0359SÀNG LỌC VI KHUÂN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG VÀ KHÁNG NÁM COLLECTOTRICHUM SP. GÂY BỆNH TRÊN CÂY ỚT

CÂY T VÀ B NHăTHÁNăTH ăTRểNăCỂYă T

T ng quan v cây t

Cây ớt (Capsicum sp) thuộc họ cà (Solanaceae), có nguồn gốc từ Nam Mỹ, là một loài cây hoang dại được thuần hóa và trồng tại châu Âu cách đây khoảng 500 năm Có hai nhóm chính của cây ớt là ớt cay (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum annuum L.), trong đó ớt ngọt được trồng nhiều ở châu Âu, châu Mỹ và một phần châu Á, thường được sử dụng làm rau xanh và gia vị Cây ớt có giá trị kinh tế cao và được trồng phổ biến tại nhiều vùng khác nhau, đặc biệt là ở châu Phi, nơi ớt được sử dụng làm gia vị Trong số các cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), cây ớt có tầm quan trọng thứ hai sau cà chua.

Theo Bosland và Votava (2003) chỉ ra rằng ớt chứa nhiều chất hóa học quý giá, bao gồm capsaicinoid, carotenoid, vitamin, protein và các khoáng chất Nhiều thành phần trong ớt có giá trị dinh dưỡng cao, giúp nâng cao sức khỏe và làm gia tăng hương vị món ăn Ớt giúp giảm cholesterol và huyết áp, đồng thời giàu vitamin A, C, kali, axit folic và vitamin E Ớt cũng chứa nhiều vitamin C hơn so với các loại trái cây họ cam quýt và nhiều vitamin A hơn so với cà rốt Capsaicinoid là hợp chất tạo ra vị cay đặc trưng, trong khi carotenoid cung cấp màu sắc và giá trị dinh dưỡng cao cho ớt Cây ớt cần nhiệt độ từ 25-28°C ban ngày và 18-20°C ban đêm để sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra, cây ớt cần nhiều ánh sáng; thiếu ánh sáng sẽ làm giảm khả năng ra hoa và đậu trái.

SVTH: Nguyễn Thị Thùy Linh cho rằng độ ẩm không khí đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành khí lạnh và chất lượng không khí Độ ẩm thích hợp (khoảng 70%) giúp cây phát triển bình thường, trong khi độ ẩm quá cao (trên 80%) có thể làm giảm sự phát triển, khiến cây còi cọc.

1.1.2 B nh thán th trên cây t

Bệnh tật ảnh hưởng đến sức khỏe con người một cách nghiêm trọng, gây ra những khó khăn trong cuộc sống hàng ngày Nguyên nhân chủ yếu đến từ lối sống không lành mạnh và môi trường ô nhiễm Để bảo vệ sức khỏe, việc duy trì thói quen ăn uống hợp lý và tập luyện thể dục thể thao là rất quan trọng Đồng thời, việc nâng cao ý thức về vệ sinh cá nhân cũng góp phần giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh.

70% công tác phòng ngừa bệnh tật hiện nay đang được chú trọng nhằm giảm thiểu tác động tiêu cực đến sức khỏe cộng đồng Việc áp dụng các biện pháp phòng ngừa hiệu quả không chỉ giúp cải thiện chất lượng cuộc sống mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của xã hội Các chiến lược này cần được triển khai đồng bộ, kết hợp giữa giáo dục sức khỏe và các chương trình can thiệp y tế nhằm nâng cao nhận thức và hành vi phòng ngừa bệnh tật trong cộng đồng.

Bánh tráng là món ăn vặt phổ biến ở Việt Nam, thường được sử dụng để cuốn các loại thực phẩm khác nhau Trên bánh tráng, người ta có thể thấy những màu sắc hấp dẫn từ rau xanh, thịt, hoặc các loại hải sản, tạo nên một món ăn vừa ngon miệng vừa bắt mắt Bánh tráng thường được ăn kèm với nước chấm, tăng thêm hương vị cho món ăn Để làm bánh tráng, người ta thường sử dụng bột gạo, tạo ra những lớp bánh mỏng, dai và dễ cuốn Món ăn này không chỉ ngon mà còn rất dễ chế biến, phù hợp với nhiều đối tượng, từ trẻ em đến người lớn.

Colletotrichum nigrum and Colletotrichum capsici are two significant fungal pathogens that affect various crops These pathogens can lead to serious economic losses in agriculture due to their rapid spread and ability to cause disease Effective management strategies are essential to mitigate their impact on crop production.

B nhăthánăth ătrênăcơyă t

Cây ớt nâu (Capsicum) có chiều cao từ 120 đến 280 cm, với kích thước trái khoảng 55-190 x 6,5-65 mm Hoa có hình dáng tròn, không có mùi, kích thước khoảng 18-25 x 3 mm Cây ớt có chiều cao từ 70 đến 100 cm, có màu sắc hấp dẫn và thường được trồng ở nơi có ánh sáng đầy đủ, nhiệt độ lý tưởng từ 150°C Hoa có hình dáng lồi, kích thước khoảng 17-28 x 3-4 mm, phát triển tốt trong điều kiện ẩm ướt Cây ớt cần được chăm sóc kỹ lưỡng để đạt năng suất cao, thường phát triển tốt trong môi trường có độ ẩm cao và ánh sáng đầy đủ.

Bánh gỏi là một món ăn phổ biến trong các bữa tiệc, thường được phát triển vào khoảng tháng 5 đến tháng 7 khi có sự kết hợp giữa các nguyên liệu tươi ngon Bánh gỏi còn được yêu thích vào giai đoạn sau thu hoạch trong quá trình bảo quản và vận chuyển Món ăn này không chỉ mang lại hương vị đặc trưng mà còn thể hiện sự sáng tạo trong ẩm thực.

Giống chìa vôi Hu và sừng bò nhím là những giống cây quý hiếm, mang lại giá trị kinh tế cao Chúng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng và có khả năng bảo tồn nguồn gen quý hiếm Đặc biệt, chúng có sức sống mạnh mẽ trong điều kiện khô hạn, giúp cải thiện môi trường sinh thái Việc bảo tồn và phát triển các giống cây này là cần thiết để duy trì sự đa dạng sinh học và phục vụ cho các nghiên cứu trong tương lai.

Tiêu di t ngu n b nh D n s chătƠnăd ăcơyăb nh, ch n h t gi ng kh e, s ch b nh X lý h t gi ng v iăn c nóng 52 o C trong 2 gi ho c KMnO4 0,1% t 1 - 2 gi ho c v i các lo i thu c tr n m

Luân canh với cây trồng khác giúp cải thiện sức khỏe đất và giảm thiểu dịch hại Để bảo vệ cây trồng, có thể sử dụng một số loại thuốc bảo vệ thực vật như Benlate 50WP với liều lượng 1 kg/ha, Topsin M 70WP từ 0,4 đến 0,6 kg/ha, và Score 250ND với liều 0,5 lít/ha.

VIăKHU NăN IăSINH

Tình hình nghiên c u th gi i

M nghiên cứu của Lodewyckx (2002) nêu lên phương pháp phân loại các loại hình khác nhau Dựa trên nghiên cứu của Hallmann (1997) và Lodewyckx (2002), cùng với Rosenblueth và Martinez-Romero (2006), có thể thấy sự đa dạng trong các hình thức phân loại này.

[48] đưăcôngăb ăm tădanhăsáchătoƠnădi năc aăviăkhu năn iăsinhăđ căphơnăl pă t ăm tălo tăcácăb ăph năc aăcơy.ăM tăs ănghiênăc uăc aăSturzăvƠăMathesonă

(1996) [52],ăDuijffăvƠăc ngăs ă(1997) [27], Krishnamurthy và Gnanamanickam

Nghiên cứu của Azevedo (2000) và Hallmann (1997, 1998) đã chỉ ra rằng việc áp dụng các phương pháp đo lường chính xác trong lĩnh vực sinh học là rất quan trọng Các nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát các yếu tố ảnh hưởng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

Chanway (1997) nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát triển các phương pháp giáo dục nhằm nâng cao khả năng tư duy phản biện ở học sinh Việc áp dụng các chiến lược giảng dạy đa dạng có thể giúp học sinh phát triển kỹ năng này một cách hiệu quả Nghiên cứu của Strobel (2004) cũng chỉ ra rằng việc sử dụng các phương pháp giảng dạy tích cực có thể thúc đẩy sự phát triển tư duy phản biện trong môi trường học tập.

SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 14 hi năcácălo iăthu căm iăđ ăđi uătr ăćăhi uăqu ăcácăb nhă ăng i,ăth căv tăvƠă đ ngăv t.

Các nhà nghiên cứu đang quan tâm đến nhiều loại vi khuẩn sinh học có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật Những vi khuẩn này có thể giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường và làm tăng hàm lượng các chất khoáng cần thiết cho cây trồng.

