vchapter công nghệ sản xuất enzyme 4

Trong quy trình sản xuất đường từ nước mía, người ta loại bỏ chất tinh bột ô nhiểm trong nước mía dùng amylase.Chỉ số Dextrose Tương Đương Dextrose Equivalent - DE➢ Một chỉ số đựơc đặt r

CHƯƠNG 4

CHẾ BIẾN TINH BỘT VÀ ĐƯỜNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ENZYME

I Thủy phân tinh bột

• Tinh bột là dạng dự trử carbohydrate thông thường nhứt ở

thực vật Thực vật, vi sinh và các sinh vật bật cao hơn đều

dùng nó Do đó có nhiều loại enzyme có thể thủy phân nó

• Tinh bột của thực vật xuất hiện ở dạng hạt có nhiều kích

thước và tính chất khác nhau tùy loài thực vật

• Sự khác biệt lớn nhứt là tỉ lệ Amylose : Amylopectin giửa các thực vật, Td Bắp sáp chứa 2% amylose, trong khi đó các bắp khác chứa 80% amylose

Cấu trúc amylopectin và amylose trong tinh bột gồm chuổi glucose nối liền nhau

Nối glucosidic ∝ - 1, 4 trong amylose Trong khi đó amylopectin còn có thêm nối ∝- 1,6

• Hầu hết các đơn vị glucose của Amylopectin nối nhau bằng nối glycosidic ∝-1,4, khoảng 4 – 6% glucose nối nhau bằng nối ∝-1, 6 tạo ra nhánh Muốn thủy phân amylopectin hoàn toàn thành glucose, người ta cần enzyme có thể thủy phân nối

∝-1, 4 và enzyme thủy phân nối 𝞪-1, 6

• Xưa người ta thủy phân tinh bột bằng acid Những nhược

điểm của phương pháp này là:

➢Cần phải có dụng cụ chống acid ăn mòn

➢Sản phẩm có màu, có mùi & chứa nhiều muối tro (sau khi trung hòa acid)

➢Tốn năng lượng để đun nóng và khó điều chỉnh

• Có 2 quy trình thủy phân tinh bột tùy theo ứng dụng:

➢Để tạo sản phẩm để dùng Td Tạo ra sirô

➢Để loại bỏ chất tinh bột Td Trong quy trình sản xuất

đường từ nước mía, người ta loại bỏ chất tinh bột ô nhiểm trong nước mía dùng amylase

Chỉ số Dextrose Tương Đương (Dextrose Equivalent - DE)

➢ Một chỉ số đựơc đặt ra để biểu thị mức độ thủy phân của

tinh bột là DE

• Dextrose equivalent DE dựa trên số nối glycosidic

DE của maltose = 50 (Maltose = 2 glucose Một nối cắt, một nối không cắt Tức là chỉ 50% nối trong tinh bột bị cắt)

• Hoặc dựa trên số glucose được thủy phân / tổng số carbohydrate

• DE của tinh bột = 0 (không có glucose) DE glucose = 100

Sự chuyển hóa tinh bột

• Phương pháp chuyển hóa bằng acid / nhiệt từ tinh bột thành đường có năng xuất thấp, thủy phân không hoàn toàn (DE =

35 – 45) Dùng ∝-amylase thì DE = 60 – 80 Khoảng thời gian này enzyme dùng không chịu nhiệt nên DE vẫn còn

thấp Bắt đầu từ 1970’ người ta tìm được amylase của vi

trùng chịu nhiệt DE bây giờ là 95 – 98

• Có 3 giai đoạn chuyển hóa tinh bột là Hóa keo

(gelatinization), Hóa lỏng (liquefaction) và Hóa đường

(Saccharification)

1 Giai đoạn hóa keo (gelatinization)

• Hạt tinh bột gồm:

➢ Lớp kết tinh (crystalline lamella) chứa chuổi thẳng

amylose và chuổi nhánh amlopectin Các chuổi này dính nhau nhờ nối hydrogen

➢ Lớp vô định hình (amorphous lamella) xen kẻ với lớp

kết tinh

• Hóa keo là tiến trình làm gảy nối hydrogen giửa các phân

tử của tinh bột Tiến trình này gồm:

