coli chiếm đa số các trường hợp nhiễm khuẩn cấp tính ở những bệnh nhân không có bất thường hoặc sỏi ở đường tiểu.. Nhiễm trùng đường tiểu là một trong những hội chứng thường gặp nhất tại
TỔNG QUAN
THUỐC KHÁNG SINH
Kháng sinh là một chất do vi sinh vật tiết ra, ức chế hay giết chết vi sinh vật khác (vi khuẩn đích) Kháng sinh có tác động chống lại sự sống của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức độ phân tử hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết của đời sống vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa
Kháng sinh có tác dụng đặc hiệu, nghĩa là mỗi loại kháng sinh sẽ tác động lên một nhóm vi khuẩn nhất định Do đó, các loại kháng sinh khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau đối với các loại vi khuẩn khác nhau.
Ngày nay, kháng sinh ngoài việc được trích ly từ động vật, thực vật, vi sinh vật còn có thể được bằng phương pháp hóa học
Dựa vào nguồn gốc của kháng sinh người ta chia ra làm 3 loại:
− Kháng sinh tự nhiên: là những kháng sinh do vi sinh vật tiết ra rồi được tinh khiết (Penicillin, Streptomycin, Tetracycline…)
− Kháng sinh bán tổng hợp: là kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên nhưng được gắn thêm một hay vài gốc hóa học để thay đổi phổ kháng khuẩn hay dược lực – dược động (Ampicillin, mynocycline…)
− Kháng sinh tổng hợp: là các hóa chất được tổng hợp hoàn toàn và có hiệu quả của kháng sinh (Sulfonamide, Quinolones, fluoroquinolones…)
Dựa trên tính đặc hiệu dược lý người ta xếp kháng sinh theo các họ như sau:
1.3 Cơ chế tác động của kháng sinh: [1, 7, 8, 14]
Hình 1.1: Cơ chế tác dụng của kháng sinh Ức chế sự thành lập vách tế bào: Bacitracin, Cephalosporins, Cycloserine, Penicillins, Rostocetin, Vancomycin Giai đoạn đầu của thuốc là gắn với trụ thể PBPs (Penicillinbinding protein) của tế bào Sau khi gắn vào một hay nhiều thụ thể, thuốc sẽ phong bế transpeptidase, làm ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của vách tế bào Giai đoạn tiếp theo có liên quan đến việc hoạt hóa enzyme tự tiêu (autolytic enzymes) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương, trong môi trường ưu trương tế bào bị biến đổi thành protoblast hay spheroblast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên rất dễ vỡ Ức chế tổng hợp protein: Chloramphenicol, Erythromycins, Lincomycins, Tetracyclines, Aminoglycosides Tùy loại kháng sinh sẽ có tác động khác nhau trong quá trình tổng hợp protein: làm vỡ các polysomes thành các monosomes không có khả năng tổng hợp protein, ngăn chặn các amino acid mới nối vào chuỗi peptide mới thành lập Ức chế sự tổng hợp acid nucleic: Actinomycin, Mitomycin, Nalidixic acid, Novobiocin, Rifampin, Sulfonamides…Tùy loại kháng sinh sẽ có tác động khác nhau: actinomycin gắn vào DNA tạo nên một phức hợp, phức hợp này ức chế các polymerase tổng hợp RNA tương ứng; Nalidixic acid làm phong bế enzyme DNA gyrase
− Vi khuẩn sản xuất enzyme để phá hủy hoạt tính của thuốc
− Vi khuẩn làm thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc
− Điểm gắn của thuốc có cấu trúc bị đổi
− Vi khuẩn thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc
− Enzyme hoạt tính của vi khuẩn bị thay đổi
1.4.2 Nguồn gốc của việc kháng thuốc:
1.4.2.1 Nguồn gốc không do di truyền:
Sự nhân lên của vi khuẩn là yếu tố cần thiết cho những tác động của thuốc kháng sinh Khi vi khuẩn vì lý do nào đó không nhân lên được và có thể trở thành kháng thuốc, nhưng những thế hệ sau có thể nhạy cảm trở lại [7]
Nguồn gốc không do di truyền còn do vi khuẩn mất điểm gắn đặc hiệu dành cho thuốc
1.4.2.2 nguồn gốc do di truyền:
Phần lớn các vi khuẩn kháng thuốc là do thay đổi về mặt di truyền và là hậu quả của quá trình chọn lọc bởi thuốc kháng sinh Đề kháng do nhiễm sắc thể: do đột biến ngẫu nhiên của một đoạn gen kiểm soát tính nhạy cảm đối với một loại kháng sinh Sự có mặt của thuốc được xem là một cơ chế chọn lọc, ức chế vi khuẩn nhạy cảm và tạo thuận lợi cho vi khuẩn đột biến kháng thuốc phát triển Đột biến nhiễm sắc thể thông thường nhất là do thay đổi cấu trúc thụ thể dành cho thuốc Đề kháng ngoài nhiễm sắc thể: yếu tố R là một lớp của plasmid mang những gen kháng 1 hay nhiều loại kháng sinh và những kim loại nặng Các gen này kiểm soát việc sản xuất những enzyme phá hủy thuốc
Vi khuẩn kháng với một loại thuốc nào đó cũng có thể kháng với những thuốc khác có cùng cơ chế tác động Mối liên hệ như vậy thường gặp ở những thuốc có thành phần hóa học giống nhau, nhưng cũng có thể thấy giữa những thuốc không liên hệ về cấu trúc hóa học
Vấn đề kháng thuốc trong những bệnh nhiễm khuẩn có thể giảm thiểu bởi những cách sau:
