ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT SINH HỌC ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT SINH HỌC ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE LỜI MỞ ĐẦU Enzyme amylase là một trong những enzyme được quan tâm nghiên cứu sớm và nhiều nhất hiện nay. Các ứng dụng của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau ngày càng được quan tâm nghiên cứu. Ngoài những ứng dụng tiêu biểu được trình bày ở trên, enzyme amylase còn có ứng dụng trong sản xuất giấm, bột ngọt, bánh kẹo, nước trái cây… Ngày nay người ta đang nghiên cứu các nguồn amylase có chất lượng cao và có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp đồng thời khắc phục những hạn chế của các phương pháp sản xuất tạo enzyme amylase năng suất cao. Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột. Hiện nay, αamylase là một trong những enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trong công nghiệp thực phẩm, αamylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng Thông qua sự thủy phân tinh bột, αamylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng như dextrin, maltose, glucose… Trước đây, người ta thu nhận αamylase từ malt là chủ yếu. Ngày nay, với nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về αamylase tăng cao nên việc áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với lượng lớn αamylase là rất cần thiết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Bộ môn Công nghệ sinh học

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH KỸ THUẬT SINH HỌC

ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE

Sinh viên thực hiện : Cấn Văn Luật

Giáo viên hướng dẫn :

Hà Nội, 10/1/2023

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 5

1.1 Giới thiệu sản phẩm 5

1.1.2 Nguồn gốc 5

1.1.3 Phân loại enzyme amylase 6

Chương 2 : Lựa chọn và thuyết minh dây chuyền 17

2.1.Công nghệ sản xuất amylase 17

2.2.Nguyên liệu sản xuất 18

2.2.1.Từ động vật 21

2.2.2Từ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 21

2.3 Giống vi sinh vật 23

2.3.1 Vi sinh vật trong sản xuất enzyme Amylase 23

2.3.2 Đặc điểm sinh lý, dinh dưỡng và cơ chế tổng hợp sản phẩm trao đổi chất 24

2.4 Nguyên liệu sử dụng trong sản xuất enzyme amylase 28

2.5 Thiết bị trong quy trình sản xuất 29

2.5.1: Tiệt trùng 29

2.5.2 Trộn giống 30

2.5.3: Lọc khung bản 31

2.5.4: Lọc (lọc lần 2) sử dụng màng siêu lọc 32

2.5.5 Băng chuyền con lăn 32

2.6 Thuyết minh quy trình công nghệ sản xuất enzyme amylase bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt 34

2.6.1: Xử lý nguyên liệu 36

2.6.2: Chuẩn bị giống 36

2.6.3: Trộn giống 36

2.6.4 Nuôi cấy 36

2.7 Thu nhận emzyme 37

2.7.1 Trích ly enzyme 37

2.7.2 Lọc (lọc lần 1) 38

2.7.3: Sử dụng màng siêu lọc UF 38

Chương 3 : Sơ đồ quy trình công nghệ 38

LỜI MỞ ĐẦU

Enzyme amylase là một trong những enzyme được quan tâm nghiên cứu sớm vànhiều nhất hiện nay Các ứng dụng của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau ngày càngđược quan tâm nghiên cứu Ngoài những ứng dụng tiêu biểu được trình bày ở trên,enzyme amylase còn có ứng dụng trong sản xuất giấm, bột ngọt, bánh kẹo, nước tráicây… Ngày nay người ta đang nghiên cứu các nguồn amylase có chất lượng cao và cóthể sản xuất theo quy mô công nghiệp đồng thời khắc phục những hạn chế của cácphương pháp sản xuất tạo enzyme amylase năng suất cao Ở Việt Nam bước đầu đã cónhiều nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là

trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột.

Hiện nay, α-amylase là một trong những enzyme được sử dụng rộng rãi trongnhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, chăn nuôi thú y, chẩn đoán bệnh…Trongcông nghiệp thực phẩm, α-amylase đóng vai trò đặc biệt quan trọng

Thông qua sự thủy phân tinh bột, α-amylase tạo ra những sản phẩm có giá trị dinhdưỡng như dextrin, maltose, glucose…

Trước đây, người ta thu nhận α-amylase từ malt là chủ yếu Ngày nay, với nềncông nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhu cầu về α-amylase tăng cao nên việc áp dụngnhững kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy vi sinh vật để thu dễ dàng hơn với lượng lớn α-amylase là rất cần thiết

