Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và làm trắng da từ cao chiết của cây Ô dược (Lindera myrha) .pdf

NTTU-NCKH-05 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017 Tên đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa làm trắng da từ cao chiết Ô dược (Lindera niyrrhaỴ' Số hợp đồng: 2017.01.11/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài:ThS Nguyễn Lương Hiếu Hòa Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 12 tháng TP Hồ Chỉ Minh, ngày tháng năm 2017 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TÔNG KÉT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017 Tên đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa làm trắng da từ cao chiết Ô dược (Lindera rnyrrha)” Số hợp đồng: 2017.01.11/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Lương Hiếu Hịa Đơn vị cơng tác: Viện Kỳ thuật công nghệ cao NTT Thời gian thực hiện: 12 tháng Các thành viên phối hợp cộng tác: STT 01 02 03 04 Họ tên Nguyễn Hoàng Dũng Phùng Thị Thu Hường Trân Lê Phương Duy Hồ Tá Giáp Chuyên ngành Công nghệ sinh học Công nghệ sinh học Công nghệ sinh học Công nghệ sinh học ii Cơ quan công tác Viện KT-CNC NTT Viện KT-CNC NTT Viện KT-CNC NTT Viện KT-CNC NTT Ký tên MỤC LỤC MỞ ĐÀU CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan melanin 1.2 Con đường tỗng hợp melanin 1.3 Qúa trình điều hịa sinh tổng hợp melanin 1.4 Tình hình nghiên cứu họp chấtlàm trắng datrên giói 1.5 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.6 Tổng quan lồi Ơ dược 1.7 Tình hình nghiên cứu lồi Ơ dượctrong vàngồi nước 1.7.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.7.2 Tình hình nghiên cứu nước CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU 2.1 Nội dung nghiên cứu 2.2 Phuơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiết 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng melanin 2.2.4 Phương pháp xác định hoat tính in vitro tyrosinase 10 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính cellulose tyrosinase 10 2.2.6 Phương pháp xác định tính chong oxy hóa (DPPH assay) 10 2.2.7 Phương pháp xử lý so liệu 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12 3.1 Thu nhận cao tổng cao phân đoạn Ô dược 12 3.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa phân đoạn cao 13 3.3 Khảo sát khả ức chế tổng họp melanin gây độc tế bàocủa phân đoạn caol4 3.4 Khảo sát khả ức chế enzyme tyrosinase phân đoạn cao 15 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 17 4.1 Kết luận 17 4.2 Kiến nghị 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 iii iv PHỤ LỤC 1: DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT ATCH Adrenocorticotropic hormone cAMP Cyclic adenosine monophosphate DOPA 3,4-dihydroxyphenylalanine DHICA 5,6-dehydroxyindole2-carboxylic acid IP3/DAG Inositoltriphosphate/diacyglyecerol IC50 The half maximal inhibitory concentration MITF Microphthalmia-associated transcription factor POMC Pro-opopmelanocortin CC-MSH a -melanocyte stimulating hormone V PHỤ LỤC 2: DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, sơ ĐỊ, HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc tế bào melanocytes Hình 1.2 Con đường tổng hợp hóa học melanin Hình 1.3 Một số đường truyền tín hiệu liên quan đến q trình tổng hợp melanin Hình 1.4 Cây dược Bảng 3.1 Kết thu nhận cao tổng mẫu ô dược 12 Hình 3.1 Cao tổng methanol ô dược 12 Bảng 3.2 Kết thu nhận cao phân đoạn mẫu ô dược 12 Hình 3.2 Biểu đồ thể khả bắt gốc tự DPPH phân đoạn cao 13 Hình 3.3 Tác dụng phân đoạn mẫu ô dược lên trình tổng hợp melanin độc tính đối vói tế bào u hắc tố B16F10 14 Bảng 3.3 Tác dụng cao methanol lên hoạt tính ty rosinase 15 Bảng 3.4 Tác dụng cao ethyl acetate lên hoạt tính tyrosinase 15 vi TÓM TẤT KẾT QUẢ NGHIÊN cửu Sán phẩm đăng ký thuyết minh Sản phẩm thực đạt - 5g cao phân đoạn ethyl acetate có 5g cao phân đoạn có hoạt tính tốt hoạt tính kháng oxy hóa ức che enzyme tyrosinase tot - Dữ liệu đầy đủ ve hoạt tính kháng Các thơng số khà kháng oxy hóa, khà làm trang da cùa oxy hóa khà làm trang da phân đoạn cao chiết phân đoạn cao Bài báo khoa học đăng tạp chí báo tạp chí Cơng nghệ sinh chuyên ngành nước học, Viện hàn lâm khoa học công - nghệ Việt Nam 15(3A),2017 sinh học đăng proceeding hội nghị ICASET, Manipal, Ấn Độ - Đào tạo cữ nhân công nghệ sinh học, ĐH Nguyền Tất Thành Thời gian đăng ký : từ ngày Đào tạo cử nhân ngành công nghệ đến ngày Thời gian nộp báo cáo: ngày 31/12/2017 vii MỞ ĐÀU Từ xa xưa, ô dược sử dụng rộng rãi loại thuốc giúp kích thích tiêu hóa, tăng thêm mùi vị ăn, tạo cảm giác ngon miệng Theo Đơng y, dược có vị cay, tính lạnh, giúp nhiệt giải độc cho thể, lợi tiểu, sát trùng, trị khí nghịch, ngực đầy bụng trướng, bụng đau, ăn qua đêm mà không tiêu, ăn vào nôn Trong tài liệu y học co truyền lưu lại nhiều tác dụng quý từ ô dược Mặc dù sử dụng rộng rãi y học dân tộc, song việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thảo dược vần chưa phổ biến, nước ta, chưa có nghiên cứu hoạt tính lồi dược, đặc biệt khả làm trắng da Với mục tiêu tìm kiểm hợp chất từ thiên nhiên có khả làm trắng da ứng dụng mỳ phẩm, đảm bảo tính an tồn cho người sử dụng, tiến hành thực đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa làm trắng da từ cao chiết Ô dược (Lindera myrrhaỴ' Đe tài bước đầu tách chiết thu nhận thành công phân đoạn cao ô dược: cao methanol, hexane, ethyl acetate, nước Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, ức che tổng hợp melanin enzyme tyrosinase phân đoạn cao thu nhận cho thấy cao ethyl acetate có hoạt tính tot phân đoạn tách chiết với khả bắt gốc tự cao (IC50 = 0,058 mg/ml), cao ethyl acetate có khả ức chế tống hợp melanin mà không gây độc cho tế bào, nồng độ 50 pg/ml có khả ức chế 38,17% hoạt tính tyrosinase tế bào u hắc to B16F10 Những kết ban đầu cho thấy ô dược có nhiều triển vọng ứng dụng mỹ phẩm thành phần làm trắng da an tồn CHƯƠNG TĨNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan melanin Melanin hợp chất sinh học cao phân tử có vai trị quan trọng việc tạo nên sắc tố da người với sắc tố khác hemoglobin, carotene [1] Melanin có vai trò quan cho việc quy định màu sắc da, tóc, mắt mồi người, ngồi chúng có tác dụng bảo vệ thê khởi tác động xấu cùa