GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Hiện nay, ô nhiễm môi trường và việc sử dụng hóa chất trong thực phẩm và mỹ phẩm đã dẫn đến sự gia tăng gốc tự do trong cơ thể, làm tăng nguy cơ mắc các bệnh nguy hiểm như ung thư và viêm gan Gốc tự do, được hình thành từ quá trình trao đổi chất và tác động của môi trường, có khả năng gây tổn thương cho tế bào, ảnh hưởng đến protein, DNA và acid béo, từ đó dẫn đến các bệnh thoái hóa Chất kháng oxy hóa có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do gốc tự do gây ra, giúp bảo vệ cơ thể khỏi các rối loạn Hơn nữa, khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật, làm gia tăng nguy cơ bệnh truyền nhiễm và dịch bệnh nếu không được kiểm soát.
Thuốc tổng hợp có thể gây ra nhiều tác dụng phụ ảnh hưởng đến sức khỏe, vì vậy trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên hiệu quả và ít độc hại với khả năng kháng oxy hóa ngày càng được chú trọng Chiết xuất từ động, thực vật đang trở thành lựa chọn phổ biến và có tính ứng dụng cao Việt Nam, với khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi, nổi bật với sự đa dạng về các loại cây dược liệu, do đó, khảo sát các loại cây trong tự nhiên có khả năng chống oxy hóa là rất cần thiết.
Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata L.) là một loại cỏ dại phổ biến ở Việt Nam, nổi bật với hoa chứa polyphenol Thuộc họ Cúc, loài cây này thường mọc thành thảm dày và nở hoa quanh năm Từ lâu, Sài đất ba thùy đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở nhiều quốc gia như Nam Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và Việt Nam để điều trị nhiều bệnh khác nhau Nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ hoa của nó chứa các hợp chất polyphenol như tanin, flavonoid và phenol Các tác dụng dược lý của Sài đất ba thùy bao gồm kháng oxy hóa, giảm đau, kháng viêm, kháng khuẩn, chữa lành vết thương, diệt ấu trùng, kháng ung thư, bảo vệ gan, điều trị tiểu đường và các vấn đề sinh sản ở phụ nữ Do đó, Sài đất ba thùy có tiềm năng lớn cho nghiên cứu sâu hơn về hoạt động sinh học, đặc biệt là khả năng kháng oxy hóa của nó.
Cấu trúc của các hợp chất polyphenol chứa các liên kết không bão hòa, khiến chúng dễ bị oxy hóa khi tiếp xúc với ánh sáng, nhiệt độ, pH, nước và enzym Điều này ảnh hưởng đến độ ổn định của các hợp chất này.
Để tăng cường hiệu quả của polyphenol, cần bảo vệ chúng khỏi các tác hại vật lý và hóa học trước khi ứng dụng Một phương pháp tiềm năng là bao gói các hợp chất polyphenol trong các vật liệu sinh học, giúp bảo vệ chúng khỏi các tác nhân có hại từ môi trường.
Fibroin, một loại protein từ tơ tằm, đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dược phẩm nhờ vào tính linh hoạt, cấu trúc lưỡng tính và khả năng kết tinh cao, giúp tăng cường sự ổn định của vật liệu sinh học Nó được sử dụng trong y dược học để hỗ trợ kỹ thuật mô và làm chất mang cho các phân tử kháng oxy hóa như resveratrol, quercetin, curcumin, alpha mangostin và các hợp chất dễ bay hơi Tuy nhiên, việc ứng dụng fibroin trong dẫn truyền dịch chiết dược liệu vẫn còn hạn chế, với một số nghiên cứu như của Bayraktar và cộng sự cho thấy khả năng tải nạp chiết xuất từ lá olive trong vi hạt fibroin.
Nghiên cứu về hoa Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata L.) đã chỉ ra rằng các chiết xuất từ hoa này có tiềm năng kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng ung thư Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây, nhưng các nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy tại Việt Nam vẫn còn hạn chế Đề tài “Bào chế và khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hệ vi hạt từ fibroin tơ tằm chứa dịch chiết hoa Sài đất ba thùy” được thực hiện nhằm định tính thành phần hóa học, định lượng polyphenol tổng và khảo sát khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%, cùng với các hệ vi hạt từ dịch chiết hoa, tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu “Bào chế và khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hệ vi hạt từ fibroin tơ tằm chứa dịch chiết hoa Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata L.)” nhằm mục tiêu phát triển phương pháp bào chế vi hạt từ fibroin tơ tằm và đánh giá hiệu quả kháng oxy hóa của hệ vi hạt này Nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quý giá về khả năng ứng dụng của fibroin tơ tằm kết hợp với dịch chiết từ hoa Sài đất ba thùy trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe và mỹ phẩm.
