vchapter công nghệ sản xuất enzyme 1

Nó sẽ bám enzyme ở pH thiên nhiên của nó, trong khi đó những protein khác không bám các hạt này, chảy xuyên qua cột.•Ta có thể thay đổi điều kiện môi trường pH hoặc nồng độ muối của môi

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME

Đại học Nông LâmMarch 2024

Chương 1

▪ Mục tiêu là thiết lập một kỹ thuật để sản xuất enzyme có độ tinh khiết mà khách hàng yêu cầu với giá cả phải chăng nhứt.

▪ Để thiết lập kỹ thuật này, ta cần biết:1 Nguồn gốc của enzyme (chương 2).2 Enzyme có đặt tính gì?

3 Phương pháp đo lường khối lượng và chất lượng của enzyme.

1 Các kỹ thuật trích chiết và tinh lọc

Các dữ kiện sau đây giúp ích trong việc thiết lập một phương pháp sản xuất enzyme:

•Khả năng hòa tan ̣(trong nước? hay trong cồn)•Khối lượng phân tử của enzyme

•Điểm đằng điện, điện tính của phân tử enzyme.

•Khả năng bám chuyên biệt của enzym

2 Kiểm soát chất lượng và Bảo đảm chất lượng

•Chúng ta cần một phương pháp để nhật diện enzyme này, để đo lường số lượng và độ tinh khiết của nó Đây là Kiển soát chất lượng

•Chúng ta cũng cần phải bảo đảm rằng tiến

trình sản xuất nhất định, không sai lệch và tất cả những thành phần vật liệu xử dụng trong tiến trình sản xuất đều có xuất xứ rõ rệt Đây là Bảo đảm chất lượng.

Dưới đây là vài kỹ thuật tinh lọc thông dụng

Kỹ thuật trầm hiện Salting out

• Phân tử Protein cuộn theo hình thể mà những amino acid (AA) kỵ nước tụ lại nhau để cho những AA háo nước bao phũ bên ngoài,

Những AA này nối liền với các phân tử nước xung quanh bằng hydrogen bonds Đây là lớp hòa tan (solvation layer) của phân tử protein làm cho the protein hòa tan trong nước.

• Khi nồng độ muối trong dung dịch gia tăng, ion muối bẻ gảy hydrogen bond của lớp hòa tan này làm cho các phân tử protein dính liền nhau và đưa đến sự trầm hiện

Lớp hòa tan xung quang phân tử protein Lưu ý những phân tử nước dang hydrogen bond ra đến phân tử protein Hình phải cho thấy 2 phân tử protein trầm hiện

Kỹ thuật trầm hiện Salting out (tiếp.)

• Khả năng protein hòa tan trong nước khác nhau tùy vào mức độ háo nước hay kỵ nước trên bề mặt của phân tử protein Proteins có bề mặt có tính chất kỵ nước cao thì dể trầm hiện.

Hoffmeister Series

• Anions and cations được xếp hạng theo khả năng trầm hiện proteins của chúng Đó là Hoffmeister Series.

• Đối với Anions

• Đối vớ Cations

Kỹ thuật trầm hiện Salting out (tiếp.)

• Một trong những muối dùng nhiều nhứt để salt out là ammonium sulfate (AS) vì:

➢ Nó rất hòa tan trong nước

➢ Hầu hết tất cả protein đều trầm hiện trong dung dịch bảo hòa AS (4M).

➢ Khi hòa tan AS, nó không phát ra nhiệt, do đó tránh protein không bị denatured.

➢ Dung dịch bảo hòa AS có tỉ trọng thấp (1.25g/mL), nhờ vậy mà ta có thể ly tâm protein xuống đáy và AS dung dịch ở trên

Preparation of ammonium sulfate %

Preparation of ammonium sulfate %

•Cách xử dụng bảng Ammonium sulfate (AMS)•Ta muốn trần hiện một protein của plasma ở

nồng độ 25% ammonium sulfate (AMS).

•Bắt đầu là plasma, tức là 0% AMS Xem bảng cột trái “Starting % saturation” Dùng hàng

“0” Nhìn bảng hàng dưới “Final Perccent

Saturation to be Obtained”, chọn cột 25 T cần 144g AMS cho 1L plasma để đạt được 25% AMS

Kỹ thuật sắc ký hoán chuyển ion (IEC)

• Kỹ thuật IEC dựa vào sự hấp thu có thể bám, nhả (reversible) của những phân tử hòa tan (enzyme) đến ion có điện tính đối ngược Đây là những ion cố định và có bán được trên thị trường.

