vchapter công nghệ sản xuất enzyme 5

CHƯƠNG 5ENZYME DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROTEIN VÀ NHỮNG SẢN PHẨM KHÁC... Enzymes dùng trong kỹ nghệ chế biến thịt• Chất enzyme làm mềm thịt là loại protease, nó bẻ gảy nối peptide giửa

CHƯƠNG 5 ENZYME DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROTEIN VÀ NHỮNG SẢN PHẨM KHÁC

• Một lợi điểm của enzymes là vì hoạt tính cao, nên có hiệu

năng kinh tế cao Thêm vào đó là người tiêu dùng thích

enzymes hơn là những hóa chất

• Khi xử dụng enzyme, thì ta nên chọn loại có tính chuyên biệt

và hoạt tính cao Tính chuyên biệt cao là thiết yếu vì phản

ứng phụ do enzyme không chuyên biệt sẽ ảnh hưởng đến vị

và kết cấu của sản phẩm

• Vì enzyme có hoạt tính cao nên ta chỉ dùng một lượng nhỏ thôi Vã lại có loại enzyme có vị đắng cho nên dùng ít thì tốt hơn

Enzymes dùng trong kỹ nghệ chế biến thịt

• Chất enzyme làm mềm thịt là loại protease, nó bẻ gảy nối

peptide giửa amino acid trong protein trong các sợi collagen trong màng gân bao quanh các sợi cơ

• Những protein này là những sợi đàn hồi để giử các sớ thịt lại với nhau Những sợi này làm cho thịt dai khó nuốt

• Enzymes protease cắt đứt các sợi collagen làm cho thịt mềm hơn Hai enzymes protein làm mềm thịt thường dùng nhứt là papain & bromelain Người ta cũng dùng ficin, từ mủ cây fig

Three layer structure of skeletal muscle

Diagram of collagen fibers covering muscle fibers

1 Papain

a Đặc tính

➢Khối lượng phân tử 23 kD, 212 amino acid

➢Chịu nhiệt Chỉ bất hoạt ở 77 – 850C

• Bất lợi: Khi chiên ở nhiệt độ “medium rare” (54-570C)

nó không bị bất hoạt Do đó sau khi chiên xong chờ đợi mang ra khách ăn thì enzyme vẫn tiếp tục làm mềm thịt cuối cùng là miếng thịt nhũng ra, không ăn được

➢Vài nguyên nhân gây vẫn đục khi lên men và trử bia là do con các hợp chất như proteins – polyphenol trầm hiện

Papain thủy phân các chất này

b Phương pháp trích chiết và tinh lọc

Phương pháp trích chiết và tinh lọc

• Thu hoạch mủ đu đủ và bảo quản bằng cách cho Na

metabisulfite (chất chống oxihóa và bảo quản) vào với nồng

papain

Quy trình chiết lọc papain

Quy trình chiết lọc papain (tiếp theo)

• Papain tinh khiết được sấy chân không ở 500C và nghiền

2 Bromelain

• Là protease chánh trong trái thơm Bromelain có nhiều trong phần cuốn thơm (stem bromelain – SBM) và trái thơm (fruit bromelain – FBM) Nồng độ trong cuốn cao hơn trong trái vì vậy mà người ta dùng cuốn thơm để trích chiết bromelain

• Đặc tính của SBM và FBM liệt kê trong slide tiếp theo Nhiệt

độ bất hoạt bromelain là 710C, cao hơn nhiệt độ chiên cho

beef steak chế độ medium rare (54 – 570C)

• Tốc độ tác động của bromelain tương tự như của papain

a Đặc tính

➢SBM and FBM là enzyme chuổi đơn có chứa carbohydrate

b Phương pháp trích chiết và tinh lọc

➢Người ta vẫn tìm phương pháp trích chiết và tinh lọc

bromelain giản dị và rẻ tiền nhứt

➢Bromelain có thể được trích dể dàng từ trái thơm, nhưng FBM ít được sản xuất vì mắc tiền Bromelain trên thị

trường là trích từ cuốn thơm dùng phương pháp trần hiệm với ammonium sulfate, ly tâm, siêu lọc và đông khô

➢Có nhiều phương pháp trích chiết và tinh lọc bromelain được xử dụng Độ tinh khiết và phí tổn sản xuất của của sản phẩm từ những phương pháp này khác nhau

Trích chiết và tinh lọc Bromelain

• Vài kỹ thuật tinh lọc bromelain

• Nó cũng được dùng trong kỹ nghệ thẩm mỹ và tơ lụa.

