CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
- Tủ sấy, bếp điện, giấy lọc
- Máy cô quay chân khơng (BUCHI)
- Cân phân tích (Mettle Toler, Switzerland)
- Becher: 100 mL, 500 mL (Trung Quốc)
- Bình cơ quay loại 500 mL (Trung Quốc)
- Ống đong: 10 mL, 50 mL, 100mL, ống nhỏ giọt (Trung Quốc)
- Máy khuấy từ có gia nhiệt (Trung Quốc)
- Máy đo quang phổ JascV-730 (Nhật Bản)
- Máy siêu âm đứng, máy siêu âm
- Máy đo độ ẩm
- Máy quang phổ hồng ngoại IR
- Máy lắc ngang, máy ly tâm, máy ly tâm lạnh
- Máy đo pH
- Máy đơng khơ
3.1.3 Hố chất
Dung mơi và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu
Dung mơi và hóa chất
MeOH, EtOH 96%, EtOH 60%, NaCl, hydrocloric acid, gallic acid.
DPPH (1,1-dipheny-2-picrylhyrazyl), ascobic acid 99%, Folin- ciocalteu.
Nước cất, Na2CO3 99,8%, EtOH 96%, acid chlohydric, natri hydroxide, đệm phosphate (pH 7,4).
3.2 Phương pháp nghiên cứu3.2.1 Thu và xử lý mẫu 3.2.1 Thu và xử lý mẫu
Hoa Sài đất ba thùy: được thu hái ở Thành phố Cần Thơ vào tháng 10/2021. Sau khi thu mẫu, loại bỏ những hoa bị sâu, hư hỏng. Tiến hành phơi khơ dưới bóng râm đến khi khơ.
Kén tằm: kén tằm giống Bombyx mori M45 được thu thập từ xã Phương Định, huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định.
35
3.2.2 Xác định độ ẩm dược liệu
Ðộ ẩm là lượng nước chứa trong 100 g dược liệu. Dược liệu tươi thường chứa một lượng nước rất lớn: lá chứa khoảng 60-80% nước, thân và cành chứa khoảng 40-50% nước. Khơng có một dược liệu nào đạt độ khô tuyệt đối (độ ẩm 0%), nhưng đối với mỗi dược liệu đều được quy định một độ ẩm an tồn.
Ngun tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi hết lượng nước trong dược liệu khô. Cân trọng lượng trước và sau khi sấy khơ, từ đó tính ra được phần trăm nước có trong dược liệu khơ [157].
Thí nghiệm được tiến hành theo Dược điển Việt Nam V: Sử dụng phương pháp sấy để xác định độ ẩm của dược liệu: dược liệu là lá, rễ, thân cần được chia nhỏ trước khi xác định độ ẩm. Dược liệu là nụ hoa, hạt nhỏ có thể tiến hành xác định trực tiếp mà không cần chia nhỏ.
Độ ẩm của bột dược liệu được xác định bằng máy đo độ ẩm (Kern Dab).
3.2.3 Điều chế cao chiết
Cao chiết được điều chế bằng phương pháp ngâm dầm kết hợp siêu âm. Khi cho dung môi chiết vào, dung môi sẽ thấm qua màng tế bào của cây, các chất trong tế bào sẽ hịa tan vào trong dung mơi. Khi đó sẽ xuất hiện một q trình thẩm thấu giữa chất trong thành tế bào và dung mơi bên ngồi. Q trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng nồng độ hợp chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào. Dưới tác dụng của siêu âm, dung môi ở các hốc nhỏ của dược liệu bị sủi bọt, đẩy các hợp chất ra khỏi dược liệu, chất tan vào trong dung môi.
Do phương pháp này dễ thực hiện, sử dụng thiết bị đơn giản, dễ dàng thao tác với một lượng vừa phải mẫu cây nên được sử dụng trong nghiên cứu này. Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần với một ít lượng dung mơi [33]. Quy trình điều chế các cao Sài đất ba thùy từ các dung mơi khác nhau được thể hiện trong Hình 3.1.