• Hầu hết IEC gồm có 5 giai đoạn

Ion exchange chromatography (cont.)

Sắc ký trao đổi ion (tiếp.)

•Tùy theo điện tính của phân tử ta muốn cho bám, ta có thể dùng hạt trao đổi anion (anion exchanger) hay cation (cation exchanger):

Sắc ký trao đổi ion (tiếp.)

•Đây là vài enzyme nguồn vi sinh xử dụng

trong kỹ nghệ thực phẩm và điểm đẳng điện: ➢ 𝞪- amylase pI 4.2

➢ Glucoamylase pI 3.8➢ Protease pI 4.1➢ Lipase pI 3.12

•Điện tính trên bề mặt của enzymes thay đổi tùy theo pH của môi trường

Sắc ký trao đổi ion (tiếp.)

•Khi pH = pI thì enzyme trở nên trung tính.•In native environment, pH ~7, the above

enzymes are negatively charged

Sắc ký trao đổi ion (tiếp.)

•Do đó ta xử dụng anion exchanger để tinh lọc enzyme Hạt sắc ký này mang điện tính

dương Nó sẽ bám enzyme ở pH thiên nhiên của nó, trong khi đó những protein khác

không bám các hạt này, chảy xuyên qua cột.•Ta có thể thay đổi điều kiện môi trường (pH

hoặc nồng độ muối của môi trường), làm cho enzyme đang bám sẽ nhã ra và ta có thể thu hoạch được.

Gel Filtration Chromatography (GFC)

•Gel filtration tách các phân tử dựa vào kích thước của phân tử khi chúng chảy qua cột sắc ký này.

•Những hạt sắc ký này hình cầu và có khe Khi các phân tử nhỏ chảy xuyên qua cột sắc ký sẽ lọt vào các khe và di chuyển lâu hơn mới

xuyên qua cột được Trong khi đó phân tử lớn không lọt vào các khe, mà chỉ chảy thẳng

xuyên qua cột nên sẽ chảy ra trước.

Gel Filtration Chromatography (cont.)

Gel filtration bead

Gel Filtration Chromatography (cont.)

•Các phân tử protein sẽ chảy ra khỏi cột vào

các thời điểm khác nhau, phân tử lớn ra trước, xong đến phân tử trung và cuối cùng là phân tử nhỏ.

•Ta hứng các dung dịch từ cột sắc ký theo thứ tự thời gian thì ta sẽ có các protein lớn trung và nhỏ trong những ống chứa khác nhau Tức là ta đã tách các protein này ra tùy theo kích thước phân tử Td enzyme có phân tử nhỏ

•Người ta ít dùng GFC trong sản xuất vì không thích hợp cho sản xuất đại trà

•Đây là kỹ thuậtdùng để loại bỏ muối khỏi sản phẩm Nó còn được gọi là Ultrafiltration (UF) Td khi ta dùng ammonium sulfate (AS) để trầm hiện enzyme Dung dịch enzyme sẽ có nhiều AS Ta dùng UF để loại AS này.

•Trong kỹ thuật này thì ta cho dung dịch sản

phẩm chảy dọc theo bề mặt của màng lọc Một phần dung dịch sẽ xuyên qua lổ nhỏ trên màng lọc Phần lớn của dung dịch sẽ chảy thẳng dọc theo màng lọc trở về bể chứa.

•Màng lọc được phân loại (tùy theo kích thước các lổ này) thành Molecular Weight Cut Off (MWCO) Td 1,5 10 30, 100 MWCO

UF cartridge of hollow fiber membranes Ống màng siêu lọc loại sợi rổng

Sơ đồ màng siêu lọc loại sợi rổng dùng trong tiếng trình UF

Tiến trình loại bỏ các phân tử nhỏ trong sản phẩm Màng lọc tách các protein ra tùy theo kích thước các lổ trong màng lọc

Affinity Chromatography (AF)

•AF phân tách protein dựa trên sự tương tác có thể đảo ngược giửa 1 protein và chất bám

chuyên biệt của nó, và chất này đang kép trên hạt sắc ký.

