0359SÀNG LỌC VI KHUÂN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG NÁM COLLECTOTRICHUM SP. GÂY BỆNH TRÊN CÂY ỚT

B TR GIÁO D CăVẨă ẨOăT O NGă IH CM TP HCM  BÁO CÁO KHOÁ LU N T T NGH P Tên đ tài: SÀNG L C VI KHU N N I SINH CÓ KH N NGăKệCHăTHệCH T NGăTR NG VÀ KHÁNG N M COLLECTOTRICHUM SP GÂY B NH TRÊN CÂY T KHOA: CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH VI SINH GVHD 1: ThS Nguy n Thanh Thu n GVHD 2: ThS Nguy năV năMinh SVTH: Nguy n Th Thùy Linh MSSV: 1053010394 Khóa: 2010 ậ 2014 Tp H Chí Minh, Tháng 05 n m 2014 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P L I C Mă N  hoàn thành đ tài này, em xin g i l i c m n đ n Th y Cô khoa Công Ngh Sinh H c, tr ng i h c M Thành ph H Chí Minh gi ng d y truy n đ t ki n th c cho em su t nh ng n m v a qua Em xin g i c m n sâu s c đ n th y Nguy n Thanh Thu n, th y Nguy n V n Minh t n tình h ng d n, ch b o cho em su t th i gian em th c hi n đ tài Em xin c m cô D ng Nh t Linh, ng i truy n đ t nhi u kinh nghi m quý báu t o u ki n cho chúng em hoàn thành t t chuyên đ th c t p t t nghi p Em xin c m n th y an Duy Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi, ch Nguy n Th M Linh anh, ch phịng thí nghi m ln ng h , giúp đ em lúc làm đ tài Bên c nh đó, tơi xin c m n b n c a tôi, b n nhóm làm đ tài b n sinh viên h c vi c phịng thí nghi m Cơng ngh Vi sinh quan tâm, giúp đ trình th c hi n đ tài Cu i xin c m n Cha, M , c m n gia đình ln bên con, t o m i u ki n t t nh t đ hoàn thành vi c h c c a Em xin g i l i chúc s c kh e đ n t t c ng kính khoa Công ngh sinh h c, Tr ng Minh, xin chúc th y cô ngày g t hái đ i th y, ng i cô đáng i h c m thành ph H Chí c nhi u thành cơng Xin chân thành c m n Sinh viên th c hi n Nguy n Th Thùy Linh BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P M CL C DANH M C VI T T T iv DANH M C B NG .v DANHăM CăS ă vi DANH M C HÌNH vii DANH M C BI Uă T V Nă PH N 1: viii T NG QUAN TÀI LI U 1.1 CÂY T VÀ B NHăTHÁNăTH ăTRểNăCỂYă T 1.1.1 T ng quan v t 1.1.2 B nhăthánăth ătrênăcơyă t .6 1.2 VIăKHU NăN IăSINH 1.2.1 S ăl c v vi khu n n i sinh 1.2.2 M t s ho tă tínhă kíchă thíchă t ngă tr ng tr ng c a vi khu n n i sinh .8 1.2.3 Tình hình nghiên c u th gi i .13 1.2.4 Tình hình nghiên c uătrongăn PH N 2: 2.1 V T LI UăVẨăPH c 14 NGăPHÁPăNGHIểNăC U 16 Aă I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U .17 2.2 V T LI U 17 2.3 THI T B , D NG C ,ăMÔIăTR NG 17 2.3.1 Thi t b 17 2.3.2 D ng c 18 2.3.3 Môiătr 2.4 PH ng, hóa ch t thu c nhu m 18 NGăPHÁPăTHệăNGHI M 19 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh i BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 2.4.1 B trí thí nghi m 19 2.4.2 Ph ngăpháp 20 2.5 PH NGăPHÁPăTH NG KÊ S LI U 42 PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 43 3.1 K T QU PHÂN L P VI SINH V T N I SINH .44 3.1.1 Quanăsátăđ i th 44 3.1.2 Quan sát vi th .47 3.2 PHÂN L P N M COLLECTOTRICHUM SP GÂY B NH THÁN TH ăTRểNăCỂYă T 49 3.2.1 K t qu thu th p m u b nh 49 3.2.2 K t qu phân l p n m b nh 50 3.2.3 K t qu th nghi m lây b nh nhân t o 51 3.3 K T QU XÁCă NH KH N NGăC 3.4 K T QU XÁCă NH KH N NGăHÒAăTANăLỂN 52 3.4.1 NHăNIT ăPHỂNăT 