ô trung tâm

2.5.2 Xác đnh gián ti p s l ng t bào b ng cách đ m s l ng khu n l c 2.5.2.1 Nguyên lý

Mật độ tế bào trong một khuẩn lạc được xác định theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể nhìn thấy được Do đó, số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích nhất định phản ánh số lượng tế bào sống trong thể tích đó Nói cách khác, số lượng tế bào đếm được gắn liền với số lượng tế bào sống Để đạt được độ chính xác, cần thực hiện sao cho mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào Vì vậy, nếu cần thiết, phải được pha loãng trước khi cấy sao cho một đĩa tế bào đạt khoảng vài nghìn CFU/mL.

Dùng pipet vô trùng hút 0,1 mL d ch huy n phù vào môi tr ng th ch

Dùng quy c y th y tinh trang đ u các t bào lên m t th ch

L u ý: nên dùng các đ a th ch đ c chu n b tr c m t ngày đ h p th nhanh l ng d ch đem c y tránh hi n t ng các t bào trôi d t làm sai l ch k t qu

Sau khi c y, đ a thí nghi m đ c trong 24 gi 37 O C tr c khi đ c k t qu (Nguy n c L ng, 2011)

M t đ đ c xác đ nh b ng cách đ m s l ng khu n l c và tính theo công th c: (Nguy n c L ng, 2011)

Các ph ng pháp đ nh l ng đ m

2.6.1 nh l ng nit t ng s b ng ph ng pháp Kjeldahl

Khi đun m u v t có chứa nit (đ m) trong H2SO4 đậm, với sự hiện diện của chất xúc tác thích hợp, tất cả các chất hữu cơ sẽ được oxy hóa thành CO2 và H2O Nit được phóng thích dưới dạng NH3, và NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.

Chúng tôi đã điều chế nitrat ammonium ((NH4)2SO4) từ dung dịch NH3 bằng cách sử dụng NaOH, sau đó kết hợp NH3 với dung dịch acid boric (H3BO3) và các chất chỉ thị màu như bromoresol green và methyl red để tạo thành muối ammonium tetraborat.

(NH 4 ) 2 SO 4 +2NaOH Na 2 SO 4 + 2NH 3 +2H2O

Sau đó đ nh phân l ng nit có trong dung d ch (NH 4 ) 2 B 4 O 7 b ng dung d ch acid

H 2 SO 4 0,05 N (chu n) đ n khi dung d ch chuy n t màu xanh sang màu đ nâu (NH 4 ) 2 B 4 O 7 + H 2 SO 4 + 5H 2 O (NH 4 ) 2 SO 4 + 4H 3 BO 3 (Nguy n V n Mùi, 2007)

Ch t xúc tác vô c hóa: nghi n m n và tr n đ u theo các t l 100 g K 2 SO 4 : 10 g CuSO 4 : 1 g Se

H n h p ch t ch th màu: cân 0,099 g bromoresol green và 0,066 g methyl red hòa tan trong 100 mL ethanol tuy t đ i

Để chuẩn bị dung dịch acid boric có màu, cần cân 20 g acid boric (H₃BO₃) và hòa tan trong 950 mL nước cất Sau đó, thêm 20 mL dung dịch chất chỉ thị màu và khuấy đều, tiếp tục cho nước cất vào cho đủ 1 lít, tạo ra dung dịch có màu đỏ Sử dụng NaOH 0,1 N để điều chỉnh màu sắc của dung dịch cho đến khi chuyển từ màu nâu sang màu xanh với pH = 5,0.

Dung d ch NaOH 10 N: cân 400 g NaOH hòa tan trong n c c t v a đ 1 lít (ch a trong bình kín h n ch ti p xúc CO 2 )

Dung d ch chu n H 2 SO 4 0,05 N (Nguy n V n Mùi, 2007)

Cho vào bình Kjeldahl l n l t 0,3 mL m u l ng (ho c 0,3 g m u khô), 5 mL

H2SO4 đặc, 0,5 g chất xúc tác vô cơ được sử dụng trong quá trình tráng bình Kjeldahl Sau đó, hỗn hợp được đun trong tủ hút gió trong khoảng 1 đến 1,5 giờ cho đến khi dung dịch chuyển sang màu trong suốt hoặc xanh lục Khi đạt được màu sắc này, cho thêm một ít nước cất vào; nếu dung dịch có màu xanh lục của CuSO4, điều đó có nghĩa là quá trình đã được vô hóa hoàn toàn Nếu dung dịch vẫn còn xuất hiện các hạt đen, cần tiếp tục đun thêm.

Song song v i m u th th t ta ti n hành m u th không (thay l ng m u b ng n c c t) đ lo i tr sai s (Nguy n V n Mùi, 2007)

Cho dung dịch đã vô cơ hóa vào bình cầu của hệ thống chưng cất đạm, tráng bình bằng dung dịch Kjeldahl ba lần bằng nước cất Tiếp theo, cho dung dịch NaOH 10 N vào bình cầu để trung hòa dung dịch vô cơ hóa đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh của CuSO4 sang màu xám (khoảng 25 mL NaOH 10 N) Đậy kín hệ thống chưng cất và chưng cất hơi NH3 vào các chén chứa 30 mL acid boric, chất chỉ thị màu Đảm bảo rằng ống sinh hàn được đặt đúng và chìm vào dung dịch acid boric để NH3 không thoát ra ngoài Sau đó, nếu có 100 mL dung dịch có màu xanh xuất hiện (thông qua việc sử dụng giấy quỳ ẩm), điều này chỉ ra rằng trong nước còn NH3, quá trình chưng cất vẫn tiếp tục; nếu giấy quỳ không đổi màu, chứng tỏ không còn NH3, quá trình chưng cất kết thúc (Nguyễn Văn Mùi, 2007)

Dung dịch sau khi chứng có màu xanh được chuẩn độ bằng dung dịch H₂SO₄ 0,05 N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu nâu Khi đạt được màu nâu, quá trình chuẩn độ kết thúc và thể tích dung dịch H₂SO₄ 0,05 N đã sử dụng sẽ được ghi nhận (Nguyễn Văn Mùi, 2007)

Ch s nit t ng đ c tính theo công th c: (Nguy n V n Mùi, 2007)

• V: s mL H 2 SO 4 0,05 N chu n đ s d ng cho m u th th t

• Vo: s mL H 2 SO 4 0,05 N chu n đ s d ng cho m u th không

• 0,0007: s gam nit ng v i 1mL H 2 SO 4 0,05 N chu n

• m: s mL m u hay s gam m u đem phân tích.

• 1000: h s quy đ i t mL sang lít hay t gam sang kg

2.6.2 nh l ng đ m formol ph ng pháp chu n đ formol (Ph ng pháp Sửrensen)

Axit amin hòa tan trong nước có tính chất muối nội phân tán, với các nhóm amin và cacboxyl trung hòa lẫn nhau Nhóm –COO- của axit amin bị ngăn trở bởi các nhóm amin, dẫn đến việc không thể chuẩn bị trực tiếp Trong formol, nhóm amin của axit amin phản ứng với nhóm anđehit để tạo ra metylen, kết quả của phản ứng này là nhóm amin mang một tính chất cơ bản, trong khi nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dưới dạng metylen không bị ngăn trở và có thể chuẩn bị được.

Sự liên kết giữa nhóm cacboxyl và nhóm amin với formol cho phép xác định nhóm amin khi nhóm cacboxyl đã được chuẩn bị Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định axit amin có trong dung dịch nghiên cứu (Nguyễn Văn Mùi, 2007)

Cho vào bình nón 10 mL dung d ch ch a axit amin và 0,5 mL dung d ch phenolphtalein 1% trung hoà dung d ch axit amin, cho t ng gi t NaOH 0,1 N đ n khi xu t hi n màu đ

Cho thêm 10 mL dung d ch formol 20% đã trung hoà và l c đ u bình nón Sau 5 phút dung d ch m t màu

Chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N đến khi xuất hiện màu đậm là một thí nghiệm để xác định nồng độ của các hóa chất Thí nghiệm này được tiến hành đồng thời với các hóa chất khác, nhưng cần thay dung dịch chứa axit amin bằng nồng độ thích hợp (Nguyên Văn Mùi, 2007)

C l mL dung d ch NaOH 0,1 N t ng đ ng l,4 mg nit S mg nit axit amin c a dung d ch nghiên c u đ c tính theo công th c: (Nguy n V n Mùi, 2007) m formol (mg) = (A - B) × 1,4 Trong đó:

• A: S ml NaOH 0,1 N dùng đ chu n đ bình thí nghi m

• B: S ml NaOH 0,1 N dùng đ chu n đ bình ki m tra

2.6.3 nh l ng đ m amoniac b ng ph ng pháp c t kéo h i n c

2.6.3.1 Nguyên lý y mu i amoni t do (th ng d i d ng mu i NH 4 Cl) b ng m t ch t ki m m nh h n amoniac nh Mg(OH)2 Dùng h i n c kéo khí amoniac đã đ c gi i phóng sang bình h p th ch a dung d ch acid boric (H 3 BO 3 ) v i ch t ch th màu (h n h p bromoresol green và methyl red ) t o thành mu i amonium tetraborat 2NH 4 Cl +Mg(OH) 2 MgCl 2 +2NH 3 + 2H 2 O

Sau đó đ nh phân nit có trong dung dch (NH 4 ) 2 B 4 O 7 b ng dung d ch acid H 2 SO 4 0,05N (chu n) đ n khi dung d ch chuy n t màu xanh sang màu đ nâu

(NH 4 ) 2 B 4 O 7 + H 2 SO 4 + 5H 2 O (NH 4 ) 2 SO 4 + 4H 3 BO 3 (Nguy n V n Mùi, 2007)

H n h p ch t ch th màu: cân 0,099 g bromoresol green và 0,066 g methyl red hòa tan trong 100 mL ethanol tuy t đ i

Để chuẩn bị dung dịch acid boric có màu, bạn cần cân 20 g acid boric (H3BO3) và hòa tan trong 950 mL nước cất Sau đó, thêm 20 mL dung dịch chất chỉ thị màu, khuấy đều và tiếp tục thêm nước cất cho đủ 1 lít dung dịch có màu Cuối cùng, sử dụng NaOH 0,1 N để điều chỉnh màu của dung dịch từ nâu sang xanh với pH 5,0.