• Subtilisin là một protease không chuyên biệt Mwt 20 –

45kD từ vi trùng bacillus subtilis, B amyloliliquefaciens

• Nó dùng để thủy phân phân tử haem dùng làm xúc xích

(black pudding)

• Người ta dùng subtilin tái tổ hơp rộng rải trong kỹ nghệ xà bông giặt, rửa chén vì subtilisin thiên nhiên sẽ bị bất hoạt hóa bởi detergent và nhiệt độ cao

• Trong bột giặt hay rửa chén subtilisin được xem như là chất tẩy vết màu

II Enzymes dùng trong sản xuất nước chấm & và tàu hủ

1 Enzymes dùng trong sản xuất nước chấm

• Phó sản của hảng chế biến hải sản có nhiều giá trị vì chứa nhiều protein, lipids Thí dụ như đồ lòng, da, đuôi, đầu và xương cá

• Phế thải các phó sản này tốn kém làm gia tăng phí tổn sản xuất của sản phẩm chánh

• Xử dụng enzyme người ta có thể gia tăng giá trị phó sản như thực phẩm chức năng, thực phẩm gia súc, nhiên liệu, phân bón, sản phẩm nông nghiệp, thực phẩm cho cá

• Có nhiều phương pháp làm gia tăng thời gian xử dụng của cá,

Td Làm lạnh, làm đông, làm khô, Nướng khói và đóng hộp Một phương pháp khác để trử và gia tăng giá trị cá là lên men với enzyme có trong cá hoặc có trong vi sinh có sẳn trong cá hoặc với enzyme nguồn bên ngoài cho thêm vào.

a Phương pháp lên men truyền thống làm nước mắm dựa vào

enzyme có sẳn trong cá hoặc enzyme từ vi sinh với sự hiện diện của lượng muối cao Các enzyme của cá là từ hệ tiêu hóa, nội tạng hoặc mô cơ của cá Muối cho vào nhằm hút trích nước trong cơ thể cá ra bằng thẩm thấu Nồng độ muối

có thể lên đến 15% Lượng muối cao quá sé ngăn hoạt tính enzyme Muối thấp quá làm vi sinh có thể nhiểm vào gây mùi không tốt cho nước mắm Tiến trình nước mắm khoảng

3 – 12 tháng

b Phương pháp lên men nhanh bằng enzyme cho vào Những

protease và amylase bổ sung vào sẽ thủy phân protein và carbohydrate cho tiến trình lên men tạo nước mắm

➢Trypsin và chymotrypsin bổ sung vào sẽ làm ngắn tiến

trình lên men từ 2 năm xuống thành ~2 tháng mà không

làm giảm phẩm lượng của sản phẩm

➢Nước mắm sản xuất với phương pháp enzyme bổ sung

chứa lượng nitrogen, protein hòa tan, amino acid cao vượt trội so với phương pháp không dùng enzyme bổ sung

2 Enzyme dùng trong kỹ nghệ sản xuất tàu hủ

• Tàu hủ là do sự cô đặc của protein của sửa đậu nành tạo ra

Có ba loại chất làm cô đặc được xử dụng: 1/ Muối và 2/ acid

là hai loại thông dụng nhứt trong thị trường, 3/ enzyme cũng được dùng để cô đặc sử đậu nành

• Tiến trình làm tàu hủ là:

➢Ngâm trong nước, nghiền nát và nấu đậu nành Nấu nước sệt này đến 1000C để denature protein đậu nành