Nghiên cứu của Paul và cộng sự (2013) cho thấy nhiều chủng vi khuẩn nội sinh cây trồng có hoạt tính kháng nấm, đặc biệt là các loài Pseudomonas, Bacillus và Burkholderia Ngoài ra, các loài vi khuẩn khác cũng được phân lập và xác định, bao gồm Actinobacter, Arthrobacter, Enterobacter, Escherichia, Kitasatospora, Pandoraea, Pantoea, Rhizobium, Ralstonia, Paenibacillus và Serratia Một nghiên cứu khác của Allu và cộng sự (2014) cũng đã chỉ ra những tiềm năng của vi khuẩn nội sinh trong việc bảo vệ cây trồng khỏi bệnh nấm.

[21] đưăphơnăl p,ăxácăđ nhăcácăđ c tính sinh hóa và PGP c a ch ng vi khu n n i sinh Pseudomonas aeruginosa đ c phân l p t trái tăđ có ho t tính kháng n m b nhăthánăth

1.2.4 Tình hình nghiên c u trong n c ưăćănhi u nghiên c u v vi khu n n i sinh trong các loài cây Vi t Namănh ăNguy n Th Thu Hà (2008) [5] đưăphơnăl păđ c vi khu n n i sinh trong m t s lo i c ch nănuôi,ăCaoăNg că i p và Nguy năThƠnhăD ngă(2010)ă phân l p vi khu n n i sinh trong cây khóm tr ngătrênăđ t phèn huy n B n L c, t nh Long An và huy năV nhăThu n, t nh Kiên Giang Cao Ng că i p và c ng s phát hi n vi khu n n iă sinhă trongă cơyă lúaă m̀aă đ c s n (Oryza sativa L.) tr ng đ ng b ng sông C u Long Nghiên c u c aăL ngăTh H ng Hi p và Cao Ng că i p (2011) [6], phân l p và nh n di n vi khu n n i sinh trong cây Cúc Xuyên Chi Nghiên c u c a Nguy n Th Ng c Bích, Cao Ng că i p

(2009) [3] nh n di n vi khu n n t r n i sinh trong cây lúa b ngăk ăthu t PCR-

SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 15 ARDRA IGS Tuy nhiên v năch aăćănghiênăc u nào v vi khu n n i sinh cây tăđ c th c hi n

SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 16

Aă I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U

tƠiăđ c th c hi n trong th i gian t 01/11/2013 ậ 22/05/2014 t i phòng thí nghi m Công ngh Viăsinh,ăTr ngă i h c M thành ph H ChíăMinhă(c ăs

THI T B , D NG C ,ăMÔIăTR NG

Thi t b

D ng c

 Pipet (th y tinh và pipetman)

2.3.3 Môi tr ng, hóa ch t và thu c nhu m

Môiă tr ng: NA, NB, TSA, TSB, PDA, Pikovskaya, Ashby, MS, Clark- Lubs,tinhb t

Thu c nhu m: thu c nhu m tím k t tinh (crystal violet), safranin O, lugol, lactophenol.

PH NGăPHÁPăTHệăNGHI M

B trí thí nghi m

D a vào m cătiêuăđ tài chúng tôi ti n hành thí nghi mătheoăs ăđ 2.1

S ăđ 2 1 Quy trình thí nghi m

Phân l p vi sinh v t n i sinh trên môi tr ng TSA

Phân l p n m b nh trênămôiătr ng PDA

Sàng l c vi khu n n i sinh có kh n ngăc đ nhăđ m, phân gi i lân, sinh IAA và kháng n m nh danh các ch ng có ho t tính cao

Th kh n ngăt ngăthíchăgi a các ch ng

Lựa chọn chất lỏng phù hợp là yếu tố tiên quyết và quan trọng nhất trong quá trình tìm kiếm và phân lập một chủng vi sinh vật Việc chọn lọc phải đảm bảo rằng khả năng sinh trưởng của chủng vi sinh vật là cao nhất Do đó, tốt nhất là tiến hành ngay trong quá trình phân lập tuyển chọn.

Vi sinh v t n iăsinhăđ c ti n hành phân l p t các lá, thân, r c a cây t kh e m nh, không sâu b nh M uăđ c ti n hành phâp l p trong vòng 6 gi tính t khi m uăđ c thu th p

 X lý m u và phân l p lo i tr các vi sinh v t còn bám trên b m t, m uăsauăkhiăđ c thu th p đ c ti n hành x lỦănh ăsauă:ă

- B c 1: r a s ch ph nă môăvƠă láăd iăvòiăn c m nh, c t thành các đo n nh 2 ậ4ăcmăđ d thao tác

- B că2:ăngơmăm uăv iăethanolă70%ătrongă2ăphút

- B că 3:ă ngâm trong dung d ch sodium hypochlorite 4-6% trong 1,5 phút

- B că4:ăngâm trong ethanol 70% trong 30 giây

- B că5:ăr aăm uăv iăn căc tăvôătr̀ng.

- B că6:ăđ tătrênăgi yăh păvôătr̀ng.

- B că7:ăki mătraăm uăđ tăyêuăc u

SVTH: Nguyễn Thị Thùy Linh 21 đã tiến hành kiểm tra khối lượng vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng Lấy 200 µL lăn cấy vào môi trường Tryptic Soy Agar (TSA) và ủ ở 30 độ C.

N u sau 24 gi cácăđ aămôiătr ng này không có s xu t hi n các khu n l c thì các m uăđưăkh tr̀ngăđ t yêu c u [53], [4]

B c 8 là một bước quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, đặc biệt là trong việc phân lập vi sinh vật nội sinh Sau khi xử lý xong, cần tiến hành đánh giá sự phát triển của các chủng vi sinh vật trong môi trường TSA ở nhiệt độ 37 độ C, nhằm đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn nội sinh.

Ti n hành c yăriaătrênămôiătr ngăNAăchoăđ năkhiăthuăđ c nh ng khu n l căćăđ đ ngăđ u v hình d ngăc ngănh ămƠuăs c C y gi gi ng l i trên môi tr ng NA hay d ng canh l ng NB

 Ti n hành quan sát đ i th và vi th

D a vào hình thái khu n, màu s c,ăkíchăth căđ nh n bi t các lo i vi sinh v tăkhácănhauăvƠăđ c th ng kê các ch ng phân l păđ c t các m u thí nghi m

Quanăsátăđ i th : b ng m tăth ng, hay dùng kính lúp c m tay nh n xét v kíchăth c, màu s cầc a khu n l c vi sinh v t n i sinh

Quan sát vi th :ăđ quan sát vi khu n n i sinh ta ti n hành nhu m Gram và quanăsátăd i kính hi n vi v t kính 100X

Nhu m Gram là phương pháp phân loại vi khuẩn dựa trên cách mà chúng hấp thụ thuốc nhuộm, từ đó giúp xác định tính chất và cấu trúc của vi khuẩn Quy trình thực hiện bao gồm việc quan sát cách sắp xếp và hình dạng của vi khuẩn, phân biệt giữa các loại Gram dương và Gram âm.

- t tiêu b năđưăph t kính và c đnh m u lên thanh th y tinh ch U

- Nhu m b ng dung d ch crystal violet trong 1 phút, r aăn c, th m khô

- Nhu m l i b ng dung d ch lugol trong 1 phút, r aăn c, th m khô

- T y màu b ng c n 96 o , kho ng 15-20ăgiơyă(choăđ n khi v a th y m t màu), r aăn c, th m khô

- Nhu m b sung b ng dung d ch safranin trong 30 giây, r aăn c, th m khô

- Quan sát b ng v t kính d u,ăđ ph́ngăđ i 1.000 l n

Vi khu n Gram (+) b t màu tím crystal violet, vi khu n Gram (-) b t màu h ng safranin [8]

M u t b nhăđ c l y d a theo các tri u ch ngăđưăđ c mô t m c 1.1.2.1

- Sau khi r a s ch có th nhìn rõ nh ng tri u ch ngăđi n hình c a v t b nh, c t nh ng m u có v t b nh dài kho ng 1 ậ 3 cm (g m c ph n t bào kh e và t bào b nh)

- Ti n hành kh trùng b m t m uăquaăcácăb c: r a nhanh mô b nh b ng ethanol 70%, r i nhúng mô b nh vào dung d ch natri hypochlorite 1% trong ethanol 10% kho ng 1 -5 phút, ti p theo r a l i mô b nh v iăn c c t

- N u kh trùng b m tăđ t yêu c u,ăđ t mô b nh lênămôiătr ng PDA nhi tăđ 27 ± 2 o C trong vài ngày [1], [4]

 Làm thu n làm thu n n m m c chúng tôi ti năhƠnhăph ngăphápăc yăđ năbƠoă t trênămôiătr ng PDA

 Quan sát đ i th và vi th

- Quanăsátăđ i th : b ng m tăth ng, hay dùng kính lúp c m tay

- Quan sát vi th :ăđ quan sát ti n hành làm tiêu b n n m m c, r i quan sát hình thái h căd i kính hi n vi v t kính 10X, 40X

 Làm tiêu b n n m m c.ăT̀yăvƠoăđi u ki n th c t chúng tôi ti n hành làm tiêu b n n m m c theo các cách sau:

Để chuẩn bị một mẫu kính trong suốt, đầu tiên, bạn cần nhỏ một giọt lactophenol lên bề mặt của kính Sử dụng que cấy để lấy một phần nhỏ mẫu nấm và đặt lên giọt lactophenol Tiếp theo, dùng kim có cán hoặc que cấy để dìm mẫu nấm vào giọt dung dịch lactophenol cho đến khi mẫu hoàn toàn chìm Cuối cùng, đặt kính lên trên và ép nhẹ để tạo thành một lớp kính đồng nhất.