➢ Khi hâm nóng, nước thấm vào lớp vô định hình

➢ Nhiệt làm cho lớp kết tinh dể thấm Nối hydrogen thấm

và tan trong nước Phân tử amylose / amylopectin hòa nhập vào lớp vô định hình

➢ Nước càng thấm nhiều vào hạt tinh bột Phân tử

amylose / amylopectin lan ra vùng nước xung quanh và hạt bột bị rả ra

• Tiến trình hóa keo làm cho phân tử amylose lộ ra sẳn sàng để cho amylase thủy phân

• Hầu hết tinh bột hóa keo ở khoảng 60 – 800C tùy theo tỉ lệ

amylose / amylopectin trong tinh bột

Cấu trúc của hạt tinh bột

Cấu trúc của hạt tinh bột

Vòng kết tinh của hạt tinh bột gồm phần lớn các chuổi glucose nhánh (∝-1, 6 amylopectin) và một ít chuổi thẳng (∝-1,4 amylose)

Nối hydrogen trong và giửa chuổi amylose / amylopectin

2 Giai đoạn Hóa lỏng (Liquefaction)

• Mục tiêu của giai đoạn này là thủy phân các phân tử của tinh bột với enzyme trong điều kiện ấn định về nhiệt độ, áp suất

• Maltodextrins chỉ hơi ngọt thôi

• Giai đoạn này cũng tạo ra một số thành phần không hòa tan

3 Giai đoạn Hóa đường (Saccharification)

• Trong giai đoạn này người ta dùng amyloglucosidase ( amylase hay glucoamylase) để thủy phân amylodextrin tạo thành glucose và maltose 𝞬-amylase thủy phân nối

𝛄-glucosidic 𝞪-1, 6

• Trên lý thuyết thì amyloglucosidase có thể hoàn toàn thủy phân tinh bột thành glucose Trong thực tế thì người ta thấy còn một ít maltose và isomaltose

• Người ta cũng có thể dùng một enzyme thủy phân tinh bột chuổi nhánh 𝝰- 1, 6 trong giai đoạn Hóa đường này Đó là enzyme pullulanase

• Giai đoạn Hóa đường cho ra nước sirô có DE ~ 96 - 98

II Sản xuất sirô fructose từ tinh bột

• Mục tiêu chánh của sirô là cho vị ngọt Các loại đường có độ ngọt khác nhau Xếp hạng vị ngọt giửa những loại đường như sau từ

ngọt nhứt xuống ít ngọt hơn là:

Fructose Sucrose Glucose Maltose Lactose

• Vì Fructose ngọt nhứt nên người ta chuyển sirô glucose thành sirô fructose bắp (High-Fructose Corn Sirup – HFCS).

• Quy trình sản xuất HFCS gồm 2giai đoạn:

1 Giai đoạn hóa đường Tinh bột của bắp thủy phân thành

glucose chỉ bằng enzyme glucoamylase (đây cũng là tên của amylase Enzyme này có khả năng thủy phân nối glucosidic 𝞪- 1, 6) hay cùng với ∝-amylase.

𝞬-2 Giai đoạn isomerize Glucose được biến thành fructose.

• Người ta phải trích tinh bột ở nhiệt độ cao (vì tinh bột khó tan trong nước), nên các enzymes dùng phải từ nguồn chịu nóng

và có hoạt tính tối hảo ở nhiệt độ cao

• Bơm sirô glucose xuyên qua cột chứa glucose isomerase

Glucose biến thành fructose cho sản phẩm HFCS-90 (90% fructose) Người ta pha loảng với glucose ra thành HFCS-55 hay HFCS-42, tức là sirô có nồng độ fructose là 55 hay 42%

• HFCS là từ tinh bột bắp Mỹ sản xuất nhiều bắp Do đó

HFCS dùng nhiều ở Mỹ như trong thức ăn, uống như nước ngọt, bánh mì, yaourt

• HFCS rẽ hơn và ngọt hơn đường Nó ở dạng thể lỏng nên dễ

xử dụng

• Đường nhân tạo (AS) có cấu trúc hóa học hoàn toàn khác với đường thiên nhiên Bốn loại AS được chấp thuận ớ Mỹ là:

saccharin, aspartame, acesulfame-K và sucralose

• Dr Fahlberg của Đại học Maryland đang oxi hóa toluene

sulfonamides Ông làm dính chất này trên tay Khi ông ăn

trưa ông thấy bánh mì của ông quá ngọt là do chất dính trên tay Ông đặt tên chất này là saccharin

