CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.8 Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của cao chiết và các hệ vi hạt
3.8.1 Nguyên tắc
Hiệu quả quét gốc tự do DPPH của cao chiết hoa Sài đất ba thùy được thực hiện dựa theo phương pháp của Shekhar el al. (2014) có hiệu chỉnh [144].
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ở nhiệt độ thường, dạng bột màu đen ở điều kiện thường, có màu tím đặc trưng trong dung dịch. Gốc tự do DPPH có bước sóng hấp thu cực đại tại 519 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hydrogen từ các chất kháng oxy hóa (dung dịch chuyển từ đen tím sang vàng nhạt). Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động quét gốc tự do của các chất kháng oxy hóa dựa trên sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch DPPH ở 519 nm [145].
Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của các dung dịch cao chiết được đánh giá qua sự giảm độ hấp thu quang phổ của dung dịch DPPH sau khi phản ứng với dung dịch mẫu thử ở bước sóng 519 nm với các nồng độ mẫu thử khác nhau. Chất kháng oxy hóa trong mẫu thử sẽ phản ứng với gốc tự do DPPH, lượng gốc tự do còn lại sẽ được phát hiện ở bước sóng 519 nm. Từ sự giảm độ hấp thu quang phổ, tính được hiệu suất làm sạch gốc tự do và dựng đồ thị tuyến tính biểu thị hiệu suất làm
42
sạch gốc tự do theo nồng độ mẫu thử, từ đó tính được giá trị IC50 dựa vào phương trình tuyến tính.
3.8.2 Chuẩn bị hóa chất
Pha dung dịch DPPH nồng độ 0,1 mM: cân chính xác 1,97 mg DPPH cho vào bình định mức 50 mL sau đó thêm MeOH đến vạch rồi lắc đều đến khi tan hoàn tồn, sau đó dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong tối.
Pha dung dịch Vitamin C nồng độ 40 μg/mL: cân chính xác 2 mg Vitamin
C cho vào bình định mức 20 mL, sau đó thêm MeOH đến vạch rồi lắc đều đến khi tan hồn tồn. Hút chính xác 2 mL dung dịch vừa pha cho vào ống ly tâm, thêm 8 mL MeOH lắc đều, được 10 mL dung dịch Vitamin C nồng độ 20 μg/mL dùng cho thí nghiệm.
Pha các dung dịch cao chiết hoa Sài đất ba thùy nồng độ 1000 μg/mL: cân chính xác 2 mg cao chiết cho vào effendorf, thêm 2 mL dung môi rồi lắc đều cho tan hoàn toàn thu được dung dịch cao chiết nồng độ 1000 μg/mL. Hút 1 mL dung dịch vừa pha được cho vào ống ly tâm thêm 9 mL dung môi, được dung dịch cao chiết nồng độ 100 μg/mL dùng cho các thí nghiệm.
3.8.3 Khảo sát khả năng quét gốc tự do của cao chiết
Khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH của Vitamin C và của cao chiết bằng cách dựng đường chuẩn giữa khả năng quét gốc tự do và dãy nồng độ chuẩn, sau đó tính nồng độ tại đó 50% gốc tự do được làm sạch (IC50). Đường chuẩn kháng oxy hóa của Vitamin C gồm dãy nồng độ: 0; 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5; 9 µg/mL. Đường chuẩn kháng oxy hóa của các cao chiết có cùng dãy nồng độ là: 0, 3, 6, 9, 12, 15 µg/mL.
Quy trình chung: hút V1 µL dung dịch Vitamin C hoặc dung dịch cao chiết thêm vào V2 µL dung dịch gốc tự do DPPH nồng độ 0,1 mM và ủ trong tối ở nhiệt độ phòng trong 30 phút (Bảng 3.1 và Bảng 3.2 tương ứng cho quy trình thử nghiệm trên các cao chiết hoa Sài đất ba thùy và Vitamin C). Đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 519 nm. Mẫu trắng khơng chứa Vitamin C hoặc cao chiết. Tồn bộ q trình thí nghiệm được thực hiện trong mơi trường tránh sáng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình.
Bảng 3.1 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của các cao MeOH, EtOH 60% và EtOH 96% từ hoa Sài đất ba thùy
Bảng 3.2 Quy trình khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do DPPH của chất đối chứng Vitamin C Nồng độ Vitamin C cuối cùng (μg/mL) 0 1,5 3 4,5 6 7,5 9
3.8.4 Khảo sát khả năng quét gốc tự do của các hệ vi hạt fibroin
Việc tải dịch chiết có trong cao chiết hoa Sài đất ba thùy vào hệ vi hạt mang tính tổng quát và tương đối, do thành phần các hợp chất có trong cao chiết được nạp vào hệ vi hạt có thể khơng đồng đều và hoạt tính của hệ vi hạt lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng giải phóng hoạt chất của hệ vi hạt, khó có thể xác định chính xác IC50. Vì vậy, nghiên cứu này sẽ khảo sát khả năng làm sạch gốc tự do của các hệ vi hạt được tải dịch chiết theo thời gian. Cụ thể, khả năng làm sạch gốc tự do của hệ vi hạt sẽ được khảo sát tại các thời điểm 30, 120, 240 phút và khối lượng hạt khảo sát sẽ được tính dựa vào hàm lượng polyphenol tại giá trị IC50 của cao chiết.
Đối với hệ vi hạt, khối lượng hạt đem phản ứng (Mpu) với DPPH được tính tốn lại dựa vào biểu đồ giải phóng hoạt chất và hàm lượng polyphenol tổng có trong cao chiết tại IC50. Khối lượng hạt được xác định như sau (3.8):
Mpu =
Trong đó: Mpu: khối lượng hạt đem phản ứng (mg) mp: hàm lượng polyphenol tổng tại IC50 (µg) Mh: khối lượng hạt thu được (mg)
H: phần trăm giải phóng tại thời điểm cao nhất mh: khối lượng polyphenol có trong hạt (µg)
Mẫu FMPs-WT sau đơng khơ sau đó được cân chính xác theo khối lượng đã tính tốn, tái phân bố lại trong môi trường đệm phosphate pH=7,4 để được dung dịch có nồng độ polyphenol sau khi giải phóng gần tương đương nồng độ cao chiết. Hỗn hợp gồm 0,5 mL dung dịch DPPH 0,1 mM trong MeOH được thêm vào 1,5 mL dịch huyền phù vi hạt. Hỗn hợp được lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời
44
gian 30, 120, 240 phút. Hỗn hợp sau phản ứng được ly tâm ở 2000 vòng/phút trong
5 phút để loại chất rắn. Đo độ hấp thu quang phổ của DPPH ở bước sóng 519 nm. Chất đối chứng được sử dụng là ascorbic acid và FMPs-Blank, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần.