LỰA CHỌN DÂY CHUYỀN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT LLYSINE THEO PHƯƠNG PHÁP FEDBATCH CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về Lysine 1.1.1. Khái niệm và đặc điểm Amino acid là những hợp chất hữu cơ sinh học quan trọng chứa nhóm chức amin ( NH2 ) và acid carboxylic ( COOH ). Amino acid rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của người và động vật, đặc biệt là các amino acid thiết yếu. Sự thiếu hụt amino acid nói chung và amino acid thiết yếu nói riêng sẽ rất đến các tình trạng bệnh lý khác nhau. Lysine là một trong số 9 α – amino acid thiết yếu trong tổng số 22 amino acid, được tìm thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và có thể tổng hợp từ vi sinh vật. Lysine chứa hai nhóm ( NH2 ) và một nhóm ( COOH ). Trong cấu tạo phân tử Lysine có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quan học là D–Lysine và L–Lysine Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một quay sang phải và một quay sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật chỉ hấp thu được Lysine dạng L. L – Lysine tồn tại ở dạng tinh thể rắn màu trắng trong điều kiện bình thường, có màu xanh tím khi tương tác với ninhydrin, nhiệt độ phân hủy 224 – 225°C. Lysine có vị chát, dễ tan trong nước, axit và kiềm nhưng khó tan trong cồn và không tan trong ete.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH ĐỀ TÀI THIẾT KẾ PHÂN XƯỞNG LÊN MEN SẢN XUẤT L-LYSINE THEO PHƯƠNG PHÁP FED-BATCH Đổi tên thành lựa chọn dây chuyền công nghệ sản xuất Sinh viên thực Ngô Thành Lực Mã số sinh viên 20190350 Lớp BF1 02 – K64 Giảng viên hướng dẫn TS Nguyễn Tiến Thành TS Lê Thị Lan Chi Công nghệ Sinh học Bộ môn Năm 2022 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Lysine 1.1.1 Khái niệm đặc điểm Amino acid hợp chất hữu sinh học quan trọng chứa nhóm chức amin ( - NH2 ) acid carboxylic ( - COOH ) Amino acid cần thiết cho sinh trưởng phát triển người động vật, đặc biệt amino acid thiết yếu Sự thiếu hụt amino acid nói chung amino acid thiết yếu nói riêng đến tình trạng bệnh lý khác Lysine số α – amino acid thiết yếu tổng số 22 amino acid, tìm thấy cấu trúc phân tử protein tự nhiên tất sinh vật sống tổng hợp từ vi sinh vật Lysine chứa hai nhóm ( - NH2 ) nhóm ( - COOH ) Trong cấu tạo phân tử Lysine có carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quan học D–Lysine L–Lysine Hai đồng phân quang học có tính chất hóa lý giống nhau, khác khả làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, quay sang phải quay sang trái làm tính chất sinh học chúng hồn toàn khác thể sinh vật hấp thu Lysine dạng L L – Lysine tồn dạng tinh thể rắn màu trắng điều kiện bình thường, có màu xanh tím tương tác với ninhydrin, nhiệt độ phân hủy 224 – 225°C Lysine có vị chát, dễ tan nước, axit kiềm khó tan cồn không tan ete 1.1.2 Cấu tạo Công thức phân tử Lysine là: C6H14N2O2, khối lượng phân tử: 146.188 g/mol, điểm đẳng điện pI = 9.59, codon mã hóa cho Lysine AAA AAG Lysine cịn có tên gọi khác 2,6 – diaminohexanoic aicd α – ε – diaminocaproic Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian L-Lysine L-Lysine D-Lysine Hình 1.2 Hai dạng đồng phân quang học Lysine 1.1.3 Vai trò ứng dụng Lysine - Vai trò ứng dụng axit amin nói chung + Amino axit có nhiều ứng dụng cơng nghiệp Khoảng 65% amino