0341SÀNG LỌC VI KHUÂN Bacillus SINH BACTERIOCIN ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẦN THỰC PHẨM

B ăGIÁOăD CăVẨă ẨOăT O TR NGă IăH CăM ăTP.ăHCM BÁOăCÁOăKHịAăLU N T TăNGHI P Tên đ tài: SẨNGăL CăVIăKHU NăBacillus SINH BACTERIOCIN NGăD NGăTRONG B OăQU NăTH CăPH M KHOAăCỌNGăNGH ăSINHăH C CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINHăH CăPHÂNăT CBHD:ăThS.ăNguy năV năMinh SVTH: LêăQu nhăY năNhi MSSV: 105 301 2530 Khóa: 2010 ậ 2014 Tp H Chí Minh, tháng 05 n m 2014 L IăC Mă N V iă lòngă bi t nă sơuă s c, th yă côă khoaă Côngă Ngh ă Sinhă H că tr ngă iă H că M ă TP.HCMă luônă s nă sƠngă truy nă đ tă nh ngă ki nă th că c ă b nă c ngă nh ă chuyênăsơuătrongăl nhăv căsinhăh căđ ăgiúpăemălƠmăc ăs ăchoănghiênăc uăsauănƠy EmăxinăchơnăthƠnhăc mă năth yăNguy năV năMinhăvƠăcôăD đưăt nătìnhăh ngăNh t Linh ngăd n,ătruy năth ăkinhănghi m,ăt oănh ngăđi uăki năt tănh tăchoă emătrongăsu tăqătrìnhăh căt păvƠăcóăth ăth căhi năt tăđ ătƠiă t iăphịngăthíănghi mă cơngăngh ăviăsinhăc aătr ngă iăH căM ăTP.HCM Xinăghiănh ăcôngă năc aăChaăM đưăkhôngăqu năm iăgianălaoăkhóănh căvƠă s ăhyăsinhăcaoăc ăđ ăchoăconăcóăđ căngƠyăhơmănay Cu i cùng, xină g iă l iă c mă nă t iă nh ngă ng iă thơnă yêu,ă b nă bè,ă ch ă Võă Ng căY năNhi,ăch ăNguy năTh ăM ăLinh cácăanhăch ătrongăphịngăthíănghi mă cơngăngh ăviăsinhăđưăđ ng viênăgiúpăđ ăvƠăđóngăgópănh ngăỦăki năc aămìnhăchoă bƠiăbáoăcáoăth căt păt tănghi pănƠy EmăxinăchơnăthƠnhăc mă n! KHĨA LU N T T NGHI P M CL C M CL C DANHăM CăCÁCăB NG iv DANHăM CăHỊNHă NH v DANHăM CăVI TăT T vi TăV Nă PH NăI:ăT NGăQUAN 1.1 T NGăQUANăV ăVIăKHU NăBACILLUS 1.1.1 Phơnălo i 1.1.2 Kháiăni m 1.1.3 căđi măsinhătháiăvƠăphơnăb ătrongăt ănhiên 1.1.4 Dinhăd 1.1.5 ngăvƠăs ăphátătri năc aăBacillus ngăd ngăc aăBacillus 1.2 T NGăQUANăV ăVIăKHU NăGÂYăB NH 10 1.2.1 Staphylococcus aureus 10 1.2.2 Escherichia coli 11 1.2.3 Salmonella typhi 12 1.2.4 Streptococcus faecalis 13 1.2.5 Listeria monocytogenes 14 1.3 T NGăQUANăV ăBACTERIOCIN 15 1.3.1 Gi iăthi uăchungăv ăbacteriocin 15 1.3.2 Phơnălo iăbacteriocinăc aăchiăBacillus 16 1.3.3 Tínhăch tăc aăBacillus bacteriocin 18 1.3.4 Ho tăđ ngăc aăbacteriocin 19 1.3.5 Tínhăđ iăkhángăvƠăph ngăphápăxácăđ nhătínhăđ iăkháng 20 1.3.6 Sinhăt ngăh păbacteriocin 22 1.3.7 Cácă ngăd ngăc aăBacillus bacteriocin 23 PH NăII:ăV TăLI UăVẨ PH NGăPHÁP 31 2.1 V TăLI U 32 2.1.1 aăđi măvƠăth iăgianănghiênăc u 32 2.1.2 Ch ngăviăkhu n dùngăth ănghi m 32 2.1.3 V tăli uăvƠăhóaăch t 32 SVTH:ăLÊăQU NHăY N NHI i KHÓA LU N T T NGHI P 2.2 PH M CL C NGăPHÁPăNGHIÊNăC U 33 2.2.1 B ătríăthíănghi m 33 nhătínhăkh ăn ngăsinhăbacteriocin 34 2.2.2 2.2.3 Xácăđ nhăho tătínhăkhángăkhu năc aăbacteriocin 36 2.2.4 Tác đ ng c