thực trạng về tình hình đề kháng kháng sinh của salmonella typhi tại bệnh viện đa khoa tỉnh an giang

Biểu đồ 4: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch và thử nghiệm MIC đối với Ciprofloxacin.. Biểu đồ 5: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC MỞ BÁN CÔNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài:

Thực trạng về tình hình đề kháng kháng sinh của Salmonella typhi tại Bệnh viện đa khoa tỉnh An Giang

Luận văn tốt nghiệp cử nhân khoa học

Chuyên ngành: Vi sinh Y học

Giáo viên hướng dẫn : TS.BS Phạm Hùng Vân

Cử nhân Phạm Thái Bình

Sinh viên thực hiện : Hoàng Tường Vi

Khoá học : 2001 – 2005

Tp.HCM, Tháng 07/2005

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1: Quy trình định danh S.typhi bằng IDS 14GNR

Hình 2.2: Kết quả kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch

Hinh 2.3: Kết quả kháng sinh đồ theo thử nghiệm MIC

DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Tỷ lệ bệnh nhân theo độ tuổi và giới tính

Bảng 2: Tỷ lệ đề kháng của 14 loại kháng sinh

Bảng 3: Tỷ lệ đề kháng đa kháng sinh

Bảng 4: Mô hình đa kháng

Bảng 5: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch và thử nghiệm MIC đối với Ciprofloxacin

Bảng 6: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch và thử nghiệm MIC đối với Ofloxacin

Bảng 7: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch và thử nghiệm MIC đối với Nalidixid acid

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Tỷ lệ bệnh nhân theo độ tuổi và giới tính

Biểu đồ 2: Tỷ lệ đề kháng của 14 loại kháng sinh

Biểu đồ 3: Tỷ lệ đề kháng đa kháng sinh

Biểu đồ 4: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch và thử nghiệm MIC đối với Ciprofloxacin

Biểu đồ 5: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch và thử nghiệm MIC đối với Ofloxacin

Biểu đồ 6: Tương quan giữa kết quả phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuếch tán trong thạch và thử nghiệm MIC đối với Nalidixid acid

Danh muïc vieát taét

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG)

MIC Minimum Inhibitory Concentration MDR Multi – Drug Resisitance

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh thương hàn cho đến ngày nay vẫn là một trong những bệnh phổ biến trên thế giới Hàng năm có khoảng 16 triệu người mắc bệnh với khoảng 600000 ca tử vong Đây là bệnh lưu hành thường xuyên ở vùng Đông Nam Á, Trung Đông, Phi Châu, Trung và Nam Mỹ, nhất là các nước đang phát triển Ở Việt Nam, bệnh thương hàn hiện diện ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước nhưng lưu hành chủ yếu là vùng đồng bằng sông Cửu Long Tỉnh An Giang là một trong những trung tâm của vùng Đồng bằng sông Cửu Long và cũng là một trong những tỉnh thành có tỷ lệ mắc thương hàn cao nhất Việt Nam.[5,9]

Theo những công trình nghiên cứu gần đây cho thấy S typhi, tác nhân

gây bệnh thương hàn đã và đang đề kháng với những kháng sinh thông dụng trong điều trị như Nalidixid acid, Chloramphenicol, Trimethoprim / Sulfamethoxazole , Ampicillin[7,8,13,38,44] và đã có xuất hiện sự đề kháng với kháng sinh Quinolones (Ofloxacin, Ciprofloxacin ) và Cephalosporines thứ hệ 3(Ceftriaxone).[13,36,38,44] Nếu điều này trở thành hiện thực cùng với việc sử dụng kháng sinh còn nhiều bất cập như hiện nay, tất yếu sẽ có

nguy cơ lan tràn những dòng vi khuẩn S.typhi kháng Quinolones và

Cephalosporines thứ hệ 3 Đây chính là hiểm hoạ lớn trong điều trị thương hàn

Do đó, đánh giá thực trạng về tình hình đề kháng kháng sinh của

S.typhi tại Việt nam nói chung và vùng đồng bằng sông Cửu Long nói

riêng là điều bức thiết hiện nay Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu này với mục tiêu tổng quát của công trình nhằm đánh giá

tình hình đề kháng của S.typhi tại An Giang Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chuyên biệt như sau:

1 Đánh giá tình hình đề kháng kháng sinh của 222 chủng S.typhi

trên 14 loại kháng sinh

2 Đánh giá về mức độ đề kháng kháng sinh: Ofloxacin,

Ciprofloxacin, Nalidixid acid thông qua thử nghiệm MIC (Minimum Inhibitory Concentration)