Định tính một số hợp chất có trong các cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy.
Định lượng polyphenol tổng có trong các cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy.
Chiết fibroin từ kén tơ tằm.
Bào chế và tải dịch chiết từ cao chiết vào hệ vi hạt fibroin tơ tằm.
Đánh giá một số đặc tính hóa lý của các hệ vi hạt fibroin.
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro của các cao chiết hoa
Sài đất ba thùy cũng như các hệ vi hạt được tải dịch chiết từ hoa Sài đất ba thùy.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com2
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Hoa Sài đất ba thùy, được thu hái tại thành phố Cần Thơ vào tháng 10/2021, đã được định danh dựa trên các đặc điểm hình thái trong sách "Cây cỏ Việt Nam" của Phạm Hoàng Hộ.
Nghiên cứu đã tiến hành định tính các nhóm hợp chất như alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, các chất khử và các acid hữu cơ có trong cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy, sử dụng các dung môi MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% Kết quả cho thấy sự hiện diện đa dạng của các hợp chất này, góp phần vào giá trị dược lý và ứng dụng tiềm năng của hoa Sài đất ba thùy trong y học.
- Chiết fibroin từ kén tơ tằm.
- Bào chế và tải dịch chiết từ các cao chiết vào hệ vi hạt fibroin tơ tằm.
- Đánh giá một số tính chất hóa lý của hệ vi hạt:
+ Hiệu suất tải dịch chiết của hệ vi hạt và khả năng tải của hệ vi hạt.
+ Khả năng giải phóng polyphenol vào môi trường.
+ Đánh giá độ kết tinh của các hệ vi hạt sau khi được tải dịch chiết từ các cao chiết.
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết hoa Sài đất ba thùy cho thấy hiệu quả đáng kể Nghiên cứu cũng đánh giá các hệ vi hạt được tải dịch chiết từ hoa Sài đất ba thùy, góp phần làm rõ tiềm năng ứng dụng của chúng trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 10/2021 đến tháng 2/2022 tại Phòng thí nghiệm Hóa Sinh 2, thuộc Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tìm hiểu sơ lược về cây Sài đất ba thùy và đặc điểm của tơ tằm.
- Thu mua kén tơ và chiết fibroin từ tơ tằm: bằng phương pháp chiết nóng hỗ trợ vi sóng.
Hoa Sài đất ba thùy được thu hái và phơi khô trong bóng râm trong vòng 14 ngày, sau đó được nghiền thành bột mịn bằng máy.
Cao chiết hoa Sài đất ba thùy được điều chế qua phương pháp ngâm dầm kết hợp siêu âm Quá trình bắt đầu bằng việc ngâm 30 g bột hoa Sài đất ba thùy trong dung môi trong 3 ngày, sau đó lọc dịch chiết và tiếp tục siêu âm ở 50℃ trong 90 phút với lượng dung môi tương tự Quy trình này được lặp lại 3 lần để chiết kiệt chất từ bột hoa Cuối cùng, các dịch chiết được gom lại và cô quay áp suất thấp, thu được các cao MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% từ hoa Sài đất ba thùy.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com3
- Định lượng polyphenol tổng trong bột dược liệu bằng phương pháp đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu.
- Bào chế hệ vi hạt fibroin tơ tằm bằng phương pháp đồng ngưng tụ.
- Đánh giá một số tính chất hóa lý của hệ vi hạt:
+ Kích thước: Phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS).
+ Hiệu suất và khả năng tải dịch chiết của hệ vi hạt và khả năng tải: Phương pháp đo quang phổ UV-Vis.
+ Khả năng giải phóng polyphenol ra môi trường đệm pH: Phương pháp đo quang phổ UV-Vis.
+ Đánh giá độ kết tinh của các hệ vi hạt sau khi được tải dịch chiết từ các cao chiết: Máy quang phổ hồng ngoại FT-IR.
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết hoa Sài đất ba thùy và các hệ vi hạt chứa dịch chiết từ hoa này đã được thực hiện Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả của các thành phần chiết xuất trong việc chống oxy hóa, góp phần vào việc phát triển các ứng dụng trong y học và dinh dưỡng.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Bài viết cung cấp thông tin chi tiết về đặc điểm nhận dạng và định tính các thành phần hóa học của hoa Sài đất ba thùy, đồng thời đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của loài hoa này.