•Các chất bám này phải còn giử được khả

năng bám của chúng với phân tử mục tiêu sau khi ta rửa sạch chúng để loại trừ những phân tử khác Sau khi được tách ra khỏi chất bám, các phân tử bám phải còn giử được trạng thái linh hoạt.

Affinity Chromatography (cont.)

•Sau đây là vài phản ứng tương tác thường được xử dụng trong AF:

➢ Enzyme Substrate analogue, cofactor, inhibitor.

➢ Antibody Antigen.➢ Hormone Receptor

Kiểm soát chất lượng

• Sự thành công của phương pháp sản xuất (trích lọc / tinh lọc) là dựa vào số thu hoạch và độ tinh khiết của sản phẩm.

A Thu hoạch

Ta đo số thu hoạch bằng assay Có nhiều loại assay đo lường số lượng sản phẩm thu hoạch Bài giảng trình bày hai loại: assay protein và assay hoạt lực.1 Assay Protein.

• Enzymes là protein Tuy nhiên không phải tất cả protein trong sản phẩm đều là enzyme Đó là tùy vào độ tinh khiết của sản phẩm Có bao nhiêu phần trăm trong sản phẩm là enzyme? Đó là độ tinh khiết của sản phẩm

Quality control (cont.)

•Nếu sản phẩm là 100% tinh khiết, nghỉa là tất cả proteintrong sản phẩm đều là enzyme

Assay protein cho kết quả là lượng protein trong sản phẩm Td.kết quả là 100mg/ml và:

➢Nếu sản phẩm 100% tinh khiết Thì nồng độ enzyme trong sản phẩm là100mg/mL x 100% = 100mg/mL

➢Nếu sản phẩm 60% tinh khiết, thì nồng độ enzyme trong sản phẩm là 100mg/mL x

60% = 60mg/mL Phần còn lại 40% là những protein khác không phải enzyme

Quality control (cont.)

•Có nhiều loại assay đo protein Sau đây là 5 loại thường dùng nhứt:

➢UV-Vis Absorbance at 280nm➢The Bradford assay

➢The Bicinchoninic Acid assay (BCA)➢The Folin-Lowry assay

➢The Kjeldahl method

2 Assay sinh học (hoạt tính)

Quality control (cont.)

•Khách hàng chú tâm đến hoạt tính sinh học của enzyme hơn là số lượng protein của sản phẩm Hoạt tính là khả năng enzyme xúc tác chất nền của nó (substrate).

•Hoạt tính của enzyme đo lường bằng đơn vị (Unit) Đó là số lượng enzyme có khả năng

xúc tác phản ứng biến 1 𝞵mole chất nền trong 1 phút ở một nhiệt độ nhứt định.

• Mổi enzyme có 1 chất nền chuyên biệt, td enzyme thrombin xúc tác biến fibrinogen thành fibrin.

Quality control (cont.)

•Assay sinh học đo lường khả năng của

enzyme xúc tác chất nền Người ta đo khả năng này dựa trên số lượng chất nền mất đi hay số lượng sàn phẩm được tạo ra.

Quality control (cont.)

•Người ta đo độ tinh khiết bằng gel

electrphoresis Kỹ thuật này dùng điện để tách các protein trên sàn gel, dựa trên kích thước phân tử của chúng

•Sản phẩm enzyme cho chạy song song với một hổn hợp của các protein mẫu có khối lượng phân tử được biết (markers).

•Những vạch trên làn sản phẩm là những loại

protein chứa trong sản phẩm Vị trí của mổi vạch này sẽ được so sánh với vị trí của marker Từ đó ta có thể tính ra được khối lượng phân tử của

protein trong lằng đó

Phân tích điện di của các sản phẩm thu hoạch sau mổi giai đoạn tinh lọc protein Protein

markers trong làn bên trái

Quality control (cont.)

•Tiến trình tinh lọc của thí dụ này gồm 5 giai đoạn Một mẫu sản phẩm của mổi giai đoạn được nhặt và cho chạy electrophoresis

•Ta nhận thấy rằng số vạch trong mổi làn giảm dần sau mổi giai đoạn tinh lọc.