Cách tiến hành:
Hoa Sài đất ba thùy khô (112 g) loại bỏ phần hư, phơi khô trong điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm. Sau đó xay nhỏ được 96 g bột mịn. Đề tài đã sử dụng cách chiết ngâm dầm kết hợp siêu âm để điều chế cao tổng. Bột nguyên liệu hoa Sài đất ba thùy được ngâm dầm với các dung môi với tỷ lệ khối lượng bột dược liệu:dung môi là 1:60 (w/v). Sau mỗi 24 giờ đem đánh siêu âm ở 50℃ và thu dịch chiết, lặp lại 3 lần với tỷ lệ dược liệu:dung môi tương ứng, dịch chiết được lọc qua giấy lọc, thu gom dịch chiết 3 lần đem cô quay thu hồi dung môi. Sau khi cô quay ta được dịch chiết cao tổng. Cơng thức tính hiệu suất điều chế cao (3.1) từ bột nguyên liệu ban đầu:
(%) =
36
Hình 3.1 Quy trình điều chế các cao hoa Sài đất ba thùy từ các dung môi MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%
3.3 Chiết xuất fibroin từ kén tằm
Hình 3.2 Quy trình chiết fibroin tơ tằm
Fibroin được chiết xuất từ kén tằm Bombyx mori M45 bằng phương pháp chiết nóng có hỗ trợ vi sóng [95]. Mười gram (10 g) kén tơ tằm được loại bỏ sericin bằng dung dịch Na2CO3 0,5% ở 100℃ trong 1 giờ. Sau đó, sản phẩm được rửa với nước cất và làm khô tự nhiên. Sản phẩm sau khi làm khơ được hịa tan vào hỗn hợp CaCl2:H2O:Ca(NO3)2:EtOH ở tỷ lệ khối lượng 30:45:5:20. Tiếp theo, dung dịch tơ tằm được gia nhiệt bằng lị vi sóng (900 W) trong 2 phút. Dung dịch sau gia nhiệt được thẩm phân với nước cất bằng màng lọc cellulose (10 000 MWCO) tại nhiệt
37
độ phòng trong 3-5 ngày. Dung dịch sau thẩm phân được ly tâm tại 10 000 vòng/phút, 4℃ trong 30 phút để loại tạp. Cuối cùng, dung dịch fibroin tơ
tằm được đông khô bằng máy đông khô tại nhiệt độ -55℃ và áp suất 10-4 Torr. Fibroin đông khô được bảo quản lạnh để sử dụng cho các thí nghiệm
sau.
3.4 Phương pháp định tính thành phần hóa học3.4.1 Chuẩn bị dịch chiết 3.4.1 Chuẩn bị dịch chiết
Tiến hành định tính theo quy trình phân tích thành phần hóa thực vật đã được cải tiến và sửa đổi từ quy trình phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) nhằm xác định các hợp chất có trong các dịch chiết MeOH, EtOH 96% và EtOH 60% để đánh giá sơ bộ thành phần hóa học hoa Sài đất ba thùy [156].
Mỗi 2 g bột dược được chiết tương tự với các dung mơi tương tự như quy trình chiết cao đã nêu ở trên. Dịch chiết được cơ quay đến cịn khoảng 20 mL.
3.4.2 Khảo sát sự hiện diện của các nhóm hợp chất có trong các loại cao chiết3.4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid 3.4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của alkaloid
Lấy khoảng 5 mL dịch chiết cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong
4 mL dung dịch HCl 5%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Thực hiện định tính alkaloid bằng các thuốc thử Wagner.
So sánh kết quả với ống nghiệm đối chứng khơng có thuốc thử, nếu dung dịch đục hoặc có tủa: Có alkaloid.
3.4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid
Lấy khoảng 3 mL dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm lớn. Thêm vào vài giọt dung dịch NaOH loãng. Dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng. Thêm vài giọt H2SO4 lỗng, màu vàng sẽ biến mất hoặc khơng màu. Chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoid.
a. Tác dụng với dung dịch NaOH 1%/EtOH
Nhỏ 0,5 mL dung dịch NaOH 1%/EtOH vào 3 mL dung dịch cao chiết. Sẽ có màu từ vàng-cam-đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, flavanon, chalcon, leucoanto- cyanydin sẽ có màu vàng; flavonol cho màu từ vàng đến cam; auron cho màu đỏ đến đỏ tím.
b. Tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc
Nhỏ 0,5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc vào 3 mL dung dịch cao chiết. Nếu có flavon và flavonol sẽ cho màu vàng đậm-cam và có phát huỳnh quang đặc biệt; chalcol và auron cho màu đỏ hoặc xanh dương-đỏ; flavanol cho màu cam đến đỏ.
3.4.2.3 Khảo sát sự hiện diện của saponin
Mỗi 3 mL được cho vào 2 ống nghiệm riêng biệt: Ống 1: 5 mL HCl 0,1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch thử. Ống 2: 5 mL NaOH 0,1N (pH=13) + 3 giọt dung dịch thử.
38
Bịt miệng ống lắc mạnh trong 1 phút, để yên, quan sát các cột bọt bong bóng trong cả 2 ống nghiệm. Nếu cột bọt cả 2 ống nghiệm bằng nhau và bọt có độ bền như nhau, có thể có saponin triterpen. Nếu ống pH 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH 1 có thể có saponin steroid.