- Khiăđ yăláăkínhăđ ngăđ có b t khí, n u có s g păkh́ăkh nătrongăkhiăsoiă kính

- Khi ép nh lá kính, nên dùng gi y th m b t dung d ch Lactophenol th aăđ dung d ch không tràn lên trên m t lá kính

- Ph ngăphápănƠyăd̀ngătrongătr ng h p c n quan sát ngay các m u n m m c

Để làm kính sạch và trong suốt, trước tiên cần chuẩn bị một khung giấy hình vuông kích thước 2cm x 2cm với độ dày 0,3cm Sau đó, đặt khung giấy lên giá làm kính và thêm một lớp chất lỏng (khoảng 10ml) lên khung Tiếp theo, cần đổ chất lỏng lên trên bề mặt của khung giấy, đảm bảo không để bị tràn ra ngoài Sau khi hoàn tất, đặt khung giấy vào thanh chữ U trong buồng mát và để yên trong 2 ngày Cuối cùng, lấy kính ra khỏi khung giấy, tiến hành nhuộm bằng lactophenol và quan sát kết quả.

- C n chú ý thao tác vô trùng tránh nhi m sinh v t khác làm sai l ch k t qu

- Bu ng măvƠăn c c tăb măvƠoăt oămôiătr ng măđưăđ c h p kh trùng

121 o C trong 20 phút làm thu n n m m c chúng tôi ti năhƠnhăph ngăphápăc yăđ năbƠoăt :

B c 2 + 3 là một phương pháp sử dụng để bào chế thuốc bằng cách dùng que cấy lấy mẫu từ một thí nghiệm có lượng bào tử lớn Việc này giúp đảm bảo rằng mẫu bào tử được lấy ra một cách chính xác và hiệu quả, đồng thời cũng cần chú ý đến việc vô trùng trong quá trình thực hiện.

B c 4: L c ng nghi m phân tán các bào t và kiểm tra mật độ bào t bằng cách quan sát ng nghi mạt r c ánh sáng hoặc kiểm tra mật độ bào t d i kính lúp soi n i Cần tránh tạo d ch bào t v i mật độ bào t quá cao.

- B c 5: làm loãng v iăn c vô trùng n u c n

- B că6:ăđ d ch bào t vào m tăđ aăpetri có ch a m t l p m ngămôiătr ng th ch

- B c 7: rót d ch bào t th a t đa petriăđi.ăM t s bào t s n m l i trên m t th ch

- B că8:ăđ yênăđ aăpetri trong kho ng 18 gi choăđ n khi bào t n y bào t , và các ng m m

- B c 9: ki mătraăđ aăPetriăd i kính lúp soi n i v i ngu năsángăphíaăd i

- B c 10: dùng m t que c y d p c t l y ra m t bào t n y m m và chuy n sang m tăđ aămôiătr ng m i [1]

2.4.2.3 Thí nghi m lây b nh nhân t o

 V t li u: Trái t (c trái xanh và trái chín) kh e, s ch b nh

- t nh ng qu tăđưăchu n b s n lên khay nh a, phun m

- Hòa d ch bào t n mă (đ t m tă đ là 106 bào t /mL),ă sauă đ́ă d̀ngă micropipet nh vài gi t d ch bào t lên qu đnh gây b nh

- Ph nilonălênătrênăđ cách li và gi m Theo dõi s bi u hi n tri u ch ng hàng ngày [14], [10]

2.4.3 Xác đnh kh n ng sinh NH3 c a vi khu n

Nh ng ch ng vi khu n có kh n ngăc đ nhăđ m s sinhătr ngăđ c trong cácămôiătr ngăvôăđ mă(Môiătr ngăAshby,ăămôiătr ngăJensenầ)

2.4.3.2 nh tính kh n ng c đnh nit phân t

Ti nă hƠnhă xácă đnh kh n ngă c đ nhă nit ă phơnă t trênă đ aă môiă tr ng

Ashby Nh ng ch ng vi khu n có kh n ngăc đ nhănit ăphơnăt s t ngătr ng trênămôiătr ngăvôăđ m này [8]

2.4.4 Xác đnh kh n ng hoà tan lân

Khi c y vi khu nă lênă môiă tr ng ch a h p ch t phospho khó tan là

Ca3(PO4)2, vi khu n có kh n ngă hòaă tană Ca 3 (PO4)2 s t o ra vòng trong xung quanh khu n l c [28]

2.4.4.2 nh tính kh n ng hòa tan lân

Ti năhƠnhăđ nhăl ngăhòaătanălơnătrênămôiătr ng Pikovskaya b ngăph ngă pháp c yăđi m 37 o C C sau 24 gi đ c k t qu ă c k t qu đ n 5-7 ngày Khu n l c có kh n ngăhòaătanălƠănh ng khu n l c có vòng phân gi i quanh khu n l cătrênămôiătr ng Pikovskaya.

2.4.4.3 nh l ng kh n ng hòa tan lân

Xây d ngăđ ng chu năphosphoălƠmăc ăs đ đ nhăl ng kh n ngăhòaătană lơnătheoăcácăb căđ c trình bày b ng 2 1

B ng 2 1 Xây d ngăđ ng chu n phospho

Dung d ch axít-clo molybdic

Dung d ch thi c axít clo hydric pha loãng (mL)

Cách thực hiện: Cho vào ống nghiệm 10 mL dung dịch phospho chuẩn với nồng độ 10-100 ppm Bổ sung 10 mL dung dịch axit molybdic vào Sau đó, thêm 40 mL nước cất Nhỏ 0,25 mL dung dịch thiếc axit hydrochloric vào hỗn hợp Thêm axit tạo màu Cuối cùng, đo dung dịch trên máy so màu ở bước sóng 600 nm để xác định nồng độ quang của mẫu dung dịch.

Các ch ng có kh n ngăhòaătanălơnăđ căđ nhăl ngătheoăs ăđ 2.2

- Nuôi c y t ng sinh trong môi tr ng NB, 37 o C/ 24 gi

10 mL axít-clomolybdic 0.25 mL thi c-axít clohyric Thu c th

Soăđ ng chu n Thu d ch

S ăđ 2 2 Quyătrìnhăđ nhăl ng phospho

- Lên men thu d ch nuôi c y trong môi tr ng l ng Pikovskaya v i th tích c y 5%, 37 o C/ 7 ngày

- Ly tâm thu d ch n i 6000 vòng/phút trong 20 phút

- Th v i thu c th (axít ậclo molybdic, thi c axít clohydric)

- So k t qu v aăthuăđ c v iăđ ng chu năphosphoăđ xácăđnh đ c n ngăđ phospho hòa tan c a các ch ng vi khu n th nghi m

2.4.5 Xác đnh kh n ng sinh IAA

IAAăđ c t ng h p t vi khu n, khi tác d ng v i thu c th Salkowski R2 (FeCl3 ậH2SO4) s t o ra ph c h p có màu h ng nh tăđ năđ m tùy theo n ngăđ IAA [30], [32]

2.4.5.2 nh l ng IAA trong d ch nuôi c y vi khu n

Xây d ngăđ ng chu năIAAălƠmăc ăs đ đ nhăl ng kh n ngăsinhăIAAă theoăcácăb căđ c trình bày b ng 2.2

B ng 2 2 Xây d ng đ ng chu n IAA

- Pha loãng d ch khu n ( 3 x 10 8 CFU/mL)

- T ngăsinhătrênămôiătr ng NB 30 o C, l c 200 vòng/phút)

Soăđ ng chu n Thu d ch

Nuôiăt ngăsinhătrênămôiă tr ng NB

S ăđ 2 3 Quyătrìnhăđ nhăl ng IAA

- Nuôi c yă trongă môiă tr ng MS có b sungă 5mMă c ă ch t tryptophan,

37 o C, l c 200 vòng/phút Tránh ánh sáng

- Ly tâm (6000 vòng/phút, 20 phút)

- B sung 4 mL thu c th FeCl3 ậH2SO4 đ trong t i 15 phút

- So k t qu v aăthuăđ c so v iăđ ng chu năIAAăđ xácăđnh đ c n ng đ IAA sinh ra c a các ch ng vi khu n th nghi m

2.4.6 Xác đnh kh n ng kháng n m b nh

Viăkhu năćăkh ăn ngăkhángăn măCollectotrichum sp.s ăt oăraăcácăch tă că ch ăn m,ăcácăch tănƠyăt năt iăxungăquanhăv̀ngăviăkhu năphátătri n,ădoăđ́ăn mă Collectotrichum sp.ăkhôngăth ăm că ăv̀ngănƠyăđ c.