acid ứng dụng công nghiệp thực phẩm, 31% ứng dụng chăn nuôi 4% ứng dụng y tế, dược phẩm nguyên liệu cho cơng nghiệp hóa học Trong cơng nghiệp thực phẩm, amino acid sử dụng riêng kết hợp để tăng vị, tăng giá trị dinh dưỡng Nhiều amino acid sử dụng y học, đặc biệt điều chế thuốc để điều trị sau phẫu thuật Trong cơng nghiệp hóa học, amino acid sử dụng nguyên liệu sản xuất polymer, sợi polyamin nhựa lysine – isocyanate Một số amino acid sử dụng để sản xuất đồ mỹ phẩm làm chất hoạt động bề mặt Một số khác sử dụng nguyên liệu ban đầu để chế tạo chất diệt cỏ,… - Vai trò ứng dụng Lysine người + Lysine thành phần thiếu protein thể, đóng vai trị quan trọng việc hấp thụ Canxi, chuyển hóa acid béo, tạo bắp, phục hồi sau chấn thương hay sau phẫu thuật Lysine giữ vai trò sống cịn tổng hợp Protein, chìa khóa sản xuất enzyme, hoocmon kháng thể giúp thể tăng cường sức đề kháng + Lysine thuộc nhóm amino acid không thay nghĩa thể người tự tổng hợp mà phải lấy từ thức ăn Nguồn thức ăn chứa nhiều Lysine thịt, trứng, sữa, phomat vài loại cá Lysine có nhiều ngũ cốc, đầu nành Tuy nhiên Lysine dễ bị phân hủy trình chế biến + Cơ thể người thiếu Lysine thể khơng hoạt động bình thường, đặc biệt trẻ em xảy tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển Chính việc đưa Lysine vào phần ăn trẻ em vô cần thiết + Cụ thể hơn: bổ sung đủ lượng Lysine cho thể giúp cải thiện lo âu triệu chứng tâm lý khác, tăng khả hấp thụ trì lượng Canxi thể, giảm biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường Lysine có vai trị quan trọng lứa tuổi dậy thì, giúp thể thể tăng cường chiều cao, ngăn ngừa phòng chống bệnh liên quan đến loãng xương hay bệnh xương khớp cho lứa tuổi, đặc biệt đối tượng người cao tuổi Hơn nữa, Lysine có tác dụng việc trì hệ miễn dịch khiến thể phát triển men tiêu hóa cách tốt nhất, giúp kích thích ăn ngon miệng trẻ biếng ăn Thiếu Lysine, trẻ chậm lớn, cịi cọc, trí tuệ phát triển Nhu cầu Lysine người lớn 30mg/kg/ngày trẻ nhỏ 35 mg/kg/ngày ( #*) Bảng 1.1: Hàm lượng Lysine số thực phẩm có bữa ăn hàng ngày Thực phẩm Lysine (mg/100g thực phẩm) Thị bò thịt cừu nạc 3582 Thịt gà 3110 Thịt lợn 2757 Đậu nành 2634 Cá ngừ 2590 Tơm 2172 Hạt bí ngơ 1386 Trứng 912 Đậu trắng 668 - Vai trò ứng dụng Lysine động vật + Lysine thành phần thiết yếu cho tăng trưởng động vật, phải có thức ăn chăn ni để đảm bảo giá trị dinh dưỡng phần ăn cân Bổ sung loại acid amin vào thức ăn chăn ni giúp bảo vệ diện tích đất trồng Vật ni sử dụng loại thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao tiêu thụ lượng thức ăn đi, điều ảnh hưởng tích cực đến nông nghiệp + Nhu cầu Lysine gia súc gia cầm cao Trung bình gà lợn cần 4,2 – 4,5% tổng số protein phần ăn Nếu thiếu Lysine, hiệu suất chuyển hóa protein thức ăn thành protein động vật thấp Ngồi ra, lợn bị giảm khối lượng , lười ăn, da khô, rụng lông Lysine ảnh hưởng đến việc tổng hợp hemoglobin Khi phần ăn thiếu kali Lysine quan trọng trở thành cation trì cân tế bào bắp thịt - Sản lượng tiêu thụ Lysine toàn giới L – Lysine thường sản xuất thương mại dạng L – Lysine monohydrochloride, với độ tinh khiết cao 98.5% trọng lượng, tương ứng với 78.8% trọng lượng Lysine tự Vào năm 1985, sản lượng L – Lysine toàn giới 70 nghìn tấn, năm 1996 250 nghìn tấn, năm 2003 600 nghìn năm 2015 2,2 triệu tấn, năm 2020 3,5 