- Phát hiện thêm ứng dụng tiềm năng của hệ vi hạt fibroin, rút ra những dữ kiện về tương tác lý hóa của hoạt chất với hệ thống.
Hoa Sài đất ba thùy, theo Y học cổ truyền Việt Nam, có nhiều công dụng quan trọng trong việc điều trị bệnh Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hoa này không chỉ mang lại lợi ích sức khỏe mà còn có thể được ứng dụng vào sản xuất theo phương pháp hiện đại Việc kết hợp giữa tri thức cổ truyền và công nghệ hiện đại hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong ngành dược phẩm.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nguồn dược liệu tự nhiên có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc, giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc Tây y, vốn có nhiều tác dụng phụ trong phòng ngừa và điều trị bệnh.
Việc nâng cao giá trị tơ tằm Việt Nam không chỉ góp phần cải thiện kinh tế cho các khu vực nuôi tằm, mà còn mở ra cơ hội phát triển dược phẩm hiệu quả trong tương lai.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com4
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 10/2021 đến tháng 3/2022.
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Hóa Sinh 2 - Bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên - Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
- Tủ sấy, bếp điện, giấy lọc
- Máy cô quay chân không (BUCHI)
- Cân phân tích (Mettle Toler, Switzerland)
- Becher: 100 mL, 500 mL (Trung Quốc)
- Bình cô quay loại 500 mL (Trung Quốc)
- Ống đong: 10 mL, 50 mL, 100mL, ống nhỏ giọt (Trung Quốc)
- Máy khuấy từ có gia nhiệt (Trung Quốc)
- Máy đo quang phổ JascV-730 (Nhật Bản)
- Máy siêu âm đứng, máy siêu âm
- Máy quang phổ hồng ngoại IR
- Máy lắc ngang, máy ly tâm, máy ly tâm lạnh
Dung môi và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu
Dung môi và hóa chất Ghi chú
MeOH, EtOH 96%, EtOH 60%, NaCl, hydrocloric acid, gallic Trung Quốc acid.
DPPH (1,1-dipheny-2-picrylhyrazyl), ascobic acid 99%, Folin- Đức ciocalteu.
Nước cất, Na2CO3 99,8%, EtOH 96%, acid chlohydric, natri Việt Nam hydroxide, đệm phosphate (pH 7,4).
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thu và xử lý mẫu
Hoa Sài đất ba thùy được thu hái tại Thành phố Cần Thơ vào tháng 10/2021 Sau khi thu mẫu, những bông hoa bị sâu và hư hỏng được loại bỏ Quá trình phơi khô diễn ra dưới bóng râm cho đến khi hoa hoàn toàn khô.
Kén tằm: kén tằm giống Bombyx mori M45 được thu thập từ xã Phương Định, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com35
3.2.2 Xác định độ ẩm dược liệu Ðộ ẩm là lượng nước chứa trong 100 g dược liệu Dược liệu tươi thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60-80% nước, thân và cành chứa khoảng 40-50% nước Không có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm
0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an toàn.
Nguyên tắc chính là sử dụng sức nóng để làm bay hơi hoàn toàn lượng nước có trong dược liệu khô Bằng cách cân trọng lượng trước và sau khi sấy khô, ta có thể tính toán được phần trăm nước còn lại trong dược liệu khô.
Thí nghiệm xác định độ ẩm của dược liệu theo Dược điển Việt Nam V sử dụng phương pháp sấy Đối với dược liệu dạng lá, rễ, thân, cần phải chia nhỏ trước khi đo độ ẩm Trong khi đó, dược liệu như nụ hoa và hạt nhỏ có thể được xác định trực tiếp mà không cần chia nhỏ Độ ẩm của bột dược liệu được đo bằng máy đo độ ẩm Kern Dab.
Cao chiết được sản xuất thông qua phương pháp ngâm dầm kết hợp với siêu âm, trong đó dung môi chiết sẽ thấm qua màng tế bào của cây Các chất bên trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, tạo ra quá trình thẩm thấu giữa các chất trong tế bào và dung môi bên ngoài Quá trình này sẽ kết thúc khi nồng độ hợp chất trong dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào đạt được sự cân bằng.
Dưới tác động của siêu âm, dung môi trong các hốc nhỏ của dược liệu sẽ bị sủi bọt, giúp đẩy các hợp chất ra khỏi dược liệu và hòa tan chúng vào trong dung môi.