PHAÀN 1

TOÅNG QUAN

1.1 BỆNH THƯƠNG HÀN

1.1.1 Khái quát

Bệnh thương hàn là bệnh gây nhiễm trùng toàn thân, với biểu hiện chính là sốt và gây viêm ruột Một số biểu hiện phụ khác cũng được tìm thấy ở người bệnh thương hàn như: lạnh run, nhức đầu, chán ăn, ho, yếu cơ, đau họng, đau cơ… có khi còn xuất hiện biểu hiện về thần kinh như lú lẫn, dễ bị kích động, mê sảng, hôn mê nhẹ… Nếu như không được điều trị kịp thời bằng kháng sinh thích hợp sẽ xuất hiện nhiều biến chứng có thể dẫn đến tử vong cho bệnh nhân như: thủng ruột, xuất huyết tiêu hoá, áp xe gan, viêm tinh hoàn, nhiễm trùng tại chỗ…

Bệnh thương hàn thường xuất hiện ở vùng Đông Nam Á, Trung Đông, Châu Phi, Trung Nam Mỹ đặc biệt là ở các quốc gia đang phát triển Những quốc gia này có chung một số đặc điểm: mức độ phát triển dân số quá nhanh, đô thị hoá nhanh chóng làm cho mật độ dân số cao, xử lý chất thải chưa tốt, cung cấp nước uống và sinh hoạt chưa đủ tiêu chuẩn vệ sinh, hệ thống y tế quá tải hoặc hoạt động chưa tốt [2]

Nguồn bệnh chủ yếu là con người Con đường lây trực tiếp hậu môn- miệng từ người mang mầm bệnh sang cho người lành[21] được ghi nhận từ rất nhiều trường hợp đã xảy ra Các nhân viên y tế cũng có thể mắc bệnh nếu như không cẩn thận khi tiếp xúc với máu, bệnh phẩm có chứa vi trùng hay sơ sót trong việc rửa tay sau khi thăm khám bệnh nhân.[2]

1.1.2 Lịch sử bệnh thương hàn

Năm 1739, Huxhmann đã tách riêng để theo dõi và nghiên cứu một số

bệnh nhân đường tiêu hoá bị sốt kéo dài ảnh hưởng đến hệ thần kinh

Năm 1804, Prost, sau đó là Petit và Serres vào năm 1811 đã phát hiện

những vết loét ở ruột non của bệnh có triệu chứng như trên

Năm 1820, Bretoneau đặt cho bệnh một tên “Dothiénentéril” có nghĩa là

bệnh đường ruột nhiễm trùng thối

Năm 1832, Louis và một số bác sĩ người Pháp khác phân biệt được sốt

thương hàn với nhiều bệnh sốt khác dựa vào biểu hiện bệnh lý ở hệ bạch huyết, ruột và lách Họ cũng mô tả được điểm hồng, biến chứng thủng ruột, xuất huyết trong bệnh thương hàn Tên thương hàn cũng bắt đầu có từ đây

Năm 1850, William Jenner phân biệt bệnh thương hàn với bệnh do chấy

rận gây nên

Năm 1873, Budd chứng minh được vai trò lây truyền bệnh thương hàn

qua thức ăn

Năm 1880, Karl J Eberth nghiên cứu trên lá lách và hạch của 40 bệnh

nhân đã phát hiện 18 trường hợp mang trực khuẩn mới và gọi tên là Bacillustyphosus - trực khuẩn thương hàn hay còn gọi là trực khuẩn Eberth Việc tìm và phát hiện ra vi khuẩn gây bệnh sốt thương hàn đã tạo cơ sở cho việc chẩn đoán xác định loại bệnh này.[5,2]

Năm 1896, Widal phát hiện sự ngưng kết huyết thanh của những bệnh

nhân đã khỏi bệnh và dùng phương pháp này để chẩn đoán bệnh gọi là phương pháp Widal.[2,4,5]

Trong nhiều năm kế tiếp dựa trên cơ sở các thành tựu của y sinh học người ta phát hiện thêm hàng trăm type huyết thanh khác của vi khuẩn thương hàn và cũng phân lập được vi khuẩn phó thương hàn A B, C

Năm 1948, kháng sinh Chlorampnenicol lần đầu tiên được đưa vào điều trị bệnh thương hàn đã giảm tỷ lệ tử vong đến 10 lần.[2,5,35]

Cùng với việc sử dụng kháng sinh trong điều trị, việc giải quyết vấn đề vệ sinh môi trường và cung cấp nước sạch cho người dân đã phần nào kiểm soát được dịch bệnh từ nửa sau thế kỷ 20 Tuy nhiên từ lúc phát hiện trường hợp kháng Chloramphenicol đầu tiên đến những trận dịch vi khuẩn thương hàn kháng thuốc ở Mexico,Việt Nam,Ấn Độ[2,4,35] tiếp sau đó đã làm cho tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc ngày càng gia tăng và đặt ra một vấn đề thách thức cho các nhà nghiên cứu khoa học