➢Chắc nước lỏng (sữa đậu nành) ra bằng ly tâm hay lọc

➢Cô đặc sữa đậu nành bằng muối / acids / enzymes

➢Ép tàu hủ đặc lại

Chất dùng làm cô đặc tàu hủ

• Hai loại muối thường dùng nhứt để cô đặc tàu hủ là: 1/

calcium sulfate (thạch cao) và 2/ magnesium chloride hợp

chung với calciun chloride

• Loại acid ăn được thường dùng nhứt là glucono delta lactone (GDL) Vài acids khác cũng được thường dùng là acetic acid

và citric acid

• Enzyme cũng được dùng làm chất cô đặc Thí dụ Papain,

bromelain và vài proteases khác xuất nguồn từ vi sinh

Cơ chế của phản ứng cô đặc tàu hủ

Đến nay người ta vẫn chưa hoàn toàn thấu hiểu cơ chế này Tiến trình cô đặc gồm 2 giai đoạn: Protein denaturation và cô đặc do

phản ứng hydrophobic.

1 Denaturation của protein do nhiệt gây ra Ở trạng thái thiên

nhiên, vùng hydrophobic của phân tử protein là nằm bên trong Khi đun nóng (denatured) vùng này trồi ra.

2 Protein của sữa đậu nành mang điện tính âm Acid (Glucono

Delta Lactone - GDL) hoặc ion calcium (calcium sulfate, Ca chloride) mang đến protons làm trung hòa hóa điện tính âm này Kết quả là các protein không còn đẩy nhau nữa, và tính hydrophobic trên mặt các phân tử protein làm chúng dính nhau Sữa cô đặc.

Cơ chế cô đặc protein sữa đậu nành với GDL (acid) hoặc

CaSO4 (ô tròn) phân tử protein; (điểm đen) vùng hydrohobic

III Xử dụng proteases trong thực phẩm và nước uống

hộp

• Sản phẩm hộp là sản phẩm đóng từng hộp riêng rẽ hoàn toàn kín khí, sau khi đun nóng để khử trùng Mục tiêu là trử thực phẩm để có thể dùng sau này một cách an toàn

• Thực phẩm tươi bị hư hay giảm chất lượng vì nhiều lý do :

➢Các vi sinh, mốc, men hư mọc ra

➢Ảnh hưởng của enzyme trong thực phẩm

➢Phản ứng với oxygen

➢Mất ẩm độ

• Một phần trong quy trình đóng hộp là đun nóng để diệt vi sinh, để bất hoạt hóa enzyme Hiện tượng oxi hóa hoặc mất

ẩm độ sẽ không xảy ra và không bị tái nhiểm trùng vì hộp đóng kín không có không khí

• Khi ra thịt hay lóc thịt thì khoảng 5% thịt còn sót lại với

xương Để thu hồi phần này, người ta có thể nghiền nát

xương và ủ nó với protease ở 600C trong 4 giờ Dung dịch thịt nghiền sệt này đóng hộp thành thịt hay cháo hộp

Protease dùng trong sản xuất thức uống

• Bia để lạnh thường trở nên vẫn đục, Đây là do protein và chất tannin trong bia kết hợp lại và trầm hiện Khi nhiệt độ tăng nó không tan Người ta có thể lọc lợn cợn này hay thêm papain vào sau khi lên men bia Phương pháp lọc tốn kém hơn

• Trong rượu vang người ta cũng thấy hiện tượng là khi nhiệt

độ tăng thì rượu vang bị vẫn đục là do protein của rượu trở

nên không ổn định Người ta thường dùng bentonite (một loại đất sét mịn) để hút các lợn cợn này Tuy nhiên bentonite lại

hút những protein khác trong rượu là cho vị rượu không còn ngon Bây giờ người ta dùng protease

• Nước trái cây cũng vậy Người ta cho hổn hợp protease và pectinase vào trong tiên trình sản xuất và trử lạnh Protease làm nước bớt vẫn đục khi sản xuất, nhưng khi trử lạnh thì nước bị đục Pectinase làm nước không bị đục khi trử lạnh

IV Enzymes dùng trong kỹ nghệ sữa

• Ứng dụng lớn nhứt là trong kỹ nghệ làm cheese Cheese là

sản phẩm từ sữa bò, sửa dê hay sữa các loài nhai lại khác Nó

là dạng cô đặc của protein trong sữa, gọi là casein Người ta

có thể làm casein cô đặc lại bằng acid hay bằng enzyme, gọi

là rennin (còn được gọi là chymosin)