Dung d ch NaOH 10 N: cân 400 g NaOH hòa tan trong n c c t cho v a đ 1 lít (ch a trong bình kín h n ch ti p xúc CO 2 )

Dung dịch chuẩn H2SO4 0,05 N được pha chế từ dung dịch H2SO4 0,1 N Đầu tiên, cho 1 lít dung dịch H2SO4 0,1 N vào bình định mức, sau đó chuyển dung dịch trong bình định mức vào beaker 2,5 lít Tiếp theo, sử dụng bình định mức để thêm 1 lít nước vào khuấy đều.

Cho vào bình chứa 50 mL nước cất, hút chính xác 1 mL mẫu nước cần phân tích (1 gam đối với chất khô) và thêm 3 g Mg(O) Làm kín hệ thống chứa nước để hòa tan NH3 thành NH4OH vào trong 10 mL dung dịch acid boric Sau đó, hướng không khí vào 50 mL dung dịch có màu xanh nước biển Nếu giấy quỳ chuyển sang màu xanh, thì trong nước còn NH3, quá trình chứa nước chưa kết thúc Ngược lại, nếu giấy quỳ tím không đổi màu thì không còn NH3, quá trình chứa nước đã kết thúc.

Song song v i m u th th t ta ti n hành m u th không (thay l ng m u b ng l ng n c c t) đ lo i tr sai s (Nguy n V n Mùi, 2007)

Sau khi dung dịch được chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,05 N, màu xanh của dung dịch sẽ chuyển sang màu nâu, đánh dấu sự kết thúc của quá trình chuẩn độ Thể tích dung dịch H2SO4 0,05 N đã sử dụng sẽ được ghi lại (Nguyễn Văn Mùi, 2007)

Ch s đ m amoniac đ c tính theo công th c: (Nguy n V n Mùi, 2007) Đ m amoniac (g

Lhay g kg) = 0,007 × (V Vo) × 1000 m =0,7 × (V Vo) m Trong đó

• V: s ml H 2 SO 4 0,05 N chu n đ s d ng cho m u th th t

• Vo: s ml H 2 SO 4 0,05 N chu n đ s d ng cho m u th không

• 0,0007: s gam nit ng v i 1mL H 2 SO 4 0,05 N chu n

• m: s mL m u (m u n c) hay s gam m u (m u khô) đem phân tích.

• 1000: h s quy đ i t mL sang lít hay t gam sang kg

Sau khi có 2 giá tr đ m formol và đ m amoniac, chuy n 2 giá tr này v cùng đ n v là g/L ho c g/kg r i tính theo công th c: (Nguy n V n Mùi, 2007) m axit amin (g/L hay g/kg)= m formol – m amoniac

2.7 Quan sát đ i th và vi th c a 2 ch ng vi khu n th nghi m

Vi khu n t ng gi ch ng đ c c y ria lên môi tr ng th ch NA, 37 O C, 24 gi

Quan sát m t s đ c đi m c a khu n l c c a 2 ch ng B polyfermenticus F27 và

B subtilis Q111 trên môi tr ng th ch NA: (Nguy n c L ng, 2011)

• Kh n ng phát tri n c a khu n l c

2.7.2 Quan sát vi th b ng ph ng pháp nhu m Gram

Phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram giúp phân biệt vi khuẩn thành hai loại dựa trên đặc điểm hình thái và cấu trúc của tế bào Vi khuẩn Gram dương có lớp vách dày chứa peptidoglycan, nên sẽ có màu tím sau khi nhuộm, trong khi vi khuẩn Gram âm có lớp vách mỏng hơn và được bao bọc bởi màng ngoài, dẫn đến màu hồng.

Thí nghi m kh n ng sinh protease c a 2 ch ng th nghi m

Casein là một loại protein sữa không thể thẩm thấu qua màng tế bào của vi khuẩn, và sự hiện diện của casein làm sữa có màu trắng Trước khi casein có thể được vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon và năng lượng, nó phải được chuyển hóa thành các axit amin Vi khuẩn thực hiện quá trình này bằng cách tiết ra enzym phân giải protein, xúc tác cho quá trình thủy phân casein thành các axit amin, sau đó được vận chuyển vào tế bào Khi sữa được pha vào môi trường thích hợp, casein trong sữa sẽ được chuyển hóa Khi vi sinh vật phát triển trên môi trường này, vi khuẩn giải phóng các enzym protease (như caseinase) để tạo ra một vùng phân giải protein xung quanh khuẩn lạc Hiện tượng này (phân hủy) là kết quả của một quá trình phân giải tạo ra axit amin hòa tan Trong môi trường âm, không có hoạt động protease, do đó môi trường xung quanh khuẩn lạc được giữ nguyên.

Chu n b môi tr ng NA b sung s a g y: (ph l c 1)

• Pha dung d ch s a g y vô trùng

• Pha môi tr ng NA, h p vô trùng 121 O C, 15 phút

Chu n b ch ng vi sinh v t: t ng sinh các ch ng vi khu n th nghi m trong môi tr ng NB, 37 O C, 24 gi

Dùng cốc đựng có đường kính 6 mm, nhúng lên bề mặt thạch agar để ra những hình thức khác nhau, tạo thành các giọt trên môi trường thạch NA bổ sung sau khi đã chuẩn bị sẵn Dùng pipette hút 50 µL dịch huyết thanh phù hợp với vi sinh vật thí nghiệm bơm vào các giọt Để dịch trong giọt khô hẳn vào trong thạch nhiệt độ 4 °C, sau đó đem ủ ở 37 °C trong 24 giờ (Nguyễn C.L và cộng sự, 2011).

Ki m tra xu t di n vòng phân gi i xung quanh các gi ng

N u có vòng phân gi i, l t s p đ a petri dùng th c đo đ ng kính vòng phân gi i (Nguy n c L ng và c ng s , 2011)

Thí nghi m kh n ng đ i kháng v i vi khu n gây b nh trên cá lóc c a 2

Chất kháng sinh là hợp chất sinh học có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật như vi khuẩn, virus và nấm Chúng được sử dụng như một biện pháp bảo vệ hiệu quả chống lại các tác nhân gây bệnh.

Chủng vi sinh vật gây bệnh phổ biến trên cá lóc bao gồm Pseudomonas aeruginosa và Streptococcus agalactiae, được phân lập từ cá lóc bệnh (Phạm Minh C, 2012)

Chu n b môi tr ng: pha môi tr ng NA h p vô trùng, 121 O C, 15 phút

Chu n b ch ng vi sinh v t: (Mai Th H ng và c ng s , 2011)

• T ng sinh các ch ng vi khu n th nghi m và vi khu n gây b nh trên môi tr ng th ch NA, canh NB l ng 37 O C, 24 gi

Sử dụng tăm bông vô trùng để thu thập vi khuẩn gây bệnh trong nước tiểu, hòa vào dung dịch muối 0,85% và so sánh đặc điểm với dung dịch Mc Farland 0,5, đạt nồng độ huyền phù vi sinh vật khoảng 10^8 CFU/ml.

• Ly tâm d ch vi khu n th nghi m trong môi tr ng NB, thu l y d ch n i

Ph t vi khu n gây b nh lên b m t th ch b ng cách dùng que t m bông vô trùng nhúng vào dung d ch huy n phù vi sinh v t

D ng c đ c l th ch (đ ng kính 6 mm) n nh lên b m t th ch đ l y ra nh ng th i th ch hình tr , t o thành các gi ng trên môi tr ng th ch đ a

Dựng pipette hýt 50 µL để ly tâm vi sinh và thử nghiệm mẫu vào các giếng Để giữ mẫu trong giếng khô, tán hỗn hợp vào trong thí nghiệm nhiệt độ mát 4°C, sau đó chuyển đến 37°C trong 24 giờ (Mai Thị Hằng và cộng sự, 2011).

Ki m tra xu t di n vòng vô khu n xung quanh các gi ng

N u có vòng vô khu n, l t s p đ a petri dùng th c đo đ ng kính vòng vô khu n (Mai Th H ng và c ng s , 2011)

Thí nghi m kh n ng t ng thích gi a 2 ch ng th nghi m

Chất kháng sinh là những hợp chất sinh học có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và virus, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe Chúng được tổng hợp từ tự nhiên và có khả năng tác động mạnh mẽ đến các tác nhân gây bệnh Việc sử dụng chất kháng sinh giúp ngăn ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng hiệu quả.

