vchapte công nghệ sản xuất enzyme 2

Nhược điểm khác của E từ nguồn động & thực vật *• Enzyme động và thực vật đều chứa những chất độc hại như hợp chất phenol trong thực vât và những proteases.. Những chất này có thể cản tr

CHƯƠNG 2

NGUỒN GỐC CỦA NHỮNG ENZYMES KỸ NGHỆ

2024

CHƯƠNG 2Trong chương 1 chúng ta học:

Sources of enzymes used in industries *

Nguồn gốc enzymes dùng trong kỹ nghệ *

Enzyme nguồn động vật

Điểm bất lợi của enzyme động vật là:

• Phải giết thú trước khi trích thu enzymes

• Tương đối không bền vững ở pH khác với pH nguồn.• Không bền vững ở nhiệt độ khác với nhiệt độ nguồn.

• Người ta chỉ tìm ra một ít enzyme thực vật thôi• Chúng có ít ứng dụng

Nhược điểm khác của E từ nguồn động & thực vật *• Enzyme động và thực vật đều chứa những chất độc hại như

hợp chất phenol trong thực vât và những proteases Những chất này có thể cản trở hoạt tính sinh học của enzyme mà ta muốn xử dụng.

• Hiện người ta cố khắc phục nhược điểm này bằng cách dùng phương pháp cấy mô động và thực vật.

Enzyme nguồn vi sinh vật.

Lợi điểm so với E từ động vật và thực vật:

1 Có thể biến đổi vi sinh để sản xuất E phù hợp với nhu cầu.2 Dể dàng trích lọc và phí tổn sản xuất enzyme thấp.

3 Lượng enzyme hàm chứa có thể ước đoán và có thể điều chỉnh được

4 Có thể thu mua được dễ dàng các nguyên liệu có thành phần cố định cho việc nuôi cấy vi sinh.

5 Enzyme chứa ít thành phần độc hại thí dụ chất kháng thể, steroids so với enzyme từ mô động vật và thực vật.

6 Enzyme ổn định trong phạm vi pH và nhiệt độ rộng lớn

• Nguồn vi sinh có thể là từ nấm, vi trùng hay men

Enzyme nguồn vi trùng

• Giống như nguồn nấm, hầu hết E nguồn vi trùng được xử dụng trong kỹ nghệ thực phẩm, td Glucose isomerase dùng trong sản xuất si rô fructose.

• Có loại E như amylase, protease sản xuất ngoại bào.

• Có loại E như penicillin amidase, asparginase được sản xuất nội bào.

• Điều quan trọng nhứt là vi trùng sản xuất E phải không gây bệnh, không độc và không sản xuất kháng sinh

• Nguồn vi trùng có sản lượng cao mà kỹ nghệ ưa chuộng phải:

➢Sản xuất enzyme ngoại bào trong thời gian ngắn

➢Cho enzyme bền vững lâu dài và sống được điều kiện khắc nghiệt (extremophiles) như nhiệt độ

(thermophiles), áp suất, nồng độ hóa chất cao, acid cao, muối cao (halophiles)

• Từ thập niên 70’ người ta trích gene cho enzyme chuyển vào DNA của vi sinh để sản xuất enzyme.

II Enzyme thủy phân carbohydrate

• Carbohydrate trong nhiều dạng: tinh bột, cellulose, hemicellulose, pectin, glycogen

• Tinh bột là do nhiều đơn vị glucose hợp lại Có 2 loại tinh bột:

➢Amylose Phân tử thẳng gồm các glucose thẳng hàng,

dính liền nhau chỉ bằng nối glycosidic 𝛂-1, 4

➢Amylopectin Phân tử nhánh cùng thành phần như

amylose nhưng nối liền nhau bằng nối glycosidic 𝛂-1,4 và 𝛂-1, 6

1 Amylase

• từ bacteria, nấm, hạt nẩy mầm, phế phẩm từ lò sát sinh.

• Thủy phân nối α-1, 4 của amylose và amylopectin Ba dạng amylase là:

a Alpha amylase

➢ Là 1 endozyme, tức là thủy phân bất kỳ nối α-1, 4 nào trên

phân tử amylose / amylopectin Nó khác với 𝞫-amylase ở chổ là 𝜷-amylase exozyme thủy phân nối α-1, 4 và cách nối (mổi đơn vị glucose thứ 2 của chuổi tinh bột) Xem slide kế.

➢ Thủy phân amylopectin do α-amylase thành hổn hợp của những chuổi thẳng như trường hợp thủy phân amylose Tuy nhiên hổn hợp này có chứa chuổi có nối α-1, 6 và α-amylase không thủy phân nối này được

b Beta amylase

➢Cũng do vi trùng, nấm, và thực vật tổng hợp ra

➢Đây là exozyme Nó thủy phân 1 nối cách 1 nối a-1.4 glycosidic, cắt tinh bột thành từng cụm chứa 2 đơn vị glucose (maltose), bắt đầu từ đầu non-reducing của tinh bột Đầu reducing là đầu chứa nhóm OH tự do ở vị trí 1.• Cả 2 𝛂 và 𝞫-amylase đều không cắt được nối 𝛂-1, 6

glycosidic (nhánh) nên khi gặp nối này thì dừng lại Người

ta cần enzyme cắt nhánh như pullulanase,

amyloglucosidase còn gọi là glucoamylase hay 𝞬-amylase.

➢ Vì α-amylase tác động bất kỳ nơi nào trên chất nền cho nên tác động nó nhanh hơn 𝛽-amylase.

➢ 𝜶-amylase có trong nước bọt, dịch tụy của loài người Nó cũng có trong thực vật, nấm và vi trùng.

Hình trái Cấu trúc phân tử tinh bột cho thấy non reducing end (C4)

Sự khác biệt giửa alpha và beta amylase

Alpha AmylaseBeta Amylase

Có thể tác động ở bất kỳ nơi nào trên chất nền

Chỉ có thể tác động ở đầu non reducing và xúc tác nối 𝝰-1, 4 glycosidic thứ nhìTác động nhanh hơn

Tác động chậm hơn 𝝰-amylase

c 𝝲-amylase.

• 𝞬-amylase còn được gọi là amyloglucosidase.

• Enzyme này thủy phân nối 𝝰- 1,6 glycosidic và nối 𝝰- 1, 4 glycosidic cuối cùng ở đầu non reducing của amylose và amylopectin để cho ra glucose.

• pH tối hảo cho hoạt tính của enzyme này là khoảng pH 3

Alpha glucose trong tinh bột; beta glucose trong cellulose

• Người không tiêu hóa được Lactose là vì họ thiếu lactase Các người này phải dùng sữa không chứa

lactose Người ta có thể mua lactase là thực phẩm chức năng để cho vào sửa giúp tiêu hóa lactose.

• Điều kiện tối hảo cho hoạt lực của lactase là 370C, pH 6

Những enzymes kỹ nghệ:

a Cellulase

➢Do nấm, vi trùng và protozoa tạo ra

➢Phân hủy cellulose và những polysaccharides tương tự thành monosaccharides Tiến trình thủy phân này liên quan đến nối b-1, 4 glycosidic trong cellulose và

hemicellulose (xem slide kế)

➢Hầu hết các loài hữu nhũ chỉ̉ có một ít khả năng tự nó tiêu hóa thực phẩm xơ như cellulose Ở loài nhai lại (bò, cừu) và ở đoạn cuối đường ruột của ngựa, vi trùng cộng sinh trong ruột sản xuất enzyme cellulases.

Nối 𝞫-1, 4 của cellulose khác với nối 𝞪-1, 4 của maltose và amylose

b Hemicellulase

• Là một nhóm enzymes, cần thiết để thủy phân

hemicellulose Hemicellulose là một chuổi có nhánh chứa pentose và hexose trong thành tế bào thực vật Hemicellulose có trong hạt lúa, cám và họ đậu Nó

không thể tiêu hóa được trong ruột non nó bị lên men phần nào thôi do vi sinh trong ruột già

• Cellulose là chuổi thẳng chứa 7000 – 15000 phân tử glucose; trong khi đó Hemicellulose là chuổi có nhánh chứa 500 – 3000 glucose.

• Bao tử (rumen) và coecum loài ăn cỏ tiết ra

hemicellulase tiêu hóa một phần hemicellulose tiêu thụ

Hemicellulose Hai loại nối glycosidic: 𝝱-1, 4 and 𝝱-1, 3 Lưu ý chiều xoay của phân tử glucose.