• Sữa là một nhũ tương (suspension) chứa hạt béo, hạt casein

lơ lững trong dung dịch nước, đường (lactose) protein whey

và chất khoáng

Protein trong sữa

• 1 lít sữa chứa 32g protein từ 2 nguồn: casein (82%) và whey (18%)

• Phân tử casein tụ lại thành cụm hình cầu là micelles

• Có 4 loại casein: ∝S1, ∝S2, 𝛽 và 𝜅 (kappa)

• Kappa casein hầu hết trải trên bề mặt của micelle Kappa

casein gồm phần kỵ nước hướng vào bên trong của micelle;

và phần ưa nước hướng ra bên ngoài Phần ưa nước làm cho micelle có hình dạng tóc bên ngoài Nó hòa tan với môi

trường nước xung quanh làm cho cấu trúc micelle ổn định và tạo cho sữa tính chất sệt như keo

• Micelles casein lơ lửng và đẩy nhau trong sữa Các sợi casein ngăn chận các micelles không cho chúng dính nhau, đông tụ mha.

k-• Những protein khác trong sữa gọi chung là whey protein

trong đó protein chánh trong sữa bò là 𝛽-lactoglobulin và lactalbumin

∝-• Mục tiêu của tiến trình làm cheese là làm cho các micelles

casein dính nhau, tức là đông tụ lại

• Ba phương pháp dùng cho tiến trình đông tụ là: acid, enzyme (rennets) và nhiệt độ

1 Đông tụ bằng acid

➢Acid làm giảm điện tính âm xung quanh micelle casein

Nó làm pH của sữa giảm lần về pI (Độ đẳng điện) của

casein, tức là 4.6 Casein mất điện tính Micelles không còn đẩy nhau mà dính lại nhau, tức là đông tụ

Điện tính của protein tại các pH khác nhau của dung dịch Ở

pH = pI (Độ đẳng điện) thì protein không còn mang điện

Đông tụ bằng acid

2 Đông tụ bằng enzymes

Ba nguồn enzyme chánh dùng làm cheese:

i Rennin (chymosin, rennet) lấy từ bao tử bê

ii Enzyme của vi sinh Vài loại nấm tạo enzyme protease

có khả năng đông tụ protein của sữa

iii Chymosin nhân tạo bằng phương pháp tái tổ hợp do E

coli hoặc Klaveromyces lactis hoặc Aspergillus niger là

vi sinh chủ tạo ra Loại rennet tái tổ hợp này hiện được

xử dụng trong 80% các cheese sản xuất trên thế giới

Hai bất lợi lớn của rennet của vi trùng là:

➢Nó có chứa protease không chuyên biệt và chịu được nhiệt, nó làm cheese đắng khi trử lâu Trong khi đó

chymosin tương đối không bền vững Một khi đã gây cô đặc casein xong thì không còn hoạt tính nữa

➢Cho thu hoạch kém

Ba giai đoạn cô đặc sửa bằng enzyme

• Tiến trình cô đặc chủ yếu là rennet thủy phân kappa casein, sau

đó micelles tụ lại dưới ảnh hưởng của Ca 2+ Ba giai đoạn cô đặc là:

1 Giai đoạn 1:

➢Rennet thủy phân nối peptide giửa–Phe 105 – Met 106 của k-casein, thành ra đoạn para-kappa-casein (kị nước, không tan trong nước) và đoạn macropeptides (còn gọi là glyco macropeptide, háo nước)

➢Đoạn háo nước macropeptide hòa tan vào môi trường nước xung quanh Đoạn kỵ nước para-kappe-casein còn lại dính với lỏi của micelle Đoạn kỵ nước của những micelles cạnh nhau sẽ dính với mhau Nó làm các micelles dính vào nhau.

