48
Dung dịch fibroin trong nước sau khi được nhỏ dung môi (FMPs-Blank)/cao chiết (FMPs-WT) vào và qua các bước xử lý thu được hệ vi hạt có màu tươi. Sản phẩm cuối cùng sau khi đơng khơ (Hình 4.2) cũng được xác định lại khối lượng thu được, khối lượng chi tiết từng hệ bào chế được trình bày trong Bảng 4.5.
Hình 4.2 Vi hạt fibroin được tải dịch chiết hoa Sài đất ba thùy sau khi đã đông khô Bảng 4.5 Kết quả xác định khối lượng (mg) của các hệ vi hạt được bào chế từ fibroin tơ tằm Mẫu FMPs- hạtBlankMeOH 1% 16,37±0,82 2% 33,42±1,67 3% 54,50±2,73
49
4.6 Kết quả xác định một số tính chất lý hóa của hệ vi hạt
4.6.1 Kết quả xác định hiệu suất tải (EE%) và khả năng tải (DL%) của hệthống vi hạt thống vi hạt
Sau khi xác định hàm lượng polyphenol tự do còn lại trong phần dịch
trong bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis. Hiệu suất tải dịch chiết vào các hệ vi hạt khá cao, tất cả các hệ vi hạt đều đạt hiệu suất tải trên 65%. Với hiệu suất tải nạp khá cao như vậy, có thể thấy rằng các hợp trong cao chiết tương tác khá tốt với cấu trúc của fibroin tơ tằm. Nhìn chung, cao chiết EtOH 60% có hiệu suất tải cao nhất (76,16-85,74%), cao MeOH có hiệu suất tải thấp nhất (68-80%), so sánh giữa 3 loại cao chiết có thể thấy các hợp chất có trong cao EtOH 60% tương tác với fibroin tốt hơn hơn 2 loại cao chiết còn lại.
Bảng 4.6 Kết quả xác định hiệu xuất tải (EE%) và khả năng tải (DL%) polyphenol từ dịch chiết hoa Sài đất ba thùy vào hệ vi hạt fibroin
Mẫu FMPs- WTMeOH FMPs- WTEtOH 60% FMPs- WTEtOH 96% 4.6.2 Kết quả xác định kích thước hạt fibroin
Kích thước hạt trung bình và sự phân bố kích thước hạt (PI) được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS). Các mẫu hạt FMPs và FMPs- WT đơng khơ trước đó được tái phân bố lại trong 5 mL nước DI, được đánh siêu âm đứng trong 15 phút ở mức 14. Phép đo được thực hiện ở 25℃ ở một góc cố định là 90°. Kết quả cho thấy hệ vi hạt có kích thước dao động từ 0,659 – 8,46 µm, kết quả chi tiết được trình bày trong Bảng 4.7. Từ kết quả có thể xác định kích thước của hệ vi hạt cho thấy, khi nồng độ fibroin càng tăng thì kích thước của hệ vi hạt cũng tăng lên. Việc ảnh hưởng đến kích thước của hệ vi hạt bởi nồng độ fibroin đã được báo cáo trước đây bởi Zhengbing Cao
và cộng sự; Yu Qi và cộng sự [147, 148]. Cấu trúc của fibroin có chứa cả đoạn ưa
lẫn kỵ nước, trong đó có tới 75% gốc acid amin kỵ nước nhưng vẫn có rất nhiều acid amine có nhóm phân cực ưa nước như Ser, Tyr, Glu, Asp. Fibroin tơ tằm là một protein dạng sợi được đặc trưng bởi hàm lượng cao đơn vị lặp lại (G-A) làm cho fibroin có tính kết tinh trong dung dịch. Và cũng vì thế, khi tăng
nồng độ fibroin sự tương tác giữa các vi tinh thể và các phân tử fibroin tự do, và tương tác giữa các vi hạt cũng tăng lên. Do đó, trong một khơng
50
gian hạn chế, các vi hạt sẽ dễ kết tụ hơn và tạo thành các vi hạt có kích thước lớn hơn.
Bảng 4.7 Kết quả xác định kích thước (µm) trung bình của mỗi hệ vi hạt fibroin (FMPs-Blank và FMPs-WT
Dung môi MeOH EtOH 60% EtOH 96%
4.6.3 Kết quả xác định khả năng giải phóng polyphenol của hệ vi hạt
Việc giải phóng polyphenol từ hệ vi hạt được đo bằng tổng hàm lượng polyphenol được giải phóng ra khỏi FMPs-WT trong mơi trường đệm phosphate pH=7,4. Đường chuẩn gallic acid được xây dựng lại trong môi trường đệm, khoảng nồng độ từ 2-10 µg/mL, y = 0,0985x + 0,0363 (R2=0,9989).