• Là enzyme thủy phân chất pectin Pectin là một loại

polysaccharide hiện diện trong vách tế bào thực vật (xem slide sa về sơ đồ vách tế bào trái cây và rau cải)

• Pectin là mạng lưới giống như thạch Nó giúp cho các tế bào thực vật dính liền nhau.

• Pectinases được dùng để thủy phân nguyên liệu thực vật, tăng tốc tiến trình trích chiết nước ép từ trái cây như nước táo.

• Trong tiến trình sản xuất rượu vang, chất pectinase

1 Làm vỡ mô thực vật do đó gia tăng hiệu năng trích chiết.

2 Trong rượu vang pectin làm rượu vang bị vẫn đục Pectinase bất hoạt pectin làm rượu trong hơn.

Note: pectin in plant cell wall

Protease dùng trong kỹ nghệ (peptidase or proteinase)

• Enzyme này thủy phân nối peptidẹ (xem họa đồ trong slide kế) giửa những amino acid thành chuổi polypeptide.

• Enzyme này có thể là endopeptidase hay exopeptidase tùy theo tác động trên chuổi polypeptide Chúng cũng có thể

được phân loại tùy theo nối của amino acid mà nó tác động Td Trypsin là endopeptidase, tác động trên nối liên quan đến arginine hoặc lysin.

• Exopeptidase có trong đường tiêu hóa, Td carboxypeptidase, aminopeptidase, dipeptidase thủy phân các chất nền ra các thành phần amino acid.

• Serine proteases Điểm tác động của tất cả serine proteases đều có chứa serine Thật ra ba amino acids góp phần trong phản ứng phân giải của enzyme là His 57, Ser 195 và Asp 102 ở điểm tác động này

• Thiol proteases còn được gọi là cysteine proteases Những enzymes chứa amino acid cysteine trong điểm tác động của chúng

• Acid proteases là những enzymes có hoạt lực mạnh mẽ nhứt

cũng như chúng vững vàng nhứt trong môi trường acid (pH 5.0).

2.0-• Metallo proteases là proteases mà cơ chế tác động của chúng liên qua đến kim loại.

Nguồn gốc của proteases kỹ nghệa Vi trùng

• Vi trùng tiết ra protease để tiêu hủy nối peptide trong protein tạo thành amino acids.

• Proteases từ vi trùng và nấm có tầm quan trọng cho chu kỳ carbon and nitrogen toàn cầu trong tiến trình tái chế proteins.• Vi trùng tạo proteases có chức năng kiểm soát chất lượng cho

protein bằng cách tiêu hủy những protein mở (unfolded) hay mở không đúng (misfolded)

• Proteases quyết định thời gian sinh tồn của những protein khác như hormones, kháng thể hoặc những enzyme khác.

Phân tử triglyceride gồm có 1 phân tử glycerol (phần trên trong họa đồ) và 3 fatty acids (phần dưới trong họa đồ)

• Cồn và acid hữu cơ hợp lại thành ester Triglyceride là một tri-ester gồm có glycerol nối liền với 3 acid béo

• Khác biệt giửa esterases và lipases: Lipases chủ yếu tác

động trên chất nền không tan trong nước, như triglycerides có các acid béo chuổi dài; trong khi đó esterases thủy phân các ester đơn giản thường là những triglycerides có chứa chuổi acid béo ngắn hơn 6

• Lipase và mật được tiết ra vào đường ruột Mật có hoạt tính của detergent trên các chất béo trong thực phẩm Nó làm

cho những hạt mỡ vỡ ra (nhũ tương hóa) thành những hạt thật nhỏ Mục tiêu là để gia tăng diện tích tiếp xúc của các hạt mỡ cho lipase thủy phân hiệu quả hơn.

• Lipase thủy phân triglycerides trong thực phẩm thành 1 monoglyceride và 2 acid béo tự do theo tiến trình phân hóa chất béo (lipolysis) Chúng tạo thành micelle (hạt) và được hấp thụ vào tế bào màng ruột bằng diffusion Tại đây, những chất này hợp nhau lại thành triglyceride

a Esterase trong phản ứng kháng thuốc diệt sâu bọ.