triệu Dự đoán tiềm tăng trưởng thị trường tiêu thụ L – Lysine năm tới ước tính vào khoảng 10% năm Hình 1.3: Sự tăng trưởng sản xuất Lysine giới qua năm 1.1.4 Các dạng tồn Lysine thị trường - L – Lysine HCl Hình 1.4: L – Lysine HCl L – Lysine HCl 98.5% amino acid sử dụng rộng rãi Đây amino acid cần thiết yêu cầu có chế độ ăn lợn, gà, vịt, gia cầm - L – Lysine sulphate Hình 1.5: L – Lysine Sulphate Thành phần: L – Lysine (51- 65%), Sulphate ( 15%), acid amin khác (3%), muối amoni (1%), kim loại nặng (0,003%),… L – Lysine sulphate bổ sung vào L – Lysine HCl làm thức ăn cho vật nuôi, chúng có hiệu L – Lysine HCl - L – Lysine dạng thực phẩm chức Các thực phẩm chức bổ sung L – Lysine giúp điều trị bệnh lây lan mụn rộp ( Herpes ), hỗ trợ điều trị ung thư, giảm lo âu triệu chứng tâm lý, tăng cường hấp thụ canxi, giảm biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường, hỗ trợ đường rượt khỏe mạnh, tăng cường phát triểu trẻ nhỏ Hình 1.6: Sản phẩm chức Anabol naturals + Có thể gọi tắt sản phẩm chức L – Lysine kết hợp với B6 + Thành phần: L – Lysine, Vitamin B6 ( Pyriodoxine hydrochloride ), Mg, Si, Men, Gluten, Muối, Đường sản phẩm sữa + Mỗi Capsule cung cấp: 500mg L-Lysine, 6mg B6 + Viên uống L – Lysine Double Strength 1000mg + Thành phần chính: L – Lysine ( L – Lysine HCl ) 1000mg + Các thành phần khác: Microcrystalline Cellulose, Silicon Dioxide, Stearic acid, Vegetarain Coating,… Hình 1.7: Viên uống L – Lysine + Hỗ trợ tổng hợp Collagen, hỗ trợ tim mạch, xương khớp Double Strength 1000mg + L – Lysine 500mg Puritans pride + Thành phần chính: L – Lysine + Thành phần khác: Gelatin, Contains < 2% of: Slica, Vegetable Magnesium, Stearate + Sản phẩm giúp tăng chiều cao, phát triển bắp, hạn chế đau tức cơ, đau nhức xương dậy thì,… Hình 1.8: L – Lysine 500mg Puritans pride 1.2 Các phương pháp sản xuất Lysine 1.2.1 Phương pháp thủy phân Người ta sử dụng acid kiềm để thủy phân nguyên liệu có chứa hàm lượng protein cao táo, đậu tương, lạc, nấm men,… Hiện phương pháp sử dụng Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp yêu cầu thiết bị sản xuất phải bền với acid hay kiềm, số amino acid bị phá hủy trình thủy phân, trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân tạo nhiều acid amin dạng D, trường hợp sử dụng acid để thủy phân gây ô nhiễm môi trường không khí lượng acid dư bay trình thủy phân sản phẩm tạo thường có giá thành cao 1.2.2 Phương pháp tổng hợp hóa học Đây phương pháp sử dụng hóa chất để tổng hợp amino acid Glycine L-alanine sản phẩm tổng hợp Mặc dù nhà khoa học tìm nhiều xúc tác bất đối xứng để tổng hợp đồng phân quang học mong muốn, chi phí cao nên lượng nhỏ amino acid alanine, glycine, methionine, phenylalanine, threonine, trytophan valine sản xuất đường hóa học 1.2.3 Phương pháp enzyme Người ta ủ 100 mL dung dịch 10% D,L-α-aminocaprolactam (điều chỉnh đến pH 8), 0,1g tế bào Cryptococus laurentii 0,1g Achromobacter obae nov.sp cách lắc nhẹ 40oC 24h kết tạo L-lysine Cryptococus laurentii sản sinh L-aminocaprolactam hydrolase mơi trường có chứa L-α-aminocaprolactam, glucose thành phần khác Achromobacter obae sản sinh aminocaprolactam racemase sử dụng dạng D- L- aminocaprolactam chất cảm ứng Giá trị pH tối ưu hai cho phép chuyển hóa cách hiệu 1.2.4 Phương pháp lên men Ở phương pháp ta tiến hành