aăcácănhi tăđ ăvƠăđ ăpHătrênăho tătínhăkhángăkhu n 37 nhădanh 38 2.2.5 2.2.6 Xácăđ nhăn ngăđ ăphaăloưngăth pănh tăc aăd ch bacteriocin thơ cịnă că ch ăv iăviăkhu năch ăth 46 2.2.7 Th ănghi măbacteriocinănh ăch tăb oăqu năsinhăh ctrong s a 48 2.2.8 Ph ngăphápăth ngăkê 49 PH NăIII:ăK TăQU ăVẨăTH OăLU N 50 3.1 XÁCă NHă KH ă N NGă SINHă BACTERIOCINă C Aă CÁCă CH NGă BACILLUS 51 3.1.1 l p: nhătínhăkh ăn ngăsinhăbacteriocinăb ngăph ngăphápăđ ăth chăhaiă 51 3.1.2 nhă tínhă kh ă n ngă sinhă bacteriocină b ngă ph ngă phápă khu chă tánă trênăth chătheoămôăt ăc aăTaggă&ăMac-Given (1971) 52 3.2 XÁCă NHăHO TăTệNHăKHÁNGăKHU NăC AăBACTERIOCIN 54 3.3 TÁCă NGă C Aă CÁCă NHI Tă ă VẨă ă pHă TRÊNă HO Tă TệNHă KHÁNGăKHU N 56 3.3.1 Nhi tăđ 57 3.3.2 pH 60 3.4 NHă DANHă CH NGă BACILLUS Cịă HO Tă TệNHă BACTERIOCINă M NHă B NGă PH NGă PHÁPă TRUY Nă TH NGă THEOă KHịAă PHÂNă LO IăC AăCOWANăVẨăSTEELă(1993) 64 3.5 XÁCă NH N NGă PHAă LOẩNGă TH Pă NH Tă C Aă D CH BACTERIOCIN THÔ CọNă CăCH ăV I VI KHU N CH TH 66 3.6 K Tă QU ă TH ă NGHI Mă BACTERIOCINă THUă Că NH ă CH Tă B OăQU NăSINHăH CăTRONGăS A 66 3.7 TÓM T T 68 PH NăIV:ăK TăLU NăVẨ ăNGH 70 4.1.ăK tălu n 71 4.2.ă ăngh : 71 TẨIăLI UăTHAMăKH O 72 SVTH:ăLÊăQU NHăY N NHI ii KHÓA LU N T T NGHI P M CL C PH ăL C 82 SVTH:ăLÊăQU NHăY N NHI iii KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C CÁC B NG B ng 1.1: Phân lo i bacteriocin c a Bacillus, ví d , so sánh v i phân lo i c a LAB bacteriocin 18 B ng 3.1 K t qu xácăđ nh kh n ngăsinhăbacteriocinăc a ch ng Bacillus 51 B ng 3.2 K t qu xácăđ nh kh n ngăsinhăbacteriocinăc a ch ng Bacillus d a vƠoăđ ng kính vịng vô khu n ( = mm) 53 B ng 3.3: K t qu xácăđ nh ho t tính kháng khu n c a bacteriocin c a vi khu n th nghi m (AU/mL) 55 B ng 3.4 K t qu tácă đ ng c a nhi tă đ ho t tính kháng khu n c a bacteriocin c a ch ng K3 (%) 57 B ng 3.5 K t qu tácă đ ng c a nhi tă đ ho t tính kháng khu n c a bacteriocin c a ch ng T3P (%) 59 B ng 3.6 K t qu tácă đ ng c aă cácă đ pH ho t tính kháng khu n c a bacteriocin c a ch ng th nghi m K3(%) 61 B ng 3.7 K t qu tácă đ ng c aă cácă đ pH ho t tính kháng khu n c a bacteriocin c a ch ng th nghi m T3P (%) 62 B ng 3.8 K t qu đ nh danh sinh hóa 65 B ng 3.9 K t qu xácăđ nh n ngăđ pha loãng th p nh t c a d ch bacteriocin thơ cịn c ch v i vi khu n ch th (t l so v i n ngăđ banăđ u) 66 B ng 3.10 K t qu th nghi măbacteriocinănh ăch t b o qu n sinh h c s a c a ch ng th nghi m SVTH: LÊ QUỲNH Y N NHI nhi tăđ th ng (gi ) 67 iv KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C HÌNH NH Hình 1.1: Hình d ng c a m t loài thu c chi Bacillus Hình 1.2: Staphylococcus aureus 11 Hình 1.3: Escherichia coli 12 Hình 1.4: Salmonella typhi 13 Hình 1.5: Streptococcus faecalis 13 Hình 1.6: Listeria monocytogenes 14 Hình 2.1: K t qu vịng vơ khu n 36 Hình 3.1K t qu đ nh tính kh n ngăsinhăbacteriocinăb ng ph ngăphápăđ th ch hai l p 52 Hình 3.2 K t qu đ nh tính kh n ngă sinhă bacteriocină b ngph ngă phápă khu ch tán th ch 54 Hình 3.3 K t qu xácăđ nh ho t tính kháng khu nc abacteriocin 56 Hình 3.4 a: s a b h ăh ng; b: s aăbìnhăth SVTH: LÊ QUỲNH Y N NHI ng 68 v KHÓA LU N T T NGHI P DANH M C DANH M C VI T T T ANOVA: One-way analysis of variance BHI: Brain heart infusion BLIS: Bacteriocin-like inhibitory subtances CFU: Colony Forming Unit- LAB: Lactic acid bacteria NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth MHA: Mueller hinton agar MHB: Mueller hinton broth OD: Optical Density L.monocytogenes: Listeria monocytogenes S.faecalis: Streptococcus feacalis S.typhi: Salmonella typhi S.aureus: Staphylococcus aureus Ecoli: Escherichia coli o Celsius degree C: SVTH: LÊ QUỲNH Y N NHI năv ăhìnhăthƠnhăkhu năl c vi KHÓA LU N T T NGHI P T V Nă T V Nă SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI T V Nă KHÓA LU N T T NGHI P An toƠnăv ăsinhăth căph mălƠăv năđ ălnăđ v iă tìnhă hìnhă hi nă nay.ă u ngăc aăconăng ph măđ căm iăng iăquanătơm,ănh tălƠă iă s ngă xưă h iă ngƠyă cƠngă t ngă caoă d nă t iă nhuă c uă n iăc ngăngƠyăđ cănơngăcao.ăVìăth ăv năđ ăv ăsinhăanătoƠnăth că căchúătr ngăvƠăđ yăm nh Tìnhătr ngăth căph măb ănhi măkhu năngƠyăcƠngăph ăbi năvƠăgơyăthi tăh iăl nă choăcôngătyăth căph măc ngănh ăs căkh eăng iătiêuădùng Cóăr tănhi uănguyênă nhơnăgơyăng ăđ căth căph mănh :ădoăviăsinhăv t,ănguyênăli uăvƠăs năph măch aă đ căt ,ăcácăquáătrìnhăch ăbi năvƠăb oăqu năth căph m,ăch tăph ăgia,ăphơnăhóaăh că vƠăthu căb oăv ăth căv t ăTheoăth ngăkê,ăm iăn măVi tăNamăcóăch ngă20-500 v ă ng ăđ căth căph măv iă7.000-10.000ăn nănhân 100 ậ 200ăcaăt ăvong.ăNhƠăn că c ngăph iăchiătrênă3ăt ăđ ngăchoăvi căđi uătr ,ăxétănghi măvƠăđi uătraătìmănguyênă nhơn.ă Ti nă thu că menă vƠă vi nă phíă choă m iă n nănhơnă ng ă đ cădoă viă sinhăv tă t nă ch ngă 300.000ă ậ 500.000ă đ ng,ă cácă ng ă đ că doă hóaă ch tă (thu că tr ă sơu,ă ph mă mƠuầ)ăt ă3ăậ 5ătri uăđ ng Cácăhoáăch tăb oăqu nălƠănh ngăh păch tăt ănhiênăho călƠănh ngăh păch tăhóaă h căt ngăh p.ăNh ngăh păch tăb oăqu năt ănhiênăth vƠămùiăv ăc aăth căph m vƠăítă nhăh ngăl uăgi ăđ ngăđ năs căkho ăconăng căd ngăch tă i.ăCịnăcácălo iă hóaăch tăđ ăb oăqu năth căph măcóă uăđi mălƠ:ăl uăgi ăth căph mălơu,ăgiúpăchoă vi că kinhă doanhă tr ă nênă d ă dƠngă vƠă thuă l iă đ că nhi uă l iă nhu n.ă Tuyă nhiênă vìă nh ngă hóaă ch tă nƠyă c ngă cóă nh ngă tácă h i nh tă đ nhă nênă chúngă ch ă đ că phépă thêmăvƠoă ăm tăn ngăđ ăh năch ăchoăphép.