 Nuôiăc yăt ngăsinhăviăkhu nătrênămôiătr ngăNB ă37ºC/ 24ăgi ,ăviăkhu nă đ tăn ngăđ 10 8 t ăbƠo/mL

 Nuôiăc yăn măCollectotrichum sp trên môiătr ngăPDA, 48ăgi emăhòaă bƠoăt ăn măvƠoă10ămLăn c mu iăsinhălỦ,ăđ tăm tăđ ă10 6 bƠoăt /mL (xác đ nhăm tđ ăn măb ngăbu ngăđ măh ngăc u).

 C yătrangăd chăn m lênăcácăđ a môiătr ngăPDA đưăchu năb ăs n,ăđ ăkhôă m tăth ch,ăđ căl ăđ ngăkínhă6ămm

 Hỳt 50 àLăd chăviăkhu năđưăt ngăsinhănh ăvƠoăl ăth ch

 ă ănhi tăđ ăphòngăvƠătheoăd̃iăkh ăn ngăkhángăn măsauă48 gi

Sau 48 gi ătheoăd̃i,ăn uăcácăviăkhu năćăt oăra m tăvòngă căch ăn măxung quanhăch ăviăkhu năm căs ăđ căđoăđ ngăkínhăvòngă căch ă[20]

2.4.6.4 Kh o sát ph n tr m c ch n m

Thông qua ph nătr mă c ch có th đánhăgiáăđ c kh n ngăkhángăn m c a vi khu n m nh hay y u làm c ăs đ lo i b nh ng vi khu n có kh n ngăkhángă n m y u

- T ngăsinhăviăkhu n th nghi m trong 8mL NB (l c200 vòng/phút trong

48 gi )ăchoăđ năkhiăđ t n ng đ 10 8 t bào/ mL

- Ly tâm 9 000 vòng/phút, trong 15 phút 4 o C

- L c d ch n i sau ly tõm, s d ng màng l c 0,45 àm

- Môiătr ng PDA sau khi h păvôătr̀ng,ăđ t b n nhi t 50 o C

- T l d ch l c vi khu nă vƠă môiă tr ng PDA là 1:1, ti n hànhă đ đ a (đ ngăkínhăđ aă90ămm).

- Pha bào t n m Collectotrichum sp.ătrongăNaClă0,85%,ăđ t m tăđ 10 6 bào t /mL (xácăđ nh b ng bu ngăđ m h ng c u)

Sử dụng micropipette để hút 10 L dung dịch mẫu vào ống nghiệm và ủ trong môi trường giếng nhỏ trong 48 giờ Thực hiện ngắt quãng với dung dịch mẫu trong môi trường PDA để đánh giá sự phát triển Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác.

- nhi tăđ phòngătrongă6ăngƠyăvƠăxácăđnh ph nătr mă c ch n m

 c k t qu - xác đ nh ph n tr m c ch theo công th c sau

C:ăđ ng kính n m m cătrênăđ aăđ i ch ng (mm)

E:ăđ ng kính n m m cătrênăđ aăch a d ch l c vi khu n (mm) [31],

2.4.7 nh danh các ch ng vi khu n có ho t tính m nh

Sau khi lựa chọn các vi khuẩn có hoạt tính mạnh, chúng tôi tiến hành nhận dạng các chủng vi khuẩn này nhằm đảm bảo an toàn khi sử dụng vi khuẩn để thử nghiệm in vivo và làm chất phẩm vi sinh vật Với mục tiêu này, chúng tôi tiến hành nhận dạng vi khuẩn thuộc chi Azotobacter theo khóa phân loại Bergey’s và vi khuẩn thuộc chi Bacillus theo Cowan & Steel.

D iă đơyă lƠă m t s testă sinhă h́aă đ đnh danh vi khu n Bacillus theo Cowan and Steel, và m t s testăsinhăh́aăđ đ nh danh vi khu n Azotobacter theo Bergey’s

Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường như glucose, galactose và mannose nhờ vào các enzym phân giải Quá trình này tạo ra axit hữu cơ, làm giảm pH của môi trường nuôi cấy, dẫn đến sự chuyển màu của phenol red sang vàng Các chất khí sinh ra, bao gồm H2 và CO2, tích tụ trong ống Durham, cho phép phát hiện sự lên men thông qua sự xuất hiện của bọt khí.

Chu n b môiătr ngălênămenăđ ng:ăcanhădinhăd ng (NB) b sung 1 % đ ng, pH シ 7

C y vi khu năvƠoămôiătr ngălênămenăđ ng.ăSauăđ́ă 37 o C trong 24 gi

Lênă men,ă sinhăh i:ă môiă tr ng chuy n t đ sang vàng, ng Durham có h i

Lênămen,ăkhôngăsinhăh i:ămôiătr ng chuy n t đ sang vàng, ng Durham khôngăsinhăh i.

Không lênămen:ămôiătr ng v n gi nguyênămƠuăđ ,ăkhôngăsinhăh iă[8],

2.4.7.2 Ph n ng VP (Vogesv- Proskauer)

Vi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic, sau đó tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành acetyl methyl carbinol (AMC) AMC tác động với α-naphtol trong môi trường kiềm tạo thành diacetyl Diacetyl phản ứng với nhân guanidine (arginine) có trong pepton, tạo hợp chất màu hồng.

Chu n b môiă tr ng Clark-Lubs, pH シ7, thu c th NaOH 40% (ho c KOHă10%)ăvƠă ă-naphtol 10% trong c n

C y vi khu năvƠoămôiătr ng Clark-Lubs, 37 o C trong 24 gi , l y ra nh kho ng 10-15 gi tă -naphtol,ăh ăńngănh r i nh ti p kho ng 10 gi t NaOH 40%, l căđ u,ăđ yên 5-10 phút

Ph n ngăd ngătính:ămôiătr ng chuy nămƠuăđ cam

Ph n ngăơmătính:ămôiătr ng có màu vàng ho cămƠuănơuăđ t [8], [44] 2.4.7.3 Kh n ng th y phân tinh b t

Vi sinh vật tiết ra enzym amylase, enzym này khuếch tán xung quanh khóm và phân giải tinh bột trong môi trường Khi dung dịch iod được thêm vào, nếu có tinh bột trên môi trường thì iod sẽ tác dụng và tạo màu xanh tím Nếu xung quanh khóm vi khuẩn không còn tinh bột, sẽ xuất hiện vòng trong.

Chu n b môiătr ng th chăđ aăNAăb sung 1% tinh b t, thu c th lugol

C y vi khu nălênăđ aămôiătr ng b ngăph ngăphápăc yăđi m

Ph n ngăd ngătính:ămôiătr ng xung quanh vi khu n không màu, trong su t.ă ́ălƠăvòngăphơnăgi i tinh b t Nh ngăn iăkhácăćămƠuăxanhătím.

Ph n ng âm tính: toàn b môiătr ng xung quanh vi khu n màu xanh [8],

Vi sinh v t ti t enzyme tryptophanase, chuy n hóa tryptophan thành Indol, Indol s k t h p v i para ậ dimethylaminobenzaldehyd trong thu c th Kowac’să t o thành ph c ch tăRosindolămƠuăđ

Chu n b môiătr ng canh NB

C y vi khu năăvƠoămôiătr ng NB, 37 o C trong 24gi , l y ra nh 3-5 gi t thu c th Kowac’s.

Ph n ngăd ngătính:ăl p m tămôiătr ng xu t hi năvòngăđ

Ph n ngă ơmă tính:ă môiă tr ng có màu vàng chanh ho c xanh nh t [8],

2.4.7.5 Kh n ng s d ng nitrate (kh NO3 -)

Ph ngăpháp

N u t iă đi m giao nhau c a 2 v ch vi khu n th nh t không m c thì vi khu n th hai có kh n ngă c ch vi khu n th nh t (k t qu d ngătính).ă

K t qu âm tính khi vi khu n th nh t v n phát tri năbìnhăth ng t iăđi m giao nhau c a 2 v ch

N u t iăđi m giao nhau c a 2 v ch vi khu n th hai m cătrênăđ ng v ch c a th nh t thì vi khu n th hai có kh xâm l n vi khu n th nh t [49].