Phương pháp này được chọn vì tính dễ thực hiện, sử dụng thiết bị đơn giản và thao tác với lượng mẫu cây vừa phải Quy tắc chiết được áp dụng là chiết nhiều lần với một lượng dung môi nhỏ Quy trình điều chế cao Sài đất ba thùy từ các dung môi khác nhau được minh họa trong Hình 3.1.
Hoa Sài đất ba thùy khô (112 g) được xử lý bằng cách loại bỏ phần hư, sau đó phơi khô trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm Tiếp theo, nguyên liệu này được xay nhỏ thành 96 g bột mịn Đề tài áp dụng phương pháp chiết ngâm dầm kết hợp với siêu âm để điều chế cao tổng Bột hoa Sài đất ba thùy được ngâm dầm với dung môi theo tỷ lệ 1:60.
Sau mỗi 24 giờ, tiến hành đánh siêu âm ở nhiệt độ 50℃ để thu dịch chiết, lặp lại quá trình này 3 lần với tỷ lệ dược liệu và dung môi tương ứng Dịch chiết sau đó được lọc qua giấy lọc và thu gom, rồi cô quay để thu hồi dung môi, cuối cùng thu được dịch chiết cao tổng Công thức tính hiệu suất điều chế cao từ bột nguyên liệu ban đầu được trình bày trong (3.1).
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com36
Hình 3.1 Quy trình điều chế các cao hoa Sài đất ba thùy từ các dung môi MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%
Chiết xuất fibroin từ kén tằm
Hình 3.2 Quy trình chiết fibroin tơ tằm
Fibroin được chiết xuất từ kén tằm Bombyx mori M45 thông qua phương pháp chiết nóng kết hợp với vi sóng Để thu được fibroin, mười gram kén tơ tằm đã được xử lý để loại bỏ sericin bằng dung dịch Na2CO3.
Sản phẩm được xử lý ở nhiệt độ 100℃ trong 1 giờ với nồng độ 0,5%, sau đó rửa bằng nước cất và để khô tự nhiên Sau khi khô, sản phẩm được hòa tan vào hỗn hợp CaCl2, H2O, Ca(NO3)2 và EtOH theo tỷ lệ 30:45:5:20 Tiếp theo, dung dịch tơ tằm được gia nhiệt bằng lò vi sóng công suất 900 W trong 2 phút Cuối cùng, dung dịch này được thẩm phân với nước cất qua màng lọc cellulose có MWCO 10.000.
TIEU LUAN MOI tải về tại địa chỉ: skknchat@gmail.com Để chuẩn bị dung dịch fibroin tơ tằm, cần ủ ở nhiệt độ 37 độ C trong 3-5 ngày Sau đó, dung dịch này được ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút và nhiệt độ 4℃ trong 30 phút để loại bỏ tạp chất Cuối cùng, fibroin được đông khô bằng máy đông khô ở nhiệt độ -55℃ và áp suất 10 -4 Torr, sau đó được bảo quản lạnh để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp định tính thành phần hóa học
Quy trình định tính đã được cải tiến từ phương pháp phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) nhằm xác định các hợp chất có trong dịch chiết MeOH, EtOH 96% và EtOH 60% Mục tiêu là đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của hoa Sài đất ba thùy.
Mỗi 2 g bột dược được chiết tương tự với các dung môi tương tự như quy trình chiết cao đã nêu ở trên Dịch chiết được cô quay đến còn khoảng 20 mL.
3.4.2 Khảo sát sự hiện diện của các nhóm hợp chất có trong các loại cao chiết
3.4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid
Lấy khoảng 5 mL dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn Hòa cắn trong
4 mL dung dịch HCl 5% Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ Thực hiện định tính alkaloid bằng các thuốc thử Wagner.
So sánh kết quả với ống nghiệm đối chứng không có thuốc thử, nếu dung dịch đục hoặc có tủa: Có alkaloid.
3.4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid
Lấy khoảng 3 mL dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm lớn Thêm vào vài giọt dung dịch NaOH loãng Dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng Thêm vài giọt
H 2 SO 4 loãng, màu vàng sẽ biến mất hoặc không màu Chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid. a Tác dụng với dung dịch NaOH 1%/EtOH
Add 0.5 mL of 1% NaOH/EtOH solution to 3 mL of the extract solution, resulting in a color change ranging from yellow-orange to red If the compounds present are flavones, isoflavones, flavanones, chalcones, or leucoanthocyanidins, the color will appear yellow; flavonols will show a color from yellow to orange; and aurones will display red to purplish-red hues Additionally, the reaction with concentrated H2SO4 solution will further indicate the presence of these compounds.