Chu n b môi tr ng: pha môi tr ng NA h p vô trùng, 121 O C, 15 phút

Chu n b ch ng vi sinh v t: (Mai Th H ng và c ng s , 2011)

• T ng sinh các ch ng vi sinh v t c n th nghi m trên môi tr ng th ch NA và

• Dùng t m bông vô trùng ph t l y vi khu n trong ng th ch NA, hòa vào ng n c mu i 0,85%, so sánh đ đ c v i ng Mc Farland 0,5 t o d ch huy n phù vi sinh v t m t đ 10 8 CFU/mL

• Ly tâm d ch vi khu n trong môi tr ng NB, thu l y d ch n i

Ph t vi khu n ki m đnh lên b m t th ch b ng cách dùng que t m bông vô trùng nhúng vào dung d ch huy n phù vi sinh v t

Dùng d ng c đ c l th ch (đ ng kính 6 mm) n nh lên b m t th ch đ l y ra nh ng th i th ch hình tr , t o thành các gi ng trên môi tr ng th ch đ a

Dựng pipette hỳt 50 µL để ly tâm các vi sinh vật và tiến hành thí nghiệm Để đạt được độ chính xác, cần đưa các giọt vào môi trường thích hợp, sau đó ủ ở nhiệt độ 4°C và chuyển sang 37°C trong 24 giờ (Mai Th Hồng và cộng sự, 2011).

Ki m tra xu t di n vòng vô khu n xung quanh các gi ng

N u có vòng vô khu n, l t s p đ a petri dùng th c đo đ ng kính vòng vô khu n (Mai Th H ng và c ng s , 2011)

Ph ph m cá (đ u, vây, v y, n i tang…), cá t p sau khi mua t ch v , đ c r a s ch, xay nhuy n l n 1 b ng c i xay, xay nhuy n l n 2 b ng máy xay, tr n đ u v i ẵ n c c t

Nguyên li u cá sau khi s ch có th s d ng ngay ho c gi l nh 4 O C, 24 gi (Arvanitoyannis, 2008)

Thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p

Nguyên li u cá đ c kh trùng b ng nhi t 3 đi u ki n: (Nguy n c L ng và c ng s , 2011)

Hi u qu c a các ph ng pháp kh trùng đ c xác đnh b ng các giá tr :

• M t đ vi sinh v t trong các m u đ c xác đ nh tr c và sau khi kh trùng b ng ph ng pháp xác đ nh gián ti p s l ng VSV (m c 2.5.2)

• Giá tr đ m nit t ng s đ c xác đnh b ng ph ng pháp Kjeldahl (m c 2.6.1) sau khi kh trùng

Giá trị định lượng axit amin được xác định bằng phương pháp định lượng đạm axit amin tại thời điểm sau khi khử trùng và 5 ngày sau khi thay phân, với các điều kiện bao gồm mật độ vi khuẩn ban đầu 10^6 CFU/mL, nồng độ NaCl 5%, và pH = 6,5.

Dựa trên nghiên cứu của Nguyễn Thị Trân Thủy (2009), hai chủng vi khuẩn B polyfermenticus F27 và B subtilis Q111 được nuôi cấy trong 20 mL môi trường NB ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ với tốc độ lắc 200 vòng/phút Trước khi tiến hành thí nghiệm, vi khuẩn sau khi nuôi cấy được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang (mục 2.5.1) để đảm bảo độ chính xác trong quá trình thí nghiệm.

Chu n b d ng c đ ng m u: bình serum 100 mL h p vô trùng 121 O C, 15 phút Nguyên li u cá sau khi qua s ch đ c cho vào các bình serum, m i bình 50 mL

Nguyên li u cá sau khi s ch đ c cho vào bình schott sau đó đ c kh trùng v i các đi u ki n khác nhau theo b ng 2.1

B ng 2.1 B ng b trí thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng

Th t Nghi m th c Th tích nguyên li u Nhi t đ Th i gian

Ki m tra m t đ vi sinh trong các m u: pha loãng dch cá đ n n ng đ thích h p trang lên đ a NA 37 O C, 24 gi

Ki m tra kh n ng th y phân c a nguyên li u cá v i đi u ki n: m t đ VK ban đ u là 10 6 CFU/mL, n ng đ NaCl là 5%, n ng đ m t r 0%, pH = 6,5

K t qu m t đ vi sinh đ c xác đ nh theo ph ng pháp gián ti p (m c 2.5.2)

Ki m tra các ch s đ m: đ m nit t ng s b ng ph ng pháp Kjeldahl (m c

2.6.1), đ m axit amin b ng ph ng pháp đ nh đ m axit amin (m c 2.6.2) t i 2 th i đi m b t đ u và sau khi th y phân 5 ngày.

Thí nghi m x ác đ nh y u t nh h ng

2.13.1 Thi t k thí nghi m xác đnh y u t quan tr ng nh h ng đ n quá trình th y phân, thí nghi m đ c b trí v i các bi n s sau: n ng đ vi sinh v t b sung, n ng đ mu i, pH (Tr n Thanh D ng, 2007), n ng đ m t r b sung (Lê Xuân Ph ng, 2008)

Thí nghi m đ c b trí theo thi t k Plackett – Burman (Plackett và Burman,

1946) m i nghi m th c đ c th c hi n v i 3 l n l p l i và x lý k t qu b ng ph n m m Minitab 16 c a Minitab Inc (USA)

Giá tr các bi n s đ c trình bày trong b ng 2.2 v i m i bi n đ c kh o sát 2 m c đ cao (+1) và th p (-1)

B ng 2.2 Giá tr các bi n s trong thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng đ n quá trình th y phân theo thi t k Plackett – Burman

Nghiên cứu của Trần Thanh Dũng (2007) đã chỉ ra rằng pH từ 4 đến 5,7 ảnh hưởng đến sự phát triển của các yếu tố dinh dưỡng, thể hiện qua việc xác định hàm lượng axit amin sau 36 thí nghiệm Các giá trị trung bình của các yếu tố này được mô tả qua phương trình hồi quy, trong đó các giá trị trung bình được ký hiệu là X_i (i = 1, 2, 3, 4).

V i: : là ch n (intercept) t c giá tr lúc X i = 0 i: là đ d c (gradient) c a y u t th i

D a vào ph ng trình h i quy, n u m c ý ngh a đ t trên 95% (p < 0,05), thì y u t đó đ c coi là có nh h ng đ n s th y phân nguyên li u cá (Nguy n V n Tu n,

D khuẩn B polyfermenticus F27 và B subtilis Q111 được nuôi cấy trong 20 mL môi trường NB ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ với tốc độ lắc 200 vòng/phút (Nguyễn Thị Trần Thủy, 2009) Sau khi nuôi cấy, một loại vi khuẩn đã được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang (mục 2.5.1) trước khi bắt đầu thí nghiệm để đảm bảo độ chính xác và tránh sai sót trong quá trình nghiên cứu.

Chu n b d ng c đ ng m u: bình serum 100 mL h p vô trùng 121 O C, 15 phút Nguyên li u cá sau khi qua s ch và kh trùng đ c cho vào các bình serum, m i bình 50 mL

Các y u t kh o sát đ c b sung theo đúng thi t k Plackett – Burman c a ph n m m Minitab 16

Các y u t không đ c kh o sát đ c gi c đ nh:

Sau 20 ngày th y phân, k t qu đ c xác đ nh b ng cách đo n ng đ đ m axit amin trong các bình serum N ng đ đ m đ c xác đnh b ng ph ng pháp đnh l ng đ m axit amin (m c 2.6.4)

K t qu sau khi xác đ nh đ c th ng kê, phân tích b ng ph n m m Minitab 16.

Thí nghi m kh i đ u

Sau khi xác định các yếu tố ảnh hưởng chính, chúng tôi tiến hành thí nghiệm khởi đầu của phương pháp tối ưu hóa với những yếu tố không có ý nghĩa thống kê trong thí nghiệm trước đó đã được loại bỏ.

Thí nghiệm được thiết kế riêng phần theo phương pháp Plackett – Burman, với việc bổ sung các điểm thí nghiệm trung tâm nhằm đánh giá mức độ phù hợp của phương trình bậc nhất trong việc xây dựng hàm mục tiêu.

M i y u t đ c kh o sát 3 m c đ : m c đ cao (+1) và m c đ th p (-1) và m c trung tâm (0) Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp quy ho ch th c nghi m b ng ph n m m th ng kê Minitab 16 Thí nghi m đ c l p l i 3 l n

(Nguy n V n D và c ng s , 2011) nh h ng c a các y u t đ n s th y phân, th hi n qua đ đ m axit amin (Tr n Thanh D ng, 2007), đ c mô t qua ph ng trình h i quy b c nh t g i giá tr y u t th i là X i (i = 1, 2, 3, 4) là:

V i: : là ch n (intercept) t c giá tr lúc X i = 0 i: là đ d c (gradient) c a y u t th i

D ch khu n, d ng c đ ng m u, nguyên li u cá đ c chu n b t ng t m c 2.13.2

Ti n hành thí nghi m kh i đ u theo thi t k c a ph n m m Minitab 16 v i 3 c p đ thí nghi m (-1; 0; 1) cho m i y u t , th c hi n 3 l n l p l i và x lý k t qu b ng ph n m m Minitab 16

Các y u t không đ c kh o sát đ c gi c đ nh:

Sau 72 gi th y phân, k t qu đ c xác đnh t ng t m c 2.13.3.