Theo TCYTTG, hiện nay bệnh thương hàn hiện nay vẫn còn là một vấn đề đòi hỏi sự quan tâm của các quốc gia và sự hợp tác của thế giới

1.1.3 Tình hình dịch tễ bệnh thương hàn trên thế giới và Việt Nam

Từ năm 1890, nếu chưa tính Trung Quốc thì mỗi năm trên thế giới có khoảng 12,5 triệu người mắc bệnh Trong đó chỉ riêng vùng Đông Nam Á đã có đến 7 triệu người mắc bệnh, phần còn lại là Châu Phi và Mỹ La Tinh.[2]

Tình hình nhiễm bệnh thương hàn của một số quốc gia đã dược ghi nhận : Trong giai đoạn 1977-1979, tính trên 100000 dân như sau :[5] Thái Lan : 22,25,Mianma: 37,2, Srilanka: 30,5, Malaysia: 5,3, Indonesia: 11,04, Bangladesh: 13,5, Ấn Độ: 22,7

Từ năm 1990 - 1994: tính trên 100000 dân, Singapore: 1 - 2, Tây Ban Nha: 2 -3, Mỹ: 4 [4]

Tại Indonesia: trong tháng 01/2002 có 589 bệnh nhân thương hàn, năm

2003 có số lượng người mắc bệnh này là 18604[45] Tại đây bệnh thương hàn là một trong năm bệnh có số lượng tử vong cao nhất.[2,35]

Theo công bố mới nhất của WHO, tính đến 31/1/2005 thì trận dich xảy ra tại Congo ( 27/09/2004 - 11/01/2005) đã có 42564 bệnh nhân thương hàn, 214 người đã tử vong.[35]

Tại Việt Nam: từ sau khi thống nhất đất nước đến cuối thập kỷ 80 số

người mắc bệnh thương hàn ở khu vực phía Nam dao động từ 5.44 - 24.49/100000 dân.Trong đó tỉnh Đồng Tháp có số người nhiễm bệnh cao nhất trên toàn quốc (có năm lên đến 197,9/100000 dân)[5]

Tỷ lệ mắc bệnh thương hàn ở khu vực phía Nam tính trên 100000 dân năm 1991 là 30,1, 1995: 107,9, 1996-1998: 64,5-59,8.[4]

Trong hai năm 1993 và 1994 đã xảy ra 3 vụ dịch thương hàn lớn ở Kiên Giang với 2456 người nhiễm, Sóc Trăng 520 người nhiễm, Thành Phố Hồ Chí Minh: 380 người nhiễm.[5]

Năm 1997, có 674 ca nhiễm thương hàn từ các vụ ngộ độc thức ăn.[14]

Trong 8 năm 1991-1998 tổng số người nhiễm thương hàn là 123651.[5]

Theo Nguyễn thị Tuyết Hoa, Tô Song Diệp,1998, khảo sát về nhiễm trùng huyết tại Bệnh viện Nhiệt Đới cho thấy hơn 90% nguyên nhân gây bệnh

là do vi khuẩn Gram âm trong đó S.typhi chiếm 67%.[7]

Trong quý I, 2005 cả nước có 370 người nhiễm thương hàn [17]

1.2 TÁC NHÂN GÂY BỆNH

S.typhi là tác nhân gây ra bệnh thương hàn Ngoài ra S.paratyphi A, S.paratyphi B, S.paratyphi C gây ra bệnh phó thương hàn có triệu chứng giống

thương hàn nên người ta gọi chung là thương hàn

1.2.1 Đặc điểm hình thái và phân loại

S.typhi là một loài thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae,

dạng trực , Gram âm, có kích thước 2-3µm * 0.4-0.6µm, không tạo giáp mô, không tạo bào tử, có khả năng di động nhờ lông mao quanh tế bào.[2,3,4,5,42ai5

Qua các yếu tố cấu tạo vỏ của vi khuẩn[26,27,28,29] người ta xác định được

các kháng nguyên của S.typhi gồm: kháng nguyên O (kháng nguyên thân),

kháng nguyên H (kháng nguyên lông), kháng nguyên Vi (kháng nguyên vỏ) Kháng nguyên O: cấu tạo bởi glucid-lipid-polypeptid Là kháng nguyên hiện diện ở tất cả các loài Salmonella và có liên hệ với nhiều độc tố Kháng nguyên này rất bền ở nhiệt độ 100oC và cồn nhưng dễ bị phá huỷ bởi formol 0.5%.[4,5] Kháng nguyên O có hơn 60 loại đơn giá O1,O2,…O12,O15…[3]