52 nh tính kh n ngăhịaătanălơn 52 3.4.2 K t qu đ nhă l ng hòa tan lân c a ch ng vi khu n th nghi m 53 3.5 K TăQU ăXÁCă 3.6 K T QU NHăKH ăN NGăSINHăIAA .55 KH O SÁT KH N NGă KHÁNGă N M COLLECTOTRICHUM SP 57 3.7 K T QU NH DANH SINH HÓA CÁC CH NG M NH 60 3.8 K T QU TH KH N NGăT NGăTHệCHăGI A CÁC CH NG 63 PH N 4: K T LU NăVẨă NGH .64 4.1 K T LU N 65 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh ii BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 4.2 NGH 65 TÀI LI U THAM KH O 66 PH L C 74 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh iii BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C VI T T T C capsici Colletotrichum capsici C nigrum Colletotrichum nigrum IAA IndolAcetic Acid MS Minimal Salt NA Nutrent Agar NB Nutrient Broth PDA Potato Dextrose Agar ppm pasts permilion OD Optical Density TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth SVTH: Nguy n Th Thùy Linh iv BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C B NG B ng Xây d ngăđ ng chu n phospho 26 B ng 2 Xây d ng đ ng chu n IAA 29 B ng K t qu quanăsátăđ i th ch ng vi khu n n i sinh 44 B ng K t qu quan sát vi th ch ng vi khu n n i sinh 47 B ng 3 K t qu đ nhăl ng hòa tan lân c a ch ng .53 B ng K tăqu ăđ nhăl ngăsinhăIAAăc aăcácăch ng 55 B ngă 3.5ă ng kính vịng c ch ph nă tr mă c ch n m Collectotrichum sp c a vi khu n 58 B ng 3.6 K t qu đ nh danh c a ch ng TL2 60 B ng 3.7 K t qu đ nh danh c a ch ng TL5, TL11, TL19 61 B ng 4.1 Giá tr OD600nm c aăđ ng chu n phospho 87 B ng 4.2 K t qu OD600nm xácăđ nh phospho d ch nuôi c y 87 B ng 4.3 Giá tr OD c aăđ th đ ng chu n IAA 88 B ng 4.4 K t qu OD530nm xácăđ nh IAA d ch nuôi c y 89 B ng 4.5 K t qu đoăđ ng kính vịng kháng n m ph nătr mă c ch n m 90 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh v BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P DANHăM CăS S ăđ Quy trình thí nghi m 19 S ăđ 2.ă2ăQuyătrìnhăđ nhăl ng phospho .27 S ăđ 2.ă3ăQuyătrìnhăđ nhăl ng IAA 30 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh vi BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C HÌNH Hình 1.1 C u trúc phân t c a IAA tryptophan 12 Hình Phân l p vi khu n n iăsinhătrênăTSAă(A),ăvƠăđ aămôiătr ng TSA đ i ch ng c y d ch r a cu i (B) 46 Hình 3.2 Hình nhăquanăsátăđ i th m t s ch ng vi khu n n i sinh môi tr ng NA .47 Hình 3 Hình nh quan sát vi th c a m t s ch ng vi khu n n i sinh d i v t kính 100X 50 Hình 3.4 M t s m u b nh thu th păđ c 51 Hình 3.5 Hình nhăquanăsátăđ i th c a n m b nhătrênămơiătr Hình 3.6 Bào t n m b nhăquanăsátăd ng PDA 51 i kính hi n vi 52 Hình 3.7 Tri u ch ng b nh thán th ătrênăqu tăđ c gây b nh nhân t o 51 Hình 3.8 Kh n ngă phátă tri n c a ch ng TL2 trênă môiă tr ngă vôă đ m Ashby 52 Hình 3.9 Kh n ngăhịaătanălơnăc a ch ng TL4 trênămôiătr ng Pikovskaya 53 Hìnhă3.10ă nhăl ng phospho tan d ch nuôi c y .54 Hìnhă3.11ă nhăl ng kh n ngăsinhăIAAătrongăd ch ni c y 57 Hình 3.12 Kh n ngăđ i kháng n m Collectotrichum sp c a ch ng TL5 58 Hình 3.13 Th kh n ngăđ i kháng gi a ch ng TL5 TL11 .63 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh vii BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C BI U Bi uăđ 3.