− Duy trì liều lượng đủ cao để ức chế vi những vi khuẩn ban đầu lẫn những vi khuẩn đột biến
− Sự dụng đồng thời 2 loại thuốc không có phản ứng chéo, mỗi loại sẽ làm giảm thiểu những chủng đột biến đối với loại thuốc kia
− Không cho vi khuẩn quen thuốc có giá trị đặc biệt bằng cách hạn chế dùng
1.4.5 Nguy hiểm của việc sử dụng kháng sinh bừa bãi:
− Quá mẫn, sốc phản vệ, nốt đỏ ngoài da, sốt, viêm gan ứ mật…
− Che lấp tình trạng nhiễm khuẩn nặng mà không loại bỏ được vi khuẩn nên quá trình nhiễm khuẩn vẫn tiếp tục
− Tác động trực tiếp do độc tính của thuốc, nhất là thuốc được sử dụng một thời gian dài
Phát triển của vi khuẩn kháng thuốc do loại bỏ vi khuẩn nhạy cảm
1.5 Tình hình đề kháng kháng sinh: [4, 7, 8, 14]
Ngày nay, tỷ lệ kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh gia tăng với tốc độ cao và không ngừng Nhiều kháng sinh từ trước được xem là phương pháp hữu hiệu trong việc trị liệu thì nay một số đã trở nên vô tác dụng đối với vi khuẩn
Trước sự tấn công của vi khuẩn, các nhà bác học đã tìm ra nhiều loại kháng sinh hữu hiệu hơn, tiêu diệt được cả những loài vi khuẩn kháng thuốc Tuy nhiên một số loại chỉ sử dụng được trong khoảng thời gian ngắn thì đã bị một số vi khuẩn kháng thuốc Những kháng sinh thuộc thế hệ thứ 3 như Cephalosporindines, thứ 4 như Aminoglycosides, Quinolones đều đã bị kháng từ 25 – 50 %
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã báo động về nguy cơ vi khuẩn gây bệnh ngày càng kháng kháng sinh, tỷ lệ kháng có nơi lên đến 50 % với các loại kháng sinh thế hệ mới Rất nhiều hội nghị quốc tế trong và ngoài nước đã bàn thảo về vấn đề trên và tìm cách khắc phục
Theo một nghiên cứu khác năm 2002 trên 40 bệnh viện tại Tây Ban Nha, tỷ lệ
E.coli sinh ESBL là 0 – 2,4 % có khả năng bất hoạt các cephalosporin phổ rộng như:
Một nghiên cứu khác của Joshi SG năm 2002, cho thấy rằng tỷ lệ vi khuẩn gram âm kháng Ceftaxime là 25 – 75 %, Gentamycin là 23 – 69 %
Theo báo cáo của NNIS năm 2004, tỷ lệ kháng Cephalosporins thế hệ 3 của
K.pneumoniae là 20,6 %, Enterobacter.spp là 31,1 %, E.coli là 5,8 %
Theo Lâm Thị Mỹ (1994) tỷ lệ trực khuẩn gram âm kháng Ampicillin là 95 %, Cefotaxime là 75 % và Gentamycin là 87 %
Có 82,1 % các chủng Klebsiella kháng β - Lactam theo nghiên cứu của Trần
Tỷ lệ vi khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng Cefotaxime là 66,7 %,
Ceftriaxone là 65,6 %, Gentamycin là 88,5 % (theo nghiên cứu của tác giả Võ Công Đồng năm 2002 – 2003)
According to a survey conducted at Tu Du Hospital in the fourth quarter of 2006, antimicrobial resistance rates among E coli, Enterobacter spp., Staphylococcus spp., and Streptococcus spp to antibiotics such as amoxicillin (78–100%), cephalexin (58–88%), and doxycycline (32%) were found to be high.
Theo khảo sát của BS Trương Anh Dũng và cộng sự tại bệnh viện nhân dân Gia Định (4/2006 – 4/2008) thì tỷ lệ kháng kháng sinh của các vi khuẩn đường ruột đối với Cotrimoxazol là 70 – 80 %, Cephalexin là 58 – 79 %, Ciprofloxacine là 35 – 70 % Đối với các cầu khuẩn gram dương thì tỷ lệ kháng đối Cotrimoxazol là 48 – 80 %, Oxacilline là 47 – 81 %
VI KHUẨN THƯỜNG GẶP TRONG NHIỄM TRÙNG TIỄU
E.coli là trực khuẩn gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng
E.coli có vỏ polysaccharide, không sinh nha bào
E.coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản Nhiệt độ thích hợp 37 0 C, pH thích hợp là 7 - 7,2
E.coli lên men nhiều loại đường sinh axit và sinh hơi như: Glucose, lactose; indol dương tính, đỏ methyl dương tính, VP âm tính, citrat âm tính, urease âm tính,
Gồm 4 loại kháng nguyên : O, K, H, F và ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng Nội độc tố đường ruột gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt đều gây tiêu chảy
Loại E coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độc mạnh hơn loài không giáp mô
Biểu hiện của nhiễm khuẩn do E.coli có đặc điểm: bắt đầu sốt đột ngột và rét run, khó thở hoặc hạ huyết áp Tác nhân này thường liên quan tới ổ nhiễm trùng từ đường tiết niệu – sinh dục, tiêu hóa và đường mật
Enterobacter có khả năng di động Trong số các loại Enterobacter đã biết thì 2 loài E cloacae và E aerogenes được biết nhiều nhất và E cloacae được chọn là vi khuẩn điển hình cho nhóm này
Vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, nhiệt độ thích hợp là 37 0 C Trên MC có khóm lớn bóng, màu hồng hoặc không màu, nhớt Trên EMB, SS tạo khóm đỏ hồng
Trên KIA tạo màu vàng/vàng (lên men glucose, lactose), sinh hơi, không sinh
H2S Các phản ứng âm tính: Indol, Methyl Red, Oxydase, hoàn nguyên nitrate thành nitrite Các phản ứng dương tính: Catalase, VP, Citrate, di động
