Bài viết nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng kháng oxy hóa 48 và bảo vệ gan của cao chiết VTCS trong tổn thương 49 gan do CCl4 ở chuột thông qua đánh giá một số chỉ 50 tiêu sinh hóa và mô học. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Natural Sciences, 4(3):xxx-xxx Bài nghiên cứu Open Access Full Text Article Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bảo vệ gan cao chiết vỏ thân cò sen (Miliusa velutina) Đái Thị Xuân Trang1,* , Bùi Lê Trung Hiếu2 , Trần Chí Linh1 , Lưu Thái Danh3 , Nguyễn Trọng Tn1 TĨM TẮT Vỏ thân Cị Sen có nhiều cơng dụng chữa bệnh khác nhau, tác dụng bảo vệ gan chưa nghiên cứu Nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bảo vệ gan cao chiết vỏ thân Cò Sen chống lại tổn thương gan carbon tetrachloride (CCl4 ) gây Cao chiết vỏ thân Cò Sen đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro tốt tiềm khử sắt (EC50, FRAP =4,04±0,00 µ g/mL), kháng oxy hóa tổng (EC50, TAC =8,73±1,08 µ g/mL) trung hòa gốc tự DPPH (EC50, DPPH =9,33±0,07 µ g/mL) Khả bảo vệ gan in vivo chuột thực cách cho chuột uống CCl4 (2,5 mL/kg khối lượng ngày) tuần liên tiếp Sau dùng CCl4 đường uống, chuột điều trị cao chiết vỏ thân Cò Sen liều 100, 200 400 mg/kg trọng lượng chuột Cao chiết vỏ thân Cò Sen liều 400 mg/kg có hiệu làm giảm hàm lượng alanine transaminase (38,00±6,78 U/L) aspartate transaminase (84,60±17,01 U/L) huyết Đồng thời, cao chiết vỏ thân Cò Sen liều 400 mg/kg làm giảm hàm lượng malondialdehyd (3,12±1,19 nM MDA/g mô) tăng hoạt động glutathione (896,21±22,69 nM GSH/g mô) gan Quan sát tiêu lát cắt ngang mô gan cho thấy chuột điều trị cao chiết vỏ thân Cò Sen với liều 200 400 mg/kg cải thiện đáng kể cấu trúc mơ gan so với nhóm đối chứng khơng điều trị Các phân tích mơ học nhóm điều trị cao chiết vỏ thân Cị Sen cho thấy giảm q trình viêm, ngăn ngừa hoại tử gan xơ hóa Tóm lại, tác dụng bảo vệ gan cao chiết vỏ thân Cị Sen có liên quan đến hoạt động kháng oxy hóa Từ khố: ALT, AST, bảo vệ gan, carbon tetrachloride, Cị Sen, kháng oxy hóa io n pr oo f Use your smartphone to scan this QR code and download this article Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ Đái Thị Xuân Trang, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ • Ngày nhận: 11-2-2020 • Ngày chấp nhận: 26-4-2020 • Ngày đăng: xx-8-2020 DOI : 10 11 12 13 14 15 16 Bản quyền Gan quan thực chức tổng hợp protein, tiết enzyme giải độc Tuy nhiên, chức gan thường bị suy yếu hóa chất độc hại, thuốc nhiễm trùng mầm bệnh Phơi nhiễm mãn tính mức với loại hóa chất tổng hợp dẫn đến xơ gan tổn thương ác tính khơng thể điều trị Trong đó, carbon tetrachloride (CCl4 ) dung mơi hóa học sử dụng rộng rãi cơng nghiệp gây tổn thương cho gan thơng qua hoạt động peroxide hóa lipid, kích hoạt cytokine gây viêm TNF-α IL-6 tăng cường độc tính gan thơng qua chu kỳ viêm lặp lặp lại 2,3 Bên cạnh đó, chế sinh bệnh gan có liên quan đến stress oxy hóa Để bảo vệ gan hạn chế ảnh hưởng xấu đến gan, có nhiều nghiên cứu hợp chất tự nhiên có khả phòng ngừa điều trị bệnh gan, đặc biệt hợp chất có nguồn gốc từ thực vật Các hợp chất flavonoid polyphenol nhiều loài thực vật chứng minh có khả kháng oxy hóa Các dịch chiết từ thực vật xem có hiệu an tồn để phòng ngừa điều trị rối