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu sản phẩm

1.1.1 Enzyme Amylase

Amylase là một loại enzyme rất cần thiết cho hệ tiêu hóa, thuộc nhóm enzyme

thủy phân Alpha-amylase (α-amylase) là dạng chủ yếu của enzyme amylase, được tìm

thấy ở người và các động vật có vú khác, giúp thủy phân liên kết alpha của cácpolysaccharide như tinh bột và glycogen, tạo ra những cơ chất đơn giản như glucose vàmaltose Alpha-amylase cũng có mặt trong các hạt thực vật sử dụng tinh bột như một loạinăng lượng dự trữ, trong vi khuẩn và trong chất tiết của một số loại nấm

Ở người, enzyme amylase có trong nước bọt (hay còn gọi là ptyalin) và trong dịchtiết của hệ tiêu hóa Amylase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng trong cácngành như công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt đối với ngành côngnghiệp thực phẩm

Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các Enzyme nàythuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhómpolysaccharide với sự tham gia của nước

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrinhạn chế Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịchtiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vikhuẩn Trong nước bọt của người có nhưng ở một số loài động vật có vú thì không cónhư ngựa, chó, mèo Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàntất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin) Amylase của maltthủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởinấm men

Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong côngnghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thựcphẩm

1.1.2 Nguồn gốc

Năm 1814 : Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tácdụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C

Năm 1833 : Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa

có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng HyLạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase) Sau này theo đề nghị của Duclo,Enzyme phân giải tinh bột được gọi là Amylase

Năm 1851 : Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bộtthành đường Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người

và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâmnghiên cứu

Năm 1862 : Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháphấp thụ chọn lọc

Năm 1949 : Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000.Năm 1950 : Englard và Singer cho biết số chu chuyển của b-Amylase là 250000

Đến năm 1952 : người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có

4 Enzyme α-Amylase

Năm 1971 : Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid

đã xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoamylase trong canhtrường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase vàtransglucosilase

Hiện nay các nước trên thế giới sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm Enzyme, trong

đó Nhật là nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch,Thụy Điển, đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng sản xuất Enzymenổi tiếng trên thế giới Bên cạnh đó trong những năm gần đây các nước Đông Âu vàTrung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme

Nếu như ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho việcchuyển hóa tinh bột thành đường, thì ở Viễn Đông Amylase thường được sản xuất từ nấmmốc trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột Như hãng Novo đã cónhiều chế phẩm Enzyme Amylase đang được sử dụng rộng rãi trong các ngành côngnghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệpgiấy…

1.1.3 Phân loại enzyme amylase

Hình 1.1 Các loại enzyme endoAmylase và exoAmylase

Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào )

- Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh.

Nhóm Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hayα-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hayoligo-1,6-glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) CácEnzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

- Exoamylase Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của

chuỗi polysaccharide Nhóm này gồm có:

+ β-Amylase (EC 3.2.1.2)

+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)

 Sự khác biệt giữa các loại Enzyme Amylase:

- Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở

pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt

- Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóacủa cơ chất Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tácdụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau.

- Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạtđộng, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau

1.1.3.1 Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1)

α-amylase (α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase) thuộc họ của endo-amylase xúc tácquá trình thủy phân ban đầu của tinh bột thành oligosaccharides ngắn hơn thông qua việcphân cắt của α-D-1,4 glycozit, có thể được tìm thấy trong các vi sinh vật, thực vật và sinhvật bậc cao Sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân α-amylase là oligosaccharides

có độ dài khác nhau với cấu hình và dextrin giới hạn, tạo thành hỗn hợp của maltose,maltotriose và phân nhánh oligosaccharides 6-8 glucose đơn có chứa cả hai mối liên

kết α-1,4 và α-1,6

a Cấu tạo

Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng50.000 đến 60.000 Dal Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn

Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến nay người ta đã biết rất rõ

các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là

taka-Amylase từ Apergillus oryzae và α-taka-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể

không gian cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạchacid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzymeα-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau

Hinh 1.2: Cấu trúc không gian của α-Amylase

b) Cơ chế tác dụng của α -Amylase

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-Amylase cókhả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinhbột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-Amylasekhông chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độrất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình hai giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạothành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảmnhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếptục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rấtchậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose(vì vậy, người ta cho rằng α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốcglucopiranose 1)

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucosecolagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose Quamột thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87%maltose Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì khôngphân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên

dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose

và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose,maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủyphân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ítmaltose Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy,người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase:

+ Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

+ Giai đoạn đường hóa:

Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide

Amylase oligosacharide poliglucose

Maltose maltotriose maltotetrose

c) Đặc tính α -Amylase

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loạiα-Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase là một protein giàutyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếmkhoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme:

+ α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

+ Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da (Knir 1956; Fisher,Stein, 1960 )

+ Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

+ Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

α-Amylase

Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).