PH NGăPHÁPăTH NG KÊ S LI U

Các s li uătrongăbƠiăbáoăcáoăđ c th ng kê b i ph n m m Microsoft Excel

K T QU PHÂN L P VI SINH V T N I SINH

Quan sát vi th

Sauăkhiăquanăsátăđ i th , chúng tôi ti n hành quan sát vi th 26 ch ng vi khu n b ng cách nhu măGramăquanăsátăd i kính hi n vi và k t qu đ c trình bày b ng 3.2 và hình 3.3

B ng 3 2 K t qu quan sát vi th các ch ng vi khu n n i sinh

Cách b t màu Hình d ng Cách s p x p

1 TL1 Màu h ng, Gram (-) Tr c, không bào t Riêng l

3 TL3 Màu tím, Gram (+) Tr c, có bào t Chu i

6 TL6 Màu tím, Gram (+) Tr c, có bào t Riêng l

7 TL7 Màu h ng, Gram (-) C u, không bào t T

14 TL14 Màu h ng, Gram (-) C u, không bào t Riêng l

18 TL18 Màu tím, Gram (+) C u, không bào t T

22 TL22 Màu tím, Gram (+) C u, không bào t Riêng l

24 TL24 Màu tím, Gram (+) C u, không bào t Riêng l

26 TL26 Màu tím, Gram (+) Tr c, không bào t Chu i

Hình 3 3 Hình nh quan sát vi th m t s ch ng vi khu n n i sinh d i v t kính 100X

PHÂN L P N M COLLECTOTRICHUM SP GÂY B NH THÁN

K t qu thu th p m u b nh

Chúng tôi tiến hành tìm kiếm các mẫu trái cây bị nhiễm bệnh tại các ruộng thuộc Chợ Gạo, Tiền Giang và phường Phú Mỹ, thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương Kết quả thu được 4 mẫu bệnh, được ghi nhận theo mục 1.1.2.1 và hình 3.4.

Hình 3.4 M t s m u b nh thu th păđ c

K t qu phân l p n m b nh

M u b nhăđ c phân l pătrênămôiătr ng PDA sau 3 ậ 5 ngày thì xu t hi n t ăn m Dùng que c y móc nh năđưăđ c kh trùng h t nh đnh s i n m r i c y sangăđ aăpetriăćăch aămôiătr ng PDA

K t qu phân l p cho th y m u b nh Ti n Giang cho k t qu hình thái n m b nhăt ngăt nh ăn m gây b nh thánăth ăCollectotrichum sp

Sau khi n m m c, ti n hành c yăsangămôiătr ng m i Ti n hành c yăđ nă bào t đ t o khóm n măđ ng nh t

Hình 3.5 Hình nhăquanăsátăđ i th c a n m b nhătrênămôiătr ng PDA

Sauă khiă ćă đ c khóm n mă đ ng nh t, chúng tôi ti n hành làm tiêu b n n măvƠăquanăsátăd i kính hi n vi quang h c k t qu trình bày hình 3.5:

Hình 3.6 Bào t n m b nhăquanăsátăd i kính hi n vi

Kết quả phân lập cho thấy mẫu nấm bệnh phân lập tại tỉnh Tiền Giang (mã chứng TG1 với TG là ký hiệu địa phương) cho kết quả hình thái nấm bệnh gây bệnh Colletotrichum sp: tại nơi phân lập, nấm ban đầu có màu trắng sau chuyển dần sang màu xám trên môi trường PDA Sợi nấm mảnh, đơm nhánh, đa bào, màu trắng đến xám tại bề mặt tấm nấm Bào tử phân sinh hình tròn, không có vách ngăn, có kích thước từ nhỏ đến vừa.

K t qu th nghi m lây b nh nhân t o

Khi ti n hành lây b nh nhân t o trên trái t kh e, sau 7 ngày lây nhi m nh ng trái tăđ u b các tri u ch ng c a b nh thán th

Hình 3.7 Tri u ch ng b nhăthánăth ătrênăqu tăđ c lây b nh nhân t o

Tình trạng ngăn chặn măng hiến cần được chú trọng, nhằm bảo vệ các tính chất và ngăn ngừa sự phát triển của các mầm bệnh như Collectotrichum sp Nghiên cứu của các tác giả Vũ Tri Mân (2007) và Phạm Minh Quân (2009) đã chỉ ra những ảnh hưởng tiêu cực của mầm bệnh này đến cây trồng.

Th Miên (2008) và có kh n ngăgơyăb nhăthánăth ăDoăđ́ăchúngătôiăćăth k t lu n ch ng n m phân l păđ c thu c vi n m Collectotrichum sp.

K T QU XÁCă NH KH N NGăC NHăNIT ăPHỂNăT

T 26 là một trong những chỉ số quan trọng trong việc xác định khả năng sinh sản của khu vực Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu và xác định được 8 chỉ số (TL2, TL4, TL8, TL11, TL15, TL18, TL21, TL26) có khả năng phát triển mạnh mẽ trong môi trường Ashby.

Hình 3 8 Kh n ngăphátătri n c a ch ng TL2 trênămôiătr ngăvôăđ m Ashby

Trong một nghiên cứu của Allu và cộng sự (2014), đã phân loại được 10 chương vi khuẩn có đặc điểm nổi bật trong tổng số 19 chương vi khuẩn nội sinh, dựa trên phân lập từ trái đất (theo phương pháp của Cappuccino và Sherman, 1992).

K T QU XÁCă NH KH N NGăHÒAăTANăLỂN

K TăQU ăXÁCă NHăKH ăN NGăSINHăIAA

Tác động của nồng độ IAA được xác định qua việc đo quang phổ OD530nm, cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với đối chứng Kết quả cho thấy nồng độ IAA ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của cây, với các chỉ số thống kê cho thấy sự khác biệt rõ ràng giữa các mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng.

B ng 3 4 K tăqu ăđ nhăl ngăsinhăIAAăc aăcácăch ng

STT Ch ng K tăqu HƠmăl ng IAA

Trên cùng m t c t, các giá tr trung bình có cùng m u t không khác bi t m c ý ngh a 0,05 qua phép th Duncan

Bi uăđ 3 2 th bi u di năhƠmăl ng IAA trong d ch nuôi c y các ch ng

Sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường MS, có 11 chủng sinh IAA Kết quả OD cho thấy chủng TL11 có nồng độ IAA cao nhất (112,52 ± 2,50 µg/mL) và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với các chủng còn lại (p < 0,05%) Các chủng TL13, TL8, TL26 và TL15 có nồng độ IAA không khác biệt có ý nghĩa thống kê với nhau, trong khi các chủng TL2, TL4, TL19, TL24, TL18, TL21 có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ IAA so với các chủng này.

Nghiên cứu của Allu và cộng sự (2014) xác định hàm lượng IAA theo phương pháp Patten và Glick (2002) Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường Luria Broth bổ sung L-tryptophan (1 mg/100 mL) trong 72 giờ, sau đó ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch và kiểm tra nồng độ IAA.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa có khả năng sinh tổng hợp axit indole-3-acetic (IAA) cao nhất, đạt 17 µg/mL Chúng tôi cũng đã so sánh với các chủng vi khuẩn khác để đánh giá khả năng sản xuất IAA của chúng.

S chênh l ch n ngăđ IAA gi aăđ tài chúng tôi th c hi năvƠăđ tài nghiên c uăc̀ngăh ng có th là do các nguyên nhân sau:

 S khác nhau v vi c áp d ngăph ngăphápănghiênăc u:ămôiătr ng nuôi c y khác nhau, ti n ch t tryptophan b sungă vƠoă môiă tr ng nuôi c y v i hƠmăl ng khác nhau, th i gian nuôi c y khác nhau

 Các ch ng khác nhau có kh n ngă sinhă IAAă khácă nhau,ă t̀yă vƠoă kh n ngăm nh hay y u c a m i ch ng

Hình 3 11 nhăl ng kh n ngăsinh IAA trong d ch nuôi c y

K T QU KH O SÁT KH N NGă KHÁNGă N M

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định tính kháng của 26 chủng vi khuẩn đối với nấm Collectotrichum sp bằng phương pháp khuếch tán giọt thạch Kết quả cho thấy có 3 chủng vi khuẩn (TL5, TL6, TL21) có khả năng kháng nấm hiệu quả.

Hình 3.12 Kh n ngăđ i kháng n m Collectotrichum sp c a ch ng TL5

Chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm khảo sát phân trắc chất lượng của 3 vi khuẩn Thí nghiệm được thực hiện với ba lần lặp lại và các số liệu được xử lý thống kê bằng ANOVA Kết quả đồng kính vòng chất lượng và phân trắc chất được thể hiện trong bảng 3.5 và biểu đồ 3.3.

B ngă3.5ă ng kính vòng c ch và ph nătr mă c ch n m

STT Mã ch ng ng kính vòng c ch n m (mm)

Trên cùng m t c t, các giá tr trung bình có cùng m u t không khác bi t m c ý ngh a 0,05 qua phép th LSD

Bi uăđ 3.3ă th bi u di n ph nătr mă c ch n m (%)

Trong 26 chủng mà chúng tôi phân lập, có 3 chủng có khả năng kháng nấm Sau 6 ngày thử nghiệm kháng sinh, hai chủng cho tỷ lệ kháng cao: TL5 (82,24 ± 1,50 %), TL6 (69,81 ± 0,29 %), và TL21 (65,04 ± 2,68 %) Đặc biệt, chủng TL5 thể hiện khả năng kháng nấm mạnh mẽ.

2 ch ng TL6 và TL21 S khác bi tăćăỦăngh aăth ng kê m c 0,05%

Nghiên cứu của Allu và cộng sự (2014) đã khảo sát khả năng kháng nấm của C.gloeosporioides và phát hiện rằng Pseudomonas aeruginosa có khả năng kháng nấm cao nhất với tỷ lệ 65,44% Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã đưa vào thử nghiệm hai chủng (TL5, TL6) cho kết quả kháng nấm cao hơn so với kết quả so sánh, trong khi chỉ có một chủng (TL21) cho kết quả thấp hơn.

Sự chênh lệch về phân bổ tài nguyên giữa các khu vực có thể do sự khác nhau về tích cực địa lý và khả năng kháng cự của môi trường Điều này dẫn đến việc các khu vực khác nhau có mức độ phát triển và nhu cầu tài nguyên không đồng đều.

K T QU NH DANH SINH HÓA CÁC CH NG M NH

Chúng tôi đã phát hiện ra 4 chủng vi khuẩn TL2, TL5, TL11, T19 với khả năng kháng sinh mạnh mẽ và tiềm năng sinh học cao Các chủng vi khuẩn TL2 là vi khuẩn Gram (-), hình que, không sinh bào tử, có màu trong suốt và không bắt màu Congo red, thuộc chi Azotobacter theo phân loại Bergey’s Trong khi đó, các chủng TL5, TL11 và TL19 là vi khuẩn Gram (+), hình que có bào tử, dương tính với catalase, thuộc chi Bacillus theo phân loại Cowan và Steel.

B ng 3.6 K t qu đnh danh c a ch ng TL2

Kh n ngăb t màu congo red -

Nh n xét: Qua b ng k t qu 3.6, chúng tôi nh n th y ch ngăTL2ăt ngăđ ng v i loài Azotobacter chroococcum theo khóa phân lo i Bergey

B ng 3.7 K t qu đnh danh c a các ch ng TL5, TL11, TL19

Kết quả nghiên cứu cho thấy, chừng 64,29% hiệu quả diệt trừ của chủng TL5 với loài Bacillus thuringgiensis, chừng 71,43% với chủng TL11 và loài Bacillus firmus, cùng với 60,72% hiệu quả của chừng TL19 đối với Bacillus polymyxa.

Trong phòng thí nghiệm, có 5 thí nghiệm không thể thiếu để xác định đặc điểm của Bacillus, bao gồm: đo chiều dài tế bào vi khuẩn, sử dụng ONPG, thử phân hủy ure, xác định vị trí hình dạng tế bào và đo pH của tế bào Các kết quả từ những thí nghiệm này giúp định danh chính xác các chủng Bacillus.

K T QU TH KH N NGăT NGăTHệCHăGI A CÁC CH NG

CH NG đánh giá khả năng tương tác giữa các chủng vi khuẩn với nhau trong quá trình thực nghiệm Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá mức độ kháng giáp của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp cấy vạch vuông góc.

Hình 3.13 Th kh n ngăđ i kháng gi a các ch ng TL5 và TL11

K t qu là 4 ch ng vi khu năăđ c ch năkhôngăđ i kháng v i nhau nên có kh n ngăk t h p đ ti n hành th c nghi m và xây d ng ch ph m

K T LU N

Qua quá trìnhăth căhi nănghiênăc u,ăchúngătôiăđưăthuăđ căm tăs ăk tăqu :

- Phơnăl păđ că26ăch ngăviăkhu năn iăsinhăcơyă tăt ă22ăm uăcơyă tăkh eă m nhăthuăth păt ăcácăru ngă tăkhácănhau.Trongăđ́:

+ 8ăch ngăćăkh ăn ngăc ăđ nhăđ m: TL2, TL4, TL8, TL11, TL15, TL18, TL21, Tl26

+ 3ă ch ngă ćă kh ă n ngă hoƠă tană lơn: TL4, TL19, TL 25; trongă đ́ă ch ngă TL19ăćăho tătínhăcaoănh tă(23,95 ± 4,27 ppm)

+ 11ă ch ngă ćă kh ă n ngă sinhă IAA: TL2, TL4, TL8, TL11, TL13, TL15, TL18, TL19, TL21, TL24, TL26; trongă đ́ă ch ngăTL11 có ho t tính cao nh t (112,52 ± 2,50 àg /mL)

+ 3 ch ng có kh n ngăkhángăn m m nh: TL5, TL6, TL21;ătrongăđ́ăch ng TL5 có kh n ngăkhángăn m m nh nh t (82,24 ± 1,50 %)

- Phân l păđ c n m Collectotrichum sp gây b nhăthánăth ătrênă t

Các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao bao gồm: chủng TL2 với kết quả tăng cường đối với loài Azotobacter chroococcum, chủng TL5 đối với Bacillus thuringgiensis, chủng TL11 với Bacillus firmus, và chủng TL19 cho Bacillus polymyxa Những chủng này không chỉ có khả năng tương thích với nhau mà còn có khả năng kết hợp trên cùng một chất phẩm.

- S d ngăph ngăphápăsinhăh c phân t đ xácăđnh m t cách hoàn ch nh tên ch ng có hi u l c cao

- ánhă giáă hi uă qu ă kíchă thíchă t ngă tr ngă vƠă ki mă soátă sinhă h că n măCollectotrichumăsp.ătrênăcơyă tătrênămôăhìnhăth cănghi m.

Tài Li u Ti ng Vi t

C m nang chu n đoán b nh cây Vi t Nam,ăChuyênăkh oăACIARăs ă129a,ă210ă pp ACIAR: Canberra, Australia

[2] Nguy năThanhă Ơo,ă(2005),ăKh o sát m t s đ c tính Azosirillum sp và nh h ng c a chúng trên vài d ng cây tr ng ng n ngày,ăTr ngă i h c

S ăph m Thành ph H Chí Minh

[3] Cao Ng că i p, Nguy n Th Ng că Bích,ă (2009),ă ắNh n Di n Vi Khu n N t R N i Sinh Trong Cây Lúa B ngăK ăThu t PCR- ARDRAă IGS”,ă CNSH Ph c V Nông-Lâm Nghi p Và Thu S n, pp.69-72

Nghiên cứu của VăV nă nh,ă (2008) về việc sử dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng trừ bệnh hại do nấm Collectotrichum gleoosporioides (Penz.) Sacc gây ra trên cây Khô cành ngàn Keo gai (Acacia auriculiformis x Acacia mangium) đã được thực hiện tại Lâm trường Tam Thông, huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

[5] Nguy n Th Thu Hà, Hà Thanh Toàn và Cao Ng că i p, (2009), ắPhơnăl p và đ c tính các dòng vi khu n n i sinh trong m t s cây c ch nănuôi”,ă

T p chí Công ngh sinh h c 7(2), pp 241-250

Bài viết của L ngăTh H ng Hi p và Cao Ng că i p (2011) nghiên cứu về sự phát triển và nhân diện vi khuẩn nội sinh trong cây Cúc Xuy n Chi (Wedelia Trilobata) bằng phương pháp PCR Nghiên cứu này được công bố trong Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 18a, trang 168-176.

[7] LêăNh ăKi u, Lê Th Thanh Th y, Tr n Quang Minh, Nguy n Th Kim Thoa, Tr n Th L a, Nguy nă V nă Huơn,ă (2009),ă ắ nhă h ng c a ch

SVTH: Nguy n Th Thùy Linh 67 ph mviăsinhăđ i kháng t i b nhăhéoăxanhăvƠăn ngăsu t l c, v ngătrongănhƠăl ivà ngoƠiăđ ng ru ng”, T p chí Khoa h c và Công ngh Nông nghi p Vi t Nam, s ă 02(11).2009 tr 54-60

[8] Nguy nă căL ng,ăPhanăTh Huy n, Nguy năÁnhăTuy t,ă(2011),

Thí nghi m Công ngh Sinh h c – Thí nghi m Vi Sinh V t h c t p 2, tái bàn l n

2,ăNhƠăxu tăb nă iăh căQu căgiaăThƠnhăph ăH ăChíăMinh.