Khi nhỏ 0,5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào 3 mL dung dịch cao chiết, nếu có sự hiện diện của flavon và flavonol, hỗn hợp sẽ xuất hiện màu vàng đậm-cam cùng với phát huỳnh quang đặc biệt Đối với chalcon và auron, màu sắc sẽ chuyển sang đỏ hoặc xanh dương-đỏ, trong khi flavanol cho màu cam đến đỏ.
3.4.2.3 Khảo sát sự hiện diện của saponin
Mỗi 3 mL được cho vào 2 ống nghiệm riêng biệt: Ống 1: 5 mL HCl 0,1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch thử. Ống 2: 5 mL NaOH 0,1N (pH) + 3 giọt dung dịch thử.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com38
Bịt miệng ống và lắc mạnh trong 1 phút, sau đó để yên và quan sát cột bọt trong hai ống nghiệm Nếu cột bọt ở cả hai ống nghiệm bằng nhau và độ bền của bọt tương đương, có khả năng có saponin triterpen Ngược lại, nếu ống nghiệm pH 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống nghiệm pH 1, có thể có saponin steroid.
3.4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của các chất khử
Khi nhỏ 0,5 mL dung dịch thuốc thử Tollens vào 3 mL dung dịch cao chiết, hiện tượng bạc bám vào thành ống nghiệm hoặc kết tủa đen sẽ xuất hiện nếu trong dung dịch có chứa đường khử.
3.4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của các acid hữu cơ
Lấy 2 mL dịch chiết cho vào một ống nghiệm Thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na 2 CO 3 Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na 2 CO 3 : Có acid hữu cơ.
Định lượng polyphenol bằng phương pháp đo quang
Phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu là cách hiệu quả để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần Thuốc thử này chứa phosphomolybdate và phosphotungstate, là các tác nhân khử màu vàng, sẽ bị oxy hóa khi tiếp xúc với phenol và polyphenol, tạo ra phức hợp màu xanh phosphotungstic-phosphomolybdenum có độ hấp thu quang phổ mạnh tại 765 nm Độ hấp thu của phức hợp này phụ thuộc vào môi trường kiềm nhẹ và nồng độ của các hợp chất phenol và polyphenol.
Na 2 CO 3 được thêm vào hỗn hợp để tạo môi trường kiềm nhẹ Hàm lượng polyphenol toàn phần trong cao chiết được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn được dựng bởi đồ thị thể hiện sự liên quan giữa giá trị OD và nồng độ chất chuẩn với chất chuẩn là gallic acid Hàm lượng polyphenol tổng được biểu thị bằng mg gallic acid đương lượng/trọng lượng bột khô (mg GAE/g DPW).
Dung dịch thuốc thử: Pha dung dịch Folin-Ciocalteu 10% được pha bằng nước cất và bảo quản trong tối.
Dung dịch Na 2 CO 3 10%: 10 g Na 2 CO 3 hòa tan hoàn toàn trong 20 mL nước cất sau đó cho vào bình, định mức đến vạch.
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gallic acid, cần cân chính xác khoảng 0,1 gam gallic acid và hòa tan trong dung môi, sau đó pha loãng thành 100 mL để tạo ra dung dịch chuẩn gốc với nồng độ 1000 µg/ml Tiếp theo, lần lượt lấy 1, 2, 3, 4 và 5 mL dung dịch chuẩn gốc gallic acid và pha loãng thành 100 mL để thu được các dung dịch với nồng độ lần lượt là 10, 20, 30, 40 và 50 µg/ml, phục vụ cho các thí nghiệm.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com39
Để tiến hành thí nghiệm, thêm 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% vào 0,5 mL dung dịch axit gallic và ủ trong 3-8 phút ở nhiệt độ 25℃ Sau đó, thêm 2 mL dung dịch Na2CO3 10% vào hỗn hợp và ủ trong bóng tối trong 1 giờ Cuối cùng, đo mật độ hấp thụ quang phổ tại bước sóng cực đại 765 nm Phương trình đường chuẩn tuyến tính sẽ được xây dựng dựa trên độ hấp thu quang phổ của dung dịch và các nồng độ của axit gallic (0, 2, 4, 6, 8).