ăSongăd iăbuônă ngănh ănh ngăng bánăkhơngăh ăquanătơmăt iăđi uănƠyăvƠăc ătìnhăl ăđi.ă i uănƠyăđưăd năđ nănh ngă h ăl yăchoăs căkh eăconăng i.ăTheoăNguy năDuyăTh nh,ăVi năCôngăngh ă Sinh h căvƠăCôngăngh ăTh căph m,ă k chăđ c,ăkhôngăđ iăh căBáchăKhoaăHƠăN i,ăformaldehydeălƠăch tă căs ăd ngăchoăb tăk ăs năph mănƠo,ăđ ngăth iăkhôngăđ căs ă d ngă lƠmă ph ă giaă th că ph m.ă Tuyă nhiên,ă vìă cóă tínhă sátă trùngă caoă nênă v nă đ gianăth că ng s ăd ng.ăCácălo iăth căph măđ căngơmăformaldehydeăs ăkíchăthíchă gơyăcayăniêmăm căm t,ăđ ăm t,ăkíchăthíchăđ ngăhơăh pătrênăgơyăch yăm i,ăviêmă SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI KHÓA LU N T T NGHI P ANOVA Source of Variation PH L C SS df MS F Between Groups Within Groups 3180.952 150 530.1587 49.48148 14 10.71429 Total 3330.952 20 P-value F crit 1.25E08 2.847726 2.3.1.4.2 pH 2.3.1.4.2.1 K3 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row Row Row Row Count 3 3 3 ANOVA Source of Variation SS Sum Average Variance 194.11 64.70333 34.63323 217.65 72.55 323.0473 276.48 92.16 11.5248 294.12 98.04 11.5248 282.36 94.12 235.29 78.43 11.5248 176.46 58.82 df MS F Between Groups Within Groups 4239.095 784.5099 706.5158 12.60815 14 56.03642 Total 5023.605 20 2.3.1.4.2.2 P-value F crit 6.08E05 2.847726 T3P Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Count SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 3 Sum Average Variance 225 75 275 91.66667 13.02083 96 KHÓA LU N T T NGHI P Row Row Row Row Row PH L C 3 3 ANOVA Source of Variation SS 300 100 281.25 93.75 243.75 81.25 193.75 64.58333 13.02083 168.75 56.25 df MS F Between Groups Within Groups 4657.738 52.08333 776.2897 208.6667 14 3.720238 Total 4709.821 20 P-value F crit 7.14E13 2.847726 2.3.2 K t qu x lý th ng kê b ng ph n m m stagraphic Plus 3.0 2.3.2.1 Steptococcus faecalis 2.3.2.1.1 Nhi tăđ 2.3.2.1.1.1 K3 2.3.2.1.1.2 T3P SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 97 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 2.3.2.1.2 pH 2.3.2.1.2.1 K3 2.3.2.1.2.2 T3P 2.3.2.2 Staphylococcus aurureus 2.3.2.2.1 Nhi tăđ 2.3.2.2.1.1 K3 SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 98 KHÓA LU N T T NGHI P 2.3.2.2.1.2 PH L C T3P 2.3.2.2.2 pH 2.3.2.2.2.1 K3 2.3.2.2.2.2 T3P SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 99 KHÓA LU N T T NGHI P 2.3.2.3 PH L C Salmonella typhi 2.3.2.3.1 Nhi tăđ 2.3.2.3.1.1 K3 2.3.2.3.1.2 T3P 2.3.2.3.2 pH 2.3.2.3.2.1 K3 SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 100 KHÓA LU N T T NGHI P 2.3.2.3.2.2 2.3.2.4 PH L C T3P Listeria monocytogenes 2.3.2.4.1 Nhi tăđ 2.3.2.4.1.1 K3 2.3.2.4.1.2 T3P SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 101 