thực hành công nghệ sản xuất enzyme 5 2024

Kỹ năng, kiến thức Sinh viên nắm vững được thao tác kỹ thuật để xác định hoạt độ của enzyme tương ứng với nội dung thực hành thông dụng trong một mẫu tự chọn Các nhóm chuẩn bị mẫu như s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TÀI LIỆU THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME

(Tài liệu sử dụng nội bộ)

Biên soạn:

TS Trương Phước Thiên Hoàng ThS Lê Phước Thọ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2024

6.2 Quy trình thủy phân đạm cá và trùng quế từ enzyme protease

6.3 Đánh giá hiệu quả của enzyme thô thu nhận từ bài 5 so với enzyme công nghiệp

YÊU CẦU ĐỐI VỚI MÔN HỌC

1 Kỹ năng, kiến thức

Sinh viên nắm vững được thao tác kỹ thuật để xác định hoạt độ của enzyme (tương ứng với nội dung thực hành) thông dụng trong một mẫu tự chọn

Các nhóm chuẩn bị mẫu như sau:

- Bài 1: Sinh khối lên men bán rắn Bacillus sp (giảng viên chuẩn bị) – Trái thơm (dứa) –

2 Tác phong, nề nếp

- Tuân thủ nghiệm mọi nội quy của phòng thí nghiệm (dán ở trước cửa phòng học) - Mặc áo blouse suốt quá trình tham gia học thực hành

- Đi học đúng giờ, trễ 15 phút không có phép xem như vắng mặt

- Không nói chuyện, đùa giỡn trong quá trình học thực hành - Để điện thoại ở chế độ rung/im lặng hoặc tắt máy

- Giữ vệ sinh chung, sắp xếp dụng cụ, hóa chất, vật liệu thí nghiệm ngăn nắp, đúng nơi quy định Sau mỗi buổi thực hành phải vệ sinh sạch sẽ phòng học, nơi làm thí nghiệm, dụng cụ, thiết bị

- Chuẩn bị đầy đủ tài liệu thực hành, để nắm rõ các quy trình, công việc sẽ làm trong suốt buổi thực hành

3 Đánh giá môn học

- Chuyên cần: tham gia đầy đủ các buổi thực hành: 20% điểm môn học

- Thi kết thúc môn học: hình thức (10 câu trắc nghiệm + 1 câu tự luận), thi vào buổi cuối cùng của đợt thực hành: 50% điểm môn học

- Báo cáo kết quả thực hành: báo cáo theo nhóm học thực hành: 30% số điểm môn học

BÀI 1 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME PROTEASE

1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Enzyme protease (còn được gọi là proteinase hay pepdidase) (EC.3.4.-.-) là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp Trong cùng một phản ứng, các protease khác nhau có các hướng xúc tác khác nhau

Enzyme protease có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: sinh khối, dịch lên

men vi sinh vật (Bacillus sp.; Aspergilus sp); thưc vật (bromelin từ trái thơm; ficin từ trái

sung, papain từ trái đu đủ ), động vật (có trong tụy, ruột non )

1.2 Xác định hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Anson

Nguyên lý: casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease

tạo sản phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lượng tyrosine và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin

Phạm vi áp dụng: áp dụng để xác định hoạt độ enzyme trong thực phẩm, thức ăn

chăn nuôi, chế phẩm sinh học

1.3 Cách tiến hành và tính kết quả 1.3.1 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

❖ Dụng cụ: máy lắc, máy đo mật độ quang, bếp ổn nhiệt, bình tam giác 250 ml; bình định

mức 10 ml, 100 ml, 500 ml, ống nghiệm, pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml

❖ Hóa chất:

- Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hòa tan 5,9690 g Na2HPO4.12H2O trong nước vừa đủ 250 ml

- Dung dịch KH2PO4 1/15 M : hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nước vừa đủ 100 ml

- Dung dịch đệm Sorensen pH 7,6: trộn chung 88,5 ml dung dịch Na2HPO4 1/15M với 11,5 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đến khi pH đạt 7,6

- Dung dịch casein 1%: pha 1g casein trong 100 ml dung dịch đệm sorensen

- Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5 g TCA trong nước cho đủ 100 ml

- Dung dich NaOH 0,5N: hòa tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml - Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:4)

- Dung dich HCl 0,2 N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250 ml

- Dung dịch Tyrosine 20 µM/l: khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosin trong dung dịch HCl 0,2 N vừa đủ 500 ml

- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 µM/l trong dung dịch HCl 0,2 N: pha loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20 µM/l trong dung dịch HCl 0,2 N thành 100 ml