α-Amylase là một metaloEnzyme Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sựhình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme(Modolova, 1965) Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của Enzyme khi bị tác độngbởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giải protein Nếu phân

tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất.α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các Enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàmlượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các Amylase đều bị kiềm hãm bởi cáckim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+,

Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-Amylase Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hếtα-Amylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử tinh bột do Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành

dextrin tới hạn phân nhánh.

Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợichủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Nồng độ α-Amylase của vi sinh vật tương đốilớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-Amylase củanấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-Amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH= 3,6 và

0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bịbất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-Amylase của nấm sợi hình như không

giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989) Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảoquản tốt ở pH = 5,0 - 5,5; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ2,5 - 2,8 Ở 0oC và pH = 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.

Bảng 1.1: Một số tính chất của α-Amylase từ vi sinh vật

1.1.3.2 Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)

β-amylase: còn có tên gọi khác là 1,4-α- D -glucan maltohydrolase, chỉ có thể tácđộng thủy phân tinh bột ở vị trí liên kết glycosid thứ hai, do đó chỉ thủy phân được đếnsản phẩm là maltose, pH hoạt động tốt nhất là 4,0 – 5,0

a) Cấu tạo

β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm Ở trong các hạtngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinhbột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử củamạch Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β

Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình nảymầm của hạt Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu nhưkhông được tổng hợp ở hạt khô Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó đượctích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này là mộtphân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ đượcphóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da

b) Cơ chế tác dụng của β-Amylase

β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải bắt đầu từđầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-Amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucosidethì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rấtnhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin

Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột

Tinh bột     - amylase  maltose (54-58%) + β-dextrin (42-46%)

(glucogen)

Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới95%

đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giảiphóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme.

1.1.3.3 Enzyme γ-Amylase (glucoamylase)

γ-amylase (glucan 1,4-α-glucosidase): sẽ phân cắt các liên kết α (1-6) glycosid,cũng như liên kết α-1,4 glycosid cuối cùng ở đầu không nhân của tinh bột,tạo ra sảnphẩm cuối cùng là glucose, pH hoạt động tối ưu là khoảng 3

Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai iso-Enzyme I và II khác nhau ởkhả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng Amyloglucosidase

I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không

có cả hai tinh chất này

b) Cơ chế hoạt động

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lầncác liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được cácliên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ) Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộcvào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng nhưkích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài(amylose và amylopectin) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và cácoligosaccharit

c) Tính chất

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside Khithuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượttừng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Enzyme này có

nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4; α-1,6-glucan- 4; 6-glucohydrolase; glucoamylase;amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoại bào.

Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thuỷphân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin,dextrin, panose, iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuảcác loại Enzyme khác Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanhhơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polisaccharide có nhánh như amylopectin,glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH = 3,5 – 5,5 và nhiệt độ

500C Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và khôngđược bảo vệ bởi Ca2+

1.1.3.4 Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose, panose

và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở vi sinh vậtnhưng đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm (đại mạch, thóc nảy mầm) Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R–Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside haydextrin-6-glucocanhydrolase Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase và β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là5,1

1.1.3.5 Enzyme pullulanase (α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41)

Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan vàcác dextrin tới hạn Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớnđến tác động của Enzyme Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bênliên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này

Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liênkết α-1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có haigốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase

và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn

1.1.3.6 α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase)(EC 3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này Giống như glucomylase, nó thủy phânmaltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột Maltase và glucozyltranferase làmột Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong cácglucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu

Chương 2 : Lựa chọn và thuyết minh dây chuyền 2.1.Công nghệ sản xuất amylase

2.1.1 Theo phương pháp nuôi cấy bề mặt

Là phương pháp nuôi cấy mà vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt môi trường Trongnuôi cấy bề mặt vi sinh vật sẽ được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường đặc(còn gọi là môi trường len men bán rắn), nhưng chủ yếu vẫn là nuôi cấy trên môi trườngđặc Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme thường sử dụng môi trường đặc để nuôi cấythu nhận enzyme từ vi sinh vật

Môi trường lên men bán rắn thường dùng nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, cám

mì, bã đậu nành, ngô mảnh,… Tùy theo đối tượng vi sinh vật và mục đích nuôi cấy khácnhau mà bổ sung thêm các chất khác nhau và một số thành phần khác cho thích hợp Khinuôi cấy theo phương pháp lên men bán rắn, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môitrường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường, rồi sinh tổng hợp ra enzyme ngoại bào

và nội bào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, cònenzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật

Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng và hoạt tính enzyme cao, chế phẩm dễsấy khô, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, không cần sử dụng những thiết

bị đặc biệt, tiêu thụ năng lượng ít nên có thể áp dụng ở nhiều địa phương Tuy nhiênnhược điểm của nó là tốn diện tích mặt bằng và đòi hỏi lượng nhân công lớn, khó cơ giớhóa trong sản xuất

Ưu điểm khác của phương pháp này là dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi các visinh vật khác, thường chỉ xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ nên dễ xử lí Tuy nhiên,phương pháp này có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự độnghóa

2.1.2 Phương pháp nuôi cấy chìm

Còn gọi là phương pháp nuôi cấy bề sâu Phương pháp này vi sinh vật được nuôitrong môi trường lỏng và được nuôi trong các thùng lên men Các thiết bị lên men đượclắp đặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp õi, hệ thống điều chỉnh pH vànông độ các chất dinh dưỡng

Tùy theo chủng loại vi sinh vật mà thành phần của môi trường lỏng sẽ được thayđổi cho thích hợp Phương pháp này được dùng phổ biến trong lên men qui mô côngnghiệp So với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy chìm ít choáng diệntích bề mặt, dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi Tuy nhiên phươngpháp này đòi hỏi đầu tư nhiều chi phí cho trang thiết bị Phương pháp này có ưu điểm là

dễ dàng cơ giới hóa, tự động hóa, ít tốn diện tích, song chúng đòi hỏi sự đầu tư lớn, khóđược thực hiện ở nhiều nơi, và sẽ rất khó khăn trong việc xử lí sự xâm nhập của các visinh vật lạ

Với sự tiến hành đơn giản , có thể tiến hành nuôi cấy đồng thời nhiều vi sinh vật ,

dễ sử lý cục bộ , có thể tận dụng được các phế phụ phẩm nông nghiệp và công nghiệp nên

ta chọn phương pháp nuôi cấy bề mặt

- Khi lọc, quay bánh răng bởi răng nhỏ yếu ớt, bánh răng, ổ trục vít điều khiển tấm

ép sẽ được đặt các tấm lọc và lọc thép tấm dày và lực đẩy giữa các tấm (vải) nén, để đảmbảo rằng các tài liệu được lọc với áp suất làm việc (bùn) trong buồng lọc là lọc điều áp

Hình 1.1.14: Máy ép khung bản

(1) Các bộ phận giá đỡ: cơ sở và bộ lọc khung ép để hỗ trợ tânn kết nối với cácthành phần khác Máy lọc khung bản chủ yếu bao gồm các tấm đẩy, tấm ép, phần ép vàcác thành phần chính

(2) Phần bộ lọc: là một hằng số theo thứ tự của các dầm chính và kẹp giữa các tấmlọc của môi trường lọc tấm lọc ( vải lọc ) thành phần, tạo thành một đơn vị bộ lọc ( buồnglọc )

(3) Phần ép: nó là đơn vị sức mạnh của sức ép, các thành phần chính của một chiếcrăng nhỏ yếu, bánh răng, trục vít Tổng số các cấu trúc, thiết kế hợp lý, hiệu suất đáng tincậy, vận hành đơn giản, dễ dàng bảo trì, ứng dụng rộng rãi và là lý tưởng cho hệ thốngtreo đơn

2.2 Nguyên liệu sản xuất

Enzyme Amylase có trong các tế bào sinh vật, động thực vật, các loại nấm mốc.Muốn thu nhận Enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào

Trong cơ thể sinh vật, Enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào nhưnhân microsom … Enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào, để đi vào dung dịchchiết Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào Việc phá vỡ cấu trúc tế bào cóthể sử dụng một số cách sau:

+ Biện pháp cơ học như nghiền xay với bột thuỷ tinh , cát thạch anh hoặc máy xayđồng hoá…

+ Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton, glycerin, etyl axetat …

+ Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV…

Sau khi nghiền nhỏ Enzyme được chiết rút bằng nuớc hay dung dịch đệm thíchhợp, hoặc dung dịch muối trung tính …

Dung dịch thu được sau khi chiết ngoài Enzyme còn có các tạp chất khác nhưprotein phi Enzyme, muối, gluxit …

Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận Enzyme có độ tinh khiết cao Có rất nhiềuphương pháp tinh sạch Enzyme sau đây là một số phương pháp cơ bản được sử dụngrộng rãi và có hiệu quả :

+ Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp thẩmtích qua màng bán thấm Tính chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân tử nhỏ

đi qua Các chất có trọng lượng phân tử lớn bị giữ lại (Enzyme, protein )

+ Để loại protein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiềuphương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, điện di lọc gel…