môi trường tia uv, gốc tự người, melanin tìm thấy chủ yếu da, tóc, mơ sắc tố nằm bên trịng đen mắt chất xám não da, melanin sản xuất tế bào melanocytes nằm lớp biếu mơ (hình 1.1), melanocytes, melanin tống hợp bào quan đặc biệt melanosome [2] Sự hình thành hắc tố hay melanin xảy the tiếp xúc với tia cực tím, tế bào melanocyte nhận tín hiệu bắt đau sản xuất melanin, khiến da chuyển màu rám nắng Melanin chất hấp thị ánh sáng hiệu quả, hấp thụ đen 99% tia uv, chúng có tác dụng bảo vệ thê khỏi tác hại tia UVB, giảm nguy ung thư da [5] Keratinocytes Melanin pigment Melanocytes Basal layer Hình 1.1 Cấu trúc tế bào melanocytes 1.2 Con đường tổng họp melanin Trong melanocytes, melanin tổng họp melanosome Melanosome chứa nhiều enzyme cần thiết cho trình tổng họp melanin [4], Enzyme chính, tyrosinase (a dụng chuyển hóa, vị trường Trong y học dân gian, thường sử dụng làm thuốc giúp trị bệnh đường tiêu hóa đau bụng, khó tiêu có tác dụng cầm máu [1-6] Cây ô dược cao khoảng 1,3 - 1,4 m cành gầy, màu đen nhạt, mọc so le, hình bầu dục, mặt nhằn bóng, có long, hoa màu hồng nhạt, mọng hình trứng, chín có màu đỏ, tồn có mùi thorn, vị đắng (hình 1.4) [9] Hình 1.4 Cây dược 1.7 Tình hình nghiên cứu lồi Ơ dược ngồi nước 1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Hiện tại, chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học lồi Các nghiên cứu cơng bố cho thấy thành phần có hoạt tính alkaloids aporhine, arosine, arosinine [8] loài gần với L myrrha L aggregate^ số hợp chất xác định norisodoldine, linderalactone, lindeneol, boldine, reticuline tìm thấy [7] Rễ Lindera cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng dị ứng, kháng oxy hóa, kháng ung thư kháng virus [15], Wang cs (2007) [3] nghiên cứu khả kháng viêm alkaloid từ dịch chiết loài Lindera tnyrrha cho thấy alkaloid dược có khả kích thích tăng sinh tế bào lympho hạch bạch huyết, nơi gần khóp bị viêm mơ hình chuột Ket nghiên cứu ban đầu cho thấy tiềm điều trị bệnh viêm khớp dạng thấp lồi dược Guo-Ọing cs (2016) [7] nghiên cứu thành phần hóa học loài Lindera nacusua phát hợp chất, bao gồm: demethylmacrosporine I (1), emodin-6-O-bDgluco- pyranoside (2), litsenolide DI (3), (2Z, 3R, 4S) -2 (dodec-11-ynylidene) -3- tanolide hydroxy-4-methyilbu- (4), l-O-3,4-dimetoxy-5-hydroxyphenyl- (6-0-3,5- dimethoxygalloyl) -b-D-glucopyranoside (5), l-O-3,4-dimetoxy-5-hydroxyphenyl- (6- Ova-nilloyl) -b-D-glucopyranoside (6), (E) -feruloyltyra (7), Z-N- feruloyltyramine (8),và 1-O-b-D-glucopyranosyl- (2S, 3R, 4E, 8Z) -2 [2 '(R) - hydroxyhex- adecanoyl-amino] 4,8-octadecadiene-1,3-diol 1.7.2 Tình hình nghiên cứu nước Hầu có nghiên cứu lồi này, có nghiên cứu Phan Bá Hưng cộng (1994) [2] nghiên cứu aporphine alkaloid thu nhận từ rề loài Lindera myrrha phát cấu trúc hai alkaloids mới, oduocine oxoduocine với bảy dần xuất aporphine khác Hầu hết nghiên cứu lồi Ơ dược ngồi nước tập trung nghiên cứu thành phần hóa học, chưa có cơng bố khả ức chế tong hợp melanin lồi Bênh cạnh đó, nghiên cứu phân tách chất có hoạt tính làm giảm q trình tổng hợp melanin Việt Nam hạn chế Do vậy, việc nghiên