Kháng nguyên H: có bản chất là protein, bị nhiệt độ và cồn phá huỷ nhưng không thay đổi dưới tác dụng của formol.[4,5] Kháng nguyên H gồm hai pha đặc hiệu và không đặc hiệu Pha đặc hiệu kí hiệu là Ha, Hb (a,b,c,g,…m), pha không đặc hiệu kí hiệu H1, H2, H5 …[3]

Kháng nguyên Vi: là kháng nguyên bề mặt bao quanh kháng nguyên O, có cấu tạo bởi phospholipid, protein đặc biệt, lipopolysaccharid.[3]

Dựa trên cấu trúc kháng nguyên O, Kauffmann- White chia salmonella

thành các nhóm A, B, C, D Trong đó S.paratyphi A thuộc nhóm A, S.paratyphi

B thuộc nhóm B, S.paratyphi C thuộc nhóm C, S.typhi thuộc nhóm D Trong từng

nhóm dựa trên cấu trúc kháng nguyên H, người ta lại chia thành từng serotype Với sự phân loại trên, Salmonella được chia thành hơn 2200 serotype khác nhau.[4,23]

Hiện nay Salmonella chia thành 6 phân nhóm khác nhau như sau:[24]

Salmonella phân nhóm 1: gồm hầu hết các serotype: S.typhi, S

cholerasuis, S.gallinarium, S.pullorum

Salmonella phân nhóm 2: S.salamae Salmonella phân nhóm 3a: S.arizonae Salmonella phân nhóm 3b: S.diarizonae Salmonella phân nhóm 4: S.houtenae Salmonellae phân nhóm 5: S.bongori Salmonella phân nhóm 6: S.cholerasuis subsp.indica

1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy và sinh hoá

S.typhi là loại hiếu khí tuỳ nghi Nhiệt độ thích hợp: 37oC, pH thích hợp : 7,2 – 7,6

Dễ mọc trên các môi trường dinh dưỡng tối thiểu: trên NA (Nutrient

Agar) S.typhi tạo khóm trắng ướt, hơi lồi, tạo 2 dạng khóm S (Smooth) và R

(Rough); trên canh lỏng NB (Nutrient Broth) tạo đục đều để lâu lắng cặn [3]

Đặc điểm khuẩn lạc S.typhi trên các môi trường phân lập [22,35]

Trên MC (Mac Conkey): khuẩn lạc S.typhi nhẵn láng, màu trắng

Trên BA (Blood Agar): S.typhi không gây dung huyết, có khuẩn lạc màu

trắng, trơn láng

Trên thạch Deoxycholate: S.typhi tạo khuẩn lạc dẹt, màu đỏ có thể có

tâm đen

Trên SS (Salmonella Shigella Agar): khuẩn lạc của S.typhi có màu trắng

có thể có tâm đen

Trên Hektoen enteric: khuẩn lạc S.typhi màu xanh(cùng màu với môi

trường) có thể có tâm đen

Trên BSA (Bismuth Sunfit Agar): S.typhi tạo khuẩn lạc đen hoặc xanh

đen

S.typhi có khả năng lên men đường glucose không sinh hơi( đây là đặc

điểm để phân biệt với các loài Salmonella khác); có khả năng chuyển hoá nitrat thành nitrit; sinh H2S; có enzym lysindecarbonxylase; không có khả năng lên men đường lactose, đường manitol; cho phản ứng Oxidase, Urease, Bile esculin, Indol, VP âm tính; không có khả năng sử dụng Citrat, Malonat.[3,4,5,20,35,41,42]

Trên môi trường sinh hoá KIA, phần đứng màu vàng, phần nghiêng màu đỏ (đỏ/vàng), sinh H2S

S.typhi trên KIA

1.2.3 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn thương hàn xâm nhập vào cơ thể người qua đường tiêu hoá bởi thức ăn, thức uống, nước sinh hoạt không đảm bảo vệ sinh, nhiễm phân hay nước tiểu người bệnh Tuỳ vào số lượng vi khuẩn nuốt vào và các yếu tố của túc chủ mà vi khuẩn thương hàn có thể gây bệnh hay không, nhưng số lượng đó thường khoảng 105-107 vi khuẩn Sau khi vào được cơ thể, phần lớn vi khuẩn bị tiêu diệt bởi độ axit của dịch vị và dạ dày Tuy nhiên vẫn còn một số lượng vi khuẩn có thể sống sót được và dịch chuyển xuống ruột non Tại ruột non vi khuẩn cũng phải cố gắng thoát khỏi tác động kháng khuẩn từ dịch tiết ra từ

ruột non, tụy tạng và đường mật Sau đó vi khuẩn S.typhi xuyên qua hàng rào

niêm mạc ruột, đi vào các vi nếp còn gọi là các tế bào M cũng là các tế bào ruột và rồi chui ra khỏi tế bào ruột đối mặt với các tế bào bạch huyết và đại thực bào ở mảng Peyer của ruột Tại những mô bạch huyết ở ruột là nơi mà vi khuẩn thương hàn có thể tăng sinh tạo thành các ổ áp xe hay hoại tử sau này