loạn chức gan Việc nghiên cứu tìm U Lịch sử MỞ ĐẦU nc Liên hệ Email: dtxtrang@ctu.edu.vn re Chi cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Sở Khoa học Công nghệ tỉnh An Giang or 17 18 © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản 19 20 the Creative Commons Attribution 4.0 International license 21 22 23 ct sản phẩm kháng oxy hóa bảo vệ gan có nguồn gốc từ thực vật mối quan tâm hàng đầu Chi Miliusa thuộc họ Na (Annonaceae) bao gồm khoảng 50 lồi tìm thấy khu rừng mưa nhiệt đới Các thành phần hóa học chi Miliusa cho thấy diện alkaloid, flavonoid , acetogenin , dẫn xuất homogentisic geranylated acid 10 , terpenoid 11 , bicyclic lactone dimeric styrylpyrone 12 Một số hợp chất chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn, kháng sốt rét, kháng virus, gây độc tế bào ức chế enzyme acetylcholinesterase 8,9,12,13 Trong lồi thuộc chi Miliusa Cị Sen (Miliusa velutina) loại thân gỗ, lâu năm thường sử dụng y học dân gian để điều trị ghẻ lở, bệnh da, hắc lào, mụn nhọt, đau dày có hiệu việc điều trị bệnh liên quan đến viêm 14 Dựa cơng bố thành phần hóa học chi Miliusa tác dụng dược lý dân gian, việc nghiên cứu hoạt tính sinh học vỏ thân Cò Sen (VTCS) cung cấp sở khoa học đáng tin cậy cho hoạt tính lồi Nghiên cứu Trích dẫn báo này: Trang D T X, Hiếu B L T, Linh T C, Danh L T, Tuân N T Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bảo vệ gan cao chiết vỏ thân cò sen (Miliusa velutina) Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 4(3):xxx-xxx 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Natural Sciences, 4(3):xxx-xxx 50 thực để đánh giá khả kháng oxy hóa bảo vệ gan cao chiết VTCS tổn thương gan CCl4 chuột thông qua đánh giá số tiêu sinh hóa mơ học 51 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 47 48 49 52 Vật liệu Phương pháp FRAP antioxidant power) (Ferric reducing- Tiềm kháng oxy hoá cao chiết xác định cách sử dụng khả khử FRAP Benzie & Strain 17 có hiệu chỉnh Nguyên tắc phương pháp dựa việc giảm phức hợp ferrictripyridyltriazine Cao chiết nồng độ khác nhau: 1, 2, 4, 10 µ g/mL (10 µ L) cho phản ứng với dung dịch FRAP (990 µ L) 30 phút điều kiện tối Độ hấp thu quang phổ phản ứng xác định bước sóng 593 nm 73 Hóa chất: silymarin (Sigma), trolox (Sigma-Aldrich), ethanol (Trung Quốc), acetic acid (Merck), glutathione (Đài Loan), 5,5’-dithio-bis-nitrobenzoic (Merck), trichloroacetic acid (Merck), hematoxylin (Merck), Eosin Y (BDH, Anh), CCl4 (Merck), DPPH (Merch), DMSO (Merck) số hóa chất khác Vật liệu: VTCS thu núi Cấm, tỉnh An Giang vào tháng 06 năm 2018 Mẫu định danh dựa vào đặc điểm hình thái thực vật sách Cây Cỏ Việt Nam hỗ trợ thạc sĩ Phùng Thị Hằng (Bộ môn Sư phạm Sinh học, Khoa Sư phạm, Đại học Cần Thơ) Mẫu lưu giữ Phịng thí nghiệm Thực vật 2, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ Đối tượng thí nghiệm chuột nhắt trắng (Mus musculus var Albino) giống đực khỏe mạnh, trọng lượng từ 30-35 gram Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp, ni phịng thí nghiệm Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại Học Cần Thơ nhiệt độ phòng chu kỳ sáng tối 12/12 74 Điều chế cao chiết Khảo sát hoạt tính bảo vệ gan 83 VTCS (14200 g) sau thu rửa sấy khô nhiệt độ từ 40–45o C Mẫu sau khô xay