ă1ă th bi u di n n ngăđ phospho tan d ch nuôi c y ch ng 54 Bi uăđ 3.ă2ă th bi u di n n ngăđ IAA d ch nuôi c y ch ng 56 Bi uăđ 3.3ă th bi u di n ph nătr mă c ch n m (%) 59 Bi uă đ 4.1.ă th t ngă quană gi a m tă đ quang n ngă đ phospho chu n .88 Bi uăđ 4.2.ă th t ngăquan gi a m tăđ quang n ngăđ IAA chu n 90 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh viii BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P Pepton 7g Glucose 5g K2HPO4 5g N 1000 mL cc t pH : 6.9 ± 0.2 1.24 Môiătr ng lên men lo iăđ ng NB 8g ng 10 g Phenol red 0,01 g N 1000 mL cc t pH = 7.4 emăh p kh trùng 1100C/15 ậ 20 phút Dung d ch Phenol red 0,1% : 0,1g 100 mL c n 200 1.25 Môiătr ng kh Nitrate NB 8g KNO3 (NaNO3) 2g N 1000 mL cc t pH = 7.2 1.26 Môiătr Môi tr ngăChiristensen’săUreaă ng c b n: Pepton NaCl SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 1g 5g 82 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P Glucose 1g KH2PO4 2g Phenol red 0,012 g N 900 mL cc t Hòa tan t t c thành ph nătrongă900ămLăn c H p 1210C/15ăphút,ăđ ngu iăđ n 50 ậ 550C, Dung d ch urea: Urea 20 g N 100 mL cc t pH = 6.8 ± 0.1 Hòa tan urê 100 mL n c c t, l căvôătr̀ng,ăthêmăvƠoămôiătr ngăc ă b năđưălƠmăngu i SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 83 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P PH ăL Că3.ăHỊNHă NH SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 84 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P Hình Th nghi m phân gi i tinh b t Hình Th nghi m phân gi i casein Hình Th nghi m k khí Hình Th nghi m Citrat Hình Th nghi m di đ ng Hình Th nghi m Nitrate SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 85 BÁO CÁO KHĨA LU N T T NGHI P Hình Th nghi m VP Hình Th nghi m NaCl 10% Hình Các th nghi mălênămenăđ SVTH: Nguy n Th Thùy Linh ng 86 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 4.1 B ng k t qu đoăODăđ đ nhăl ng chu n,ăđ th đ ng chu n v trình ng phospho B ng 4.1 Giá tr OD600nm c aăđ ng chu n phospho N ngă đ ă phospho 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 chu nă (ppm) OD600nm 0,146 0,176 0,205 0,225 0,244 0,263 0,28 0,302 0,328 0,336 B ng 4.2 K t qu OD600nm xác đ nh phospho d ch nuôi c y K tăqu ăOD STT Ch ngăviăkhu n L nă1 L nă2 L nă3 TL4 0.149 0.153 0.15 TL19 0.202 0.171 0.185 TL25 0.141 0.154 0.15 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 87 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 0.4 y = 0.0021x + 0.1357 R² = 0.9915 0.35 OD600nm 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 20 40 60 80 100 120 N ngăđ ăphosphoă(ppm) Bi u đ 4.1 th t ngăquanăgi a m t đ quang n ng đ phospho chu n 4.2 B ng k t qu đoăODăđ đ nhăl ng chu n, đ th đ ng chu n v trình ng IAA (Indol Acetic Acid) B ng 4.3 Giá tr OD c a đ th đ ng chu n IAA N ngă đ ăIAAă chu nă 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 (ppm) OD530nm 0,018 0,039 0,047 0,052 0,075 0,096 0,115 0,14 0,173 0,181 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 88 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P B ng 4.4 K t qu OD530nm xác đ nh IAA d ch nuôi c y K tăqu ăOD STT Ch ngăviăkhu n L nă1 L nă2 