Sự tồn tại lâu dài của S.typhi trong cơ thể người là do khả năng sống và nhân

lên của vi khuẩn bên trong đại thực bào Những tế bào này đưa vi khuẩn đi khắp cơ thể Khi sinh khối đạt đến ngưỡng, tương ứng với thời gian ủ bệnh 10-

14 ngày Và từ lúc này các triệu chứng của bệnh thương hàn bắt đầu xuất hiện Sau đó bệnh bắt đầu tiến triển từ từ Các biến chứng thường thấy xuất hiện ở người bệnh là thủng ruột và xuất huyết tiêu hoá - hậu quả của của quá trình hoại tử xuyên thủng ở các mô bạch huyết Các ổ áp xe có thể xảy ra ở mọi nơi nhưng thường thấy ở gần các mô đã hoá sẹo, hoại tử hoặc quanh chỗ dặt dụng cụ nhân tạo vào cơ thể Viêm tuỷ xương là biến chứng đặc biệt của bệnh nhân mắc chứng hồng cầu lưỡi liềm Những người bị bệnh về đường mật cụ thể là sỏi mật dễ gặp tình trạng mang trùng mãn tính do viên sỏi tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn thương hàn hiện diện dai dẳng trong đường mật

Tuy nhiên những biểu hiện rất đặc trưng của bệnh thương hàn cũng như các yếu tố liên quan chắc chắn đến cơ chế sinh bệnh vẫn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ và hoàn chỉnh.[2,4,6]

1.3 TÌNH HÌNH ĐỀ KHÁNG

1.3.1 Lược sử sử dụng kháng sinh trong điều trị thương hàn

Năm 1948, Theodore Woodward và CS đã điều trị thành công một người Malaysia mắc bệnh thương hàn bằng kháng sinh Chloromycetin (Chloramphenicol) mở ra một kỷ nguyên sử dụng kháng sinh trong điều trị thương hàn.[2] Ưu điểm của Chloramphenicol là rẻ tiền, hiệu quả cao khi dùng qua đường uống Tuy nhiên, Chloramphenicol gây thiếu hồng cầu do ảnh hưởng đến tuỷ xương, làm cho bệnh dễ tái phát, không có hiệu quả đối với người lành mang trùng Chloramphenicol còn làm suy yếu hệ miễn dịch [2,30]

Năm 1964-1965, theo L.Mauriquez và W.L.Sanders Ampicillin mới thực sự đem ra để điều trị thương hàn Qua quá trình thử nghiệm người ta cũng nhận thấy Ampicillin có tác dụng đối với người lành mang trùng.[31,32]

Trimethoprim/Sulfamethoxazole lần đầu tiên được đưa vào sử dụng điều trị thương hàn vào năm1968 do Akinkungbe Vào năm 1969 , S.A.Kamat chứng minh hiệu quả tác dụng cuả hai loai kháng sinh Ampicillin, Trimethoprim / Sulfamethoxazole tương tự như Chloramphenicol [30]

Vào thập niên 70, xuất hiện dòng S.typhi kháng Chloramphenicol gây

dịch tại một số nước châu Á, châu Mỹ La tinh Năm 1974, miền Bắc Việt Nam

là nước thứ 5 trên thế giới phát hiện ra S.typhi kháng Chloramphenicol.[11] Từ đó, Ampicillin, Trimethoprim/ Sulfamethoxazole được dùng thay thế

Chloramphenicol trong điều trị thương hàn

Năm 1979-1983, M.I.Hug ghi nhận ở Úc, Mexico, Ấn Độ, Bangladesh có nhiều vụ dịch thương hàn do vi khuẩn không chỉ kháng Chloramphenicol mà còn kháng Streptomycin, Sulfonamid, Tetracylin.[33]

Từ năm 1990, sự xuất hiện của những dòng vi khuẩn đa kháng với kháng sinh nêu trên làm cho việc điều trị thương hàn phải dùng đến kháng sinh Quinoloness (Ciprofloxacin, Ofloxacin), Cephalosporiness thế hệ 3 (Ceftriaxone)

1.3.2 Tình hình đề kháng của S.typhi trên thế giới

Tại Ấn Độ: Tình hình kháng Chloramphenicol theo Sridhar và CS, năm

1978 là 1,7%, 1979: 22,2%, 1980: 43,7% và 1990: 81% ( theo báo cáo của National Health and Education Society).[37]