10 àg/mL) Cỏc thớ nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.5.3.2 Xác định hàm lượng polyphenol
Một gram bột dược liệu khô được chiết xuất theo quy trình đã mô tả, thu được dịch chiết Sau khi cô quay thu hồi dung môi, dịch chiết được pha loãng thành 100 mL trong dung môi chiết Tiếp theo, thêm 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% vào 0,5 mL dịch chiết và ủ trong 3-8 phút ở 25℃ Sau đó, bổ sung 2 mL dung dịch Na2CO3 10% và ủ hỗn hợp trong 1 giờ ở nơi tối Cuối cùng, đo mật độ hấp thụ quang phổ tại bước sóng 765 nm và thực hiện song song với mẫu trắng, lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Hàm lượng polyphenol tổng theo chất khô trong mẫu phân tích được tính theo công thức (3.2):
Trong đú: C thực : nồng độ polyphenol toàn phần trong dung dịch thử (àg/ml)
V: thể tích dung dịch thử (ml) k: hệ số pha loãng m: khối lượng bột dược liệu (g)
Phương pháp bào chế hệ vi hạt fibroin
3.6.1 Bào chế hệ vi hạt fibroin trống (FMPs-Blank)
Cân bột khô fibroin với các khối lượng 0,055 g, 0,11 g và 0,165 g, sau đó hòa tan trong 5 mL nước cất để tạo ra dung dịch fibroin 1%, 2% và 3% Tiến hành ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút và lấy 2 mL dung dịch trong Nhỏ từ từ 1 mL dung môi (MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%) vào 2 mL dung dịch fibroin trong nước, lắc đều trong 1 giờ và bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong 24 giờ trước khi tiếp tục ly tâm.
1 vòng/phút trong 40 phút, loại bỏ phần nổi phía trên thu được FMPs-
Blank Phần cắn được đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4℃ cho đến khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
3.6.2 Bào chết hệ vi hạt fibroin được tải dịch chiết (FMPs-WT)
Việc điều chế hạt FMPs chứa polyphenol từ chiết xuất hoa WT được tiến hành tương tự như hạt FMPs-Blank, với sự thay thế 1 mL dung môi.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com40
Pha 1 mL dung dịch cao chiết khô bằng các dung môi chiết để định lượng hàm lượng polyphenol Sau đó, pha loãng để đạt được dung dịch cao chiết với nồng độ polyphenol lần lượt là 7 mg, 10 mg và 10 mg cho cao chiết từ MeOH, EtOH 60% và EtOH 96%.
Sau khi nhỏ từ từ vào 2 mL dịch fibroin trong nước và lắc trong 1 giờ, bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong 24 giờ Tiến hành ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 40 phút để thu được phần dịch trong, dùng để xác định hàm lượng polyphenol tự do còn lại Phần cặn được đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4℃ cho đến khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp xác định một số tính chất lý hóa của hệ vi hạt
3.7.1 Xác định hàm lượng polyphenol được tải vào hạt và khả năng tải của hệ vi hạt
Hàm lượng polyphenol trong hạt được xác định thông qua phương pháp đo quang phổ UV-Vis Để xác định hàm lượng polyphenol trong dung dịch trước và sau khi tải vào hệ vi hạt, chúng tôi sử dụng phương pháp đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu ở bước sóng 765 nm Hàm lượng polyphenol tải được (EE%) và khả năng tải của hệ vi hạt (DL%) được tính toán theo các công thức cụ thể.
Hàm lượng trước khi nạp − Hàm lượng sau khi nạp
Hàm lượng trước khi nạp
Tổng hàm lượng polyphenol ược tải vào hạt được tải vào hạt
3.7.2 Đo kích thước hệ vi hạt
Kích thước hạt trung bình và phân bố kích thước hạt (PI) được xác định thông qua phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) với sự hỗ trợ của máy phân tích chuyên dụng.
MicroTrac S3500 là thiết bị đo hạt FMPs và FMPs-WT đã được đông khô và tái phân bố trong 5 mL nước DI Phép đo được thực hiện ở nhiệt độ 25℃ với góc cố định 90°.
3.7.3 Xác định khả năng giải phóng polyphenol của hệ vi hạt
Khả năng giải phóng polyphenol trong vi hạt FMPs-WT được thực hiện bằng phương pháp lắc Mẫu hạt được phân tán trong 50 mL dung dịch đệm phosphate
(pH=7,4) với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 2,5 giờ Tại mỗi thời điểm 30, 60,
Mẫu 1 mL được rút ra sau các khoảng thời gian 90, 120, 150, 180, 210 và 240 phút, sau đó thêm một lượng đệm tương ứng Mẫu được ly tâm ở tốc độ 18.000 vòng/phút trong 5 phút Hàm lượng polyphenol trong dịch sau ly tâm được xác định bằng phương pháp đo quang với thuốc thử Folin-Ciocalteu ở bước sóng 765 nm Đường chuẩn cho hàm lượng polyphenol trong dung dịch đệm phosphate được xây dựng trong khoảng nồng độ 2-10 àg/mL, với công thức y = ax + b Cuối cùng, phần trăm tích lũy giải phóng (%T) được tính theo công thức (3.5).
