Nhiễm trùng huyết cũng là một nguyên nhân gây tử vong cho người bệnh trong bệnh viện, bệnh rất hay gặp ở các nước đang phát triển do điều kiện chăm sóc về mặt y tế còn hạn chế, thường gặ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Bệnh nhân nội trú tại bệnh viện Nhân Dân Gia Định có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm trùng huyết, được chỉ định cấy máu tìm vi khuẩn, bệnh phẩm máu được các khoa lâm sàng gửi đến khoa Vi sinh trong chai cấy máu thường và chai cấy máu Bactec [18].
Phương pháp nghiên cứu
• Phân lập và định danh vi khuẩn từ các mẫu máu theo thường qui của Tổ chức
• Xác định mức độ kháng kháng sinh của các vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp Kirby-Bauer theo hướng dẫn của NCCLS-2004 Sử dụng đĩa giấy tẩm kháng sinh của Công Ty Nam Khoa và Bio-Rad
• Xử lý kết quả theo các phương pháp thống kê y học
3.1.1 Chai cấy máu được cung cấp cho các khoa lâm sàng, có 2 loại:
Chai cấy máu 2 pha của công ty Nam Khoa
Chai cấy máu Bactec của công ty Becton Dickinson
Bảng 2: Thành phần môi trường chai cấy máu
HÓA CHẤT BACTEC CHAI THƯỜNG
Soybean casein digest broth (SCD) 2.75%
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 26
3.1.2 Lượng máu cấy vào chai cấy máu: Ở trẻ em, sự hiện diện của vi khuẩn nhiều hơn người lớn, do đó chỉ cần một lượng máu ít là đủ để phát hiện vi khuẩn
Bảng 3: Mối liên hệ giữa thể tích máu và tuổi
Theo Tenney và cộng sự, sự phát hiện vi khuẩn tăng theo thể tích máu So sánh thể tích máu 2ml và 7ml, tỷ lệ dương tính 29% Do đó, đối với chai Bactec 25ml cần 3-10ml máu
3.2.1 Môi trường phân lập: Thạch CAXV, thạch máu (BA), Mac Conkey (MC)
• Blood Agar (BA): là môi trường dùng để phân lập vi khuẩn nhóm
Staphylococci, Streptococci từ các mẫu bệnh phẩm
• Mac Conkey Agar (MC) dùng phân lập trực khuẩn Gram âm dễ mọc
• Thạch CAXV: là môi trường dinh dưỡng cao, môi trường có bổ sung thêm yếu tố XV
3.2.2 Môi trường thực hiện phản ứng sinh hóa: CITRATE, SIM, MR-VP, KIA,
UREASE, và một số thử nghiệm như: CAMP, Optochin, NaCl 6,5%, Taxo A, ID32E,…
3.2.3 Môi trường thực hiện kháng sinh đồ: Mueller Hinton là môi trường thực hiện kháng sinh đồ và các đĩa kháng sinh dùng để thử nghiệm sự nhạy cảm kháng sinh
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 27 của vi khuẩn ( công ty Nam Khoa), ATB Strep, ATB Stap, ATB G (-) theo máy mini API (Bio Merieux)
3.3 Trang thiết bị dụng cụ:
Tủ cấy Ống nghiệm, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle…
Phương pháp khảo sát
Vi khuẩn ở trong máu nhiều hơn vào giai đoạn cấp tính và giai đoạn đầu của bệnh hoặc lúc bệnh nhân sốt cao Để tăng xác suất phân lập được vi khuẩn, ít nhất là 2 chai vào hai thời điểm nên được cấy, thông thường cách nhau mỗi một giờ trước khi dùng kháng sinh [18] Nghiên cứu ở bệnh viện MAYO CLINI (Washington) [18]:
- 80% cấy máu dương chai cấy đầu
4.1.2 Kỹ thuật lấy máu và cấy máu:[17]
- Chà sát gòn thấm cồn 70 0
- Dùng miếng gòn khác vệ sinh trở lại chỗ lấy máu bắt đầu từ giữa lan dần ra chung quanh, đợi khô
- Buộc dây garrot chỗ tĩnh mạch đã chọn dùng kim tiêm rút 3-5ml máu đối với người lớn, trẻ em thì 2-3ml máu