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C 2.3.2.4.2 pH 2.3.2.4.2.1 K3 2.3.2.4.2.2 T3P 2.4 K t qu x lý th ng kê ANOVA m t y u t k t qu th nghi măbacteriocinănh ăch t b o qu n sinh h c s a 2.4.1 K t qu x lý th ng kê b ng ph n m m Microsoft Excel SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 102 KHÓA LU N T T NGHI P 2.4.1.1 PH L C K3 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row Row Row Row Row Row Row 10 Row 11 Count 3 3 3 3 3 ANOVA Source of Variation SS Sum 23.5 28 28.5 29.25 29.5 31 31.75 32.5 33.5 35.25 38.25 Average 7.833333 9.333333 9.5 9.75 9.833333 10.33333 10.58333 10.83333 11.16667 11.75 12.75 Variance 0.583333 0.020833 0.0625 0.083333 0.083333 0.020833 0.020833 0.083333 0.0625 0.0625 df MS F Between Groups 52.16667 Within Groups 2.166667 10 5.216667 22 0.098485 Total 32 2.4.1.2 54.33333 52.96923 P-value 4.77E13 F crit 2.296696 T3P Anova: Single Factor SUMMARY Groups Row Row Row Row Row Row Row Row Count SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 3 3 3 3 Sum 23.5 25.5 27.75 28.25 29.75 30.5 31.75 32.75 Average 7.833333 8.5 9.25 9.416667 9.916667 10.16667 10.58333 10.91667 Variance 0.583333 0.25 0.0625 0.145833 0.020833 0.083333 0.020833 0.020833 103 KHÓA LU N T T NGHI P Row Row 10 Row 11 PH L C 33.75 11.25 0.1875 34.5 11.5 0.25 38 12.66667 0.333333 ANOVA Source of Variation SS df MS F Between Groups Within Groups 58.86742 3.916667 10 5.886742 33.06596 22 0.17803 Total 62.78409 32 P-value F crit 6.01E11 2.296696 2.4.2 K t qu x lý th ng kê b ng ph n m m stagraphic Plus 3.0 2.4.2.1 K3 2.4.2.2 T3P SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 104 KHÓA LU N T T NGHI P SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI PH L C 105 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C PH ăL CăHỊNHă NH Hình nh danh Bacillus sp theo khóa phân lo i Cowan Steel SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 106 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Hình Th nghi mphân gi i tinh b t (+) iăch ng + Hình Th nghi m catalase Hình Th nghi m VP SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 107 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Hình Th nghi măkh ăn ngăs ăd ngănitrat Hình Th nghi mălênămenăđ SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI ng 108 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Hình Th ănghi măkh ăn ngăs ăd ngăcitrate (-) (+) Hình 8Th nghi m kh n ngăphơnăgi i ure Hình Th nghi m oxidase Hình 10 Th nghi m k khí SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI 109 KHÓA LU N T T NGHI P PH L C Hình 11 Th nghi măkh ăn ngădungăn pămu iăn ngăđ ă10% Hình 12ăTestăkh ăn ngăsinhătr SVTH:ăLÊăQU NHăY NăNHI ngă ă50oC 110