cứu hoạt tính ức chế tổng hợp melanin cùa dược sè góp phần tăng hiểu biết sở khoa học nhằm định hướng sử dụng đắn nguồn dược liệu CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư 2.1 Nội dung nghiên cứu Dựa mục tiêu đề ra, đề tài thực với nội dung sau: Nội dung 1: Tách chiết cao tổng cao phân đoạn lồi dược Nội dung 2\ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa Nội dung 3: Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase, ức chế tồng hợp melanin liên quan đến khả làm trắng da cùa lồi dược Nội dung 4: Tổng hợp kết quả, xác định cao phân đoạn cho hoạt tính tốt Cách tiếp cận Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm bao gồm thu thập dừ liệu, phân tích thử nghiệm hoạt tính làm trắng da mơ hình chuẩn phù hợp với điều kiện Việt Nam 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiết Mầu ô dược sấy khô nghiền mịn thành dạng bột Bột chiết ba lần dung môi Methanol (99%) 24 nhiệt độ phòng Dịch chiết methanol sau lọc qua giấy lọc, cạn máy cô chân không 35°c đe tạo thành cao methanol Sau đó, cao methanol phân đoạn dung môi hữu đê tạo thành phân đoạn Hexane, Chloroform, Ethyl acetate 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào Te bào B16F10 melanoma cung cấp ATCC Te bào B16F10 nuôi môi trường DMEM bổ sung 10% (v/v) huyết bê (FBS) 1% (v/v) kháng sinh penicillin/streptomycine 37 °C, 5% CƠ2, nước bão hòa Te bào cấy chuyền sau mồi ngày sử dụng lần cấy chuyền thứ 30 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng melanin Te bào B16 nuôi cấy mật độ X 104 tế bào đĩa giếng (6-well plate) Sau 24 nuôi cấy, tế bào ủ với mẫu cần kiếm tra vòng 48 Sau 48 nuôi cấy, tế bào thu nhận hòa tan 200 pl DMSO chứa 10% NaOH Sau đó, mầu đem đun 80 °C vòng Hàm lượng melanin xác định cách đo quang phổ bước sóng 405 nm Arbutin (200 pl/ml) sử dụng đối chứng dương 2.2.4 Phương pháp xác định độc tính (MTT assay) Đẻ xác định độc tính dược tế bào B16F10 melanoma, thử nghiệm dựa đối màu MTT (3-(4,5- dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) sử dụng Te bào B16 nuôi đĩa 96 giếng (96-well plate) mật độ tế bào 2.5 X 103 Sau 24 giờ, tế bào ủ với mầu cần kiếm tra nồng độ khác nuôi cấy tiếp 48 Sau 100 pl dung dịch MTT nồng độ mg/ml bổ sung vào giếng Sau ủ 37°c, môi trường chứa dung dịch MTT hút 100 pl DMSO cho vào để hòa tan formazan tạo Sau mầu đem đo quang phố bước sóng 540 nm 2.2.5 Phương pháp xác định hoat tỉnh in vitro tyrosinase Phương pháp để xác định tác dụng trực tiếp cao chiết ô dược lên hoạt tính tyrosinase Hồn hợp phản ứng gồm 100 pl dung dich mẫu, 22U mushroom tyrosinase, 40 pl L-DOPA (5 mM) ủ đìa 96 giếng 37°c Sau 20 phút, mầu đem đo quang phổ bước sóng 475 nM Kojic acid sử dụng làm chứng dương 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tỉnh cellulose tyrosinase Te bào B16 nuôi cấy mật độ X 104 te bào đìa giếng (6-well plate) Sau 24 nuôi cấy, tế bào ủ với mẫu cần kiếm tra vòng 48 Sau 48 nuôi cấy, tế bào thu nhận Te bào sau ly giải cách sử dụng dung dịch PBS chứa 1% Tryton-X100 sonicate 4°c Dung dịch tế bào sau tiến hành ly tâm lạnh, tốc độ 13000 rpm để thu dịch protein