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com41
Trong đó: C t , C i : nồng độ của polyphenol được giải phóng tại thời điểm t và i
V 0 : tổng thể tích dung dịch đệm giải phóng (50 mL) V: thể tích mẫu rút tại mỗi thời điểm (1 mL) M 0 : lượng polyphenol ban đầu
M i : tổng lượng polyphenol rút tại thời điểm i
3.7.4 Đánh giá tương tác của hệ vi hạt và các hợp chất trong dịch chiết Đánh giá sự tương tác giữa fibroin và dịch chiết dựa vào phổ FT-IR của các mẫu FMPs, FMPs-WT và các cao chiết được, phổ thu được bằng máy quang phổ
FT/IR 6300 (Jasco-Nhật Bản, dải tần từ 4000 đến 400 cm -1) được sử dụng với phương pháp viên KBr để phân tích Các phân tích này được thực hiện trong điều kiện không khí khô, với bộ mã hóa 256 hình ảnh giao thoa được thu thập ở độ phân giải 4.0 cm -1.
Các mũi tín hiệu amide I và amide II đóng vai trò quan trọng trong việc xác định độ kết tinh của hệ vi hạt Độ kết tinh được xác định thông qua các công thức (3.6) và (3.7).
CI IRI và CI IRII là các chỉ số tính toán từ mật độ quang học của dải amide I và II Cụ thể, D 1626 và D 1525 đại diện cho mật độ quang học của phần tinh thể fibroin tại các amide I và II, trong khi D 1655 và D 1557 tương ứng là mật độ quang học của phần vô định hình fibroin tại các amide I và II.
Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết và các hệ vi hạt
Hiệu quả quét gốc tự do DPPH của cao chiết hoa Sài đất ba thùy được thực hiện dựa theo phương pháp của Shekhar el al (2014) có hiệu chỉnh [144].
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do ổn định, tồn tại dưới dạng bột màu đen và có màu tím trong dung dịch Gốc tự do này hấp thu ánh sáng với bước sóng cực đại tại 519 nm, và độ hấp thu giảm khi nhận một điện tử hydrogen từ các chất kháng oxy hóa, làm cho dung dịch chuyển từ màu đen tím sang vàng nhạt Do đó, DPPH được sử dụng phổ biến trong các thử nghiệm đánh giá khả năng quét gốc tự do của các chất kháng oxy hóa thông qua sự thay đổi độ hấp thu tại 519 nm.
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các dung dịch cao chiết được đánh giá thông qua sự giảm độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 519 nm sau khi phản ứng với mẫu thử Chất kháng oxy hóa trong mẫu sẽ tương tác với gốc tự do DPPH, dẫn đến lượng gốc tự do còn lại được phát hiện tại bước sóng này Từ sự giảm độ hấp thu, có thể tính toán hiệu suất làm sạch gốc tự do và dựng đồ thị tuyến tính biểu thị hiệu suất này.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com42 sạch gốc tự do theo nồng độ mẫu thử, từ đó tính được giá trị IC 50 dựa vào phương trình tuyến tính.
Để pha dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM, cần cân chính xác 1,97 mg DPPH và cho vào bình định mức 50 mL Tiếp theo, thêm MeOH đến vạch định mức và lắc đều cho đến khi dung dịch tan hoàn toàn Cuối cùng, dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong điều kiện tối.
Pha dung dịch Vitamin C nồng độ 40 μg/mL [23].g/mL: cân chính xác 2 mg Vitamin
Cho 20 mL dung dịch vào bình định mức, thêm MeOH đến vạch và lắc đều cho tan hoàn toàn Hút 2 mL dung dịch đã pha vào ống ly tâm, thêm 8 mL MeOH và lắc đều để thu được 10 mL dung dịch Vitamin C với nồng độ 20 μg/mL, sẵn sàng cho thí nghiệm.
Pha dung dịch cao chiết hoa Sài đất ba thùy với nồng độ 1000 μg/mL bằng cách cân chính xác 2 mg cao chiết cho vào ống Eppendorf, thêm 2 mL dung môi và lắc đều cho tan hoàn toàn Sau đó, hút 1 mL dung dịch vừa pha và cho vào ống ly tâm, thêm 9 mL dung môi để thu được dung dịch cao chiết với nồng độ 100 μg/mL, sẵn sàng cho các thí nghiệm.