nuôi cấy vi sinh vật thích hợp mơi trường thích hợp để thu nhận amino acid Phương pháp giúp ta thu nhận amino acid dạng L Phương pháp nhìn chung sử dụng nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản phát triển mạnh vi sinh vật giúp ta thu suất cao Quan trọng giá thành sản phẩm phương pháp thấp so với sản xuất phương pháp khác 1.2.5 Phương pháp kết hợp hóa học sinh học Người ta kết hợp phương pháp hóa học sinh học Bằng đường hóa học, thu nhận hợp chất dạng L-keto tiền chất amino acid Sau sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa chất thành amino acid Cơ sở khoa học phương pháp trình trao đổi chất, vi sinh vật có khả tích lúy amino acid mơi trường Ở điều kiện sống bình thường, lượng amino acid mà chúng tổng hợp thường đủ đáp ứng nhu cầu thân, điều kiện thích hợp đó, lượng amino acid vượt xa nhu cầu thân vi sinh vật tích lũy lại tế bào hay mơi trường Hiện tượng gọi siêu tổng hợp amino acid vi sinh vật Bảng 1.2: So sánh phương pháp thu nhận Lysine Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp thủy phân + Quá trình phản ứng nhanh triệt để + Dễ điều khiển kiểm sốt q trình + Sản phẩm chứa tạp chất + Hiệu suất q trình khơng cao, giá thành cao + Cần thiết bị chống ăn mòn, bền với acid kiềm + Khi thủy phân kiềm tạo nhiều D – Lysine + Dùng acid gây ô nhiễm môi trường Dựa vào thành phần hàm lượng chất tế bào vi sinh vật để thiết kế thành phần môi trường lên men Trong tế bào vi sinh vật, C chiếm khoảng 50% trọng lượng khô tế bào Các nguyên tố C, N, H, O chiếm tổng cộng khoảng 92%, lại yếu tố vi lượng Những yếu tố có hàm lượng cao yếu tố ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật Vì vậy, mơi trường lên men, hàm lượng C, N thường cao nhiều so với nguyên tố vi lượng 1.4.2 Ảnh hưởng thành phần lên môi trường lên men Nước: Tế bào vi sinh vật chứa 70% nước, hoạt động sống vi sinh vật đồng hóa, dị hóa diễn mơi trường nước Do vậy, nước yếu tố quan trọng thiếu q trình lên men Ngồi ra, nước cần thiết cho hoạt động khác trình lên men như: gia nhiệt, giải nhiệt,… Nước sử dụng môi trường lên men phải nước loại bỏ hồn tồn ion khống để khơng làm thay đổi hàm lượng khống mơi trường lên men Nguồn carbon: Carbon có ảnh hưởng đến hình thành sinh khối, sản phẩm sơ cấp thứ cấp vi sinh vật Sản xuất L-lysine Corynebacterium glutamicum quy mơ phịng thí nghiệm, nguồn C chọn thường tinh khiết (glucose), sản xuất cơng nghiệp thường dùng nguồn C rẻ tiền có nguồn gốc tự nhiên bột ngô, bột ngũ cốc, mật rỉ đường mía củ cải Những nguồn C chứa nhiều tạp chất nên cần chế biến loại bỏ tạp chất có ảnh hưởng khơng tốt đến vi sinh vật trước đưa vào sử dụng Khi khử trùng môi trường lên men cần tách riêng nguồn đường khử nguồn nito hữu phân tử đường glucose dễ dàng phản ứng với gốc -NH2 amino acid (phản ứng caramen hóa) tạo hợp chất có màu nâu đen, gây ức chế sinh trưởng tế bào Nguồn nito: nito có vai trị quan trọng giai đoạn hình thành sinh khối, tham gia vào nhiều cấu trúc tế bào Ở quy mơ phịng thí nghiệm, nguồn N vơ lấy từ muối amonium, muối nitrate, nitrite; N hữu lấy từ cao nấm men, peptone, dịch chiết bắp,… Trong đó, dịch bắp nguồn cung cấp C, N amino acid cần nên thường dùng công nghiệp Đối với chủng Corynebacterium glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng methionine threonine, người ta sử dụng 19