Proteus gồm 4 loài: P vulgaris, P mirabillis, P morganni, P rettgeri Có khả năng di động
Hiếu khí nhưng có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí Dễ mọc trên môi trường đặc, không tạo thành khóm mà có khả năng mọc lan trên bề mặt thạch máu, trông như lớp sóng đồng tâm, tính chất này cản trở cho việc phân lập các vi khuẩn khác Trên môi trường lỏng tạo thành màng trên bề mặt
Không lên men glucose và lactose Có sinh hơi Có khả năng hóa lỏng gelanine Các phản ứng âm tính: Indol, hoàn nguyên nitrate thành nitrite Các phản ứng dương tính: VP, Citrate, di động, Methyl Red, H2S, Phenylalanin
2.1.3.4 Kháng nguyên và độc tố:
Dựa vào kháng nguyên O và H, Proteus được chia thành 100 type huyết thanh
Trực khuẩn Gram âm, kích thước thay đổi thông thường nhỏ và mảnh, 1,5 - 3 mm, thường họp thành đôi và chuỗi ngắn, rất di động, có lông ở một đầu, hiếm khi tạo vỏ và không tạo nha bào
Vi khuẩn hiếu khí, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang Nhiệt độ thích hợp 30 - 37 0C, nhưng có thể phát triển được ở 41 0 C pH thích hợp là 7,2-7,5 Khuẩn lạc thường lớn, trong, bờ đều hoặc không đều, có thể có ánh kim loại, màu xám nhạt trên nền môi trường màu hơi xanh, mùi thơm Cũng có thể gặp loại khuẩn lạc xù xì hoặc nhầy P aeruginosa có thể tiết ra các loại sắc tố:
− Pyocyanin: là loại sắc tố phenazin có màu xanh lơ, tan trong nước và chlorofoc, khuếch tán ra môi trường nuôi cấy làm cho môi trường và khuẩn lạc có màu xanh Sắc tố này sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không khí Chỉ có trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố pyocyanin
Pyoverdin là sắc tố huỳnh quang phát màu xanh khi chiếu tia cực tím 400 nm, có tính tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc Ngoài trực khuẩn mủ xanh, một số loài Pseudomonas khác cũng tạo thành sắc tố này.
− Pyorubrin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh ra sắc tố này
− Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố này
Vi khuẩn không lên men đường glucose, lactose mà chỉ oxy hóa đường Các phản ứng âm tính: VP, Indol, MR, H2S Các phản ứng dương tính: Oxydase, Urease, Catalase, Citrate, di động, hoàng nguyên nitrate thành nitrite
Thử nghiệm oxydation – fermentation (oxy hóa – lên men) dùng để phân biệt các loại Pseudomonas
2.1.4.4 Kháng nguyên và độc tố:
Kháng nguyên O chịu nhiệt, bản chất hóa học là lypopolysaccharide Dựa vào kháng nguyên này mà người ta chia Pseudomonas ra làm 12 nhóm
Kháng nguyên H không chịu nhiệt, là kháng nguyên tiêm mao Vì khó khăn trong việc điều chế nên việc đinh type huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi
Klebsiella thường hoại sinh trong các nguồn cung cấp nước, một vài chủng cộng sinh đường ruột ở người Dòng Klebsiella có rất nhiều loại, trong đó loại
Klebsiella gây bệnh thường gặp là Klebsiella pneumoniae
Trong bệnh phẩm K pneumoniae có hình trực khuẩn ngắn, gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn này có nhiều hình thể, có khi như cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động, không sinh nha bào
NGUYÊN NHÂN GÂY NHIỄM TRÙNG TIỂU
5.1.1 Nhiễm trùng đường tiết niệu dưới: gồm có
Viêm niệu đạo và tuyến tiền liệt
Nhiễm trùng đường niệu dưới có đặc điểm là nhiễm trùng xảy ra ở bề mặt của niêm mạc, vi khuẩn không tiếp xúc với máu nên trên bề mặt của vi khuẩn không có kháng nguyên Vì vậy, thử xét nghiệm huỳnh quang (test ABC) sẽ âm tính Do đó trong điều trị chỉ cần cho kháng sinh từ 1 đến 3 ngày
5.1.2 Nhiễm trùng đường tiết niệu trên:
Nhiễm trùng đường niệu trên, vi khuẩn xâm nhập vào chủ mô thận, có tiếp xúc với máu, nên vi khuẩn đó được bao bọc bởi kháng thể Thử test ABC sẽ dương tính Điều trị phải lâu dài hơn, phải cho kháng sinh từ 3 đến 4 tuần
5.2 Khả năng chống đỡ của bàng quang:
Bàng quang luôn được rửa sạch bởi nước tiểu mới vô trùng, vì lúc đi tiểu, bàng quang tống hết nước tiểu lẫn vi khuẩn ra ngoài và nước tiểu từ thận xuống là vô trùng
Khả năng thực bào của niêm mạc bàng quang, số ít vi khuẩn còn dính trên niêm mạc bàng quang sẽ bị niêm mạc phá hủy Nhưng nếu niêm mạc bị viêm nhiễm nặng do vi khuẩn xâm nhập với một số lượng quá lớn thì khả năng này bị giảm sút trầm trọng đưa đến viêm bàng quang cấp
5.3 Nguyên nhân của việc duy trì sự nhiễm trùng:
Có nước tiểu tồn lưu Hiện tượng này có thể là do:
Bệnh làm cho cổ bàng quang không mở ra được tốt lúc đi tiểu như có bướu ở tuyến tiền liệt, bàng quang hỗn loạn thần kinh
Nước tiểu trào ngược lên niệu quản Lúc bệnh nhân đi tiểu, một số nước tiểu trào ngược lên niệu quản và sau đó số nước tiểu này trở lại bàng quan làm cho vi khuẩn có thời gian sinh sản.
