VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
Các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này là tất cả các chủng được phân lập từ các bệnh phẩm khác nhau từ các khoa điều trị gửi tới khoa vi sinh (bao gồm cả nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng không phải nhiễm trùng bệnh vieọn) trong naờm 2005
- Mac Conkey Agar (MC) dùng phân lập các trực khuẩn Gram âm dễ mọc
- Blood Agar (Thạch máu cừu BA): là môi trường phân lập vi khuẩn nhóm
Staphylococci, Streptococci, Haemophilus từ các mẫu bệnh phẩm (trừ mẫu phân) và thực hiện kháng sinh đồ của vi khuẩn nhóm Streptococci
- Shigella Salmonella (SS) dùng phân lập Salmonella và Shighella trong maãu phaân
- Chocolate Agar (CA) bổ sung máu cừu và NAD phân lập vi khuẩn từ mẫu dịch não tủy và phân lập và thực hiện kháng sinh đồ của Haemophilus
- Mueller Hinton Agar (MHA): dùng thực hiện kháng sinh đồ của các vi khuẩn thuộc nhóm: trực khuẩn Gram âm dễ mọc, Staphylococci, Enterococci
- Các loại môi trường dùng để định danh trực khuẩn Gram âm dễ mọc: KIA, Simon citrate và NB bổ sung 0.25% agar
- Các loại môi trường dùng định danh nhóm Streptococci: bile esculine và TSB 6,5% NaCl
Tất cả các loại môi trường trên đều do khoa Vi sinh tự sản xuất từ nguyên
Thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ trên 22 loại kháng sinh như sau:
Kháng sinh Nồng độ KS/đĩa Ký hiệu
- Ticaricillin/acid clavulanic 75/10 àg TCC
Tất cả những đĩa giấy kháng sinh đều do hãng Biorad sản xuất, ngoại trừ norfloxacin, novobiocin và nitrofurantoin (furanes) do hãng Sanofi sản xuất Dựa trên khuyến cáo của Uỷ Ban Quốc Gia về tiêu chuẩn các phòng thí nghiệm tại Mỹ (NCCLS) và kinh nghiệm thực tế chúng tôi lựa chọn các loại đĩa kháng sinh khác nhau cho từng nhóm vi khuẩn như bảng sau:
Bệnh viện Nhi Đồng 1 Bảng 2.1: QUY ĐỊNH ĐẶT ĐĨA KHÁNG SINH ĐỒ
Khoa Vi sinh (Bắt đầu thực hiện tháng 6/2000)
B ¯ : bacilli Gram âm C + : cocci Gram dương DNT: dịch não tủy NT: nước tiểu
PNE: Pneumococci HIN: H influenzae PSA: P aeruginosa MEN: Meningococci
Chú thích: Trong năm 2005 khoa vi sinh không sử dụng kháng sinh ceftriaxone (CRO) và amikacin (AN)
AM CTX CAZ CRO CXM C CIP SXT ER GM NA NO FT NOR OX AN P PB RA VA IMP CEF PEF TCC CFP
- Nhóm trực khuẩn Gram âm dễ mọc: dùng các phản ứng sinh hóa kinh điển cơ bản (KIA, Citrate, Indole, di động) để định danh nhóm vi khuẩn này
- Staphylococci: định danh sơ bộ bằng thử nghiệm calalase và oxidase Dùng thử nghiệm coagulase để phân biệt 2 nhóm S aureus và Coagulase negative Staphylococci
- Streptococci: dùng các thử nghiệm optochin, bacitracin, bile esculine và NaCl
6,5% để định danh nhóm vi khuẩn này.