1.3.2 Dựng đường chuẩn tyrosin

Từ dung dịch tyrosin chuẩn 1 µM/l, xây dựng đường chuẩn với dung dịch tyrosin có nồng độ từ 0,2 - 1,0 µM/l

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

1 2 3 4 5 6 Dung dịch tyrosine chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0

Nồng độ tyrosine tương ứng (µM) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0

Dung dịch HCl 0,2N (ml) 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 5,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660 nm

Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn tyrosine tương quan tương quan giữa lượng tyrosine (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN - ODKC)

1.3.3 Chuẩn bị mẫu

Mẫu cân chính xác 10 g ( đối với mẫu rắn) hoặc 10 ml (đối với mẫu lỏng) cho vào becher, định mức vừa đủ 100 ml bằng nước cất đem lắc trên máy lắc trong vòng 15 phút Đem ly tâm lạnh với 4000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch, bỏ bã (đối với mẫu lỏng không cần ly tâm, chỉ lắc để đồng nhất mẫu)

1.3.4 Tiến hành

Lấy 4 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 2 ống thử thật, 2 ống thử không Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Thử thật Thử không Dung dịch casein 1% (ml) 2,5 2,5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 5 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 0,5 0,5

Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút

Dung dịch TCA 5% (ml) 5 0 Để yên 10 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 4 ống nghiệm mới khác, cho vào mỗi ống tương ứng kí hiệu mã hóa 2,5 ml dịch lọc của ống thử thật và ống thử không sau khi ủ và lọc ở bước trên

Tiếp tục thêm vào mỗi ống 5 ml NaOH 0,5 N và 1,5 ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660 nm ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được µM tyrosine

1.3.5 Tính kết quả

Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,5oC: pH 7,6 …) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660 nm tương ứng với 1 µM tyrosine trong đường chuẩn

Với:

Hđ Protease: hoạt độ enzyme protease ( UI/g)

V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzyme

µM tyrosine: lượng µM tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn

BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME CELLULASE

2.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Cellulase (EC 3.2.1.4) là là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng là glucose Cellulase có thể "phá vỡ" phân tử cellulose thành các monosaccharide ("đường đơn") như beta-glucose, hoặc thành các polysaccharide ngắn hơn và oligosaccharide Nếu đi cụ thể hơn thì phản ứng liên quan đến sự thủy phân của các liên kết 1,4-beta-D-glycosidic trong cellulose, hemicellulose, lichenin và beta-D-glucan trong ngũ cốc.Enzyme cellulase bao gồm 3 loại là: carboxymethyl cellulase (CMCase), exo-β-glucanase và β-glucosidase

Cellulase được thu nhận chủ yếu từ: sinh khối, dịch lên men vi sinh vật (nấm mốc:

Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…; xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces reticuli…; vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…) dịch dạ dày động vật nhai lại (dạ dày 4 ngăn) như bò và cừu và động vật có dạ

dày đơn như ngựa, hoặc bởi một vài loại động vật chẳng hạn như một số mối

2.2 Xác định hoạt độ Cellulase bằng phương pháp Miller

- Nguyên lý: cellulase sẽ thủy phân cơ chất thành đường đơn glucose Vì vậy

phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

- Phạm vi áp dụng: áp dụng để xác định hoạt độ enzyme trong thực phẩm, thức

ăn chăn nuôi, chế phẩm sinh học

2.3 Cách tiến hành và tính kết quả 2.3.1 Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ

- Thuốc thử DNS: cân 1 g DNS pha trong 20 ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50 ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml

- Dung dịch glucose mẫu (500 µ/ml): cân 0,5 g D - glucose pha trong nước cất thành 1 lít - Dung dịch CH3COONa 0,1 N: cân chính xác 8,2 g CH3COONa, thêm nước cất và định tới mức 1000 ml

- Dung dịch CH3COOH 0,1 N: Hút 5,77 ml CH3COOH, thêm nước cất và định tới mức 1000 ml

- Dung dịch đệm acetat 0,1 N pH 5: Cho từ từ 35,2 ml dung dịch CH3COONa 0,1 N vào 14,8 ml dung dịch CH3COOH 0,1 N, điều chỉnh pH = 5,0 bằng máy đo pH

- Dung dịch cơ chất 0,3%: cân chính xác 3 g CMC, hoà tan trong dung dịch đệm acetat 0,1 N, pH = 5, khuấy trong 2 giờ ở 45oC để hoà tan cơ chất, thêm dung dịch đệm cho đủ 1000ml