Theo Vikas Gautam và CS thuộc Department of Microbiology,[44] 436 chủng thu nhận từ 1997-2001 cho thấy độ nhạy cảm của các loai kháng sinh như sau: Ampicillin (21%-45%), Chloramphenicol (41%-52%), Trimethoprim/ Sulfamethazole (15%-74%), Gentamycin (57%-76%), Norfloxacin (34%-83%), Amikacin (76%-87%), Ciprofloxacin (62%-89%), Cefotaxime (74%-88%), Ceftriaxone (87%-90%) Cũng trong báo cáo này, 60 chủng thử nghiệm MIC cho thấy đối với Ampicillin MIC= 128µg/ml, Ciprofloxacin 63% MIC < 4µg/ml, Cefotaxime MIC= 0.03 - 0.5µg/ml, Ceftriaxone MIC= 0.06 - 0.5µg/ml

Tại Kuwait: Theo D.Panigrahi,Abdulaziz, P.W.J.West, ghi nhận 266

chủng phân lập được từ 1993-1994 có 45% kháng một đến nhiều loại kháng sinh, 35% đa kháng Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracylin,

Trimethoprim/Sulfamethazole và tất cả đều nhạy với Cephalosporiness và FluoroQuinoloness.[43]

Tại Anh: TheoE John Threlfall và Linda R Ward (Central Public Health

Laboratory, London) ghi nhận tình hình kháng Chloramphenicol từ 1978-1985: 0,47%, 1986-1989: 1,5%, 1990: 20% 1990-1999: tỷ lệ đa kháng Ampicillin, Chloramphenicol, Trimethoprim dao động từ 21%-36%, mức dộ nhạy cảm với Ciprofloxacin giảm 0,5%-23% 1999: MIC của Ciprofloxacin 0,25-1mg/l là 23%.[34]

Tại Mỹ:Theo báo cáo của tổ chức NARMS:

Năm 1999: Nalidixid acid có MIC= 4 là 73,5%, MIC>=32 là 19% Với kết quả này thì theo NCCLS[16] tỷ lệ kháng Nalidixid acid là 19% và 73,5% vẫn còn nhay cảm với kháng sinh này

Ciprofloxacin có MIC<= 0.03 là 75,3%, MIC>=0,25 là 15% Như

vậy S.typhi vẫn còn nhạy cảm cao với Ciprofloxaxin

Năm 2001: tỷ lệ đề kháng của S.typhi với Ciprofloxacin là 0.5%

Số liệu thu thập được trong ba năm từ 1999-2001,tỷ lệ kháng các loại kháng sinh như sau: Ampicillin (13-20%), Ceftriaxone(0,5-0,6%), Chloramphenicol(12-21%), Nalidixid axid (19-30%), Tetracylin (9-21%), Trimethoprim/Sulfamethazole (13-21%).[38]

Tại Bangladesh: Năm 2001, tỷ lệ kháng các loại kháng sinh lần lượt là:

Ampicillin (55,1%), Trimethoprim/Sulfamethazole (57,1%), Chloramphenicol (57,1%), Ceftriaxone (2%), Ciprofloxacin (0%).[36]

1.3.3 Tình hình đề kháng cuả S.typhi tại Việt Nam

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thế Trâm và Lê Lan Hương:[8]

(1987-1989) : tỷ lệ kháng Ampicillin: 25%, Tetracillin: 21%, Chloramphenicol: 17%, các chủng nay còn nhạy với Gentamycin, Nalidixid acid, Bactrim

Theo nghiên cứu của Ngyuễn thị Tuyết Hoa và Tô Song Diệp : [7]

1988: tỷ lệ kháng Chloramphenicol: 45%, Ampicillin, Ceftriaxone: 0%

1990: tỷ lệ kháng Chloramphenicol: 49%, Ampicillin: 3%, Sulfamethazole : 46%, Trimethoprim: 2%,Ceftriaxone: 0%

1993: tỷ lệ kháng Chloramphenicol: 75%, Ampicillin: 68%, Sulfamethazole: 79%,Trimethoprim: 71%, Ceftriaxone : 0%, Quinolones 0%

1994:tỷ lệ kháng Chloramphenicol: 84%, Ampicillin: 79%, Sulfamethazole: 79%, Trimethoprim: 82%, Ceftriaxone: 0%, Quinolones:0%

1997:thử nghiệm các chủng thương hàn với kháng sinh thuộc Quinoloness cho kết quả 20% các chủng thử nghiệm kháng với kháng sinh này

Theo tổng kết của Phạm Kim Sắc, tỷ lệ kháng Nalidixid acid trong năm

1997, 1998 lần lượt là 32,3%, 76,7% MIC90 của Ofloxacin và Ceftriaxone lần lượt là 0,125µg/ml, 0,25µg/ml.[5]