3.8.3 Khảo sát khả năng quét gốc tự do của cao chiết
Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của Vitamin C và các cao chiết được thực hiện bằng cách thiết lập đường chuẩn giữa khả năng quét gốc tự do và dãy nồng độ chuẩn Nồng độ tại đó 50% gốc tự do được làm sạch (IC 50) được tính toán Đường chuẩn oxy hóa của Vitamin C bao gồm các nồng độ: 0; 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5; 9 µg/mL Đường chuẩn kháng oxy hóa của các cao chiết cũng sử dụng dãy nồng độ tương tự: 0, 3.
Quy trình thí nghiệm bắt đầu bằng việc hòa tan dung dịch Vitamin C hoặc cao chiết thờm vào dung dịch gốc tự do DPPH nồng độ 0,1 mM, sau đó ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo độ hấp thu quang phổ tại bước sóng 519 nm, với mẫu trắng không chứa Vitamin C hoặc cao chiết Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong môi trường tránh sáng và lặp lại ba lần để lấy giá trị trung bình.
Bảng 3.1 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của các cao MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% từ hoa Sài đất ba thùy
Nồng độ cao chiết cuối cựng V 1 àL
V 2 àL V 3 àL (Cao chiết μg/mLg/mL (MeOH) (DPPH 0,1 mM)
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
Bảng 3.2 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của chất đối chứng Vitamin C
Nồng độ Vitamin C V 1 àL V 2 àL V 3 àL cuối cùng (μg/mLg/mL) (Vitamin C 20 μg/mLg/mL) (MeOH) (DPPH 0,1 mM)
3.8.4 Khảo sát khả năng quét gốc tự do của các hệ vi hạt fibroin
Việc tải dịch chiết trong cao chiết hoa Sài đất phụ thuộc vào hệ vi hạt, với thành phần hợp chất có thể không đồng đều và hoạt tính của hệ vi hạt liên quan đến khả năng giải phóng hoạt chất Nghiên cứu này sẽ khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do của các hệ vi hạt được tải dịch chiết theo thời gian, cụ thể tại các thời điểm 30, 120 và 240 phút Khối lượng hạt khảo sát sẽ được tính dựa vào hàm lượng polyphenol tại giá trị IC 50 của cao chiết Đối với hệ vi hạt, khối lượng hạt phản ứng với DPPH sẽ được tính toán lại dựa vào biểu đồ giải phóng hoạt chất và hàm lượng polyphenol tổng có trong cao chiết tại IC 50.
Trong đó: M pu : khối lượng hạt đem phản ứng (mg) m p : hàm lượng polyphenol tổng tại IC 50 (àg)
M h : khối lượng hạt thu được (mg) H: phần trăm giải phóng tại thời điểm cao nhất m h : khối lượng polyphenol cú trong hạt (àg)
Mẫu FMPs-WT sau khi đông khô được cân chính xác và tái phân bố trong môi trường đệm phosphate pH=7,4, tạo ra dung dịch có nồng độ polyphenol tương đương với nồng độ cao chiết Để thực hiện thí nghiệm, 0,5 mL dung dịch DPPH 0,1 mM trong MeOH được thêm vào 1,5 mL dịch huyền phù vi hạt và hỗn hợp này được lắc với tốc độ 200 vòng/phút.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com44 gian 30, 120, 240 phút Hỗn hợp sau phản ứng được ly tâm ở 2000 vòng/phút trong
5 phút để loại chất rắn Đo độ hấp thu quang phổ của DPPH ở bước sóng 519 nm.
Chất đối chứng được sử dụng là ascorbic acid và FMPs-Blank, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.
Xử lý kết quả
Bài viết trình bày việc vẽ đồ thị thể hiện hiệu suất quét gốc tự do theo nồng độ của Vitamin C và các loại cao chiết, từ đó thu được các phương trình hồi quy tuyến tính dạng y = ax + b Dựa vào các phương trình này, giá trị IC 50 của Vitamin C và các cao chiết được tính toán So sánh khả năng kháng oxy hóa giữa hai loại cao chiết và chất đối chứng Vitamin C được thực hiện thông qua giá trị IC 50 Ngoài ra, khả năng làm sạch gốc tự do của hệ vi hạt theo thời gian cũng được xác định theo phương trình (3.9).
Trong đó: A 0 là độ hấp thụ của DPPH không chứa cao chiết.
A 1 là độ hấp thụ khi có mặt của mẫu thử hoặc mẫu chuẩn.
TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com45