- Sát khuẩn nút cao su chai cấy máu
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 28
Có dấu hiệu vi khuẩn mọc (Quy trình A)
Không có dấu hiệu vi khuẩn mọc (Quy trình B)
BA, MC Định danh, kháng sinh đồ
Lắc trộn, tráng lên phase đặc, Ủ tiếp 35 0 C, qua đêm
Quan sát chai cấy mỗi ngày, sau khi quan sát lắc trộn, tráng đều Sau đó ủ tiếp
Nếu không có dấu hiệu vi khuẩn mọc, để đến
7 ngày, sao đó ra kết quả
Nếu có dấu hiệu mọc, thực hiện quy trình A
- Bơm máu vào pha lỏng của chai cấy (chai cấy máu 2 phase)
- Lắc trộn qua phase đặc (chai cấy máu 2 phase)
- Đặt chai trong tủ ấm 35 0 C
Hình 3: Quy trình cấy máu với chai cấy máu 2 pha
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 29
Hình 4: Quy trình cấy máu bằng máy BacTec
Bệnh Phẩm Máu Chai cấy máu Bactec Máy Bactec
Máy báo âm sau 5 ngày (không có vi khuẩn mọc) Nhuộm gram
Kết quả: vi khuẩn không mọc sau 5 ngày
Kết quả định danh và kháng sinh đồ
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 30
4.1.3 Theo dõi chai cấy máu:
Chai cấy máu 2 phase được ủ trong tủ ấm 35 0 C và theo dõi mỗi ngày trong 7 ngày xem có dấu hiệu vi khuẩn mọc hay không
Phase lỏng: Đục đều hay có màng
Phase đặc: Quan sát xem có khúm vi khuẩn mọc hay không Nếu không có thì nghiêng tráng lên phase lỏng
Khi có dấu hiệu vi khuẩn mọc cần cấy phân lập ngay, cấy trên CAXV, BA, và
MC Đồng thời nhuộm gram quan sát trực tiếp, sau đó tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ
Sau 7 ngày theo dõi, cần phải cấy mù để chắc chắn trước khi trả lời âm tính
Cố định mẫu lên phiến kính
Phủ dung dịch crystal violet trong 1 phút, rửa lại với nước
Phủ dung dịch lugol trong 2 phút, rửa lại với nước
Tẩy cồn – acetol khi vừa hết vết tím, rửa nước
Phủ dung dịch safranine trong 30 giây, rửa nước
Vi khuẩn gram dương bắt màu tím của crystal violet
Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng của safranine
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 31
4.2.2 Phương pháp định danh trực khuẩn gram âm: [16] [17]
Các test sinh hóa thường dùng để định danh vi khuẩn theo bảng sau:
Bảng 4: Test sinh hóa và kết quả
Thuốc thử Đọc kết quả
Lên men Glucose Không Phần sâu vàng Phần sâu đỏ
Lên men Lactose Không Phần nghiêng vàng Phần nghiêng đỏ
Sinh gas Không Có gas Không có gas
Sinh H2S Không Đen Không đen
Khả năng di động Không Hơi đục Trong suốt Sinh Indol Kovac Vòng màu đỏ Vòng màu vàng
3 Simon citrate Sử dụng citrate Không Xanh biển Xanh lá cây
4 MR Khả năng lên men Glucose
Methyl red Màu đỏ Màu vàng
5 Đĩa Ure Urease Không Màu hồng cánh sen Không màu
Bảng 5: Hệ thống định danh một số vi khuẩn thường gặp
Glucose Lactose H2S Gas Indol Di động Citrate
Ký hiệu: (+): Dương tính (+/-): Đa số dương tính
(-): Âm tính (-/+): Đa số âm tính
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 32
Hình 6: Các kết quả sinh hóa trên KIA
Hình 7: Kết quả thử Indol
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 33
Hình 8: Kết quả thử Citrate
Hình 9: Kết quả thử Methyl Red
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 34
4.2.3 Phương pháp định danh cầu khuẩn gram dương:
Hình 10: Quy trình định danh nhóm Staphylococci
Bảng 6: Quy trình thực hiện phản ứng sinh hóa