Hình 4.3 Biểu đồ giải phóng polyphenol của hệ vi hạt FMPs- WTMeOH ra mơi trường đệm pH 7,4
51
Hình 4.4 Biểu đồ giải phóng polyphenol của hệ vi hạt FMPs- WTEtOH 60% ra môi trường đệm pH 7,4
Hình 4.5 Biểu đồ giải phóng polyphenol của hệ vi hạt FMPs- WTEtOH 96% ra môi trường đệm pH 7,4
Bảng 4.8 Hàm lượng polyphenol (%) giải phóng cực đại trong thời gian 240 phút của các hệ vi hạt được tải dịch chiết
Mẫu FMPs-WTMeOH FMPs-WTEtOH 60% FMPs-WTEtOH 96%
Như đã thấy trong Hình 4.3, Hình 4.4 và Hình 4.5, hàm lượng polyphenol được giải phóng ra khỏi hệ vi hạt có sự tăng dần theo thời gian. Sự tuyến tính khơng đều của đồ thị giải phóng có thể là do hàm lượng từng hợp chất polyphenol được tải vào trong hệ vi hạt không đều. Hàm lượng polyphenol được phóng thích cực đại được thể hiện ở Bảng 4.8. Sự chênh lệch hàm lượng giải phóng giữa các hệ vi hạt
52
có thể lý giải như sau, thành phần các hợp chất được chiết bởi các dung môi khác nhau sẽ khác nhau và tương tác giữa chúng với cấu trúc của SF cũng khác nhau. Những chất tương tác tốt và bền với cấu trúc SF sẽ có thể giải phóng chậm hơn so với những chất tương tác kém hơn. Việc hàm lượng polyphenol giải phóng chậm và đạt hiệu quả giải phóng thấp là do cấu trúc tấm của tơ fibroin khơng hịa tan trong nước và có tính kị nước đáng kể giữa fibroin và polyphenol có trong Wedelia
trilobata L. Sự hiện diện của các tương tác kị nước giữa fibroin và polyphenol đã
được báo cáo trong một số nghiên cứu trước đây được báo cáo bởi Pizzino G và
cộng sự (2017); Lozano-Pérez AA và cộng sự (2017); Montalbán MG và cộng sự
(2018) [1, 8, 10]. Việc giải phóng chậm vừa có lợi trong vấn đề bảo vệ polyphenol khỏi bị phân hủy bởi các tác nhân trong môi trường xung quanh, đồng thời là một ứng dụng tiềm năng cho các dạng thuốc phóng thích có kiểm sốt.
4.6.4 Kết quả đánh giá cấu fibroin từ kén tằm và đánh giá tương tác của hệvi hạt được tải dịch chiết từ các cao chiết vi hạt được tải dịch chiết từ các cao chiết
Cấu trúc của tơ và hệ vi hạt fibroin được xác định bằng các mũi tín hiệu cực đại của phổ hồng ngoại FT-IR cụ thể ở 1626 cm-1 (amide I), 1525 cm-1 (amide II) và 1234 cm-1 (amit III). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã được báo cáo bởi Phạm Duy Toàn và cộng sự (2019) (1622 cm−1 (amide I), 1517 cm−1 (amide II), and 1265 cm−1 (amide III)) [94].
So sánh phổ FT-IR của các mẫu FMPs, FMPs-WT và cao chiết. Có thể thấy rằng mặc dù tải dịch chiết nhưng các đỉnh tín hiệu của cao chiết không thể hiện rõ trong phổ FT-IR của FMPs-WT, điều này có thể nói rằng các hợp chất sau khi được tải tồn tại ở dạng vơ định hình trong hệ vi hạt. Từ kết quả xác định độ kết tinh của hệ vi hạt và bột tơ thô (Bảng 4.6), dễ dàng nhận thấy độ kết tinh của bột fibroin nhỏ hơn hệ vi hạt (FMPs-Blank) và độ kết tinh của hệ thống vi hạt rỗng lớn hơn của hệ
thống vi hạt được tải (CIpowder < CIFMPs-Blank, CIFMPs-Blank > CIFMPs-WT). Kết quả xác định độ kết tinh cho thấy hệ vi hạt sau khi được tải dịch chiết thì độ kết tinh của fibroin giảm, độ vơ định hình tăng lên. Điều này cũng góp phần giải thích khả năng giải phóng các hoạt chất của hệ vi hạt.
Bảng 4.9 Kết quả xác định độ kết tinh của của các hệ vi hạt fibroin (FMPs và FMPs-WT) dựa vào quang phổ hồng ngoại FT-IR
Bột khô
CIIRI 0,39
CIIRII 0,39
4.7 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết hoa Sài đất bathùy và các hệ vi hạt bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH. thùy và các hệ vi hạt bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH.