Chymosin hydrolyzes k-casein at Phe 105 – Met 106 bond to produce para-k-casein and glycomacropeptide

Chymosin cắt kappa casein Đoạn háo nước hòa tan trong môi trường xung quanh Phần cỏn lại là kỵ nước dính liền nhau

thành cụm

2 Giai đoạn 2

➢ Khi 80% k-casein bị thủy phân, và ở nhiệt độ ~200C với

sự hiện diện của Ca2+ micelles dính nhau thành chuổi

và cụm

➢ Cụm micelles càng ngày càng lớn lan ra ba chiều và tạo

thành thạch

3 Giai đoạn 3

Thạch lan rộng tạo thành mạng khắp bể chứa và bắt đầu

sắn lại Nhiều tác giả nhập giai đoạn này vào giai đoạn 2

Hai giai đoạn đầu của tiến trình cô đặc casein sữa

3 Đông tụ bằng nhiệt

• Hai phương pháp đông tụ kể trên (acid và enzyme) nhằm vào casein Phương pháp đông tụ bằng nhiệt liên quan đến tất cả protein của kể cả whey

• Protein whey bị nhiệt denature làm cho phần “dính” lộ ra

ngoài Các phần “dính”này của những phân tử protein của

whey và của cả casein liên kết nhau tạo thành mạng lưới Kết quả là sự đông tụ của protein của sữa, tức là whey và casein

Yếu tố ảnh hưởng đến tiến trình cô đặc sữa

1 Ảnh hưởng của pH

• pH thấp làm gia tăng hoạt lực của enzyme Hạ pH xuống

làm các phân tử casein mất đi bớt điên âm bên ngoài, do đó chúng không đẩy nhau và cô đăt sửa nhanh hơn

• Điểm đẳng điện (isoelectric point) của casein là 4.6 pH của sữa là 6.6 ở pH này casein mang điện âm xung quanh Khi cho acid vào, pH sữa xuống dần đến 4.6 thì micelles dần

dần mất điện âm này Chúng không còn đẩy nhau nữa và cô đặc sữa

Yếu tố ảnh hưởng đến tiến trình cô đặc sữa (tiếp theo)

2 Ảnh hưởng của calcium

Giai đoạn 1 (enzyme thủy phân k-casein) không cần

calcium Tuy nhiên giai đoạn 2 cần phải có calcium cho các cụm micelle gắn lại nhau thành mạng lưới Đó là do tác động của calcium trung hòa hóa điện âm trên casein

3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ tối hảo hầu hết cheese là 30 – 320C

➢Dưới 300C, thạch sữa yếu Khó cắt và thu hoạch kém

➢Dưới 200C hiện tượng cô đặc không xảy ra Tuy nhiên khi hâm nóng lên thì sữa cô đặc ngay

V Enzymes dùng trong kỹ nghệ da

• Thành phần da thú từ lò sát sinh gồm 30% protein, 10% chất béo xen lẫn trong các sợi collagen, 60% nước và được bao phủ bởi

lông, máu, chất bẩn và các mô liên kết khác.

• Trong tiến trình thuộc da thì những thành phần trên (trừ các sợi

collagen) sẽ bị loại trừ ra hoàn toàn hay gần như hoàn toàn.

• Ngày xưa thì người ta dùng hổn hợp vôi với sodium sulphide để cho lông tách ra khỏi da và tan thành bột Lớp mô dưới da cũng bị loại ra

• Tuy nhiên hóa chất này gây ô nhiểm Người ta dùng enzyme thay thế và không gây ô nhiểm

Quy trình thuộc da

• Điểm bất lợi khi xử dụng enzyme ở mô hình kỹ nghệ là enzyme chỉ ổn định ở những điều kiện nhứt định như pH, nhiệt độ, thời gian tác động, phí tổn và enzyme dùng phải có tính chuyên biệt;

td enzyme làm rụng lông thôi Chúng phải không tác động trên các sợi collagen

• Người ta dùng loại keratinolytic proteases không có tác

động đến collagen Các enzymes này chuyên biệt thủy phân

mô keratin, làm rụng lông mà không ảnh hưởng đến độ

chắc của da

3 Bating và tẩy mỡ

• Mục tiêu là tẩy bỏ protein không cần thiết để da mềm

• Lúc trước người ta dùng protease từ tụy tạng Bây giờ

người ta dùng protease từ vi trùng (td Pseudomonas

aeruginosa, bacillus licheniformis, bacillus sutilis) hay từ

nấm

• Thường người ta dùng một hổn hợp gồm protease, lipase

và carbohydrases