➢ Căn bản thuốc diệt sâu bọ là esters Sâu bọ tạo ra esterase để thủy phân ester của thuốc diệt sâu thành ra hổn hợp

cồn và acid để chúng có thể bài tiết dể dàng

➢ Genes sâu bọ tạo các esterase biến dạng liên tục trong các loại sâu bọ tạo ra những esterase chuyên biệt cho mổi

Ngày nay người ta dùng phân tử hiệp đồng (synergistic) với thuốc diệt sâu bọ Chất hiệp đồng này sẽ ngăn cản hệ thống enzyme của sâu bọ Do đó duy trì hiệu lực của thuốc.

Gan cũng có khả năng tạo ra một lượng nhỏ enzyme này.• Chất ngăn cản cholesterol esterase sẽ có tác dụng giới hạn

lượng cholesterol trong thực phẩm hấp thụ vào cơ thể.

SUMMARY ON PROTEASE AND LIPASE

Quy trình sản xuất enzyme kỹ nghệ

1 Sản xuất enzyme thiên nhiên

a Chọn nguồn tạo enzyme Mục tiêu là nguồn này sản xuất enzyme nhanh nhứt Nguồn vi sinh nhanh hơn động và thực vật.

b Cô lập vi sinh và cải thiện giống Mục tiêu là trích loài vi sinh

➢ có khả năng sản xuất nhiều enzyme, ít phụ sản khác ➢ Hoàn tất chu trình lên men nhanh để tạo enzyme

➢ Dùng môi trường nuôi cấy rẻ tiền

➢ Có khả năng biến chuyển gene để tăng năng xuất

c Chuẩn bị liều vi sinh, chọn vi sinh khỏe mạnh để cấy nuôid Chuẩn bị môi trường nuôi dưởng vi sinh Chứa

carbohydrate như mật đường, lúa, bắp; Protein như đậu nành, đậu phộng, whey sữa

e Quy trình sản xuất

f Thu hoạch và tinh lọc

Quy trình sản xuất enzyme kỹ nghệ

a Nguồn từ vi sinh

• Enzyme có thể là sản xuất nội bào hay ngoại bào Nếu là nội bào thì phải phá vở màng tế bào để thu hoạch Phá vở bằng cách

➢ Vật lý: siêu âm, thẩm thấu, nhiệt, áp suất➢ Hóa học: detergent, dung môi

➢ Enzyme: dùng lysozyme

• Loại bỏ mảnh vụn tế bào bằng sàn lọc, ly tâm.

• Dung dịch sau khi ly tâm sẽ chứa enzyme cùng với nhiều

protein khác Đây là nguồn enzyme dùng để tinh lọc enzyme.

b Nguồn động vật

• Enzyme trong huyết tương, thí dụ prothrombin.

• Enzyme trong tuyến / mô động vật, thí dụ trypsin trong tuyến tụy tạng (pancreas) Tuyến được xay nhuyển và làm vỡ tế bào acinar để nhả enzyme ra Dung dịch thu được là nguồn

enzyme để trích lọc.

c Nguồn từ phương pháp tái tổ hợp

• Ngày xưa các nhà sản xuất enzyme dựa vào đột biến để cải thiện sản phẩm Bây giờ người ta dùng thao tác di truyền

(genetic manipulation) để cải thiện khả năng sản xuất của vi sinh.

• Thí dụ: Chymosin là protease dùng trong sản xuất cheese Ngày xưa người ta trích chymosin từ bao tử bê Số bê trong lò mổ giảm dần

• Ngày nay người ta dùng chymosin tái tổ hợp đa phần là do vi trùng tạo ra.

• Enzyme do các vi sinh này tạo ra có thể nội hay ngoại bào Đây là nguồn enzyme để tinh lọc

Quy trình sản xuất chymosin tái tổ hợp

Một thí dụ về sản xuất enzymes tái tổ hợp

Phương pháp trích chiết và tinh lọc enzyme từ nguồn

• Enzyme là một protein

• Nguồn chứa enzyme lẫn lộn với nhiều protein khác Mục tiêu là thu hoạch được sản phẩm chỉ chứa enzyme chứ không

chứa protein khác.

• Dựa trên tính chất của enzyme

• Hai phương pháp để đạt mục tiêu: 1/ dùng kỹ thuật để trích enzyme mà thôi ra khỏi dung dịch nguồn để protein khác lại; 2/ dùng kỹ thuật để loại những protein khác ra khỏi dung dịch nguồn, để enzyme lại.

• Đo lường sản lượng và độ tinh khiết của sản phẩm ở tất cả các gia đoạn tinh lọc.