Tiêu huyết Catalase Taxo A Taxo P CAMP Bile-
Cầu khuẩn gram dương, xếp thành chuỗi rời rạc Catalase (+)
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 35 Đọc kết quả: kết quả được biểu hiện ở bảng sau
Bảng 7: Kết quả định danh Streptococci
Catalase Taxo A Taxo P CAMP Bile-
• Thử nghiệm catalase: dùng để phân biệt khúm vi khuẩn Streptococci và Staphylococci
Tụ cầu vàng có khả năng tiết enzyme catalase thủy phân nước oxy già (H2O2), giải phóng O2 và H2O
Thao tác và kết quả:
Bước 1: Nhỏ giọt Oxy già 3% lên lame kính sạch
Bước 2: Dùng que cấy vô khuẩn chạm nhẹ vào khúm vi khuẩn muốn thử, rồi cho que cấy chạm vào giọt H2O2
Bước 3: Đọc kết quả : nếu có hiện tượng sủi bọt thì dương tính (+), ngược lại là âm tính (-)
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 36
Một số vi sinh vật, đặc biệt là các loài thuộc giống Staphylococcus, có khả năng tiết enzyme coagulase làm kết tụ các thành phần huyết tương
Thao tác và kết quả
Nếu thực hiện thí nghiệm trên Lame:
Bước 1: Cho vài giọt dung dịch huyết tương thỏ lên lame
Bước 2: Dùng que cấy vô khuẩn, lấy một khúm vi khuẩn muốn thử, cho vào và khuấy cho vi khuẩn trải đều
Bước 3: Đọc kết quả: xem trên lame có xuất hiện kết tụ hay ko? Nếu có thì phản ứng dương tính (+), ngược lại hỗn hợp đồng nhất là âm tính (-)
Nếu thực hiện thí nghiệm bằng ống nghiệm:
Bước 1 : Cho dung dịch huyết tương thỏ vào ống nghiệm
Bước 2: Dùng que cấy cho vi khuẩn vào ống nghiệm, ủ 35 0 C, sau 4h đọc kết quả Bước 3: Đọc kết quả: nếu hỗn hợp kết tụ đồng nhất, không còn thấy dung dịch tự do, thì là dương tính (+), ngược lại âm tính (-)
Hình 12: Thử nghiệm coagulase trong ống nghiệm
Hình 13: Thử nghiệm coagulase trên lame
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 37
Một số vi sinh vật có khả năng thủy phân liên kết β- glucoside trong esculine phóng thích glucose và esculetin Esculetin phản ứng với muối sắt trong môi trường tạo thành phức hợp màu đen hay màu nâu Đọc kết quả:
Bile esculine dương tính (+): môi trường có màu nâu hay nâu đen
Bile esculine âm tính (-): môi trường không đổi màu
• Thử nghiệm dung nạp NaCl 6,5%:
Dùng khuyên cấy vô khuẩn cấy vi khuẩn không quá 24h cấy vào tube TSB 6,5% NaCl và ủ 35 0 C, 18-24h Kết quả [+]: vi khuẩn làm đục môi trường
Hình 14: Thử nghiệm Bile esculine
SVTH Cao Bảo Hiền - 30760740 Trang 38
• Thử nghiệm Optochin và Bacitracin:
Dùng khuyên cấy hoặc que gòn cấy Ziczac vi khuẩn trên môi trường BA, dùng kẹp đặt đĩa Optochin và Bacitracin lên vùng cấy Ủ 35 0 C, 18-24h
Nhạy cảm với Optochin khi vòng vô khuẩn >= 14 mm
Với Bacitracin khi có bất kỳ vòng vô khuẩn nào
• Thử nghiệm CAMP (Christie, Atkins, and Munch- Peterson):
Nguyên tắc: yếu tố CAMP là một chất ngoại bào được sản xuất bởi
Streptococci nhóm B có tác dụng hợp đồng tiêu huyết với β- lysin của S aureus
+ Trên hộp thạch máu cừu BA, dùng que cấy lấy 1 quệt vi khuẩn S aureus có men tiêu huyết β- lysin cấy 1 vạch vào giữa mặt thạch
+ Sau đó dùng vòng cấy lấy 1 quệt vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β thử nghiệm, cấy 1 đường thẳng góc với vạch cấy S aureus và ngừng cách vạch cấy S aureus khoảng 2-3mm