PHƯƠNG PHÁP
2.1 Khảo sát đặc điểm mẫu
- Bệnh phẩm là máu, mủ, dịch cơ thể, phân và nước tiểu được lấy vào các loại dụng cụ vô trùng bởi các kỹ thuật viên từ các Khoa Điều trị và được chuyển ngay đến Khoa Vi sinh
- Thông tin về bệnh nhân và chẩn đoán lâm sàng được ghi trên phiếu xét nghiệm
- Tiến hành khảo sát đại thể mẩu bệnh phẩm màu sắc, độ trong hay đục và điền vào phiếu xét nghiệm, và phiếu tiến trình phân lập vi khuẩn
2.2 Quy trình xét nghiệm vi sinh các loại bệnh phẩm
2.2.1 Sơ đồ quy trình cấy máu
Phân lập trên MC và
BA có vạch S aureus Staphylococcus aureus
Kết quả: Vi khuẩn không mọc sau 7 ngày Không có vi khuẩn mọc Có vi khuẩn mọc
Cấy máu kiểm tra trên BA uû 35 o C/ CO2, 18-24h Máy báo âm (-) sau 7ngày (không có vi khuẩn mọc) Máy báo dương (+)
Nhuộm Gram, khảo sát hình dạng vi khuẩn
Thực hiện KSĐ sau khi khảo sát phết nhuộm Gram
Kết quả định Thực hiện các thử nghiệm định danh cơ bản sau khi khảo sát phết nhuộm Gram
2.2.2 Sơ đồ quy trình cấy mủ và các loại dịch cơ thể
2.2.3 Sơ đồ quy trình cấy phân
Bệnh phẩm: MỦ VÀ CÁC DỊCH
Kết quả: Vi khuẩn không mọc
Kết quả định danh và KSĐ
Thực hiện các thử nghieọm ủũnh danh
Vi khuẩn mọc: chọn khóm tách rời
Cấy phân lập trên BA ,
MC uû 37 o C, 18-24h Nhuộm Gram: khảo sát hình dạng vi khuẩn
Thực hiện KSĐ Thực hiện định danh sinh hóa
Vi khuẩn mọc: chọn khóm điển hình (2 nhóm lên men Lactose và không lên men lactose)
Cấy phân lập trên: MC, SS uû 37 o C, 18-24h Nhuộm Gram tìm bạch cầu
Ghi chú: Trong mẫu phân tại Khoa chỉ tiến hành phân lập và thực hiện KSĐ của Escherichia coli (trẻ ≤ 3 tuổi và có bạch cầu hoặc hồng cầu trong phân),
2.2.4 Quy trình cấy nước tiểu
Chuự yự: ≥ 10 5 CFU/ml chaộc chaộn nhieóm truứng tieồu
Kết quả định danh và KSĐ Thực hiện KSĐ Tiến hành định danh sinh hóa Khoõng nhieóm truứng tieồu
Cấy định lượng đếm vi khuẩn trên môi trường BA, MC ủ 37 o C,18-24h
2.2.5 Quy trình cấy dịch não tủy
Chú ý: Tất cả các môi trường BA, CA sau khi phân lập hay thực hiện KSĐ thì được ủ ở 35 o C trong tủ CO2
2.3.1 Phương pháp cấy phân lập [5,27,28]
- Phương pháp cấy 3 chiều để tách riêng biệt từng tế bào vi sinh vật trên môi trường nuôi cấy, từ một tế bào ban đầu sau một thời gian nuôi cấy sẽ tạo ra một khóm vi khuẩn
- Bước đầu phâm biệt vi khuẩn Gram dương hay Gram âm nhờ các môi trường phân lập chuyên biệt
Kết quả định danh và KSĐ Thực hiện KSĐ Thực hiện các thử nghieọm ủũnh danh
Cấy phân lập trên CA ủ
Ly taâm 5000rpm/5min DỊCH NÃO TUỶ
Hình 2.1: Kết quả cấy phân lập trên MC
Bên trái: vi khuẩn không lên men lactose (Acinetobacter, Pseudomonas…)
Bên phải: vi khuẩn lên men lactose (E coli,
2.3.2 Phương pháp cấy định lượng [24,25]
- Dùng để cấy mẫu nước tiểu, sử dụng que cấy định lượng chuẩn cấy lên môi trường theo hình mạng lưới
- Bước đầu xác định được có nhiễm trùng tiểu (≥10 5 CFU/ml) hoặc nghi ngờ nhiễm trùng tiểu (10 4 -10 5 CFU/ml) và không nhiễm trùng tiểu (