Nồng độ protein định lượng cách sử dụng protein assay kit (Bio-RAD, USA) Sau đó, hồn hợp phản ứng bao gồm 40 pg protein tong, 40 pl L-DOPA 0.1 M PBS ù đĩa 96 giếng 37°c Sau 20 phút, mẫu đem đo quang phổ bước sóng 475 nM 2.2.7 Phương pháp xác định tính chống oxy hóa (DPPH assay) Hoạt tính chống oxy hóa xác định phương pháp DPPH Mầu hòa dung dịch PBS nồng độ khác Hồn hợp phản ứng bao gồm 100 pl mầu, 10 100 pl dung dich DPPH đĩa 96 giếng ủ 37°c 30 phút Sau mầu đem đo quang phố bước sóng 517 nm Khả chống oxy hóa đươc xác định theo cơng thức % scavenging activity = [Acontrol-^sample]/ /lcontrol* 100 2.2.8 Phương pháp xử lý so liệu Các thí nghiệm lặp lại lần Giá trị số liệu biểu thị giá trị trung bình ± SD (standard derivation) Sự khác biệt mầu kiêm tra t-test, Duncane với giá trị p < 0.05 xem khác biệt có ý nghĩa Tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo: - Hiện điều kiện Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu sử dụng mơ hình dịng tế bào động vật cho việc sàng lọc hợp chất làm trắng da - Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính lồi dược chưa nghiên cứu nhiều chưa có cơng bố hoạt tính làm trắng da dược Việc nghiên cứu hoạt tính làm trắng da từ lồi thảo dược thành cơng tạo giá trị thương mại lớn góp phần bảo ton từ có cách sử dụng hiệu 11 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu nhận cao tổng cao phân đoạn Ô dược Mầu rề dược mua Công ty cổ phần Kỳ Bá Linh, Hãi Thượng Lãn ông, quận 5, Tp Hồ Chí Minh Mầu sấy khơ, nghiền thành dạng bột ngâm với methanol (99%) tỉ lệ 1:4 24 giờ, nhiệt độ phòng, dịch chiết lọc qua giấy lọc cô quay loại dung môi thu nhận cao tổng Kết thu nhận cao tổng mầu ô dược thể bảng 3.1 Sản phẩm cao thu nhận có màu nâu sầm, dạng đặc (hình 3.1) Bảng 3.1 Ket thu nhận cao tổng mầu ô dược Khối lượng mẫu thô Thế tích dung mơi chiết Khối lượng cao tơng (g) 250 (ml) 1000 (g) 22 Hiệu suất (%) 8,8 Hình 3.1 Cao tông methanol ô dược Cao tổng methanol sau thu nhận chiết với hexane ethyl acetate để thu nhận cao phân đoạn Sử dụng 10 g cao tổng, hoà tan 100 ml nước cất, chiết phân đoạn với hexane theo tỉ lệ : 1, lặp lại lần Sau lấy lớp nước, chiết phân đoạn với ethyl acetate tỉ lệ : 1, lặp lại lần Ba phân đoạn chiết hexane, ethyl acetate nước đem cô, kết khối lượng cao phân đoạn ghi nhận Bảng 3.2 Bảng 3.2 Ket thu nhận cao phân đoạn mẫu ô dược Khối lượng (g) Cao hexane 5,96 Cao ethyl acetate 3,62 Cao nước 0,37 Tỉ lệ (%) 59,9 36,4 3,7 12 ... tiến hành thực đề tài ? ?Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa làm trắng da từ cao chiết Ô dược (Lindera myrrhaỴ'' Đe tài bước đầu tách chiết thu nhận thành công phân đoạn cao ô dược: cao methanol, hexane,... chất làm trắng da - Các nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính lồi dược chưa nghiên cứu nhiều chưa có cơng bố hoạt tính làm trắng da ô dược Việc nghiên cứu hoạt tính làm trắng da từ lồi thảo dược. .. tính tốt hoạt tính kháng oxy hóa ức che enzyme tyrosinase tot - Dữ liệu đầy đủ ve hoạt tính kháng Các thơng số khà kháng oxy hóa, khà làm trang da cùa oxy hóa khà làm trang da phân đoạn cao chiết