nhuyễn thành mẫu bột Bột nguyên liệu (4000 g) cho vào túi vải ngâm dầm ethanol (10 L) Mẫu ngâm lần, lần ngâm khoảng 24 giờ, dịch chiết từ lần ngâm gom lại, cô đuổi dung môi 15 thu 155,2 g cao ethanol VTCS, cao chiết có ẩm độ 4,68±0,05% xác định dựa vào cân phân tích độ ẩm hồng ngoại FD-610 (Kett, Janpen) 84 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa Thí nghiệm khảo sát hoạt tính bảo vệ gan cao chiết thực theo Kang & Koppula 19 Phan Kim Định et al 20 có hiệu chỉnh Chuột gây tổn thương gan CCl4 liều 2,5 mL/kg trọng lượng chuột (CCl4 pha dầu olive theo tỉ lệ 1:4) Chuột khỏe mạnh chia ngẫu nhiên thành nghiệm thức, nghiệm thức gồm chuột Các nghiệm thức chuột thí nghiệm bố trí sau: chuột bình thường uống nước cất; chuột uống dầu Olive DMSO 1%; đối chứng bệnh lý (chuột uống CCl4 ); đối chứng dương (chuột tổn thương gan điều trị silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng); chuột tổn thương gan điều trị cao chiết VTCS liều 100 mg/kg, 200 mg/kg 400 mg/kg trọng lượng Thời gian thí nghiệm kéo dài tuần, kết thúc thí nghiệm chuột cân trọng lượng, gây mê giải phẫu lấy máu tim để xét nghiệm sinh hóa (alanine transaminase, aspartate transaminase) gan tách lấy rửa qua dung dịch sinh lý chia làm hai phần, phần để phân tích sinh hóa (malondialdehyd, glutathione) phần cịn lại thực tiêu mô học 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 75 76 nc 77 78 79 U 80 81 82 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 Hoạt tính kháng oxy hoá cao chiết đánh giá phương pháp phosphomolybdenum theo mô tả Prieto et al 18 Cao chiết nồng độ khác nhau: 1, 2, 4, 10 µ g/mL (300 µ L) kết hợp với 900 µ L dung dịch thử (0,6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate mM ammonium molybdate) Dung dịch phản ứng ủ 95◦ C 90 phút Sau đó, độ hấp thu quang phổ dung dịch đo bước sóng 695 nm sau làm mát nhiệt độ phịng f 60 Phương pháp kháng oxy hóa tổng (total antioxidant capacity) oo 59 pr 58 n 57 io 56 ct 55 re 54 or 53 Phương pháp trung hòa gốc tự DPPH (1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl) Khả kháng oxy hóa cao chiết xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự DPPH Sharma & Bhat 16 có hiệu chỉnh Hỗn hợp phản ứng gồm 40 µ L DPPH (1000 µ g/mL) 960 µ L cao chiết nồng độ khác nhau: 1, 2, 4, 10 µ g/mL Hỗn hợp phản ứng ủ tối 30o C thời gian 30 phút Sau đó, đo độ hấp thụ quang phổ DPPH máy đo quang phổ bước sóng 517 nm Trolox sử dụng chất kháng oxy hóa chuẩn cho thí nghiệm kháng oxy hóa in vitro trung hòa gốc tự DPPH, FRAP kháng oxy hóa tổng số (TAC) 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Natural Sciences, 4(3):xxx-xxx Đánh giá sinh hóa 175 Thực tiêu mơ bệnh học 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 Tách lấy thùy nhỏ gan chuột thí nghiệm ngâm dung dịch formol 4% 24 giờ, xử lý tiến hành tẩm paraffin-xylene, đúc khuôn theo qui trình thực tiêu mơ học Saalu et al 23 nc 173 176 177 U 178 179 180 Thống kê phân tích số liệu 188 Số liệu trình bày giá trị trung bình±sai số chuẩn giá trị trung bình (SEM) Kết xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA phần mềm Minitab 16.0 Excel Hoạt tính kháng oxy hóa so sánh với chất chuẩn trolox dựa giá trị EC50 , nồng độ chất chuẩn hay cao chiết khử trung