ĐƯỜNG XÂM NHẬP CỦA VI KHUẨN
6.1 Qua đường ống từ niệu đạo:
Vi khuẩn thường có quanh vùng hậu môn và âm hộ (ở nữ), nhất là trường hợp có bệnh phụ khoa Từ đó vi trùng xâm nhập vào bàng quang qua đường niệu đạo Đường xâm nhập này rất dễ đối với phụ nữ vì có đường niệu đạo rộng, ngắn và có điều kiện thuận lợi (gần hậu môn, lúc giao hợp) cho vi khuẩn xâm nhập Ở nam giới, do có đường niệu đạo dài, hẹp và xa hậu môn hơn, nên mức độ nhiễm trùng thấp hơn, ngoài ra những chất tiết ra từ tuyến tiền liệt cũng có tính chất kháng khuẩn
Từ bàng quang, vi khuẩn khó thâm nhập ngược chiều lên đường niệu trên nhờ cớ một nếp niêm mạc ở lỗ niệu quản, có tác dụng như một chiếc van một chiều làm cho nước tiểu không trào ngược được từ bàng quang lên niệu quản Tuy nhiên, nước tiểu có thể trào ngược được là do:
− Viêm bàng quang cấp: niêm mạc bàng quang bị viêm, nếp niêm mạc ở lỗ niệu quản bị phù nề không đậy kín được lúc bệnh nhân tiểu tiện Khi đó, nước tiểu có chứa vi khuẩn sẽ trào ngược lên niệu quản
− Lỗ niệu quản bị hở do bị tật bẩm sinh
− Bàng quang chống đối lâu ngày như trường hợp hẹp niệu đạo, xơ chai cổ bàng quang hay bướu tuyến tiền liệt
Do áp lực nước tiểu cao trong bàng quang, các nếp niêm mạc ở lỗ niệu quản có thể bị phá vỡ, cho phép nước tiểu trào ngược lên niệu quản và thậm chí đến bể thận.
Trong thực nghiệm, các nhà nghiên cứu thấy rằng khi tiêm vi khuẩn vào trong máu, vi khuẩn sẽ bị hệ bạch cầu phá hủy nhanh chóng và chỉ có vi khuẩn lao là có thể gây nhiễm trùng niệu qua đường máu Tuy nhiên, đối với E coli có thể gây bệnh trong
− Có sự cản trở đường lưu thông của nước tiểu như hẹp hay sỏi niệu quản
− Có gây chấn thương ở thận trước khi tiêm vi khuẩn vào máu
Các đường xâm nhập khác của vi khuẩn vào nước tiểu vẫn còn nhiều tranh cãi Hệ bạch dịch có thể góp phần gây nhiễm trùng đường tiết niệu Một số nghiên cứu chỉ ra khả năng vi khuẩn xâm nhập từ ruột già thông qua liên kết chặt chẽ về mặt giải phẫu giữa hệ tiết niệu và đại tràng Thực tế, bệnh nhân mắc nhiễm trùng đường tiết niệu tái phát thường được khuyến cáo điều hòa hệ ruột, mặc dù mối liên quan này vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng.
TRIỆU CHỨNG
Triệu chứng lâm sàng: bệnh nhân thường có triệu chứng khó tiểu, tiểu nhiều lần, tiểu gấp, nước tiểu đục, có mùi hôi, có mủ hoặc máu, sốt, lạnh run, đau hông, lưng kèm theo các triệu chứng viêm bàng quang
Triệu chứng nhiễm trùng tiểu ở trẻ nhỏ: tiêu chảy, khóc quá mức, chán ăn, sốt, buồn nôn, sốt kéo dài… Ở trẻ lớn : triệu chứng điển hình là tiểu rắt, tiểu buốt, nước tiểu đục đôi khi có máu hoặc mùi bất thường, nếu viêm đài thận bể mạn thì thường không có triệu chứng Ở người lớn: Nhiễm trùng đường tiểu dưới thường đau lưng, tiểu máu, nước tiểu đục, tiểu khó mặc dù rất muốn tiểu, sốt, tiểu nhiều lần, cảm giác toàn thân không được khỏe, tiểu đau, giao hợp đau Nhiễm trùng đường tiểu trên thường ớn lạnh, sốt cao, buồn nôn, nôn mửa, đau vùng hạ sườn.