• Sau đây là một thí dụ tiến trình trích lọc enzyme từ nguồn

Đây là thí dụ của phương pháo sản xuất 1 enzyme xúc tác protein; ie prothrombin (Ptn) Nguyên tắc là:

• Nguồn gốc prothrombin là huyết tương.• Đặc tính của Ptn là:

➢Nó hòa tan trong barium citrate

➢Nó hòa tan trong 23% ammonium sulfate (AMS)➢Nó trầm hiện trong 40% AMS

• Người ta theo dỏi thu hoạch vả độ tinh khiết của sản phẩm suốt tiến trình sản xuất (tinh lọc) dựa trên lượng protein, hoạt tính và hoạt tính chuyên biệt của enzyme trong sản phẩm ở mổi giai đoạn.

• Sản phẩm thu hoạch ở mổi giai đoạn phải tinh khiết hơn sản phẩm thu họach ở giai đoạn trước

• Chọn phương pháp cho thu hoạch cao nhứt có thể có độ tinh khiết cần thiết.

Tiến trình trích lọc enzyme Prothrombin từ huyết tương

Trích chiết và tinh lọc prothrombin (Ptn)

• Huyết tương chứa nhiều loại proteins Lượng Ptn rất ít • Ta dùng hoạt tính (Unit) để chỉ số lượng Ptn.

• Ta dùng Hoạt tính chuyên biệt (SA) để chỉ độ tinh khiết Ptn SA huyết tương = 3U/mG nghỉa là tỉ số Ptn trong

huyết tương so với những proteins khác rất thấp; SA của 40% AMS = 1364 nghỉa là sản phẩm này tinh khiết hơn.• Độ thu hoạch ở giai đoạn là 𝐻oạ𝑡 𝑙ự𝑐 𝑠ả𝑛 𝑝ℎẩ𝑚 ở 𝑔iai đoạ𝑛

𝐻oạ𝑡 𝑙ự𝑐 𝑐ủa 𝑠ả𝑛 𝑝ℎẩ𝑚 𝑏ắ𝑡 đầu

• Td tiến trình Ba Citrate trích chiết 79% lượng Ptn trong huyết tương; trong khi tiến trình Ba Citrate tiếp theo là 23% AMS trích chiết 57% lượng Ptn trong huyết tương.

Trích chiết và tinh lọc prothrombin (Ptn)

• Thu hoạch và độ tinh khiết của sản phẩm thường đi ngược nhau Khi ta gia tăng thu hoạch thì độ tinh khiết thường bị giảm.

• Nhà sản xuất phải ấn định một độ tinh khiết để đạt được một thu hoạch thích hợp Thu hoạch thấp tức là lượng sản phẩm đạt được ít lại, nghỉa là lợi tức thấp Ngược lại sản phẩm có độ tinh khiết thấp thì lại khó bán vì khách hàng có thể muốn có sản phẩm tinh

khiết hơn.

Thí dụ về phương pháp sản xuất enzyme xúc tác carbohydrates, đó là enzyme 𝜶-amylase

• Nguồn gốc của 𝞪-amylase là Bacillus cereus và Bacillus

licheniformis Người ta nuôi các vi sinh này trong bể lên men

• Vi sinh nuôi sẽ tiết ra enzyme ngoại bào Do đó người sẽ trích chiết và tinh lọc enzyme dùng dung môi nuôi các vi sinh này Trước tiên người ta ly tâm dung môi để loại xác vi sinh và những mảnh vụn của tế bào vi sinh Sau đó người ta cô đặc dung dịch bằng ultrafiltration.

• Tính chất enzyme này là nó trầm hiện trong ammonium sulfate 30-80% Sau khi ly tâm, ta hòa tan chất trầm hiện trong nước khử ion

• Ta loại bỏ muối ammonium sulfate bằng diafiltration Sản phẩm thu hoạch là 𝝰-amylase khá tinh khiết

Yield is measured by protein assay Purity is determined by electrophoresis

Sản xuất 𝞪-amylase (tiếp.)

• Trong tiến trình này, người ta không có assay để đo lường hoạt tính 𝞪-amylase cho nên người ta dựa trên lượng protein của sản phẩm và độ tinh khiết của nó để ước đoán số lượng enzyme trong sản phẩm.

• Trong thí dụ này lượng protein trong dung môi sau khi ly tâm là