L nă3 TL2 0.174 0.165 0.173 TL4 0.162 0.165 0.16 TL8 0.169 0.178 0.175 TL11 0.202 0.198 0.189 TL13 0.186 0.175 0.172 TL15 0.166 0.167 0.181 TL18 0.137 0.121 0.13 TL19 0.148 0.139 0.143 TL21 0.112 0.124 0.121 10 TL24 0.134 0.13 0.125 11 TL26 0.177 0.169 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 0.17 89 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 0.2 y = 0.0018x - 0.0062 R² = 0.9783 OD530nm 0.15 0.1 0.05 0 20 40 60 80 100 120 -0.05 N ngăđ ăIAAăµg/mL Bi u đ 4.2 th t 4.3 B ng k t qu đoăđ ngăquanăgi a m t đ quang n ng đ IAA chu n ng kính vịng kháng n m (mm) ph nătr mă c ch n m (%) c a ch ng vi khu n th nghi m B ng 4.5 K t qu đoăđ STT Mã ng kính vịng kháng n m ph nătr mă c ch n m ng kính vịng kháng n m ch ng Ph nătr mă c ch n m (%) (mm) L n1 L n2 L n3 L n1 L n2 L n3 TL5 25,14 21,19 20,45 81,43 80,14 85,14 TL6 10,32 11,35 10,03 70,09 70,1 69,23 TL21 18,44 20,03 20,11 61,23 70,21 63,67 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 90 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 4.3 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ngă hòaă tană lơnă vƠă soă sánhă s khác bi t Ủă ngh aă b ng ki măđ nh LSD c a ch ng vi khu n th nghi m: Anova: Single Factor SUMMARY Groups TL4 TL19 TL25 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Count Sum Average Variance 21,38095 7,126984 0,982615 71,85714 23,95238 54,64853 18,04762 6,015873 10,05291 SS 606,0469 131,3681 737,415 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh df MS F P-value F crit 303,0234 13,84005 0,005654 5,143253 21,89468 91 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi măxácăđ nh 4.5 kh n ngăhòaăsinhăIAAăvƠăsoăsánhăs khác bi tăỦăngh aăb ng ki măđ nh Duncan c a ch ng vi khu n th nghi m: Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance TL2 294,78 98,26 7,51 TL4 280,89 93,63 1,95 TL8 300,33 100,11 6,48 TL11 337,56 112,52 13,68 TL13 306,44 102,15 16,77 TL15 295,89 98,63 21,71 TL18 225,89 75,30 19,86 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 92 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P TL19 249,22 83,07 6,28 TL21 208,67 69,56 12,04 TL24 226,44 75,48 6,28 TL26 297,00 99,00 5,86 ANOVA Source of Variation SS df 5574,57 Between Groups 10 236,831 Within Groups Total F P-value F crit 557,457 51,7840 6,04E- 2,29669 13 10,7650 22 5811,41 32 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh MS 93 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 4.6 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi măxácăđ nh kh n ngă khángă n m so sánh s khác bi tă Ủă ngh aă b ng ki mă đ nh LSD c a ch ng vi khu n th nghi m: SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 94 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P Anova: Single Factor SUMMARY Groups TL5 TL6 TL21 ANOVA Source of Variation Count 3 Sum Average Variance 246,71 82,23667 6,738033 209,42 69,80667 0,249433 195,11 65,03667 21,56093 Between Groups SS 473,097 Within Groups 57,0968 Total 530,194 SVTH: Nguy n Th Thùy Linh df MS 236,548 9,51613 F 24,8576 P-value 0,00124 F crit 5,14325 95 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 96