- Dung dịch enzym thô sau khi thu từ ly tâm (100 ml), lấy khoảng 20 ml đem đi đun sôi ở 1000C, sau đó làm lạnh nhanh

2.3.2 Dựng đường chuẩn glucose

Từ dung dịch glucose 500 (µg/ml) chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ từ 5 – 25 (µg/ml)

Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose

2.3.3 Tiến hành xác định hoạt độ enzyme Cellulase

Để xác định hoạt độ enzym cellulase, ta cần sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzym với CMC trong 60 phút pH = 5,0 Hệ enzym cellulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt độ cellulase

Chuẩn bị thêm 2 ống nghiệm thử thật và 2 ống nghiệm thử không

Hút 0,5 ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 0,5 ml DNS Đun sôi cách thủy trong 3 phút Thêm vào 5 ml nước cất Đo OD tại bước sóng 530 nm

Đơn vị hoạt độ cellulase (UI/g) được xác định như là lượng enzyme phân giải tạo ra lượng đường khử tương đương với 1 µg glucose trong một phút ở điều kiện pH 5, 400C

Trong đó:

Hđcellulase: hoạt độ enzym cellulase a: hàm lượng glucose (µg /ml)

5: thể tích của hỗn hợp phản ứng (ml) n: hệ số pha loãng

m: khối lượng canh trường (g) t: thời gian phản ứng

a n.5

m t

BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME LIPASE

Lipase được tìm thấy trong máu, dịch dạ dày, dịch tiết tuyến tụy, dịch ruột và mô mỡ của động vật

3.2 Xác định hoạt độ enzyme lipase bằng phương pháp chuẩn độ

- Nguyên tắc: thủy phân các este triglycerid bằng lipase Các axit béo tự do được

giải phóng giải phóng ra khỏi cơ chất được chuẩn độ bằng natri hydroxit ở pH ổn định Lượng natri hydroxit tiêu tốn trong một khoảng thời gian xác định được dùng để tính hoạt độ ILU/ml hoặc ILU/g

- Phạm vi áp dụng: phương pháp xác định hoạt độ lipase trong chế phẩm lipase

đường tiêu hóa và rennet dạng hồ nhão có nguồn gốc từ động vật

3.3 Các tiến hành và tính kết quả 3.3.1 Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ

❖ Dụng cụ: becher 100 ml, 250 ml; erlen 250 ml; bình định mức, pipette, ống chuẩn độ 25 ml, bếp đun cách thủy

- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,01M (b): 2,6525 g Na2HPO4.7H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml

+ Trộn chung 39 ml dung dịch dung dịch mononatri orthophosphate 0,01M với 61 ml dung dịch dinatri hydrophosphate 0,01M dẫn nước đến 200 ml

- Dung dịch hỗn hợp ethanol - acetone theo tỉ lệ 1:1 Dung dịch này được pha trước khi sử dụng

- Dung dịch phenolphtalein 1% (w/v): hòa toan 0,5 g phenolphtalein trong ethanol thành 50 ml

Dầu olive (ml) 1,25 1,25 Gum Arabic 7% (ml) 3,75 3,75 Đệm phosphate 0,01M 2 2 Dung dịch enzyme (ml) 1(bất

3.3.2.2 Tính toán kết quả

Một đơn vị hoạt tính lipase được xác định là lượng enzyme tạo ra 1 µmol axit béo trong mỗi phút ở điều kiện pH 7,0 và 37 oC

- Hđ: hoạt độ enzyme (UI/g)

- CMNaOH : nồng độ mol của dung dịch NaOH - t: Thời gian phản ứng

- 1000 – hệ số quy đổi

- Venzyme : thể tích enzyme phản ứng (ml)

(Vt – Vk) x CMNaOH x 1000*L Hoạt độlipase (UI/g) =

m x t x Venzyme

BÀI 4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE

β-amylase cắt ra từng phân tử maltose từ đầu tự do của phân tử amylose và amylopectin Phản ứng ngừng khi gặp một nhánh ngang Vậy ta có thể nói phân tử không phân nhánh của amylose sẽ hoàn toàn biến thành maltose trong khi phân tử amylopectin sẽ cho ta hỗn hợp maltose và các phân tử dextrin có nhánh Do đó, sự tác động của hỗn hợp α-amylase và β-amylase trên tinh bột cho ta hỗn hợp cùng lúc nhiều maltose và dextrin đơn giản hơn

Các loại amylase đều có ở các loại thực vật, động vật và vi sinh vật Khi hạt nảy mầm, hoạt tính amylase tăng lên làm thủy phân tinh bột thành đường cần thiết cho sự phát triển của phôi