• Giáo sư Hough của Cao đẳng Queen Elizabeth tạo ra một hổn hợp chlorinated sugar dùng đo lường 1 hóa chất trong phòng thí nghiệm Sau khi tổng hợp được chất đó, ông bảo 1 sinh

viên người Ấn “test” chất đó xem dùng được không Sinh

viên này “taste” nó và cho biết rất ngọt Đây là sucralose

• Saccharin là derivative của sulphonamide toluene Aspartame

là aspartic acid, Acesulfame K là isothiazinone dioxide Chỉ

có sucralose là xuất xứ từ sucrose

• Đường sucrose cũng như AS bám vào điểm bám trên nụ vị

giác, tạo ra cảm giác ngọt Các điểm bám này có đầy trên bề mặt của lưởi và trong miệng

• AS có calorie thấp hay zero calorie vì cơ thể không thể tiêu hóa AS Các chất AS chỉ đi qua đường tiêu hóa chứ không

được hấp thụ Chỉ có sucralose là làm từ đường Tuy nhiên cơ thể chúng ta không nhận ra chất đường nên không biến

dưởng, do đó không tạo ra calories

III Hiện tượng thủy phân cellulose và ứng dụng

• Khi dầu hỏa cạn thì Biofuel sẽ dùng để thay thế Nguyên liệu của biofuel là đường từ tinh bột Hiện tại thì hầu hết

carbohydrates trong sinh khối sẳn có là từ cellulose,

hemicellulose và lignocellulose (cellulose và lignin) Nhưng

ít ai dùng vì phí tổn biến ra chất đường quá cao

1 Cấu trúc của cellulose

➢Cellulose là một polysaccharide gồm một chuổi thẳng với hằng ngàn đơn vị glucose nối liền nhau bởi nối b-1, 4

➢Các chuổi cellulose không nhánh chen chật vào nhau nhờ nối hydrogen giửa các chuổi Nhờ vậy mà làm cho thân cây vững chắc

Tinh bột, ∝ Glucose, nối ∝ -1, 4 Tất cả đơn vị đều cùng một hướng, nhóm OH vị trí 1 (xanh) và vị trí 4 đều hướng xuống

Cellulose, 𝛽 glucose, nối 𝛽-1, 4 Nhóm OH ở vi trí 1 hướng lên trong khi OH ở vị trí 4 hướng xuống Do đó đơn vị glucose 2 phải lộn đầu để hai OH của glucose 1 và 2 có thể nối nhau và nối 𝛽-1,4 giửa glucose 1 và 2 nằm phía trên Vì glucose 2 lộn đầu nên nối giửa glucose 2 và 3 nằm phía dưới

Tinh bột và glycogen: các nối giửa đơn vị glucose là ∝-1, 4, 𝞪 1, 6 và có nhánh; Cellulose: Nối 𝞫 1, 4 và không nhánh

2 Thủy phân cellulose

• Vi trùng chỉ có thể xử dụng glucose trong tiến trình tạo nhiên liệu sinh học

• Các sợi cellulose chen đặc nhau Nó không tan trong nước, trong dung môi hữu cơ hoặc trong acid hay kiềm yếu

• Người ta có thể phá hủy cấu trúc cellulose để biến nó thành dạng vô định hình bằng nhiệt độ (3000C) và áp suất (25MPa) (1megapascal=145 psi) Có 2 cách thủy phân cellulose:

1 Dùng acid mạnh đậm đặc ở nhiệt độ và áp suất cao

2 Dùng enzyme ở điều kiện ôn hòa

• Phương pháp 1 không chọn vì chất độc của phế phẩm tạo ra ảnh hưởng đến vi trùng / men trong tiến trình lên men

Thủy phân cellulose bằng Enzyme và phí tổn

• Người ta cần các vi trùng có thể tiết ra những enzymes, cần loại thủy phân cellulose thành đoạn ngắn; và loại thủy phân các đoạn này thành glucose

• Sản xuất biofuel từ cellulose phí tổn cao hơn từ tinh bột Td phí tổn sản xuất ethanol từ cellulose là $1.5 / gallon, từ tinh bột là $1 / gallon

• 50% phí tổn sản xuất biofuel là do tiến trình thủy phân

cellulose bằng enzyme Trong tiến trình này phí tổn sản xuất enzyme cellulase chiếm khoảng 15-25% tổng phí tổn