Tìm kho ng t i u c a các y u t nh h ng chính b ng ph ng pháp leo

Nghiên cứu này nhằm xác định một hàm mục tiêu bằng một hàm hồi quy bậc nhất, điều này cho thấy vùng thí nghiệm không gần vùng cực trị Các thí nghiệm leo dốc được thực hiện để xác định vùng cực trị Các thông số cho phương pháp này được tính toán thông qua hồi quy tuyến tính của thí nghiệm khởi đầu, với công thức y = b + b1x1 + b2x2 + + bnxn.

T m c c s c a các y u t này và các h s h i quy, các b c chuy n đ ng s đ c tính nh sau:

Ch n b c chuy n đ ng ng v i y u t có giá tr tuy t đ i c a h s h i quy l n nh t và tính toán các b c chuy n đ ng còn l i b ng các công th c:

= b b Trong đó: : kho ng bi n thiên b : h s h i quy c a y u t x 1 : b c chuy n đ ng c a y u t x 1

T k t qu tính toán b c chuy n đ ng c a t ng y u t nh h ng, thí nghi m b t đ u t m c trung tâm c a các y u t nh h ng chính (Nguy n V n D và c ng s , 2011)

D ch khu n, d ng c đ ng m u, nguyên li u cá đ c chu n b t ng t m c 2.13.2

Ti n hành thí nghi m leo d c theo theo giá tr b c chuy n đ ng đã tính đ c, m i y u t nh h ng đ c c ng thêm m t giá tr b c chuy n đ ng trong m i b c leo d c

Các y u t không đ c kh o sát đ c gi c đ nh:

Sau 72 gi th y phân, k t qu đ c xác đnh t ng t m c 2.13.3.

Thí nghi m b m t ch tiêu

Khi tiến hành thí nghiệm trong vùng cực, việc sử dụng thiết kế Box-Behnken giúp xác định mức độ ảnh hưởng của các yếu tố chính Kết quả từ các thí nghiệm trước đó đã chứng minh tính hiệu quả của phương pháp này trong việc đánh giá các yếu tố ảnh hưởng.

Thiết kế thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp Box-Behnken sử dụng phần mềm thống kê Minitab 16 Nghiên cứu tập trung vào ba mức độ: mức cao (+1), mức thấp (-1) và mức trung tâm Các yếu tố ảnh hưởng được khảo sát nhằm tối ưu hóa quy trình.

(0) Thí nghi m đ c l p l i 3 l n (Nguy n V n D và c ng s , 2011)

Các y u t không đ c kh o sát đ c gi c đ nh:

D ch khu n, d ng c đ ng m u, nguyên li u cá đ c chu n b t ng t m c 2.13.2

Ti n hành thí nghi m b m t ch tiêu theo thi t k Box – Behnken c a ph n m m Minitab 16 v i 3 m c đ thí nghi m (-1; 0; 1) cho m i y u t , th c hi n 3 l n l p l i và x lý k t qu b ng ph n m m Minitab 16

Sau 72 gi th y phân, k t qu đ c xác đnh b ng cách ki m tra n ng đ đ m axit amin và m t đ vi khu n có l i trong các m u thí nghi m

N ng đ đ m axit amin đ c xác đnh b ng ph ng pháp đ nh l ng đ m axit amin (m c 2.6.4)

K t qu m t đ vi sinh v t đ c xác đnh b ng ph ng pháp gián ti p (m c 2.5.2)

K t qu sau khi xác đ nh đ c th ng kê, phân tích b ng ph n m m Minitab 16.

i th và vi th c a 2 ch ng vi khu n th nghi m

Sau 24 gi nuôi c y, 2 ch ng B polyfermenticus F27 và B subtilis Q111 đ c nhu m Gram c đi m c a vi th 2 ch ng vi khu n thí nghi m đ c mô t b ng 3.1, hình 3.1 và hình 3.2

B ng 3.1 c đi m đ i th và vi th c a 2 ch ng vi khu n th nghi m

Tên ch ng i th Vi th

Khu n l c tr ng đ c, b r ng c a, nhô, tâm lõm, khô

Tr c khu n, Gram d ng, đ ng riêng l ho c chu i đôi, sinh bào t , bào t hình b u d c, n m l ch tâm

Khu n l c tr ng đ c, b r ng c a, ph ng, b m t nh n, khô

Tr c khu n, Gram d ng, đ ng riêng l ho c chu i ng n, sinh bào t , bào t hình b u d c, n m l ch tâm

Hình 3.1 i th (a) và vi th (×100) (b) c a ch ng B polyfermenticus F27

Hình 3.2 i th (a) và vi th (×100) (b) c a ch ng Bacillus subtilis Q111

Thí nghi m kh n ng sinh enzym protease c a 2 ch ng vi khu n thí nghi m

Sau khi ti n hành thí nghi m th kh n ng sinh enzym protease c a 2 ch ng thí nghi m

Chúng tôi thu đ c k t qu th hi n hình 3.3

• Ch ng B polyfermenticus F27 t o đ c vòng phân gi i có đ ng kính 27 mm

• Ch ng B subtilis Q111 t o đ c đ c vòng phân gi i có đ ng kính 24 mm

Hình 3.3 K t qu th nghi m kh n ng sinh protease c a ch ng B polyfermenticus F27 (a) và B subtilis Q111 (b)

Kết quả thí nghiệm cho thấy các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease mạnh, phù hợp để sử dụng trong nghiên cứu phân giải nguyên liệu cá tạp Nghiên cứu của Nguyễn Thị Trân Thủy (2009) chỉ ra rằng chủng B subtilis KT10 tạo ra vòng phân giải có đường kính 22 mm.

Thí nghi m kh n ng đ i kháng v i vi khu n gây b nh trên cá lóc c a 2

Sau khi ti n hành thí nghi m đ i kháng gi a 2 ch ng vi khu n th nghi m và vi khu n g y b nh trên cá lóc, chúng tôi thu đ c k t qu th hi n hình 3.4 và 3.5:

• Ch ng B polyfermenticus F27 t o vòng kháng khu n trên đ a đã ph t vi khu n

Pseudomonas aeruginosa và Streptococcus agalactiae

• Ch ng B subtilis Q111 không t o vòng kháng khu n trên đ a đã ph t vi khu n

Pseudomonas aeruginosa và Streptococcus agalactiae

Hình 3.4 K t qu thí nghi m đ i kháng vi khu n gây b nh Pseudomonas c a 2 ch ng thí nghi m

(a): Pseudomonas aeruginosa đ c ph t trên m t th ch và d ch ly tâm B subtilis Q111 trong gi ng

(b): Pseudomonas aeruginosa đ c ph t trên m t th ch và d ch ly tâm B polyfermenticus F27 trong gi ng

Hình 3.5 K t qu thí nghi m đ i kháng vi khu n gây b nh Streptococcus c a 2 ch ng thí nghi m

(a): Streptococcus agalactiae đ c ph t trên m t th ch và d ch ly tâm B subtilis Q111 trong gi ng

(b): Streptococcus agalactiae đ c ph t trên m t th ch và d ch ly tâm B polyfermenticus F27 trong gi ng

Thí nghiệm cho thấy chủng B polyfermenticus F27 có khả năng kháng lại hai vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa và Streptococcus agalactiae, trong khi chủng B subtilis Q111 không có khả năng kháng đối với hai loại vi khuẩn này.

Thí nghi m t ng thích gi a 2 ch ng vi khu n thí nghi m

Thí nghi m th t ng thích gi a 2 ch ng vi sinh v t thí nghi m cho k t qu th hi n hình 3.6:

• Trên đ a đã ph t ch ng B polyfermenticus F27, d ch ly tâm c a ch ng B subtilis Q111 không t o vòng vô khu n

• Trên đ a đã ph t ch ng B subtilis Q111, d ch ly tâm c a ch ng B polyfermenticus F27 không t o vòng vô khu n

Hình 3.6 K t qu thí nghi m t ng thích gi a 2 ch ng thí nghi m

(a): B polyfermenticus F27 đ c ph t trên m t th ch và d ch ly tâm B subtilis Q111 trong gi ng

(b): B subtilis Q111 đ c ph t trên m t th ch và d ch ly tâm B polyfermenticus F27 trong gi ng

Kết quả thí nghiệm không xuất hiện vòng vô khuẩn do trong đĩa ly tâm không có tế bào sống, tránh hiện tượng xuất hiện vòng trong do cạnh tranh chất Thí nghiệm chỉ ghi nhận các chất do vi sinh vật tổng sinh ra, bao gồm kháng sinh, và các chất độc phát tán trên một môi trường không bị che chắn bởi các loại kháng sinh đó Như vậy, kết quả thí nghiệm thực tế cho thấy các chất trong thí nghiệm không có sự đề kháng lẫn nhau.

Nh v y, 2 ch ng B polyfermenticus F27 và B subtilis Q111 trong thí nghi m t ng thích nhau và có th s d ng chung đ t o ch ph m.

Thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p

Mật độ vi sinh vật (VSV) được xác định sau khi khử trùng hiệu quả các nhiệt độ khử trùng đối với nguyên liệu cá tươi Việc xác định mật độ VSV và mẫu nguyên liệu cá sau khi khử trùng cần được pha loãng đến nồng độ thích hợp để tiến hành kiểm tra môi trường.