4.2 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme amylase

Nguyên tắc: Xác định số lượng cơ chất phân giải (tinh bột) trên cơ sở giảm cường

độ màu với iod

Phạm vi áp dụng: phương pháp áp dụng để xác định hoạt độ enzyme amylase trong

thực phẩm, chế phẩm sinh học, hạt nảy mầm

4.3 Cách tiến hành và tính kết quả 4.3.1 Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

❖ Dụng cụ: ống nghiệm, cối chày sứ, phếu lọc, pipette, bình định mức 50 ml, erlen 250

ml, becher, ống chuẩn độ 25 ml, ống đong 200 ml

❖ Hóa chất:

- Dung dịch NaCl 0,1%: hòa tan 0,1g NaCl trong nước thành 100 ml

- Dung dịch Iod: hòa tan 1 g iod vào 2g KI, thêm nước cất đến 100 ml Khi dùng pha loãng dịch này 500 lần

- Dung dịch HCl 0,1 N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 500 ml

- Dung dịch tinh bột 1%: hòa tan 1 g tinh bột trong dung dịch đệm phosphate 0,0 5M, pH 6,0 thành 100 ml

4.3.2 Cách tiến hành và tính kết quả 4.3.2.1 Dựng đường chuẩn

Từ dung dịch tinh bột 1% xây dựng đường chuẩn với dung dịch tinh bột có nồng độ từ 0 – 10 mg/ml

Nồng độ tinh bột (mg/ml) 0 2 4 6 8 10 Dung dịch tinh bột (ml) 0 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0

Lấy 1ml từ những ống số 0, 1, 2, 3, 4, 5 cho vào các ống nghiệm mới mã hóa tương ứng, sau đó thêm 9ml dung dịch iod đã pha loãng 500 lần Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang OD theo nồng độ tinh bột (mg/ml) ở bước sóng 560 nm

4.3.2.2 Cách tiến hành thử nghiệm

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Thử thật Thử không Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 1 Dung dịch NaCl 0,1% (ml) 1 1

Dung dịch đệm phosphate (ml) 2 2 Dung dịch HCl 0,1N (ml) 0 5

V: thể tích enzyme ban đầu (ml)

10: thể tích của hỗn hợp phản ứng (ml) m: khối lượng canh trường (g)

BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN ENZYME THÔ

5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Enzyme có bản chất là protein thường được thu nhận từ 3 nguồn chính: động vật, thực vật và vi sinh vật Trong đó, enzyme có thể được tạo ra và thoát khỏi tế bào để thực hiện các phản ứng thủy phân ngoài tế bào gọi là enzyme ngoại bào, thực hiện các phản ứng trong tế bào gọi là enzyme nội bào

Thu nhận enzyme nội bào: các enzyme này không có khả năng đi quan màng tế bào và màng của các bào quan chứa chúng Trong cơ thể vi sinh vật, enzyme có trong tế bào chất và các bào quan (nhân, ti thể, lysosome ) của tế bào Do đó, để chiết rút enzyme nội bào thì trước tiên phải phá vỡ cấu trúc tế và chuyển chúng vào dung dịch Có thể phá vỡ tế bào bằng các tác nhân vật lý, hóa học và sinh hóa

- Vật lý: phá vỡ bằng đá nghiền hoặc hạt nghiền, áp suất cao, sóng siêu âm - Hóa học: sử dụng kháng sinh, chất tẩy, chất làm biến tính, dung môi - Sinh hóa: enzyme phân giải màng tế bào, phân giải phage

Sau khi phá vỡ cấu trúc tế bào, tiến hành ly trích enzyme nội bào bằng các dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước, bằng li tâm, việc chọn phương pháp lý trích enzyme nội bào tùy thuộc vào tính chất của enzyme cần nghiên cứu Thu nhận enzyme ngoại bào được ly trích trực tiếp từ dịch ép, dịch huyền phù hoặc môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Ở thực vật, enzyme ngoại bào có thể được thu nhận từ các bộ phận của cây hoặc từ nhựa mủ Dịch enzyme có thể là dịch ép của quả, thân, lá hoặc chồi, hoặc từ nhựa quả, nhựa từ thân cây

Ở động vật, các mô động vật được xay nhuyễn Dịch huyền phù của các mô này chứa enzyme ngoại bào

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, vi sinh vật sản xuất enzyme và tiết ra môi trường Nếu là môi trường lỏng thì dịch nuôi cấy sau khi lọc bỏ sinh khối chứa enzyme Đối với môi trường bán rắn, nước hoặc dung dịch đệm được sử dụng để ly trích sau thời gian nuôi cấy thích hợp