BIẾN CHỨNG VÀ NGUY CƠ NHIỄM TRÙNG TIỂU
− Tồn tại lâu dài của nhiễm trùng tiểu
− Phá hủy nhu mô thận
− Viêm thận bể thận cấp
− Trẻ em có trào ngược bàng quang niệu quản có thể gây nhiễm trùng thận nhanh chóng dẫn đến suy thận mãn tính
− Phụ nữ có thai bị nhiễm trùng tiểu có thể gây sinh non, sẩy thai, nhiễm trùng sơ sinh.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
Tủ cấy Ống nghiệm, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle…
MHA (Mueller Hinton Agar): là môi trường thực hiện kháng sinh đồ và các đĩa kháng sinh dùng để thử nghiệm sự nhạy cảm của kháng sinh của của vi khuẩn
MSA (Mannitol Salt Agar): thành phần muối cao và có chứa phenol – red làm chất chỉ thị màu (chuyển từ đỏ sang vàng khi pH môi trường chuyển từ kiềm sang axít)
BA (Blood Agar) : là môi trường thạch máu cừu, trên môi trường thạch máu có thể phân biệt 3 dạng tiêu huyết : tiêu huyết α, tiêu huyết β và tiêu huyết γ
Uri Selected: là môi trường đặc trưng để phân lập vi khuẩn trong nước tiểu Môi trường thực hiện các phản ứng sinh hóa: CITRATE, SIM, MR – VP, KIA, UREASE, Test định danh ID 32 theo máy định danh.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mô tả cắt ngang trên bệnh phẩm nhiễm trùng tiểu từ tháng 2/2011 – 07/2011
− Phân lập và đinh danh vi khuẩn từ các mẫu nước tiểu theo thường quy của Tổ chức Thế giới
− Xác định mức độ kháng kháng sinh của các vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp Kirby – Bauer theo hướng dẫn của NCCLS – 2004 Sử dụng đĩa kháng sinh của Công Ty Nam Khoa và Bio – Rad
− Xử lý kết quả theo phương pháp thống kê y học
Tiêu chí bệnh phẩm: bệnh phẩm nghiên cứu là nước tiểu của những bệnh nhân được chuẩn đoán là nhiễm trùng tiểu hoặc đang theo dõi nhiễm trùng tiểu
Tiêu chí loại trừ: tất cả các loại bệnh phẩm khác
Soi tươi cặn nước tiểu Cấy định lượng trên BA và Uri tìm bạch cầu ủ 35 0 C/CO2, 24h
Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát quy trình xét nghiệm vi sinh nước tiểu
Lấy nước tiểu bằng cách thông tiểu vào buổi sáng sớm, điều kiện vô khuẩn
(không tiến hành định danh và kháng sinh đồ)
>10 5 /ml nước tiểu và lớn hơn 2 loại khuẩn lạc (không tiến hành định danh và kháng sinh đồ)
>10 5 /ml nước tiểu và nhỏ hơn hoặc bằng 2 loại khuẩn lạc
Kháng sinh đồ Kết quả Định danh
Rữa sạch vùng quanh ống tiểu 2 lần bằng xà phòng và nước hoặc bằng một chất sát khuẩn nhẹ, sau đó rửa sạch lại bằng nước vô khuẩn sạch
Cho bệnh nhân đi tiểu, bỏ phần nước tiểu đầu tiên Hứng nước tiểu sau đó bỏ vào chai vô khuẩn có nắp vặn, bỏ ra ngoài đoạn cuối vài ml Gửi bệnh phẩm đến phòng thí nghiệm
Dùng que cấy vòng (tỷ lệ 1/1000 ml) chấm vào lọ nước tiểu Sau đó, cấy ria với đường cấy hình hàng rào trên thạch BA và Uri Ủ đĩa BA trong tủ CO2 và đĩa Uri trong tủ ấm
Khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu crystal violet và một chất gắn màu iodine, nếu ta tẩy màu bằng cồn 95%, có một số vi khuẩn vẫn giữ màu tím của crystal violet, đó là nhóm Gram (+) Một số khác tẩy mất màu tím vì màng tế bào thiếu chất chuyên biệt dùng kết hợp với crystal violet (peptidoglycan), đó là cầu khuẩn Gram (-)
Khi nhuộm lại với dung dịch safranin 0.5%, nhóm vi khuẩn Gram (+) vẫn giữ màu tím, còn nhóm vi khuẩn Gram (-) sẽ bắt màu hồng
Cố định vi khuẩn trên lame qua ngọn lửa đèn cồn
Phủ dung dịch Crytal violet lên phiến, chờ 1 phút, rửa nước
Phủ dung dịch Lugol lên phiến, chờ 2 phút, rửa nước và nghiêng kính cho ráo Tẩy cồn – acetol đến khi vừa hết vết tím, rửa nước và nghiêng kính cho ráo Nhuộm lại với dung dịch safranin trong 30 giây, rửa nước và để ráo
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím; vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng
Hình 2.2: Các bước tiến hành nhuộm Gram và kết quả nhuộm Gram
2.2.3.2 Phương pháp định danh trực khuẩn Gram (-):
Ta tiến hành định danh bằng bộ trắc nghiệm sinh hóa: KIA, CITRATE, SIM,
Bảng 2.1: Các test sinh hoá và cách đọc kết quả
Thuốc Thử Đọc Kết Quả
Lên men Glucose Không Phần sâu vàng Phần sâu đỏ
Lên men Lactose Không Phần nghiêng vàng Phần nghiêng đỏ
Sinh gas Không Có gas Không gas
Sinh H2S Không Đen Không đen
Khả năng di động Không Hơi đục Trong suốt
Sinh Indol Kovac Vòng màu đỏ Vòng màu vàng
3 Simmon’ s Citrate Sử dụng Citrate Không Xanh biển Xanh lá cây
4 MR Khả năng lên men
5 Đĩa Ure Urease Không Màu hồng cánh sen Không màu
Bảng 2.2: Hệ thống định danh một số vi khuẩn thường gặp
Glucose Lactose H 2 S Gas Indol Di động Citrate
Ký hiệu: (+): dương tính (+/-): đa số dương tính
(-): âm tính (-/+): đa số âm tính
2.2.3.3 Phương pháp định danh cầu khuẩn Gram (+):
Chọn khóm khuẩn nghi ngờ trên thạch BA, tạo khóm tròn ướt, có thể có hay không có vòng tiêu huyết
Xác định Staphylococcus bằng thử nghiệm Catalase (+) và Oxydase (-)
Sau đó tiến hành phân biệt S aureus và Staphylococci coagulase (-) bằng thử nghiệm coagulase
Trong nhóm Stayphylococci coagulase (-) dùng thử nghiệm Novobiocin để phát hiện S saprophyticus và Staphylococci khác
Trong nhóm Staphylococci khác sau thử nghiệm Novobiocin, tiến hành thử nghiệm Urease để phân biệt S epidermidis, S simulans (cho kết quả dương tính) và S captidis, S hemolyticus (cho kết quả âm tính)
Mục đích: chẩn đoán phân biệt khóm vi khuẩn Staphylococcus với khóm vi khuẩn Streptococcus
Nguyên tắc: Staphylococci có emzyme catalase sẽ phóng thích O2 từ nứơc oxy già tạo hiện tượng sủi bọt
Cách tiến hành: lấy khóm khuẩn đặt trên lame, sau đó nhỏ H2O2 (3%) lên trên khóm khuẩn
Kết quả: Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn → catalase (+) Không có hiện tượng sủi bọt → catalase (-)
Nguyên tắc: Dùng phát hiện có enzyme oxydase hay không
Cách tiến hành: lấy khóm khuẩn đặt trên lame, cho một ít nước muối sinh lý chỗ phết vi khuẩn, sau đó đặt đĩa oxydase lên
− Vết khuẩn chuyển sang màu tím đen là dương tính → Micrococus
− Vết khuẩn không chuyển màu làm âm tính → Staphylococci
Enzyme coagulase ở S aureus là một dấu hiệu quan trọng giúp phân biệt với các loài Staphylococcus khác Coagulase tồn tại dưới hai dạng: liên kết và tự do Khi tiếp xúc với huyết tương, coagulase liên kết sẽ gây ra phản ứng tạo cục trong khi coagulase tự do gây đông đặc Thử nghiệm này đóng vai trò thiết yếu trong việc xác định S aureus do khả năng đông tụ huyết tương của chúng.