NA (m c 2.5.1), 37 O C Sau 24 gi k t qu đ c ghi nh n trong b ng 3.2 và bi u đ 3.1:

B ng 3.2 So sánh m t đ vi sinh v t các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng

Th t Nghi m th c M t đ VSV (CFU/mL)

Trong cùng m t c t, các tr s có cùng m u t không có s khác bi t m c ý ngh a 5% qua phép th LSD

Bi u đ 3.1 So sánh m t đ vi sinh v t c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng

Biểu đồ 3.1 cho thấy mức độ vi sinh vật (VSV) của NT 1 cao hơn nhiều lần so với NT 2 còn lại Bảng 3.2 cũng cho thấy NT 1 khác biệt có ý nghĩa đối với NT 2 và NT 3, đồng thời cho thấy NT 2 và NT 3 không khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Các chỉ số định lượng được xác định sau khi khử trùng và thay phân cho biết sự ảnh hưởng của các nhiệt độ khử trùng đối với nguyên liệu cát tạp Kết quả kiểm tra các chỉ số định lượng được thể hiện trong bảng 3.3, biểu đồ 3.2, biểu đồ 3.3 và biểu đồ 3.4.

B ng 3.3 K t qu ki m tra các ch s đ m c a thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng

Th t Nghi m th c Nit t ng s

Trong cùng m t c t, các tr s có cùng m u t không có s khác bi t m c ý ngh a 5% qua phép th LSD

Bi u đ 3.2 So sánh ch s đ m nit t ng s c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng

Bi u đ 3.3 So sánh ch s đ m axit amin c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng t i th i đi m ngày 0

Bi u đ 3.4 So sánh ch s đ m axit amin c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng t i th i đi m ngày 5

DC NT 1 NT 2 NT 3 Đ m axit amin (mg/g)

DC NT 1 NT 2 NT 3 Đ m axit amin (mg/g)

B ng 3.3 và bi u đ 3.2 cho th y giá tr đ m nit c a nghi m th c đ i ch ng không có s khác bi t ý ngh a v i NT1 (70 O C – 30 phút) và khác bi t có ý ngh a v i NT2 (80 O C – 30 phút) và NT3 (121 O C – 30 phút)

Biểu đồ 3.3 cho thấy giá trị đỉnh của axit amin trong các thí nghiệm có sự khác biệt rõ rệt, với NT1 (70°C – 30 phút) và NT2 (80°C – 30 phút) đạt hiệu suất cao nhất Thí nghiệm ở nhiệt độ 121°C trong 30 phút cũng cho kết quả đáng chú ý, nhưng không cao bằng hai thí nghiệm trước đó Sự phân tích này chỉ ra rằng nhiệt độ và thời gian xử lý có ảnh hưởng lớn đến giá trị của axit amin trong các thí nghiệm thực nghiệm.

Biểu đồ 3.3 và biểu đồ 3.4 cho thấy giá trị đỉnh của axit amin tại thời điểm 5 của NT2 (80 °C – 30 phút) là cao nhất và có sự khác biệt có ý nghĩa đối với các nghiệm thức còn lại Trong khi đó, NT1 (70 °C – 30 phút) và NT3 (121 °C – 30 phút) không có sự khác biệt có ý nghĩa với nhau, nhưng đều cao hơn và khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức đối chứng.

T các s li u th ng kê trên cho th y, hi u qu kh trùng 80 O C – 30 phút và

Nhiệt độ 121°C trong 30 phút mang lại hiệu quả tiệt trùng cao hơn so với nhiệt độ 70°C trong cùng khoảng thời gian Các điều kiện tiệt trùng cho thấy rằng nhiệt độ 80°C trong 30 phút là hiệu quả nhất, giúp giảm thiểu các ảnh hưởng đến nguyên liệu nhạy cảm Do đó, việc sử dụng nhiệt độ 80°C trong 30 phút được coi là điều kiện tiệt trùng tối ưu cho các thí nghiệm tiếp theo.

Thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng

Thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thay phân cá tạp theo thiết kế của Plackett - Burman đã được thực hiện bằng phần mềm Minitab, với 4 yếu tố đầu vào gồm nồng độ NaCl, nồng độ mật r, và pH Kết quả được trình bày trong bảng 3.4, cho thấy nồng độ axit amin có sự biến đổi đáng kể.

B ng 3.4 B trí và k t qu thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng theo thi t k Plackett - Burmen

Bằng cách thay đổi các yếu tố trong thí nghiệm, giá trị đỉnh của axit amin sinh ra từ quá trình thủy phân đã tăng từ 903 mg/L lên 1302 mg/L Mục đích của nghiên cứu này là xác định ảnh hưởng của các yếu tố khoáng sát đến kết quả thí nghiệm.

Sau khi xử lý số liệu, phần mềm Minitab cho thấy mối liên hệ giữa các yếu tố thể hiện trong hình 3.5 và thông tin mô hình hồi quy (phần 4a) Từ những thông tin đó, chúng tôi nhận thấy rằng yếu tố pH có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả.

Nghiên cứu cho thấy rằng yếu tố đầu tiên có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thay phân cá t p với giá trị p ≤ 0,000, cho thấy ý nghĩa thống kê Yếu tố thứ hai liên quan đến nồng độ VK bổ sung có giá trị p = 0,007, cũng cho thấy ý nghĩa thống kê Tiếp theo, yếu tố nồng độ NaCl có giá trị p = 0,024, chứng tỏ ảnh hưởng đáng kể Ngược lại, yếu tố thứ ba không có ảnh hưởng rõ rệt với giá trị p = 0,184, không đạt yêu cầu ý nghĩa thống kê Điều này phù hợp với yêu cầu chuẩn hóa trong phân tích.

T thông tin mô hình h i quy (ph l c 4a) ta vi t đ c ph ng trình h i quy b t nh t mô t s nh h ng c a các y u t đ n quá trình th y phân cá t p th hi n qua giá tr đ m axit amin:

V i giá tr y u t th i là X i (i = 1, 2, 3) l n l t là:

Quan sát ảnh hưởng của độ mặn và độ bền vi khuẩn đến hàm lượng amino acid trong phẩm vi khuẩn sát cho thấy rằng khi độ bền vi khuẩn ban đầu càng thấp, nồng độ NaCl càng cao và giá trị pH càng thấp thì hàm lượng amino acid đạt được càng cao (Nguyễn Văn D, 2011).

Qua b ng phân tích ph ng sai c a thí nghi m (ph l c 4b) ta th y đ c h s R 2

Giá trị R 2 trong nghiên cứu cho thấy mức độ ảnh hưởng của các yếu tố trong thí nghiệm liên quan đến giá trị đỉnh của axit amin, đạt 52,73% Để cải thiện độ chính xác của kết quả, cần tiến hành thêm các nghiên cứu thí nghiệm với nhiều yếu tố khác nhau (Nguyễn Văn Tuân, 2007)

Thí nghi m kh i đ u

T k t qu thí nghi m xác đnh y u t nh h ng, thí nghi m kh i đ u đ c thi t k v i các y u t nh h ng chính là: m t đ VK b sung (CFU/mL), n ng đ NaCl

Để xác định vùng khảo sát phù hợp với mô hình bậc nhât, cần xem xét ba mức độ pH: thấp (-1), cao (1) và trung bình (0) Các giá trị pH được đánh giá và thể hiện trong bảng 3.5, giúp nhận diện rõ ràng các điều kiện thích hợp cho nghiên cứu.

B ng 3.5 Giá tr bi n s c a thí nghi m kh i đ u theo thi t k Plackett – Burman

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện 45 thí nghiệm, bao gồm 9 thí nghiệm tại điểm trung tâm, được thiết kế riêng biệt Các thí nghiệm này được phân tích và xử lý dữ liệu bằng phần mềm thống kê Minitab 16, đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong quy trình nghiên cứu.

B ng b trí thí nghi m và k t qu th c nghi m đ c trình bày b ng 3.6

B ng 3.6 B trí và k t qu thí nghi m kh i đ u t i u hóa các y u t nh h ng

M t đ VK (CFU/mL) N ng đ NaCl (%) pH m axit amin

Trong thí nghiệm T b ng 3.6, giá trị đậm đặc axit amin đã tăng từ 5,67 g/L lên 6,30 g/L khi các yếu tố được điều chỉnh Kết quả cho thấy giá trị đậm đặc axit amin (g/L) đã tăng đáng kể, từ 1,30 g/L lên 6,30 g/L, cho thấy sự ảnh hưởng rõ rệt của các yếu tố trong thí nghiệm Mục đích của nghiên cứu này là xác định ảnh hưởng của ba yếu tố khoáng sát đến giá trị đậm đặc axit amin.

Sau khi xử lý số liệu, phần mềm Minitab cho thấy mối định hướng của các yếu tố thể hiện trong đồ thị 3.8 và thông tin mô hình hồi quy (phần 6a) Từ thông tin đó, chúng tôi nhận thấy yếu tố pH có độ tin cậy cao nhất với giá trị p = 0,1536 và giá trị thống kê (p ≤ 0,000) cho thấy có ý nghĩa thống kê, đồng thời là yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất, phù hợp với thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng Tiếp theo, yếu tố một đệm VK bổ sung có độ tin cậy cao thứ hai với giá trị p = 0,0486 và giá trị thống kê (p ≤ 0,000), cũng phù hợp với thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng Cuối cùng, yếu tố nồng độ NaCl có độ tin cậy thấp hơn với giá trị p = 0,005, cho thấy kết quả phù hợp với thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng và cũng phù hợp với hai yếu tố chuẩn hóa trong phần phân tích 5 (Nguyễn Văn D, 2011)

Mô hình hồi quy (phân loại 6a) cho phép chúng ta phân tích mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thay phân cá, thông qua việc đánh giá giá trị của các axit amin có trong sản phẩm.