3.4.2.4 Khảo sát sự hiện diện của các chất khử
Nhỏ 0,5 mL dung dịch thuốc thử Tollens vào 3 mL dung dịch cao chiết. Sẽ có hiện tượng bạc bám vào thành ống nghiệm hoặc kết tủa đen nếu có đường khử.
3.4.2.5 Khảo sát sự hiện diện của các acid hữu cơ
Lấy 2 mL dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: Có acid hữu cơ.
3.5 Định lượng polyphenol bằng phương pháp đo quang3.5.1 Nguyên tắc 3.5.1 Nguyên tắc
Phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu được sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol toàn phần. Thuốc thử Folin-Ciocalteu là một hỗn hợp với thành phần chính gồm phosphomolybdate và phosphotungstate là các tác nhân khử có màu vàng, sẽ được oxy hóa khi có mặt phenol và polyphenol để hình thành phức hợp màu xanh phosphotungstic-phosphomolybdenum có độ hấp thu quang phổ mạnh ở 765 nm [77]. Độ hấp thu của phức hợp này phụ thuộc vào môi trường kiềm nhẹ và nồng độ của các hợp chất phenol và polyphenol, vì thế Na2CO3 được thêm vào hỗn hợp để tạo môi trường kiềm nhẹ. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong cao chiết được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn được dựng bởi đồ thị thể hiện sự liên quan giữa giá trị OD và nồng độ chất chuẩn với chất chuẩn là gallic acid. Hàm lượng polyphenol tổng được biểu thị bằng mg gallic acid đương lượng/trọng lượng bột khô (mg GAE/g DPW).
3.5.2 Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch thuốc thử: Pha dung dịch Folin-Ciocalteu 10% được pha bằng nước cất và bảo quản trong tối.
Dung dịch Na2CO3 10%: 10 g Na2CO3 hịa tan hồn tồn trong 20 mL nước cất sau đó cho vào bình, định mức đến vạch.
Dung dịch chuẩn gallic acid: Cân chính xác khoảng 0,1 gam chất chuẩn gallic acid, hòa tan trong các dung mơi và pha lỗng thành 100 mL thu được dung dịch chuẩn gốc gallic acid nồng độ 1000 µg/ml. Sau đó lần lượt hút 1, 2, 3, 4 và 5 ml dung dịch chuẩn gốc gallic acid và pha loãng thành 100 mL để thu được các dung dịch gallic acid có nồng độ 10, 20, 30, 40 và 50 µg/ml, dùng cho các thí nghiệm.
39
3.5.3 Tiến hành thí nghiệm3.5.3.1 Xây dựng đường chuẩn 3.5.3.1 Xây dựng đường chuẩn
Thêm 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% vào 0,5 mL dung dịch gallic acid. Ủ 3-8 phút ở 25℃, sau đó
thêm vào hỗn hợp 2 mL dung dịch Na2CO3 10%. Ủ hỗn hợp 1 giờ trong bóng tối, sau đó đo mật độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng cực đại 765 nm. Phương trình đường chuẩn tuyến tính được
xây dựng dựa vào độ hấp thu quang phổ của dung dịch và dãy nồng độ của gallic acid (0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL). Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.5.3.2 Xác định hàm lượng polyphenol
Một gram bột dược liệu khô được tiến hành chiết xuất như quy trình đã trình bày, thu lấy dịch chiết. Cô quay thu hồi dung môi, pha dịch chiết thành 100 mL trong dung mơi chiết. Sau đó, 2,5 mL Folin-Ciocalteu 10% được thêm vào 0,5 mL dịch chiết. Ủ 3-8 phút
ở 25℃, sau đó thêm vào hỗn hợp 2 mL dung dịch Na2CO3 10%. Ủ hỗn hợp 1 giờ trong
bóng tối, sau đó đo mật độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng cực đại 765 nm. Tiến hành song song với mẫu trắng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Hàm lượng polyphenol tổng theo chất khô trong mẫu phân tích được
tính theo cơng thức (3.2): Hàm lượng polyphenol tổng =
Trong đó: Cthực: nồng độ polyphenol tồn phần trong dung dịch thử (µg/ml)
V: thể tích dung dịch thử (ml) k: hệ số pha loãng
m: khối lượng bột dược liệu (g)
3.6 Phương pháp bào chế hệ vi hạt fibroin
3.6.1 Bào chế hệ vi hạt fibroin trống (FMPs-Blank)
Cân bột khô fibroin lần lượt các khối lượng 0,055 g / 0,11 g / 0,165 g hòa tan trong 5 mL nước cất, vortex 2 phút, được các dung dịch fibroin 1%, 2% và 3%. Sau đó ly tâm 4000 vịng/phút trong 5 phút, hút lấy 2 mL dung dịch trong. Nhỏ từ từ 1 mL dung môi (MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%) vào 2 mL dịch fibroin trong nước, lắc trong 1 giờ. Bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong thời gian 24 giờ. Sau đó, ly tâm 6
1 vịng/phút trong 40 phút, loại bỏ phần nổi phía trên thu được FMPs- Blank. Phần cắn được đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4℃ cho đến khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
3.6.2 Bào chết hệ vi hạt fibroin được tải dịch chiết (FMPs-WT)
Việc điều chế hạt FMPs có chứa polyphenol từ chiết xuất hoa WT được thực hiện tương tự như hạt FMPs-Blank. Tuy nhiên, sẽ thay thế 1 mL dung môi bằng
1 mL dung dịch cao chiết. Pha cao chiết khô bằng các dung môi chiết, định lượng lại hàm lượng polyphenol và pha loãng lại để được dung dịch cao chiết có nồng độ polyphenol lần lượt là 7/10/10 mg đối với cao chiết MeOH, EtOH 60%, EtOH 96%.