Trên lame: tìm coagulase liên kết
Bước 1: cho vài giọt huyết tương thỏ lên Lame
Bước 2: dùng que cấy vô khuẩn, lấy một khóm vi khuẩn muốn thử, cho vào và khuấy cho vi khuẩn trải đều
Bước 3: đọc kết quả: nếu có kết tụ thì phản ứng dương tính (+), ngược lại hỗn hợp đồng nhất thì âm tính (-)
Trong ống nghiệm: tìm coagulase tự do ( kỹ thuật trên ống nghiệm cho kết quả chắc chắn hơn)
Lấy 1 ống nghiệm có chứa 0.5ml vi khuẩn, sau đó cho 0.5ml huyết tương thỏ vào ống nghiệm trên, trộn lẫn huyết tương và vi khuẩn Đem ủ cách thủy 35 0 C/4h
Kết quả: Sau 1 – 4h có hiện tượng đông đặc huyết tương → thử nghiệm coagulase (+), ngược lại (-)
Hình 2.4: Thử nghiệm coagulase trong ống nghiệm và trên lame.
Nguyên tắc: S saprophyticus có khả năng đề kháng novobiocin
Dùng tăm bông đánh đều vi khuẩn Staphylococcus Coagulase (-) lên mặt thạch dinh dưỡng, chờ mặt thạch khô, đặt đĩa novobiocin lên vùng đã phết vi khuẩn Đem ủ ở 35 0 C/18 – 24h
− Đường kính vô khuẩn < 16mm → vi khuẩn kháng novobiocin → kết luận là S saprophyticus
− Đường kính vô khuẩn > 16mm → nhạy cảm → Staphylococcus khác
Hình 2.5: Quy trình định danh nhóm Staphylococci
Mục đích: Quan sát và ghi nhận phản ứng tiêu huyết quang các khóm khuẩn trên thạch máu Từ đó định hướng và lựa chọn các thử nghiệm cần thực hiện tiếp theo
Kết quả: Tùy loại chuỗi cầu khuẩn sẽ cho 1 trong 3 kiểu tiêu huyết sau:
Tiêu huyết α (tiêu huyết không hoàn toàn): hồng cầu bị ly giải không hoàn toàn, tạo nên vùng tiêu huyết nhỏ, mờ, hơi màu xanh
Tiêu huyết β (tiêu huyết hoàn toàn) : hồng cầu bị ly giải hoàn toàn, tạo nên vòng tiêu huyết rộng, sáng và trong bao quang khóm vi khuẩn trên thạch máu
Cầu khuẩn Gram (+) xếp chuỗi rời rạc Catalase (+)
Tiêu huyết γ (không tiêu huyết) : hồng cầu không bị ly giải nên không tạo ra vòng tiêu huyết
Th ử nghi ệ m Taxo P (th ử nghi ệ m nh ạ y c ả m Optochin):
Mục đích: để phân biệt Pneumococcus với các Streptococci tiêu huyết α khác (S.viridans)
Nguyên tắc: Pneumococcus nhạy cảm với optochin
Cách tiến hành: Dùng tăm bông vô trùng, lấy 1 khóm vi khuẩn rồi phết trên thạch BA Dùng kẹp vô khuẩn lấy 1 đĩa Optochin (Taxo P) đặt lên giữa vùng cấy Ủ hộp BA thử nghiệm trong bình nến ở 35 0 C/24h
Kết quả: Vi khuẩn nhạy cảm với Optochin có đường kính vòng vô khuẩn > 13mm quang đĩa O và có thể định danh Streptococci tiêu huyết α này là S pneumonia
Mục đích: có thể xác định Streptococci thử nghiệm này không phải nhóm A hay B
Sử dụng tăm bông vô trùng lấy mẫu vi khuẩn, phết lên thạch BA Đặt đĩa Bactrim lên giữa vùng cấy bằng kẹp vô trùng Ủ hộp BA trong bình nến ở nhiệt độ 35 độ C trong vòng 24 giờ để kiểm tra kết quả.