V i giá tr y u t th i là X i (i = 1, 2, 3) l n l t là:

Bảng phân tích phương sai của thí nghiệm khí điều (phụ lục 6b) cho thấy "Lack of fit" của phương trình hồi quy bậc nhất có giá trị p thấp (p = 0,003), nhỏ hơn mức ý nghĩa 0,01 Bảng phân tích cũng cho thấy giá trị Curvature thấp (p = 0,013), cho thấy khả năng xuất hiện đường cong của bậc mục tiêu lên đến 98,7% Điều này có nghĩa là mô hình hồi quy bậc nhất không phù hợp, giá trị vùng khối sát đang gần vùng cực trị, ta có thể chuyển sang thí nghiệm bậc mục tiêu mà không cần thực hiện thí nghiệm leo dốc.

Thí nghi m b m t ch tiêu

3.8.1 K t qu thí nghi m b m t ch tiêu

Dựa vào kết quả của thí nghiệm khối đầu, mô hình bậc nhất được xác định là không phù hợp, có nghĩa là hàm mục tiêu đã gắn vùng cực trị Do đó, thí nghiệm leo dốc cần được thực hiện để đáp ứng bám sát theo thiết kế thí nghiệm bám mục tiêu.

Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp Box – Behnken với các yếu tố: mật độ VK bổ sung (CFU/mL), nồng độ NaCl (%) và pH, nhằm xác định giá trị tối ưu của các yếu tố này Mỗi yếu tố được xem xét ở ba mức độ: mức độ thấp (-1), mức độ cao (1) và mức độ trung tâm (0) Vì hàm mục tiêu đã gần vùng cực trị với các giá trị yếu tố ảnh hưởng của thí nghiệm khởi đầu, các giá trị này sẽ được giữ nguyên trong thí nghiệm bám sát mục tiêu Bảng bố trí thí nghiệm và kết quả thu được sẽ được trình bày trong bảng 3.7.

B ng 3.7 B trí và k t qu thí nghi m b m t ch tiêu t i u hóa các y u t nh h ng

Trong nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng giá trị đỉnh của axit amin sinh ra sau quá trình phân hủy đã thay đổi từ 5,67 g/L lên 6,30 g/L khi các yếu tố được điều chỉnh Kết quả cho thấy giá trị đỉnh axit amin (g/L) không thay đổi so với thí nghiệm mốc, vẫn giữ ở mức 6,30 g/L Bên cạnh đó, số lượng vi sinh vật (VSV) sau quá trình phân hủy đã tăng từ 0,13 × 10^8 lên 1,60 × 10^8.

 Phân tích ph ng trình h i quy mô t s nh h ng c a các y u t đ n quá trình th y phân

Mô hình hồi quy (phân loại 7a) cho phép phân tích mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thay phân Sau khi loại bỏ các hạng mục không có ý nghĩa thống kê, chúng ta có thể viết lại phương trình hồi quy để phản ánh chính xác các yếu tố này.

V i giá tr y u t th i là X i (i = 1, 2, 3) l n l t là:

B ng phân tích ph ng sai c a thí nghi m b m t ch tiêu (ph l c 7b) cho th y

“Lack of fit” c a ph ng trình h i quy có giá tr p value p = 0,129, l n h n so v i m c ý ngh a 0,05 i u này có ngh a s sai khác v i ph ng trình h i quy b c nh t l n

B ng phân tích c ng cho th y giá tr p value c a các thành ph n riêng r c a mô hình h i quy đ u có ý ngh a:

• Interaction (t ng tác): p = 0,040 i u này cho th y ý ngh a c a chúng trong ph ng trình h i quy cao

Các thông s trên ch ng t ph ng trình h i quy hi n t i r t phù h p v i d li u Ta có th ti n hành b c t i u hóa đ tìm c c tr cho hàm m c tiêu

 Phân tích ph ng trình h i quy mô t s nh h ng c a các y u t đ n m t đ VSV trong quá trình th y phân

Mô hình hồi quy (phương pháp 8a) cho phép phân tích mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng đến mật độ vi sinh vật (VSV) trong quá trình thay phân Sau khi loại bỏ các hồ sơ không có ý nghĩa thống kê, chúng ta có thể viết lại phương trình hồi quy để phản ánh rõ ràng sự tác động của các yếu tố này.

V i giá tr y u t th i là X i (i = 1, 2, 3) l n l t là:

B ng phân tích ph ng sai c a thí nghi m b m t ch tiêu (ph l c 8b) cho th y

Giá trị p = 0,266 cho thấy "lack of fit" trong mô hình hồi quy không có ý nghĩa thống kê so với mức ý nghĩa 0,05, điều này chỉ ra rằng mô hình hồi quy bậc nhất không phù hợp Phân tích cũng cho thấy giá trị p của các thành phần riêng rẽ trong mô hình hồi quy đầu tiên có ý nghĩa.

Tương tác có ý nghĩa quan trọng với p = 0,028 trong phương trình hồi quy cao, cho thấy rằng chúng ta có thể tối ưu hóa và tìm kiếm các giá trị cho hàm mục tiêu.

Tối ưu hóa quá trình thủy phân biểu diễn trực quan mối quan hệ giữa hàm mục tiêu tối đa hóa amino acid và các cấp biến thí nghiệm có thể sử dụng để đạt được mục tiêu Biểu đồ 3.9 minh họa mối quan hệ này, với ngầm mục (bên trái) và ngầm đáp ứng (bên phải) của các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân.

Cách xác định vùng cực trị của hàm mục tiêu thường mang tính chủ quan và không chính xác Việc xác định vùng cực trị khi có nhiều hơn hai biến độc lập là rất khó khăn Do đó, để xác định chính xác vùng cực trị của hàm mục tiêu, cần sử dụng công cụ tối ưu hóa của phần mềm Minitab 16.

K t qu t i u hóa quá trình th y phân nguyên li u cá th hi n trong hình 3.7

Hình 3.7 K t qu t i u hóa quá trình th y phân nguyên li u cá b ng công c t u hóa c a ph n m m Minitab 16

T hình 3.7, chúng thôi nh n th y đ m axit amin đ t giá tr t i u 6,30 g/L khi các y u t nh h ng có giá tr :

Tiêu hóa một đ VSV sau quá trình thay phân biểu diễn trực quan mối quan hệ giữa hàm mục tiêu một đ VSV và tín hiệu đáp ứng trong thí nghiệm có sử dụng đ th b m t Hình 3.10 minh họa ng m c (bên trái) và b m t đáp ứng (bên phải) của t ng c p, cho thấy các yếu tố ảnh hưởng đến một đ VSV sau quá trình thay phân.

Việc xác định vùng cực trị của hàm mục tiêu thường gặp khó khăn do tính chủ quan và không chính xác trong cách tiếp cận Đặc biệt, khi có nhiều hơn hai biến, việc xác định chính xác vùng cực trị trở nên phức tạp Do đó, để đạt được kết quả chính xác, cần sử dụng công cụ tối ưu hóa của phần mềm Minitab 16.

K t qu t i u hóa m t đ VSV trong quá trình th y phân nguyên li u cá th hi n trong hình 3.8

Hình 3.8 K t qu t i u hóa m t đ VSV sau quá trình th y phân nguyên li u cá b ng công c t u hóa c a ph n m m Minitab 16

T hình 3.8, chúng thôi nh n th y m t đ VSV đ t giá tr t i u 1,36 × 10 8 CFU/mL khi các y u t nh h ng có giá tr :

 T i u hóa quá trình th y phân và m t đ VSV sau quá trình th y phân

T 2 k t qu t i u hóa đ n m c tiêu, ta có giá tr t i u c a đ m axit amin là 6,30 g/L, giá tr t i u c a m t đ VSV là 1,36 × 10 8 CFU/mL

Mục tiêu chính của đề tài là tạo ra sản phẩm có thành phần dinh dưỡng cao, trong đó vai trò probiotic của các vi sinh vật tham gia thải phân được xác định Chúng tôi quyết định chọn mục tiêu tối ưu giá trị đạm axit amin có ý nghĩa quan trọng hơn (Import = 1) so với mục tiêu tối ưu giá trị mật độ vi sinh vật (Import = 0,5) Đồng thời, giá trị Lower của mục tiêu đạm axit amin được chọn là 6 g/L (tương ứng 95,23% giá trị đạm axit amin tối ưu) và giá trị Lower của mục tiêu mật độ vi sinh vật là 10^8 CFU/mL (tương ứng 73,53% giá trị mật độ vi sinh vật tối ưu).