Sau đó nhỏ từ từ vào 2 mL dịch fibroin trong nước, lắc trong 1 giờ. Bảo
quản ở nhiệt độ 4℃ trong thời gian 24 giờ. Sau đó, ly tâm 6 000
vịng/phút trong 40 phút, phần dịch trong được sử dụng để xác định lại hàm lượng polyphenol tự do còn lại. Phần cắn được đông khô và bảo
quản ở nhiệt độ 4℃ cho đến khi thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
3.7 Phương pháp xác định một số tính chất lý hóa của hệ vi hạt
3.7.1 Xác định hàm lượng polyphenol được tải vào hạt và khả năng tải củahệ vi hạt hệ vi hạt
Hàm lượng polyphenol được tải vào hạt được xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis. Xác định hàm lượng polyphenol
trong dung dịch trước và sau khi được tải vào hệ vi hạt bằng phương pháp
đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu, ở bước sóng
cực đại 765 nm. Hàm lượng polyphenol tải được (EE%) và khả năng tải của hệ vi hạt (DL%) được tính theo cơng thức (3.3) và (3.4) [10]:
EE% =
Hàm lượng trước khi nạp − Hàm lượng sau khi nạp
Hàm lượng trước khi nạp
DL% =
Tổng hàm lượng polyphenol được tải vào hạt
Khối lượng hạt
3.7.2 Đo kích thước hệ vi hạt
Kích thước hạt trung bình và sự phân bố kích thước hạt (PI) được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) sử dụng máy phân tích MicroTrac S3500. Mẫu hạt FMPs và FMPs-WT đơng khơ trước đó được tái phân bố lại trong 5 mL nước DI và phép đo được thực hiện ở 25℃ ở một góc cố định là 90° [143].
3.7.3 Xác định khả năng giải phóng polyphenol của hệ vi hạt
Khả năng giải phóng polyphenol trong vi hạt FMPs-WT được thực hiện bằng phương pháp lắc. Mẫu hạt được phân tán trong 50 mL dung dịch đệm phosphate (pH=7,4) với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 2,5 giờ. Tại mỗi thời điểm 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 phút, 1 mL mẫu được rút ra và cùng một lượng đệm được thêm vào. Mẫu được ly tâm ở 18 000 vòng/phút trong 5 phút [15, 91]. Hàm lượng polyphenol trong phần dịch sau ly tâm được xác định bằng phương pháp đo quang sau khi phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu, ở bước sóng 765 nm. Để xác định hàm lượng polyphenol trong dung dịch đệm phosphate, đường chuẩn được xây dựng trong khoảng nồng độ 2-10 µg/mL, y = ax + b. Cuối cùng, phần trăm tích lũy giải phóng (%T) được tính theo cơng thức (3.5):
C V + V ∑t−1 C
% T =
M0 − ∑1t−1 Mi
41
Trong đó: Ct, Ci: nồng độ của polyphenol được giải phóng tại thời điểm t và i V0: tổng thể tích dung dịch đệm giải phóng (50 mL)
V: thể tích mẫu rút tại mỗi thời điểm (1 mL) M0: lượng polyphenol ban đầu
Mi: tổng lượng polyphenol rút tại thời điểm i
3.7.4 Đánh giá tương tác của hệ vi hạt và các hợp chất trong dịch chiết
Đánh giá sự tương tác giữa fibroin và dịch chiết dựa vào phổ FT-IR của các mẫu FMPs, FMPs-WT và các cao chiết được, phổ thu được bằng máy quang phổ