Kết quả: Vi khuẩn nhạy cảm với Bactrim có vòng vô khuẩn > 15mm quanh đĩa Bactrim và có thể xác định Streptococci thử nghiệm này không phải nhóm A hay B
Mục đích: xác định Streptococci thử nghiệm này là Streptococci nhóm D
Nguyên tắc: Streptococci nhóm D có khả năng thủy phân Esculin (dưới điều kiện môi trường chứa 4% muối mật) để cho ra Glucose và Esculetin Esculetin sẽ phản ứng với muối Fe cho ra màu nâu đậm hay đen trên bề mặt môi trường
Tiến hành cấy que cấy vòng lấy một khóm vi khuẩn mọc không quá 24 giờ trên môi trường BA, cấy hình zig - zag với đường cấy dày và sít nhau lên mặt nghiêng thạch hay tube thạch Bile esculin rồi ủ ở nhiệt độ 35 độ C trong 24 giờ.
Kết quả: Xuất hiện màu nâu đậm hay đen trên bề mặt môi trường là Bile esculin dương tính và kết luận vi khuẩn Streptococci nhóm D
Hình 2.6: Thử nghiệm Bile – Esculin
Mục đích: phân biệt Enterococci và Non enterococci trong Streptococci nhóm D
Nguyên tắc: Enterococci có thể dung nạp NaCl 6.5% hay có thể mọc được trên môi trường này
Dùng que cấy vòng lấy 1 cấy khóm vi khuẩn mọc không quá 24h trên môi trường BA, cấy vào môi trường vào môi trường TSB bổ sung 6.5% NaCl Ủ 35 0 C/24h
Kết quả: dung nạp NaCl 6.5% khi vi khuẩn mọc được trong môi trường Vi khuẩn Streptococci nhóm D (bile esculin dương) nếu dung nạp được NaCl 6.5% thì định danh là S faecalis Không dung nạp thì định danh là S faecium
Th ử nghi ệ m Taxo A (th ử nghi ệ m nh ạ y c ả m v ớ i Bacitracin)
Mục đích: định danh Streptococci tiêu huyết β này là Streptococci tiêu huyết β nhóm A
Nguyên tắc: Streptococci tiêu huyết β nhóm A có khả năng nhạy cảm với Bacitracin
Cách tiến hành: Dùng tăm bông lấy 1 khóm vi khuẩn Streptococci tiêu huyết β mọc không quá 24h phết đều trên mặt thạch BA Dùng kẹp vô khuẩn lấy 1 đĩa Bacitracin (Taxo A) đặt lên giữa vùng cấy Ủ 35 0 C/24h
Kết quả: Vi khuẩn nhạy với Bacitracin khi có vòng vô khuẩn quanh đĩa Bacitracin (không cần đo đường kính vòng vô khuẩn) → Streptococci tiêu huyết β nhóm A
Th ử nghi ệ m CAMP (Christie, Atkins, and Munch- Peterson)
Mục đích: dùng để định danh Streptococci tiêu huyết β là nhóm B ( S agalactiae)
Nguyên tắc: yếu tố CAMP là một chất ngoại bào được sản xuất bởi
Streptococci nhóm B có tác dụng hợp đồng tiêu huyết với β- lysin của S aureus
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
KẾT QUẢ
Trong số 429 mẫu nước tiểu chúng tôi khảo sát của những bệnh nhân được chuẩn đoán là nhiễm trùng tiểu hoặc đang theo dõi nhiễm trùng tiểu từ đa khoa và bệnh phòng gửi mẫu xét nghiệm
Kết quả được ghi nhận như sau:
1.1 Chuẩn đoán lâm sàng phân bố theo độ tuổi và giới tính:
Bảng 3.1: Chuẩn đoán lâm sàng phân bố theo tuổi và giới tính (n = 429) TUỔI < 5 5 – 18 19 – 50 > 50 TỔNG SỐ
Theo số liệu thống kê của bảng 3.1, tỷ lệ bệnh nhân tìm đến Bệnh viện Nhân dân Gia Định để khám hoặc điều trị nội trú vì nhiễm trùng tiểu có độ tuổi cao nhất là trên 50 (67,36%) Đặc biệt, tỷ lệ bệnh nhân nữ luôn cao hơn bệnh nhân nam ở mọi nhóm tuổi được thống kê.
BIỂU ĐỒ 3.1: KẾT QUẢ CHUẨN ĐOÁN LÂM SÀNG
BIỂU ĐỒ 3.2: KẾT QUẢ CHUẨN ĐOÁN LÂM
1.2 Kết quả định lượng vi khuẩn
Bảng 3.2: Kết quả định lượng vi khuẩn:
SỐ LƯỢNG VI KHUẨN SỐ MẪU TỶ LỆ
Trong 93 trường hợp số lượng vi khuẩn > 10 5 CFU / ml nước tiểu có:
− 75 trường hợp vi khuẩn > 10 5 CFU/ ml nước tiểu và có số loại vi khuẩn ≤ 2
− 03 trường hợp > 2 loại khuẩn lạc
− 15 trường hợp có nấm men
Chúng tôi chỉ tiến hành phân lập và nghiên cứ sự đề kháng kháng sinh INVITRO trong 75 trường hợp có số lượng vi khuẩn > 10 5 CFU/ ml nước tiểu và có số khuẩn lạc ≤ 2
BIỂU ĐỒ 3.3: KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG VI KHUẨN
1.3 Kết quả nuôi cấy phân bố theo giới tính và mức độ nhiễm khuẩn:
Bảng 3.3: Giới tính và mức độ nhiễm khuẩn:
> 10 5 CFU/ ML NƯỚC TIỂU TỔNG SỐ
GIỚI N TỶ LỆ % N TỶ LỆ % N TỶ LỆ % N TỶ LỆ %
Qua bảng 3.3 chúng tôi nhận thấy rằng: tỷ lệ bệnh nhân Nữ ở các mức độ nhiễm khuẩn điều cao hơn của Nam Cụ thể:
− Mức độ âm tính: Nữ: 49,42 %, Nam: 21, 45 %
− Mức độ gợi ý chuẩn đoán: 4,89 %, Nam: 2,56%