[9] V ăTri u Mân, (2007), Giáo Trình B nh Cây Chuyên Khoa,ăTr ng i H c Nông Nghi p I Hà N i

[10] Tr n Th Miên, (2008), Nghiên c u b nh thán th (Collectotrichum) h i t t i Gia Lâm – Hà N i v xuân hè 2008,ătr ngă i h c Nông nghi p Hà

[11] Tr n Thanh Phong, (2012), ánh giá kh n ng c đ nh đ m c a vi khu n n i sinh đ n n ng su t và ch t l ng c a trái khóm tr ng t i huy n Tân

Ph c, t nh Ti n Giang,ăTr ngă i h c C năTh

[12] B ch Lan Ph ng,(2004),Giáo Trình Ho t Tính Vi Sinh V t t,

[13] QCVN 01 ậ 138 : 2013/BNNPTNT v quy chu n k thu t qu c gia v quy trình phòng tr b nhă thánă th ă (Collectotrichum spp.) h i tă trênă đ ng ru ng

[14] Ph mă ìnhă Quơn,ă (2009),ă Nghiên c u b nh thán th

(Collectotrichum spp.) h i qu t t i H i D ng v ông Xuân n m 2008 –

2009 và bi n pháp phòng tr ,ătr ngă i h c Nông nghi p Hà N i

[15] Shivas R., Beasley D., (2005), Ph ng pháp qu n lí m u b nh th c v t,ăB oătƠngăb nhăcơy,ăS ăNôngănghi păvƠăTh yăs năQueensland,ăAustralia

[16] H a Th S n,ă (2010),ăTuy n ch n và phân lo i m t s ch ng vi khu n đ i kháng v i vi khu n Ralstonia solanacearum gây b nh héo xanh trên cây l c,ăTr ngă i h c Nông lâm Thái Nguyên

[17] Nguy năV năTh ng và Tr n Kh c Thi, (1996), S tay ng i tr ng rau, NXB Nông nghi p Hà N i, pp 78-82

[18] Tiêuăchu năngƠnhă10ăTCNă714:2006ăv ăViăSinhăV tăậăPh ngăphápă đánhăgiáăho tătínhăđ iăkhángăviăkhu năgơyăb nhăhéoăxanhăcơyătr ngăc năRalstoniaă solanacearum Smith

[19] Ph măQuangăThuăvƠăTr năThanhăTr ng,ă(2002),ăPhân l p và tuy n ch n vi khu n đ i kháng v i n m gây b nh vùng r tr ng cây Thông con, Thông tin KHKT Lâm nghi p s 3/2002

Tài li u ti ng Anh

[20] Ahmadă I.A.F,ă Khană M.S,ă (2006),ă ắScreeningă ofă free-living Rhizospherică bacteriaă foră theiră multipleă plantă growthă promotingă activities”,ă Microbiological Research 163, pp 173-181

[21] Alluă S.,ă Kumară N.P.,ă Audipudiă A.ă V,ă (2014),ă ắIsolation,ă biochermical and PGP characterization of endophytic Pseudomonas aeruginosa isolatedăfromăchilliăredăfruităantagonisticăagainstăchilliăanthracnoseădisease”,ăInt J Curr Microbiol App Sci 3(2): 318-329

[22] Azevedo J.L., Maccheroni J Jr., Pereira O and Ara W.L., (2000), ắEndophytic microorganisms: a review on insect control and recent advances on tropical plants”, Electr J Biotech 3: pp 40 - 65

[23] Barrow G.I, Feltham K.A, (1993),Cowan and Steel's manual for the identification of medical bacteria, Cambridge University Press, p 88

[24] Bent E & ChanwayăCP,ă(1998),ăắTheăgrowth-promoting effects of abacterial endophyte on lodgepole pine are partially inhibited by the presence of otherărhizobacteria”,ăCan J Microbiol 44: 980ậ988

[25] Breed R.S, Murray E.G.D, (1974), Bergey’s Manual Of Systematic

[26] Chanway CP, (1997), ắInoculationă ofă treeă rootsă withă plantă growthă promoting soil bacteria: an emerging technology for reforestation”, Forest Sci 43:99ậ112

[27] Duijff B.J., Gianinazzi-Pearsonand V and Lemanceau P., (1997), ắInvolvement of the outer membrane lipopolysaccharides in the endophytic colonization of tomato roots by biocontrol Pseudomonas fluorescens strain WCS417r”,ăNew Phytol 135: pp 325 - 334

[28] Farahă A.,ă Iqbală A.ă (2006),ă ắScreeningă ofă free-living rhizospheric bacteriaă foră theiră multipleă plantă growthă promotingă activities”,ă Agricultural Microbiology, 163, pp 173-181

[29] Feltham R.K.A, Barrow G.I, Cowan and Steel’s manual for the indentification of medical bacteria, Cambridge university press

[30] Glickmann E., Dessaux Y., (1994), ắAăCriticalăExaminationăofătheă Speciﬁcityă ofă theă Salkowskiă Reagentă foră Indolică Compounds Produced by Phytopathogenică Bacteria”,ăApplied And Environmental Microbiology, pp.793ậ

[31] Gong M., Wang J.D, Zhang J., Yang H., Lu X.F., Pei Y., and Cheng J.Q.,ă(2006),ăắStudyăofătheăAntifungalăAbilityăofăBacillus subtilis Strain PY-1 in Vitroă andă Identificationă ofă itsă Antifungală Substanceă (Inturină A)”,ă Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 38(4), pp.233-240

[32] Gordonă S.A.ă andă Weberă R.P,ă (1950),ă ắColorimetrică Estimationă ofă IndoleăAceticăAcid”,ăPlant Physiology, pp 192-195

[33] Guoă L.D.,ă Hydeă D.,ă Liewă E.C.Y,ă (2000),ă ắIdentificationă ofă endophytic fungi from livestonachinesis based on morphology and rDNA sequences”,ăNew Phytol, 147: 617-630

[34] Hallmann J., Qualt-Hallmann A., Mahaffee W F and Kloepper J W., (1997), ắBacterial endophytes in agricultural crops”,ăCan J.Microbiol 43, pp 895 ậ 914

[35] Hallmann J., Quadt-Hallmann A., Rodríguez-Kábana R.and Kloepper J.W., (1998),ă ắInteractions between Meloidogyne incognita and endophytic bacteria in cotton and cucumber”,ăSoil Biol Biochem 30: pp 925 -

[36] Holliday P, (1989), A Dictionary of Plant Pathology, Cambridge University Press, Cambridge

[37] Isaac S, (1992),ắFungalăPlantăInteraction”,Chapman and Hall Press, pp 115

[38] Krishnamurthy K and Gnanamanickam S.S., (1997),ă ắBiological control of sheath blight of rice: induction of systemic resistance in rice by plant- associated Pseudomonas spp”, Curr Sci 72: pp 331 - 334

[39] Kumar K V K., Yellareddygari S K., Reddy M S., Kloepper J W., Lawrence K S., Zhou X G., Sudini H., Groth E., Krishnam raju S., Miller M E., (2012),ăắEfficacyăofăBacillus subtilis MBI 600 Against Sheath Blight Caused by Rhizoctonia solani and onăGrowthăandăYieldăofăRice”,ăRice Science 19(1): 55-

[40] Lemos M.L., Toranzo A.E., BarjaăJ.L.,ă(1985),ăắAntibioticăactivityă of epiphytic bacteriaăisolatedăfromăintertidalăseaweeds”,ăMicrob Ecol 11: 149-

[41] Lodewyckx C, Vangronsveld J, Porteous F, Moore ERB, Taghavi S, MezgeayăMă&ăvanăderăLelieăD.,ă(2002),ăắEndophyticăbacteriaăandătheirăpotentială applications”.ăCrit Rev Plant Sci 21: 583ậ606

[42] LokeshaăN.M.ăandăBenagiăV.I.,ă(2007),ăắBiologicalăManagementăofă Pigeonpea Dry Rootă Rotă Causedă byă Macrophominaă phaseolina”,ă Karnatakaă J.ă Agric 20(1), pp.54 - 56

[43] Maheshwariă K.,ă (2011),ă ắPlantă Growthă andă Healthă PromotingăBacteria”,ăMicrobiology Monographs

[44] MacFaddin J.F., (2000), Biochemical test for identification of Medical bacteria, Lippincott Williams & Wlikins

[45] PaulăN.C,ăJiăS.H,ăDengăJ.XăandăYuăS.H,ă(2013),ăắAssemblagesăofă endophytic bacteria in chili pepper (Capsicum annuum L.) and their antifungal activity against phytopathogensăinăvitro”,ăPlant Omics Journal 6(6), pp 441 ậ

[46] Posadaă F,ă Vegaă FEă (2005),ă ắEstablishmentă ofă theă fungală entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota: Hypocreales) as an endophyteăinăcocoaăseedlingsă(Theobromaăcacao)”,ăMycologia 97: 1195ậ1200

[47] Robert P Ryan, Kieran Germaine , Ashley Franks , David J Ryan ,

& David N Dowling, (2007), Bacterial endophytes: recent developments andapplications

[48] Rosenblueth M and Martínez-Romeroă E.ă (2006),ă ắBacterială endophytesăandătheirăinteractionsăwithăhosts”,ăAm Phytopathol Soc 19, pp 827-

[49] Shafiqur R., Niamul N M Shakila N K., and Manjurul K M.,

(2009), ắApplication of probiotic bacteria: A novel approach towards ensuring food safety in shrimp aquaculture”, Journal of Bangladesh Academy of Sciences 33(1), pp.139-144

[50] Strobel G., Daisy B., Castillo U and Harper J., (2004),ă ắNatural products from endophytic microorganisms”, J Nat Prod 67: pp 257 - 268

[51] Strobelă GA,ă Stierleă A,ă Stierleă D,ă Hessă WMă (1993),ă ắTaxomycesă andreanae a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated withăPaciﬁcăyewăMycotaxon”ă47:71ậ78.Sun L., Qiu F., Zhang X., Dai X., Dong X.,ăSongăW.,ă(2008).ăắEndophyticăBacterialăDiversityăinăRiceă(Oryza sativa L.) RootsăEstimatedăbyă16SărDNAăSequenceăAnalysis”.ăMicrob Ecol 55: 415ậ424