•Làn 5 chỉ cỏn chứa 1 vạch thôi, ở vị trí ngang với vạch 35kD của làn marker Điều này chỉ rằng sản phẩm của làn 5 có độ tinh khiết

100% và lượng protein trong sản phẩm này hoàn toàn là enzyme mình muốn tinh lọc, và nó có khối lượng phân tử là 35kD

Quality control (cont.)

•Trong trường hợp mà có nhiều hơn 1 vạch trong sản phẩm cuối cùng người ta phải đo độ đậm của mổi vạch và tính số phần trăm của mổi vạch là bao nhiêu Người ta dùng máy đo độ dầy đặc

•Phần trăm độ đậm của vạch ở vị trí 35kD là độ tinh khiết của sản phẩm enzyme.

Quality control (cont.)

• Đây là 1 thí dụ của kỹ

thuật ước đoán phần trăm độ đậm của mổi vạch của gel electrophoresis.

• Mổi làn trên gel được scan và máy sẽ vẻ ra 1 đường dựa trên độ đậm của mổi vạch Vạch đậm sẻ có ̣đỉnh cao Vạch dầy sẽ có đỉnh rộng Diện tích của mổi đỉnh sẽ được tính ra thành phần trăm của tổng cộng độ đậm của tất cả các đỉnh

Bảo đảm chất lượng - Quality assurance (QA)•QA chỉ đến những hoạt động hành chánh và

phương pháp thực hiện trong một hệ thống

chất lượng, sao cho những yêu cầu và tiêu chí cho mổi sản phẩm, mổi dịch vụ hay hoạt động đều phải đạt được hết.

•Đó là sự đo lường, sự so sánh có hệ thống với một tiêu chuẩn hoặc là sự theo dỏi các tiến

trình, cùng với hệ thống phản hồi với mục tiêu là để tránh những sai sót trong tương lai.

Quality assurance (QA)

•Khách hàng chỉ mua sản phẩm của chúng ta khi họ có niềm tin vào hệ thống của mình Nghỉa là:

➢Chu trình sản xuất của tất cả lô sản phẩm phải hoàn toàn giống nhau và ghi nhận.

➢Tất cả các thành phần xử dụng cho sản phẩm phải được ghi xuống và có thể truy cập

➢Tất cả máy móc xử dụng phải được kiểm tra thường xuyên.

➢Nhân viên sản xuất sản phẩm này phải được huấn luyện hoàn toàn và hồ sơ nhân viên của họ phải được cập nhựt…

Quality assurance (QA)

•Đây là một thí dụ tưởng tượng: Chúng ta sản xuất enzyme thrombin từ máu bò Khách hàng của chúng ta dùng sản phẩm này để làm đông máu bệnh nhân khi giải phẩu Thình lình bệnh nhân có phản ứng khác thường đối với sản phẩm này Một cuộc điều tra xảy ra sẽ nhằm vào:

➢Nguồn gốc lượng máu xử dụng để làm sản

phẩm này, các bò này từ trại nào, bò giết trong lò sát sanh nào, nhân viên nào xử lý máu.

➢Xuất xứ và số lượng hóa phẩm xử dụng➢Có những sai biệt gì đối với tiến trình sản

xuất thông tường

Cấu trúc hóa học của enzyme

Enzyme là một protein hình cầu do nhiều

chuổi polypeptide nối liền nhau tạo thành hình thể của nó

Chuổi amino acid bên hông tạo thành hình thể củ protein

•Trên cấu trúc này có 1 điểm gọi là điểm tác động (Active site, viền vàng trong hình sau) Điểm này là nơi enzyme tác động với những phân tử khác Hình thể ba chiều của điểm này do cấu trúc lập thể của enzyme tạo ra Điểm này rất chuyên biệt Bất kỳ chất nào tác động với enzyme phải nhận dạng và bám vào điểm tác động này Các chất đó được gọi là chất

nền (substrate) Chúng hợp với enzyme tạo thành hổn hợp enzyme-chất nền.

•Enzyme chỉ bám vào chất nền hoàn toàn vừa khích với nó mà thôi.

Làm thế nào mà điểm tác động và chất nền kết hợp nhau được?

Có hai mô hình:

•Mô hình ổ khóa và chìa khóa.•Mô hình tạo vừa khít

Mô hình ổ khóa và chìa khóa

•Điểm tác động của enzyme gắn vừa khít với chất nền Enzyme là ổ khóa và chất nền là chìa khóa.