− Mức độ dương tính: Nữ: 14,45 %, Nam: 7,23 %
Số Lượng Vi Khuẩn/ ml nước tiểu
BIỂU ĐỒ 3.4: KẾT QUẢ NUÔI CẤY THEO GIỚI
TÍNH VÀ MỨC ĐỘ NHIỄM KHUẨN
BIỂU ĐỒ 3.5: KẾT QUẢ NUÔI CẤY
1.4 Kết quả định danh vi khuẩn phân lập được:
Bảng 3.4: Tỷ lệ các chủng vi khuẩn phân lâp được (n = 75)
NHÓM STT TÊN VI KHUẨN SỐ
Các vi khuẩn phân lập được phần lớn là các trực khuẩn Gram (–) (61,33 %) trong đó E.coli chiếm tỷ lệ cao nhất (48 %), sau đó đến các vi khuẩn Gram (–) khác Các cầu khuẩn Gram (+) cũng chiếm tỷ lệ khá cao (38,67 %)
BIỂU ĐỒ 3.6: TỶ LỆ VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC
Pseudomonas aeruginosa Enterobacter spp Klebsiella spp Enterococcus spp Staphylococcus spp Streptococcus spp
BIỂU ĐỒ 3.7: TỶ LỆ VI KHUẨN XẾP THEO NHÓM
TRỰC KHUẨN GRAM ÂM CẦU KHUẨN GRAM DƯƠNG
1.5 Kết quả đề kháng kháng sinh của E coli :
Trong 75 mẫu nước tiểu phân lập được 36 chủng E coli, kết quả khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh như sau:
Bảng 3.5: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của E coli : (n = 36)
N TỶ LỆ % N TỶ LỆ % N TỶ LỆ %
Kết quả trên cho thấy, chủng E coli có mức độ đề kháng cao đối với Ofloxacin
E colibắt đầu kháng mạnh đối với các kháng sinh thường sử dụng trong điều trị như: Tobramycin (38,89 %), Ceftriaxone (44,44 %), Cefoperazone (44,44 %).
Bên cạnh đó, Imipenem (83,33 %), Meropenem (88,90 %), Nitrofurantoin (83,33 %) vẫn còn độ nhạy cảm rất cao.
BIỂU ĐỒ 3.8: TỶ LỆ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
Pip era + T az ob ac tam
Ci pro flo xa cin
Ce fo pe raz on e
Ni tro fu ran toi n
Am pi + s ulb ac tam
1.6 Kết quả đề kháng kháng sinh của Enterococcus spp :
Trong 75 mẫu nước tiểu, chúng tôi phân lập được 18 chủng Enterococcus spp
Kết quả khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh như sau:
Bảng 3.6: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của Enterococcus spp (n = 18):
N TỶ LỆ % N TỶ LỆ % N TỶ LỆ %
Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy:
Các Enterococcus spp (+) có sự đề kháng khá cao đối với các kháng sinh như: Nitrofurantoin (61,11 %), Penicilline (77,78 %) Đặc biệt, đề kháng rất cao đối với Doxycyclin và Erythromycin (83,34 %) Đối với Neltimycin thì độ nhạy cảm vẫn còn cao (55,56 %)
Riêng đối với Levofloxacin thì độ nhạy cảm còn rất cao chiếm tỷ lệ 88,88 %
BIỂU ĐỒ 3.9: TỶ LỆ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
BÀN LUẬN
2.1 Kết quả định danh vi khuẩn:
Nhiều vi sinh vật khác nhau có thể gây bệnh nhiễm trùng tiểu Trong 75 mẫu nước tiểu đạt tiêu chuẩn vi sinh mà chúng tôi phân lập thì chiếm tỷ lệ cao nhất là E coli (48 %), cầu khuẩn Gram (+) (24 %), các trực khuẩn Gram (-) khác chiếm tỷ lệ thấp hơn Điều này cũng phù hợp so với một số kết quả nghiên cứu gần đây.
2.2 Kết quả kháng sinh đồ:
2.2.1 Sự đề kháng kháng sinh của E coli:
E colilà loại gây bệnh thường gặp nhất, nó có khả năng gây bệnh ở đường tiểu, đường máu, hệ tiêu hóa và màng não trẻ em… hiện tại đã đề kháng nhiều loại kháng sinh với tỷ lệ cao như: Ciprofloxacin (66,48 %), Ofloxacin (61,12 %)…đối với
Ceftriaxon và Cefoperazone, E coli bắt đầu có dấu hiệu kháng thuốc mạnh (44,44 %)
Do tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng gia tăng, chúng ta cần tập trung giám sát chặt chẽ tình trạng này Đồng thời, ứng dụng thêm các kháng sinh mới có độ nhạy cảm cao như Impenem, Meropenem và Neltimycin để xử lý kịp thời những trường hợp điều trị kháng sinh không hiệu quả.
2.2.2 Sự đề kháng kháng sinh của cầu khuẩn Gram (+):
Các cầu khuẩn Gram (+) trong các mẫu nước tiểu chúng tôi phân lập được xếp hàng thứ 2 sau E coli, tỷ lệ đề kháng khá cao đối với Erythromycin và Doxycycline (cùng 83.34%), Penicilline (77,78 %)…
2.2.3 Sự đề kháng kháng sinh của các trực khuẩn Gram (-) khác:
Số lượng mẫu nghiên cứu của chúng tôi còn thấp nên số lượng các trực khuẩn Gram (-) khác khi tiến hành phân lập không nhiều Tuy nhiên sự đề kháng với nhiều loại kháng sinh của các vi khuẩn này cũng đang dần tăng cao Vì thế, cần có sự thận trọng trong việc điều trị.