[52] Sturz A.V and Matheson B.G., (1996), ắPopulationă ofă endophytică bacteria which influence host-resistance to Erwinia-induced bacterial soft rot in potatoătubers”,ăPlant Soil 184, pp 265 ậ 271

[53] Sun L., Qiu F., Zhang X., Dai X., Dong X., Song W., (2008), ắEndophytică Bacterială Diversityă ină Riceă (Oryza sativa L.) Roots Estimated by 16SărDNAăSequenceăAnalysis”,ăMicrob Ecol 55: 415ậ424

[54] Than P.P., Prihastuti H., Phoulivong S., Paul W J Taylor and Kevin D.ăHyde,ă(2008),ăắChiliăanthracnoseădiseaseăcausedăbyăCollectotrichumăspecies”,ă Journal of Zhejiang University Sience 9(10), pp.764-778

[55] Verma S C., Ladha J K., Tripathi A K., (2001) ắEvaluationă ofă plant growth promoting and colonization ability of endophytic diazotrophs from deepăwaterărice”,ăJournal of Biotechnology, 91(2-3): 127ậ141

[56] WangăH.,ăWenăK.,ăZhaoăX.,ăWangăX.,ăLiăA.,ăHongăH.,ă(2009).ăắTheă inhibitory activity of endophytic Bacillus sp strain CHM1 against plant pathogenic fungi and its plant growth-promotingă effect”,ăCrop Protection 28: 634ậ639

[57] Wangă J.F,ă(1998),ăắSysmtoms and diasgnotic methods for bacteria wilt in tomato in the field”,ăfieldăguideăforăCLVăproject.

[58] Zinniel D.K, Lambrecht P., Harris N.B., Feng Z., Kuezmarski D., Highley P., Ishimaru C., Barletta G R, Vidaver A.K và Arunakumari A., (2002), ắIsolationăandăcharacterizationăofăendophyticăcolonizingăbacteriaăfromăagronomică cropsăandăprairieăplants”,ăAppl.Environ Microbiol 59, pp 2198-2208

[59] căLam,ă(2013),ăHi uăqu ămôăhìnhătr ngă tăc aănôngădơnăxưăXíchă

Th ,ă http://baoninhbinh.org.vn/hieu-qua-mo-hinh-trong-ot-xuat-khau-cua-nong- dan-xa-xich-tho-20130917102526944p2c20.htm (17/09/2013)

[60] General Plant Biology Horticulture and Crop Science 300 Online Resources,http://www.biologie.uni-hamburg.de/b- online/library/knee/hcs300/hormone.htm

PH L C 1 HÓA CH T VÀ THU C TH

HoƠătană20ăgăKIătrongă50ămLăn c;ăb ăsungăHgIăchoăđ năkhiăbưoăhòaă(32g), sauăăđ́ăthêmă460ăămLăăn c.ăăCu iăc̀ngăb ăsungă134ăgăKOH.ăB oăqu nătrongăl ă t iă ănhi tăđ ăphòng.

1mL 0,5 M FeCl3 + 30 mL H2SO4đđă+ă50ămLăn c.

Cân chính xác 15g (NH4)6Mo7SO24 vào 400 mL nước cất, sau đó thêm 400 mL HCl 10N và khuấy đều Tiếp theo, cho thêm 342 mL HCl 12N vào dung dịch và khuấy cho đến khi hòa tan hoàn toàn Cuối cùng, điều chỉnh thể tích đến 1000 mL bằng nước cất Bảo quản trong bình thủy tinh để đảm bảo chất lượng dung dịch.

1.4 Dung d ch thi c ậaxít clohydric g c:

Hòa tan 10g SnCl2.2H2O vào 25 mL HCl trong bình kín Dung dịch sau phản ứng sẽ có 1 mL dung dịch chứa 132 mL khí CO2 Dung dịch này có thể được sử dụng để phân tích hàm lượng ion natri trong mẫu thử.

Cân chính xác 0.4390g KH2PO4 khô vào 400 mL nước, sau đó thêm 25 mL H2SO4 7N và pha loãng đến 1000 mL để tạo dung dịch phospho 100 ppm Sử dụng dung dịch này để pha loãng các nồng độ phospho khác như 1, 2, 3, 4, 10 và 15 ppm.

1.6 ậ naphtol 5% ậ naphtol : 5 g nh m c ethanol 960ă đ n 100 mL

B o qu n trong chai th y tinh t 2 ậ 3 tu n

Isoamyl alcohol ho c butyl alcohol: 150 mL p-Dimethylaminobenaldehyde (DMBA): 10 g

Cáchăpha:ăChoăaldehydeăvƠoăalcohol,ăăđunănh h n h p 50-60 0 C Cho t t axít vào h n h p trên B o qu n trong chai màu 40 0 C

Axítăacetică(glacial)ă30%ăđnh m căđ n 1000 mL

Axítăacetică(glacial)ă30%ăđnh m căđ nă1000ămL,ăđunănh

1.12 Môi tr ng nutrient Broth (NB)

1.13 Môi tr ng Nutrient Agar (NA)

1.14 Môi tr ng Trypticase soya Agar (TSA)

1.15 Môi tr ng Potato Dextrose Agar (PDA)

1.18 Môi tr ng Minimal Salt ( MS )

1.20 Môi tr ng k khí (Wilson Blair Agar Base)

1.22 Môi tr ng NA b sung 1% casein

HòaăcaseinăvƠoăNaOHă0,1NăvƠăđunăcáchăth yăchoătan.ăSauăđ́ăthêmăt ng t HClă0,1Năđ trung hòa cho t iăkhiăăđ t pH mong mu n thì d ng (pH = 7 -8) Thêm n c c tăchoăđ 100 mL

1.23 Môi tr ng Clark ậ Lubsă(môiătr ng canh MR - VP)

1.24 Môiătr ng lên men các lo iăđ ng

N c c t 1000 mL pH = 7.4 emăh p kh trùng 110 0 C/15 ậ 20 phút

Dung d ch Phenol red 0,1% : 0,1g trong 100 mL c n 20 0

Hòa tan t t c các thành ph nătrongă900ămLăn c H p 121 0 C/15ăphút,ăđ ngu iăđ n 50 ậ 55 0 C,

Hòa tan urê trong 100 mL n c c t, l căvôătr̀ng,ăthêmăvƠoămôiătr ngăc ă b năđưălƠmăngu i

PH ăL Că3.ăHỊNHă NH

Hình 1 Th nghi m phân gi i tinh b t

Hình 5 Th nghi m di đ ng

Hình 2 Th nghi m phân gi i casein

Hình 7 Th nghi m VP Hình 8 Th nghi m NaCl 10%

Hình 9 Các th nghi mălênămenăđ ng

4.1 B ng k t qu đoăODăđ ng chu n,ăđ th đ ng chu n v quá trình đ nhăl ng phospho

B ng 4.1 Giá tr OD 600nm c aăđ ng chu n phospho

B ng 4.2 K t qu OD 600nm xác đnh phospho trong d ch nuôi c y

Bi u đ 4.1 th t ngăquanăgi a m t đ quang và n ng đ phospho chu n

4.2 B ng k t qu đoăODăđ ng chu n, đ th đ ng chu n v quá trình đ nhăl ng IAA (Indol Acetic Acid)

B ng 4.3 Giá tr OD c a đ th đ ng chu n IAA

B ng 4.4 K t qu OD 530nm xác đ nh IAA trong d ch nuôi c y

TL2 TL4 TL8 TL11 TL13 TL15 TL18 TL19 TL21 TL24 TL26

Bi u đ 4.2 th t ngăquanăgi a m t đ quang và n ng đ IAA chu n 4.3 B ng k t qu đoăđ ng kính vòng kháng n m (mm) và ph nătr mă c ch n m (%) c a các ch ng vi khu n th nghi m

B ng 4.5 K t qu đoăđ ng kính vòng kháng n m và ph nătr mă c ch n m

STT Mã ch ng ng kính vòng kháng n m

4.3 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi m xác đ nh kh n ngăhòaătanălơnăvƠăsoăsánhăs khác bi t Ủăngh aăb ng ki măđ nh LSD c a các ch ng vi khu n th nghi m:

Groups Count Sum Average Variance

Variation SS df MS F P-value F crit

4.5 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi măxácăđ nh kh n ngăhòaăsinhăIAAăvƠăsoăsánhăs khác bi tăỦăngh aăb ng ki măđ nh Duncan c a các ch ng vi khu n th nghi m:

4.6 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t thí nghi măxácăđ nh kh n ngăkhángăn m và so sánh s khác bi tăỦăngh aăb ng ki măđ nh

LSD c a các ch ng vi khu n th nghi m:

Tiêu đề	Sàng Lọc Vi Khuẩn Nội Sinh Có Khả Năng Kích Thích Tăng Trưởng Và Kháng Nám Collectotrichum Sp. Gây Bệnh Trên Cây Ớt
Tác giả	Nguyễn Thùy Linh
Người hướng dẫn	ThS. Nguyễn Thanh Thủy, ThS. Nguyễn Văn Minh
Trường học	Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	báo cáo khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2014
Thành phố	Thành Phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	106
Dung lượng	1,63 MB