K t qu t i u hóa đa m c tiêu đ m axit amin và m t đ VSV trong quá trình th y phân nguyên li u cá th hi n trong hình 3.9

Hình 3.9 K t qu t i u hóa đa m c tiêu hi u qu th y phân và m t đ VSV sau quá trình th y phân nguyên li u cá b ng công c t u hóa c a ph n m m

T hình 3.9, chúng thôi nh n th y đ m axit amin đ t giá tr t i u t i giá tr 6,27 g/L và m t đ VSV đ t giá tr t i u t i giá tr 1,22 × 10 8 CFU/mL khi các y u t nh h ng có giá tr :

Giá trị đỉnh của nồng độ axit amin trong thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng đạt 1,30 g/L Qua các thí nghiệm tối ưu hóa, chúng tôi đã đạt được nồng độ axit amin tối ưu là 6,27 g/L Đồng thời, mục tiêu thứ hai là đạt số lượng vi sinh vật có ích là 1,22 × 10^8, so với giá trị ban đầu là 10^7.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, giá trị tối đa của vi khuẩn đạt được là 10^7 CFU/mL sau thời gian thí nghiệm 3 ngày So với nghiên cứu của Trần Thanh Dũng năm 2007, kéo dài 10 ngày, thời gian thí nghiệm ngắn hơn cho thấy hiệu quả thay phân tăng lên khi lượng vi khuẩn bổ sung càng lớn.

Nghiên cứu của Trần Thanh Dũng cho thấy sự khác biệt đáng kể trong nồng độ NaCl và pH, với nồng độ NaCl là 5,61% so với 7% và pH là 5,52 so với pH 5,2 Nguyên nhân của sự khác biệt này có thể được giải thích bởi sự khác nhau về vật liệu vi khuẩn sử dụng trong các thí nghiệm phân tích.

K t lu n

T k t qu c a các thí nghi m và phân tích s li u, chúng tôi đã hoàn thành m c tiêu đ ra và có m t s k t lu n sau:

Hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Q111 và Bacillus polyfermenticus F27 được sử dụng trong thí nghiệm thử nghiệm phân nguyên liệu cá, cho thấy khả năng sinh protease mạnh mẽ và khả năng kết hợp trong cùng một chế phẩm Đặc biệt, chủng B polyfermenticus F27 có khả năng kháng lại hai giống vi khuẩn gây bệnh cho cá lóc là Pseudomonas và Streptococcus.

• Trong 4 y u t thí nghi m, có 3 y u t nh h ng chính đ n quá trình th y phân nguyên li u cá là m t đ vi khu n b sung, n ng đ NaCl và pH

Quá trình tối ưu hóa đa mục tiêu cho giá trị đạm amino tối đa đạt 6,27 g/L và mật độ vi sinh vật tối ưu là 1,22 × 10^8 CFU/mL, với các yếu tố ảnh hưởng chính bao gồm: mật độ vi khuẩn bổ sung 10^7 CFU/mL, nồng độ NaCl 5,61%, và pH 5,52, được thực hiện trong thời gian 72 giờ.

ngh

Do đ tài có th i gian và kinh phí có h n, cùng v i m t s khó kh n trong quá trình th c hi n đ tài nên chúng tôi xin đ a ra m t s đ ngh đ hoàn thi n k t qu nghiên c u:

• ánh giá s nh h ng c a vi sinh v t trong nguyên li u không b tiêu di t sau quá trình kh trùng đ n quá trình th y phân

• Kh o sát thêm m t s y u t có nh h ng đ n quá trình th y phân nguyên li u cá t p (th i gian, nhi t đ ,…)

• Kh o sát thêm ph ng pháp kh mùi cho ch ph m mà không nh h ng đ n các vi sinh v t có l i

• Nghiên c u bi n pháp b o qu n ch ph m sau khi th y phân

• ánh giá ch ph m trên cá lóc đ kh o sát hi u qu c a ch ph m

[1] Ki u H u Ánh (2008), Giáo trình vi sinh v t h c công nghi p, NXB Khoa

[2] Minh Chung và Lê Xuân Sinh (2010), “Phân tích chu i giá tr cá lóc (Channa sp.) nuôi ng b ng sông C u Long” K y u H i ngh khoa h c th y s n tr ng i h c C n Th , 4, tr 512 – 523

[3] Nguy n V n D (2011), Quy ho ch th c nghi m trong k thu t, NXB Khoa h c và K thu t Hà N i

Nghiên cứu của Trần Thanh Dũng (2007) về việc sử dụng chế phẩm cá Tra bông kết hợp với vi khuẩn Bacillus subtilis làm phân bón cho cây H đã được công bố trong tài liệu khoa học cấp trung Nghiên cứu này được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.

[5] Nguy n Hoàng Tu n Duy, Ph ng Qu nh, D ng Nh t Linh, Nguy n

V n Minh (2013), “Phân l p và sàng l c vi khu n Bacillus spp có ho t tính probiotic dùng cho cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus)” H i ngh CNSH toàn qu c t i khu v c phía Nam

Nghiên cứu của Phạm Minh C, Trần Ngọc Tuấn và Trần Thế Thành Hiền (2012) về mầm bệnh trên cá lóc (Channa striata) nuôi ao thâm canh tại An Giang và Đồng Tháp đã được công bố trong Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tập 2b, trang 124 – 132 Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về tình trạng sức khỏe của cá lóc trong môi trường nuôi trồng thủy sản, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo vệ nguồn lợi thủy sản.

[7] Quý Hai, Tr n Thanh Phong (2008), Công ngh và ng d ng Enzyme, i h c Hu

[8] Mai Th H ng, inh Th Kim Nhung, V ng Tr ng Hào (2011), Th c hành

[9] Nguy n V n Hi u (2012), “Nghiên c u thu nh n protease ki m tái t h p có ho t tính keratinase t vi khu n và ng d ng trong công nghi p thu c da”,

Lu n án Ti n s, Tr ng i h c Bách khoa Hà N i

Nghiên cứu của Trần Thị Mỹ Khanh và Võ Thị Hồng Lan (2011) tại Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, Đại học Kỹ thuật Công nghệ TP.HCM, tập trung vào việc tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng xử lý protein và nâng cao khả năng xử lý nước thải sinh hoạt.

[11] Giang Th Kim Liên (2009), Bài gi ng Quy ho ch th c nghi m, Tr ng i h c à N ng

Nguyễn Thùy Linh (2010) đã thực hiện một nghiên cứu về việc sử dụng nguồn thực phẩm cho cá tra và cá bỉnh nuôi tại tỉnh Trà Vinh Báo cáo này được công bố trong tài liệu tổng kết của Khoa học và Công nghệ, Nhà xuất bản Trường đại học Trà Vinh, nhằm cung cấp thông tin hữu ích cho ngành nông nghiệp địa phương.

[13] D ng Nh t Long (2003), “K thu t nuôi cá lóc đen (Channa striata Bloch,

1793)”, B môn K thu t nuôi cá n c ng t, Khoa Th y s n - i h c C n

[14] Nguy n c L ng (2004), Công ngh Enzme, NXB i h c Qu c gia TP.HCM

[15] Nguy n c L ng, Phan Th Huy n, Nguy n Ánh Tuy t (1996), Vi sinh v t công nghi p T p 2, Tr ng i H c Bách Khoa TP.HCM

[16] Nguy n c L ng, Phan Th Huy n, Nguy n Ánh Tuy t (2011), Thí nghi m Công ngh Sinh h c T p 2: Thí nghi m Vi sinh v t h c, NXB i h c Qu c Gia TP.HCM

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Minh và các đồng tác giả (2010) về việc phân lập và sàng lọc các vi khuẩn tiềm năng làm probiotic trong nuôi trồng thể sán tươi (Perionyx excavatus) đã được trình bày tại Hội nghị CNSH toàn quốc Các tác giả đã chỉ ra tầm quan trọng của probiotic trong việc cải thiện chất lượng và hiệu quả của quá trình nuôi trồng.

[18] Nguy n V n Minh, Nguy n Hoàng Tu n Duy, Ph ng Qu nh, Võ Ng c

Y n Nhi, D ng Nh t Linh, Nguy n Th Ng c T nh, Lê H ng Ph c

(2013), “Kh n ng ki m soát sinh h c Edwardsiella ictaluri gây b nh c a m t s ch ng Bacillus spp phân l p t ao nuôi cá tra” H i ngh khoa h c công ngh qu c t ISCE

[19] Ph m Th Tuy t Ngân (2007), Giáo trình vi sinh v t h u ích, Khoa th y s n, tr ng i h c C n Th

Nghiên cứu của Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng và Trương Quang Bình (2009) tập trung vào việc ứng dụng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis trong quá trình chế biến và phân hủy phụ phẩm cá tra Công trình này được công bố tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, góp phần quan trọng vào việc phát triển công nghệ xử lý phụ phẩm trong ngành thủy sản.

[21] L ng c Ph m (2004), Công ngh Vi sinh v t, NXB Nông nghi p, Hà

[22] Lê Xuân Ph ng (2008), Vi sinh v t h c môi tr ng, H Bách Khoa à

[23] Lê Xuân Sinh và Minh Chung (2009), “Kh o sát các mô hình nuôi cá lóc (Channa micropeltes và Channa striatus) ng b ng Sông C u Long”, Khoa Th y s n, i h c C n Th

[24] Nguy n V n Tu n (2007), H ng d n phân tích s li u và v bi u đ b ng

R, Ch 10, NXB i h c Qu c gia TP.HCM

Nghiên cứu hiện trạng khai thác và nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam đã được thực hiện bởi Trịnh Ngọc Tuấn (2005), với mục tiêu đề xuất phương pháp giải quyết các vấn đề liên quan Viện Nghiên cứu NTTS 1 đã tập trung vào việc quản lý, bảo vệ môi trường và phòng ngừa dịch bệnh trong khu vực miền Bắc.