4.7.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn về khả năng quét gốc tự do DPPH củachất đối chứng Vitamin C chất đối chứng Vitamin C
Vitamin C được biết đến là một chất với khả năng kháng oxy hóa mạnh. Trong phản ứng với chất oxy hóa DPPH, lượng gốc tự do trong dung dịch giảm, nên mật độ quang (OD) của dung dịch DPPH đo ở bước sóng cực đại 519 nm sẽ giảm. Nồng độ Vitamin C và hiệu suất làm sạch gốc tự do sẽ tỷ lệ với nhau, nồng độ Vitamin C càng lớn khả năng quét gốc tự do càng cao (Bảng 4.10).
Từ kết quả trên, giá trị IC50 của Vitamin C là 4,31 µg/mL dựa vào phương trình đường chuẩn kháng oxy hóa của Vitamin C: y = 11,409x – 0,823 (R2=0,9964). Khả năng kháng oxy hóa của các cao chiết hoa Sài đất ba thùy dựa vào hàm lượng các chất kháng oxy hóa có trong từng loại cao chiết được tính tương đương µg/mL Vitamin C dựa vào phương trình đường chuẩn được xây dựng bởi đồ thị biểu thị khả năng làm sạch gốc tự do của Vitamin C theo nồng độ. Bảng 4.10 Kết quả khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của Vitamin C
4.7.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết hoa Sài đấtba thùy ba thùy
Khả năng quét gốc tự do DPPH của 3 loại cao chiết MeOH, EtOH 60%, EtOH 96% từ hoa Sài đất ba thùy được trình bày trong Bảng 4.11, 4.12, 4.13. Kết quả khảo sát khả năng quét gốc tự do của 3 loại cao chiết tỷ lệ với nồng độ cao chiết, nồng độ cao chiết càng lớn khả năng làm sạch gốc tự do càng cao. Hiệu suất làm sạch gốc tự do khi tăng nồng độ từ 2,25-13,5 µg/mL đối với cao MeOH
là 22,28%-71,30%, cao EtOH 60% là 16,48%-77,65% và đối với cao EtOH 96% là 18%-60,27%.
So sánh hiệu quả làm sạch gốc tự do của 3 loại cao chiết có thể dễ dàng thấy được cao EtOH 60% có hoạt tính cao nhất sau đó là cao MeOH và EtOH 96%. Các giá trị IC50 của các cao chiết được tính tốn dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính từ đồ thị biễu diễn khả năng làm sạch gốc tự do của 3 loại cao chiết, cho kết quả lần lượt là 8,67; 7,98; 10,7 µg/mL đối với cao MeOH, EtOH 60% và EtOH 96%. Phương trình hồi quy tuyến tính của các cao chiết và chất đối chứng Vitamin
C được trình bày trong Bảng 4.14. Tuy nhiên, khả năng làm sạch gốc tự do của 3 loại cao chiết vẫn thấp hơn so với đối chứng là Vitamin C (IC50=4,31 µg/mL).
54
Kết quả khảo sát cho thấy các cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy được xếp vào loại rất mạnh. So sánh với các kết quả nghiên cứu của V Mardina và cộng sự (2020) giá trị IC50 của các cao chiết MeOH và ethyl acetate lần lượt là 19,072 µg/mL, 127,43 µg/mL [22, 23]; J. Chethan và cộng sự (2012) giá trị IC50 của cao chiết MeOH là 90 µg/mL [21]; Govindappa M và cộng sự (2011) giá trị IC50 của cao chiết EtOH là 86,82 µg/mL [15]. Kết quả cho thấy các cao chiết hoa Sài đất ba thùy thu hái ở Thành phố Cần Thơ, Việt Nam cho hoạt tính kháng oxy hóa tốt hơn, có thể do điều kiện khí hậu, mơi trường, thổ nhưỡng của từng vùng khác nhau dẫn đến thành phần và hàm lượng các hợp chất trong cây khác nhau. Nhìn chung, qua các kết quả nghiên cứu trên, bước đầu cho thấy đối với hoa Sài đất ba thùy, cao chiết từ dung môi phân cực hơn cho khả năng kháng oxy hóa tốt hơn. Do các hợp chất polyphenol có tính phân cực cao nên dung mơi phân cực hơn sẽ chiết tốt hơn, từ đó hàm lượng chất kháng oxy hóa cao hơn. Có thể dễ dàng thấy được khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của 3 loại cao chiết tăng dần khi hàm lượng polyphenol có trong cao chiết tăng dần.
Bảng 4.11 Kết quả khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của cao MeOH hoa Sài đất ba thùy
Nồng độ cao chiết (µg/mL) 0 2,25 4,5 6,75 9 11,25 13,5
Bảng 4.12 Kết quả khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của cao EtOH 60%
Nồng độ cao chiết (µg/mL) 0 2,25 4,5 6,75 9 11,25 13,5
55
Bảng 4.13 Kết quả khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của cao EtOH 96% Nồng độ cao chiết (µg/mL) 0 2,25 4,5 6,75 9 11,25 13,5
Bảng 4.14 Phương trình tuyến tính hiệu suất làm sạch gốc tự do DPPH (%) theo nồng độ (µg/mL), giá trị IC50 của Vitamin C và 3 loại cao chiết hoa Sài đất ba thùy
Vitamin C Cao chiết MeOH Cao chiết EtOH 60%
Cao chiết EtOH 96
4.8 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các hệ vi hạt (FMPs,FMPs-WT) FMPs-WT)
Kết quả khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do của hệ vi hạt được thể hiện ở Bảng 4.15. Từ hoạt tính kháng oxy hóa mạnh của cao chiết và sự thay đổi về khả năng làm sạch gốc tự do của hệ vi hạt fibroin chưa được tải dịch chiết và vi hạt đã được tải dịch chiết đã góp phần chứng minh việc tải thành cơng polyphenol có trong các cao chiết vào hệ vi hạt fibroin. Qua kết quả khảo sát cho thấy hiệu quả làm sạch gốc tự do của các hệ vi hạt sau khi được tải dịch chiết sẽ phụ thuộc vào thời gian các chất được giải phóng ra khỏi hệ vi hạt, thời gian càng lâu hoạt chất giải phóng càng nhiều và hiệu quả làm sạch gốc tự do càng cao. Theo kết quả cho thấy, có thể do trong các cao EtOH có những hợp chất polyphenol tương tác tốt với cấu trúc fibroin và dễ dàng phóng thích trong mơi trường đệm nên hệ vi hạt được tải dịch chiết từ các cao EtOH có hiệu quả quét gốc tự do tương đối tốt hơn so với hệ vi hạt được tải dịch chiết từ cao MeOH.
Bảng 4.15 Kết quả khảo sát khả năng quét gốc tự do của các hệ vi hạt được tải dịch chiết từ các cao chiết hoa Sài đất ba thùy
Hiệu suất làm sạch gốc tự do DPPH (%)
56
Từ những kết quả về hàm lượng polyphenol, hiệu quả làm sạch gốc tự do, hiệu suất tải của cao EtOH 60%, có thể nói rằng cao EtOH 60% tốt nhất trong 3 loại đã được nghiên cứu, có thể những hợp chất có hoạt tính tốt, tương thích với cấu trúc hệ vi hạt fibroin. Bên cạnh đó, trong một số nghiên cứu trước đây đã được báo cáo bởi Hcini và cộng sự (2021) [14], việc fibroin có thể quét một lượng nhỏ DPPH bởi do dư lượng tyrosine có trong cấu trúc của fibroin.
Hàm lượng polyphenol được tải vào mỗi hệ vi hạt tăng dần từ 1-3% và hiệu quả quét gốc tự do của mỗi hệ cũng khác nhau. Kết quả ở Bảng 4.15 cho thấy hiệu quả quét gốc tự do có sự thay đổi từ hệ vi hạt 1% fibroin đến hệ vi hạt 3% fibroin. Trong các cao chiết có những hợp chất cho hoạt tính tốt, khi tăng hàm lượng fibroin có thể những hợp chất đó được tải nạp nhiều hơn so với các hệ có tỷ lệ fibroin thấp hơn. Và kết quả cũng cho ta thấy được tiềm năng của hệ vi hạt fibroin có khả năng dẫn truyền và phóng thích hoạt chất có kiểm sốt, mà ở đây muốn nói đến là các hợp chất tự nhiên.
57
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận
Qua quá trình thực hiện đề tài “Bào chế và khảo sát hoạt tính kháng oxy
hóa của hệ vi hạt từ fibroin tơ tằm chứa dịch chiết hoa Sài đất ba thùy (Wedelia trilobata L.)” thu hái tại thành phố Cần Thơ, đề tài đã thu được nhiều
kết quả và hoàn thành tốt mục tiêu mà đề tài đã đặt ra:
Sau quá trình xử lý hoa, chiết cao và định tính thành phần hóa học có trong có trong 3 loại cao chiết từ hoa Sài đất ba thùy. Đã xác định được sự hiện diện của các hợp chất sau: alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, các hợp chất khử, acid hữu cơ.
Hàm lượng polyphenol có sự thay đổi khi chiết bằng các dung môi khác nhau. Kết quả định lượng hàm lượng polyphenol tổng của 3 loại cao MeOH, EtOH 60%, EtOH 96% lần lượt là 24,45; 46,47; 33,47 mg GAE/g DPW.