hòa 50% gốc tự (EC50 -Effective Concentration of 50%) 189 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 190 Hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết VTCS 181 182 183 184 185 186 187 191 192 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 pr 150 196 n 149 195 io 148 ct 147 194 Hình 1: Hoạt tính kháng oxy hóa cao chiết VTCS re 146 or 145 193 oo 174 Khả bảo vệ gan đánh giá việc xác định hoạt độ enzyme alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) huyết hàm lượng malondialdehyd (MDA), glutathione (GSH) gan Huyết chuột thí nghiệm đo hoạt độ enzyme ALT AST máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động Erba CHEM-7 Đồng thời, gan chuột xử lý tiến hành định lượng MDA GSH theo phương pháp Ohkawa et al 21 Moron et al 22 hiệu chỉnh Gan chuột tách khỏi thể nghiền đồng thể dung dịch đệm KCl 1,15% nhiệt độ 4o C Dịch đồng thể gan gồm mL trộn với 0,5 mL dung dịch đệm phosphate 25 mM (pH = 7,4) ủ 37o C 60 phút Phản ứng sau kết thúc 0,5 mL tricloacetic acid 10% ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút 4◦ C Phần dịch lỏng sau ly tâm sử dụng để xác định hàm lượng MDA GSH Hàm lượng MDA xác định sau: Lấy mL dịch ly tâm cho phản ứng với 0,5 mL thiobarbituric 0,8% 100o C 30 phút đo mật độ quang bước sóng 532 nm Hàm lượng MDA (nM MDA/g mơ) tính dựa theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA Hàm lượng GSH xác định sau: mL dịch ly tâm phản ứng với 0,2 mL thuốc thử Ellman 1,8 mL dung dịch đệm EDTA phosphate Hỗn hợp phản ứng để yên phút nhiệt độ phòng sau tiến hành đo mật độ quang bước sóng 412 nm Hàm lượng GSH (nM GSH/g mơ) tính dựa theo phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn GSH 144 trình bày Hình Hoạt tính kháng oxy hóa tổng xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0392x + 0,3447 (R2 =0,9963) Theo đó, cao chiết VTCS (EC50 =3,96±0,04 µ g/mL) có khả khử Mo (VI) thành Mo (V) mạnh trolox (EC50 =35,02±0,40 µ g/mL) 8,84 lần Dựa vào phương trình tuyến tính y = 0,0875x + 0,2701 (R2 = 0,9995) kết trình bày Hình cho thấy, tiềm khử (FRAP) cao chiết VTCS trolox 2,57 lần Nguyên nhân diện chất kháng oxy hoá cao chiết làm giảm dạng oxy hoá sắt (Fe3+ ) thành dạng khử (Fe2+ ) cách cho điện tử 24 Không thế, cao chiết VTCS cịn có khả trung hịa gốc tự DPPH với phương trình hồi quy tuyến tính y = 5,0791x + 2,6406 (R2 =0,999) giá trị EC50 9,33±0,07 µ g/mL, chất chuẩn trolox 14,35 lần f 143 Hiệu kháng oxy hóa cao chiết VTCS theo phương pháp TAC, FRAP DPPH thực Ảnh hưởng cao chiết VTCS đến trọng lượng chuột Sự gia tăng trọng lượng thể chuột tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể chuột sau tuần thí nghiệm nghiệm thức thể cụ thể Hình Khi so sánh nghiệm thức đối chứng với nhau, chuột nghiệm thức uống nước cất Olive+DMSO 1%, đạt 6,7±0,67 gram 5,7±0,49 gram, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Từ chứng tỏ, olive DMSO 1% không ảnh hưởng đến chuột Trong đó, chuột nghiệm thức uống CCl4 có khối lượng thể bị giảm so với khối lượng ban đầu Ở nghiệm thức này, sau cho uống CCl4 , chuột bị lừ đừ, hoạt động, chán ăn, số lông gần phần đuôi bị ướt, đơi bị tiêu chảy q trình thí nghiệm nên trọng lượng chuột khơng tăng nghiệm thức khác Theo nghiên cứu Phan Kim Định et al 25 , gia