[26] Ph m V n Ty và V Nguyên Thành (2009), Công ngh sinh h c T p n m – Công ngh vi sinh và môi tr ng, NXB Giáo D c

[27] Ph m Th Lan Thanh (2007), “Phân l p, đnh danh và nghiên c u ti m n ng Probiotic c a vi khu n Lactobacillus có ngu n g c t ng i”, Lu n v n

Th c s Sinh h c, Tr ng i h c T nhiên, i h c Qu c gia TP.HCM

[28] Th Bích Th y (2012), “Nghiên c u các y u t nh h ng đ n s thu nh n ch ph m protease ngo i bào c a Bacillus amyloliquefacien n1” T p chí khoa h c, i h c Hu , 71(2)

[29] Nguy n Th Tr n Th y (2009), “Nghiên c u tuy n ch n ch ng vi khu n Bacillus phân l p t đ t v n sinh Protease ki m”, Lu n v n Th c s Sinh h c, Tr ng i h c S ph m TP.HCM, B Giáo d c và ào t o

[30] Arvanitoyannis I S and Kassaveti A (2006), “Fish industry waste: treatments, environmental impacts, current and potential uses”, International Journal of Food Science and Technology, 43, pp 726 – 745

[31] Esteban M.B., Garcia A.J., Ramos P & Marquez M.C (2006), “Evaluation of fruit–vegetable and fish wastes as alternative feedstuffs in pig diets” Waste Management, 27, pp 193 – 200

[32] Gao M T., Hirata M., Toorisaka E., Hano T (2005), “Acid hyprolysis of fish wastes for lactic acid fermentation” Bioresource Technology, 97, pp

[33] Hammoumi A., Faid M., El Yachioui M & Amarouch H (1998),

“Characterization of fermented fish waste used in feeding trials with broilers” Process Biochemistry, 33, pp 423 – 427

[34] Harley J P và Prescott L M (2002), Laboratory Exercises in Microbiology, 5 th Edition

[35] Harry P R (1965), “A Bacillus subtilis proteinase”, The Journal of Biological Chemistry, 240(1)

[36] Holt J G., Krieg N R., Sneath P H A., Staley J T., Williams S T (2000), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9 th Edition

[37] Ikram-ul-Haq and Mukhtar H (2006), “Biosynthesis of protease from Lactobacillus paracasei: Kinetic analysis of fermentation parameters”

[38] Kashyap D R., Chandra S., Kaul A., Tewari R (2000), “Production, purification and characterization of pectinase form Bacillus sp DT7”, World Journal of Microbiology & Biotecnology, 16, pp 277 – 282

[39] Kim K M., Myo J K., Dong H K., You S P., Jae S K (2009),

“Characterization of Bacillus polyfermenticus KJS-2 as a Probiotic”, J Microbiol Biotechnol., 19(9), pp 1013 – 1018

[40] Kim Y S., Park J W & Choi Y J (2003), “New approaches for the effective recovery of fish proteins and their physicochemical characteristics” Fisheries Science, 69, pp 1231 – 1239

[41] Konsoula Z., Kyriakides M L (2005), “ -amylase production in aqueous two-phase systems by Bacillus subtilis”, FEBS Journal, 272, pp 2

[42] Martone C B., Perez Borla O & Sanchez J J (2005), “Fishery byproduct as a nutrient source for bacteria and archaea growth media” Bioresource Technology, 96, pp 383 – 387

[43] Mayday E E., Paquet D., Ramet J P and Linden G (1986), “Proteolytic activity of a Bacillus subtilis neutral protease preparation upon caseins and whey proteins of cow’s milk” Journal of Dairy Science, 69(2), pp 305 –

[44] Nguyen T T., Nguyen T L., Lindberg J E and Ogle B., (2007) “Survey of the production, processing and nutritive value of catfish by-product meals in the Mekong Delta of Vietnam”, Livestock Research for Rural Development, 19

[45] Plackett R L., Burman J P (1946), “The Design of Optimum Multifactorial Experiments”, Biometrika, 33(4), pp 305 – 325

[46] Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraete W (2000) “Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture”, Microbiol Mol Biol Rev, 64(4), pp 655 – 671

[47] Tr n Th Bé (2011), “B sung ch t d n d trong th c n th y s n”, http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId05, 11/11/2013

Ng c Di p (2011) đã nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cá lóc bông trong điều kiện công nghiệp, được công bố tại Trung tâm Khuyến nông An Giang Bài viết nhấn mạnh tầm quan trọng của việc áp dụng công nghệ trong nuôi trồng thủy sản để nâng cao hiệu quả sản xuất Thông tin chi tiết có thể được tìm thấy tại trang web của Sở Khoa học và Công nghệ An Giang.

[49] H u c (2011), “Nuôi cá lóc- Ngh m i phát” http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-vn/72/45/45/77979/Nuoi-ca-loc- nghe-moi-phat.aspx, 11/11/2013

Nguy cơ thoái hóa giống cá lóc là một vấn đề nghiêm trọng được nhấn mạnh bởi Nguyễn Kim Kiều (2012) trong bài viết của Trung tâm Khuyến nông An Giang Bài viết này cung cấp cái nhìn sâu sắc về tình trạng này và những tác động tiêu cực đến nguồn gen cá lóc, đồng thời kêu gọi sự chú ý từ cộng đồng và các nhà quản lý để bảo vệ và phát triển giống cá lóc bền vững Thông tin chi tiết có thể được tìm thấy tại trang web của Thủy sản Việt Nam.

Nguyễn Quang Minh nhấn mạnh rằng nhu cầu tiêu thụ cá lóc ngày càng tăng, dẫn đến việc nuôi cá thâm canh với chi phí cao, nhưng cũng tiềm ẩn nguy cơ dịch bệnh Thời tiết giao mùa là thời điểm dễ xảy ra dịch bệnh, do đó, người nuôi cần tuân thủ các yêu cầu kỹ thuật để hạn chế thiệt hại Các nguyên nhân gây bệnh bao gồm chất lượng nước kém, thức ăn không đảm bảo, và nguồn giống kém chất lượng Để phòng bệnh, cần cải tạo môi trường nuôi, tẩy độc ao và tăng cường chăm sóc quản lý, như tẩy trùng cá và dụng cụ cho ăn, cũng như chọn giống khỏe mạnh Việc bổ sung vitamin C và men tiêu hóa vào thức ăn cũng giúp tăng sức đề kháng cho cá.

[52] Ph m Th Tuy t Ngân (2011), “ ng d ng các dòng Bacillus sp có ích trong nuôi tr ng Th y s n”, http://uv- vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId91 11/11/2013

[53] S Nông nghi p và Phát tri n nông thôn t nh Th a Thiên Hu (2011), K thu t nuôi cá lóc nhím trong b xi m ng, http://khuyennonghue.org.vn/default.asp?sq=News&naidT1&caid,

Ph l c 1 Môi tr ng NA b sung 5% s a g y

Pha NB trong 2/3 th tích n c c t, h p ti t trùng 121 O C, 15 phút, 1 atm

1/3 th tích n c c t h p ti t trùng 121 O C, 15 phút, 1 atm

Cân s a g y vào 1/3 th tích n c c t đã h p ti t trùng m nhi t đ 60 O C Cho d ch s a g y vào d ch NB nhi t đ 60 O C, l c đ u

Ph l c 2 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p

Hình ph l c 2a K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v m t đ VSV c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p

Hình ph l c 2b K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s đ m nit t ng s c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p

Hình ph l c 2c K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s đ m axit amin ngày 0 c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p

Hình ph l c 2d K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t v ch s đ m axit amin ngày 5 c a các nghi m th c trong thí nghi m kh o sát nhi t đ kh trùng nguyên li u cá t p

Phân tích dữ liệu trong thí nghiệm xác định yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng amino acid đã được thực hiện bằng phần mềm Minitab 16 Hình ảnh chuỗi tối ưu hóa cho thấy bốn yếu tố khảo sát đã được xác định, trong khi biểu đồ Pareto làm nổi bật tầm quan trọng của các yếu tố này trong việc ảnh hưởng đến hàm lượng amino acid.

Ph l c 4 Thông tin mô hình h i quy và k t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng đ n quá trình th y phân nguyên li u cá t p

Hình ph l c 4a Thông tin mô hình h i quy c a thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng

Hình ph l c 4b K t qu p hân tích ph ng sai c a thí nghi m xác đ nh y u t nh h ng

Phân tích dữ liệu từ thí nghiệm khởi đầu tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ đạm amin được thực hiện bằng phần mềm Minitab 16 Trong đó, hình ảnh hóa các yếu tố này thông qua biểu đồ Pareto giúp xác định ba yếu tố quan trọng nhất Các yếu tố này được khảo sát kỹ lưỡng để tối ưu hóa nồng độ đạm amin trong thí nghiệm.

Ph l c 6 Thông tin mô hình h i quy và k t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m kh i đ u t i u hóa các y u t nh h ng đ n quá trình th y phân nguyên li u cá t p

Hình ph l c 6a Thông tin mô hình h i quy c a thí nghi m kh i d u

Hình ph l c 6b K t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m kh i d u

Ph l c 7 Thông tin mô hình h i quy và k t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m b m t ch tiêu t i u hóa các y u t nh h ng đ n quá trình th y phân nguyên li u cá t p

Hình ph l c 7a Thông tin mô hình h i quy c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm đ m axit amin

Hình ph l c 7b K t qu phân tích ph ng sai c a thí nghi m b m t ch tiêu cho hàm đ m axit amin