Theo Lê Huy Chính (1995-1998), tỷ lệ kháng Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracylin, Trimethoprim/Sulfamethoxazole từ 83,1%- 91,8%.[18]

Theo Trần Tịnh Hiền (1989,1993), Tỷ lệ đa kháng Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracylin, Trimethoprim/Sulfamethoxazole lần lượt là 1%, 85%.[12]

Theo Nguyễn Trọng Chính và CS nghiên cứu các chủng S.typhi thu nhận

được tại bệnh viện TWQĐ 108ø (1999-2000), cho thấy tỷ lệ kháng của các loai

kháng sinh như sau: Ampicillin: 72,41%, Gentamycin: 34,5%, Chloramphenicol: 79,3%, Trimethoprim/Sulfamethoxazole: 82,8%, Ciprofloxacin: 13,8%, Cefoperazone: 20,7%, Norfloxacin: 20,7%, Cefotaxime:18,2% [13]

Theo Tô Song Diệp, (2002): MIC Ceftriaxone= 0,094, MIC Ofloxacin = 0,75.[19]

Theo WHO, sự phân bố các vùng dịch S.typhi đa kháng trên toàn thế

giới:[35]

Dựa vào biểu đồ nhận thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ

S.typhi kháng đa kháng sinh cao trên thế giới

PHẦN 2

VẬT LIỆU

&

PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn S.typhi được thu nhận từ Bệnh viện đa khoa tỉnh An

Giang từ 12/ 2003 đến 01/2005 Đây là những chủng vi khuẩn được thu nhận thông qua đề tài nghiên cứu cấp Thành phố: “Nghiên cứu chế tạo bộ kits Elisa

phát hiện và định lượng kháng thể IgM đặc hiệu với S.typhi gây bệnh thương

hàn” do Cử nhân Phạm Thái Bình làm chủ nhiệm đề tài

Các chủng được phân lập từ mẫu bệnh phẩm có chẩn đoán thương hàn tại bệnh viện , được cấy phân lập trên môi trường NA (Nutrient Agar) và chuyển về Phòng Vi Sinh Miễn Dịch để đinh danh lại Sau đó được giữ trong môi trường giữ chủng ở nhiệt độ -80oC

Môi trường giữ chủng: : là môi trường BHI (Brain Heart Infusion) broth

có bổ sung 20% glycerol và được pha chế trong các tube nhựa nắp vặn 1.5ml (Greiner)

Môi trường sinh hoá: môi trường sinh hoá KIA (Kligler Iron Agar) chế trong tube Þ16 mm

Môi trường kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer: Môi trường

MHA (Mueller – Hinton Agar) được chế trong hộp petri nhựa loại Þ 90mm

Môi trường kháng sinh đồ theo thử nghiệm MIC : Môi trường MHA có bổ sung kháng sinh Ciprofloxacin, Ofloxacin, Nalidixid acid theo các nồng độ 0.25µg/ml, 0.5µg/ml, 1µg/ml, 2µg/ml, 4µg/ml, 8µg/ml, 16µg/ml, 32µg/ml, 64µg/ml, 128µg/ml được chế trong hộp Petri nhựa loại Þ90mm

Tất cả các loại môi trường trên do Công ty Nam Khoa sản xuất và cung cấp cho công trình nghiên cứu này

2.1.3 Đĩa kháng sinh

Trên cơ sở khuyến cáo của NCCLS[16]và thực tế sử dụng kháng sinh trong

điều trị (National Committee for Clinical Laboratory Standards) chúng tôi chọn lựa đĩa kháng sinh cho thử nghiệm kháng sinh đồ S.typhi như sau:

Amoxicillin/Clavulanic acid 20/10µg, Trimethoprime/Sulfamethoxazole 1.25/23.73 µg, Chloramphenicol 30µg, Ceftriaxone 30µg, Cefotaxime 30µg, Azithromycin 15µg, Nalidixid acid 30µg, Ofloxacin 5µg, Ciprofloxacin 5µg, Norfloxacin 10µg, Streptomycin 30µg, Tetracyclin 30µg, Ampicillin 10µg, Cefuroxime 30µg

2.1.4 Kháng sinh chuẩn : Ofloxacin, Ciprofloxacin, Nalidixid acid (Sigma)

2.1.5 Định danh: bộ định danh IDS 14GNR

Tất cả hoá chất và môi trường do công ty Nam Khoa cung cấp để thực hiện nghiên cứu này

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp cấy phân lập

Từ các chủng vi khuẩn cấy trong môi trường giữ chủng được bảo quản ở -80oC, cấy phân lập trên môi trường SS, ủ 37oC/ 16-24h Từ khuẩn lạc trên môi trường phân lập tiến hành thử nghiệm định danh và làm kháng sinh đồ