tăng trọng lượng nhóm chuột uống CCl4 nhóm chuột bình thường Trong đó, chuột bị tổn thương gan CCl4 điều trị cao chiết VTCS có gia tăng trọng 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Natural Sciences, 4(3):xxx-xxx 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 oo nc 247 248 U 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 dẫn đến xơ gan hoại tử Riêng nhóm chuột cho uống CCl4 điều trị silymarin liều 16 mg/kg trọng lượng chuột (Hình 3D), gan chuột có nhiều cải thiện mặt hình thái Bề mặt gan chuột điều trị silymarin láng mịn hơn, chưa phục hồi hồn tồn gan chuột bình thường Tuy nhiên, gan chuột điều trị silymarin có cải thiện rõ rệt so với nhóm gây bệnh CCl4 Cao chiết VTCS sử dụng cho thấy hoạt động bảo vệ gan hiệu Cụ thể sau, màu sắc gan nồng độ 100 mg/kg (Hình 3E) nhạt màu nhóm bình thường, bề mặt gan giảm ghồ ghề Ở nồng độ 200 (Hình 3F) 400 mg/kg (Hình 3G), màu sắc gan kể độ láng đặc điểm hình thái giống với nhóm chuột bình thường pr 236 n 235 io 234 ct 233 lượng thể tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết Chuột cho uống cao VTCS có trọng lượng gia tăng khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chuột uống nước cất, silymarin 1,1 1,97 lần Trái ngược với gia tăng trọng lượng thể, chuột uống CCl4 có tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể 9,28±0,23% cao nghiệm thức khảo sát Điều CCl4 loại chất độc gây trương phồng tế bào, làm cho tế bào gan phình to lên 26 , trọng lượng gan tăng lên nhanh trọng lượng thể Cao chiết VTCS sử dụng liều 100, 200 400 mg/kg làm cho tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể giảm dần theo nồng độ cao chiết Xét mặt thống kê, tỷ lệ tương đối trọng lượng gan/cơ thể nhóm chuột bình thường tương đương với nhóm chuột sử dụng cao chiết silymarin Từ đó, cho thấy hiệu bảo vệ gan cao chiết VTCS việc trì trọng lượng gan tương đương với nhóm bình thường re 232 or 231 f Hình 2: Ảnh hưởng cao chiết vỏ thân Cị Sen đến trọng lượng chuột.Ghi chú: BT-chuột bình thường uống nước cất; DMSO-chuột bình thường uống dầu olive DMSO 1%; CCl4 -chuột bình thường uống CCl4 DMSO 1%; Si16-chuột bình thường uống CCl4 silymarin 16 mg/kg; CS100-chuột bình thường uống CCl4 cao chiết VTCS liều 100 mg/kg; CS200-chuột bình thường uống CCl4 cao chiết VTCS liều 200 mg/kg; CS400-chuột bình thường uống CCl4 cao chiết VTCS liều 400 mg/kg Ảnh hưởng cao chiết VTCS đến hình thái gan chuột Khả tổn thương gan CCl4 bảo vệ gan cao chiết VTCS đánh giá cảm quan qua việc quan sát hình thái gan chuột Hình Kết cho thấy, chuột uống nước cất (Hình 3A) chuột uống DMSO 1% (Hình 3B) gan có bề mặt trơn láng, mềm, mịn có màu đỏ sậm Trong đó, nhóm chuột uống CCl4 (Hình 3C) gan có kích thước lớn tế bào gan phình to, bề mặt gan gồ ghề, xơ cứng Các vùng gan có màu sắc khơng đồng nhất, phần lớn bị tái nhạt bề mặt xuất đốm đen bất thường Ngoài ra, bề mặt gan số vị trí cịn xuất dấu hiệu hoại tử Từ dó cho thấy, chuột cho uống CCl4 gây tổn thương gan Ảnh hưởng cao chiết VTCS đến hàm lượng enzyme ALT AST Tổn thương gan nói chung kèm với gia tăng hàm lượng enzyme ALT AST 27 Như thể Bảng 1, hàm lượng enzyme ALT AST chuột cho uống CCl4 có gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng bình thường 10,62 35,16 lần (p