Phản ứng enzyme gồm hai giai đoạn:

i Giai đoạn bám Một số các amino acid trong điểm tác động thu hút và bám giử

chất nền với enzyme theo một chiều hướng chuyên biệt, tạo thành hợp chất enzyme-

Mô hình Tạo vừa khít

•Mô hình ổ khóa và chìa khóa dựa trên giả thuyết là điểm tác động của enzyme và chất nền ráp nhau vừa khít Nhưng trong thực tế thì enzyme không có hình thể cứng rắn Do đó mô hình Tạo vừa khít ra đời để giải thích các hiện tượng thực tế.

•Theo mô hình Tạo vừa khít thì enzyme sẽ bám vào chất nền, tuy nhiên sư kết hợp này không vừa khít Lực giử chặt hợp chất này không mạnh lắm

Mô hình Tạo vừa khít

•Sau đó cả hai enzyme và chất nền thay đổi

hình thể một ít để sự kết hợp thật vừa khít và thật chặt Trong mô hình này enzyme thay đổi hình dạng liên tục nhằm gắn khít với chất

•Enzyme cắt chất nền thành hai phần Sản phẩm được nhả ra và enzyme trở lại hiện trạng giống y như lúc ban đầu

Induced-Fit Model

Cofactors and coenzyme

•Một enzyme cofactor là một chất không phải là protein, nó làm cho enzyme trở nên hoạt động.

•Những loại cofactor vô cơ như chất kẻm hoặc sắt.

•Cofactor hữu cơ còn được gọi là co-enzyme, Td vitamins

•Cofactor hoặc co-enzyme có thể có vị trí

trong điểm tác động để giúp sư kết hợp giửa enzyme và chất nền của nó.

Cofactors and coenzymes

Chất ngăn cản enzyme

•Chất ngăn cản cạnh tranh chiếm vị trí trong điểm tác động, như vậy nó ngăn cản không cho chất nền nào bám vào điểm này.

•Chất ngăn cản không cạnh tranh bám vào một vị trí khác trên enzyme với điểm tác động

Điểm này gọi là allosteric site Khi chất ngăn cản không cạnh tranh bám vào allosteric site, thì hình thể của điểm tác động của enzyme bị thay đổi, là nó không còn vừa vặn với chất

nền nữa Do đó chất nền không thể bám được

Allosteric sites

Ứng dụng của Enzymes trong kỹ nghệ

Bốn lãnh vực úng dụng enzymes là:•Chất xúc tác kỹ nghệ.

•Chất trị liệu.

•Thuốc thử phân tích

•Công cụ chuyển hóa (manipulative tools)

Enzymes dùng làm xúc tác trong kỹ nghệ

Aspergillus niger là nấm

Enzymes dùng làm thuốc trị liệu

EnzymePhản ứngNguồn gốc Ứng dụng

Loại trừ

L-Asparagine là chất cần thiết cho sự tăng trưởng của tế bào ung thư

E coli

Hóa trị cho bệnh ung thư bạch cầu

•L-asparagine là nhu cầu dinh dưởng cho cả tế bào thường và tế bào cancer

•Asparagine Synthetase (ASNS) xúc tác sự tổng hợp asparagine từ aspartate và glutamine Khác với tế bào cơ thể là tế bào cancer không thể tự tạo ra asparagine mà phải tùy vào nguồn cung cấp từ máu và mô

•Cho enzyme L-asparaginase vào sẽ diệt nguồn asparagine này, làm tế bào cancer mất dinh

dưởng và chết.

Enzymes dùng làm thuốc phân tích (analytical reagents)

EnzymePhản ứngNguồn gốcỨng dụngGlucose

oxidase Oxi hóa glucose

Aspergillus niger

Dò ra chất glucose trong máu

Peroxidase Oxi hóa chất màu dùng H2O2

Horse radish

Đo lường hormone và kháng thể

Trong phương pháp ELISA, người ta muốn đo nồng độ protein Ta gắn chất nền không màu vào protein Khi cho enzyme vào hổn hợp protein-chất nền thì enzyme phân giải chất nền thành sản phẩm có màu Nồng độ chất nền-protein cao thì màu càng đậm Ta đo độ đậm này bằng quang phổ sẽ biết nồng độ

protein.