2.2.2 Phương pháp định danh

Lấy mầm vi khuẩn trên KIA không quá 24h, pha loãng với nước muối 0.85% để đạt độ đục chuẩn MacFarland 0.5 Sau đó dùng dịch khuẩn này định danh bằng IDS 14GNR

IDS 14GNR - Bộ 14 thử nghiệm sinh hoá định danh trực khuẩn Gram âm

[15]là một hệ thống bao gồm 14 thử nghiệm sinh hoá: Oxidase, lên men glucose, khả năng chuyển hoá nitrat thành nitrit, ß- galactosidase (ONPG), sử dụng citrate, thuỷ giải esculin, sinh H2S, sinh indol, phản ứng Voges- Proskauer (VP), sử dụng malonat Dựa vào hệ thống mã định danh để định danh đến loài

vi khuẩn

2.2.3 Phương pháp kháng sinh đồ : theo phương pháp khuếch tán

kháng sinh trong thạch Kirby – Bauer

+ Nguyên tắc: dùng khoanh giấy vô khuẩn có đường kính và độ dày

nhất định tẩm sẵn kháng sinh ở nồng độ quy định (dựa vào hiệu lực của từng kháng sinh), đặt lên một đĩa môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn Nồng độ vi khuẩn đã được quy định trước Để tủ ấm cho vi khuẩn mọc và đo đường kính vòng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh,

dựa vào đó xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn được thử với kháng sinh đó [1]

Sau khi trải không quá 15 phút, phải đặt các đĩa giấy kháng sinh Cách đặt đĩa kháng sinh là đặt ở giữa 1 đĩa và các đĩa khác xung quanh sao cho khoảng cách từ thành hộp petri đến tâm đĩa tối thiểu là 15mm và khoảng cách giữa tâm các đĩa tối thiểu phải đạt 25mm Dùng kẹp (pane) vô trùng cẩn thận đặt các đĩa kháng sinh, khi đã đặt đĩa kháng sinh rồi thì không được xê dịch vì ngay khi vừa chạm môi trường, kháng sinh từ trong đĩa giấy sẽ nhanh chóng khuếch tán vào môi trường thạch

Sau khi đặt đĩa kháng sinh, ủ các hộp thạch này ở 37oC/12-16 giờ Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vô khuẩn xung quanh các đĩa giấy và được

đo bằng mm tròn Trong một số trường hợp, đường kính vòng vô khuẩn là đường kính vòng tròn quanh đĩa kháng sinh có độ chiết quang khác với vùng có

vi khuẩn mọc xung quanh

Trên số liệu đường kính vòng vô khuẩn, biện luận kết quả kháng sinh đồ theo chuẩn mực NCCLS phiên bản January năm 2003.[16]

2.2.4 Thử nghiệm MIC: theo phương pháp pha loãng kháng sinh trong

thạch

+ Nguyên tắc: dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loãng của

kháng sinh đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn trong mỗi nồng độ kháng sinh khác nhau mà ta xác định được độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh Phương pháp này ta sẽ xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn: MIC(Minimum Inhibitory Concentration).[1]

+ Cách pha loãng kháng sinh trong thạch

Pha dung dịch kháng sinh theo các nồng độ lần lượt : 128, 64, 32, 16, 8, 4,

+ Cách tiến hành thử nghiệm MIC

Từ huyền dịch vi khuẩn đã pha loãng theo độ đục chuẩn Mac-Farland 0.5 dùng micropipette hút mỗi 5ul đặt vào từng hộp thạch MHA đã pha loãng kháng sinh theo các nồng độ đã kể trên Giọt dung dịch vi khuẩn phải được đặt chính xác vào vị trí đã được quy định trên hộp thạch Mỗi nồng độ của mỗi

loại kháng sinh trong một hộp thạch có thể dùng cho 25 chủng vi khuẩn được đánh số thứ tự từ 1 đến 25

Sau khi nhỏ giọt dung dịch vi khuẩn vào đúng vị trí, tránh làm dao động mạnh hộp thạch để giọt vi khuẩn không bị lan sang các vị trí khác Để yên hộp thạch cho đến khi giọt vi khuẩn khô hẳn mới đem ủ ấm ở 37oC/24 giờ

Đọc kết quả bằng cách quan sát xem vi khuẩn mọc đến nồng độ nào thì không còn có khả năng phát triển nữa Ở nồng độ nào vi khuẩn không còn khả năng phát triển thì ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu là chính là nồng độ kế cận trước đó

Biện luận kết quả kháng sinh đồ theo chuẩn mực NCCLS phiên bản January năm 2003.[16]