IV Ứng dụng enzyme trong lên men

• Hầu hết tất cả tiến trình thủy phân tinh bột trong kỹ nghệ đều dùng vi sinh để tạo ra enzyme Vi sinh được dùng nhiều nhứt

là Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquifaciens,

Aspergillus niger và yeast Saccharomyces cerevisiae

• Amylases là enzyme chánh dùng trong kỹ nghệ thực phẩm, sản xuất bia, dệt, detergent và dược phẩm

Aq =

aqueous

• Enzymes trong men thủy phân tinh bột thành glucose Trong môi trường hiếm khí, men biến glucose ra ethanol và CO2

• Trong tiến trình làm bánh mì, người ta ủ bột nhồi ở nơi ấm

Enzyme thủy phân tinh bột thành đường cho men tạo ra rượu

và CO2

1 Ứng dụng Enzymes trong quy trình làm bánh mì

• Bột mì chứa 82% tinh bột, 12.5% protein, 3.5% chất xơ,

1.5% chất béo và 0.5% tro (chất khoáng) Người ta dùng

enzyme để xúc tác thành phần tinh bột và chất xơ

• Enzyme amylase cho vào bột nhồi sẽ biến tinh bột thành

đường đơn và làm thay đổi độ nhuyển của bột, làm nó mềm hơn

• Ba enzymes dùng để thủy phân tinh bột là ∝, 𝛽 và 𝝲 amylase.

• Hai loại carbohydrate chánh trong tinh bột là:

1 Amylose

➢Chiếm 20% tinh bột, là chuổi glucose thẳng

➢Gắn liền nhau bằng nối ∝-1, 4 Cả ∝ và 𝛽 amylase đều có thể thủy phân amylose

2 Amylopectin

➢Chiếm 80% tinh bột, là chuổi glucose nhánh.

➢Gắn liền nhau bằng nối ∝-1, 4 và ∝-1, 6 Cả ∝ and 𝛽

amylase đều thủy phân nối ∝-1, 4 được, nhưng không thủy phân được nối ∝ -1, 6 Ta dùng 𝞬-amylase cho nối này.

• Sơ đồ 2 dạng carbohydrate của tinh bột: chuổi thẳng amylose chuổi nhánh amylopectin Sơ đồ chỉ vị trí hai nối alpha

Loại carbohydrate Amylose Amylopectin

% trong tinh bột 20% 80%

Cấu trúc đơn vị glucose Chuổi thẳng Chuổi nhánh Nối Glycosidic a-1,4 a-1,4 and a-1,6

Nhuộm với iodine thành Xanh Nâu đỏ

a-and b-amylase thủy

phân a-1,4 a-1,4 not a-1,6 Hòa tan trong nước Hòa tan Ít hòa tan

Hòa tan trong nước nóng Không trương nở

Không tạo keo

Trương nở và thành keo

1. ∝ -amylase

• a-amylase thủy phân một cách ngẫu nhiên nối ∝-1, 4 dọc theo chuổi của tinh bột tạo thành những chuổi 1 đơn vị

(glucose), 2 đơn vị (maltose) hoặc dài hơn (dextrin)

• Bột lúa mì (wheat) chứa rất ít, hoặc không chứa ∝ amylase

Do đó người ta phải bổ xung enzyme này vào mới có thể

thủy phân tinh bột này được Người ta dùng lúa mạch ủ

(malted barley) là nguồn enzyme ∝ amylase

• Ngày nay người ta dùng amylase từ nấm nhiều hơn từ vi

trùng vì nó không chịu nhiệt Nó bị biến tính (denatured)

khi nướng bánh Nếu enzyme còn tiếp tục hoạt động sau

khi nướng thì nó sẽ thủy phân bánh mì thành chất keo lỏng

2. 𝛽-amylase

• b-amylase thủy phân nối ∝-1, 4 giửa đơn vị thứ 2 và thứ 3 cuối cùng của chuổi tinh bột và mổi 2 đơn vị từ cuối trở lên phía đầu của chuổi Kêt quả là maltose (disaccharide)

• Tinh bột của lúa mì chứa rất nhiều b-amylase Nó có thể

thủy phân amylopectin từ cuối chuổi tinh bột cho đến khi

nó gặp nhánh thì ngưng Kết quả là một số maltose và

dextrin

3 𝝲-amylase.

• 𝞬-amylase còn được gọi là amyloglucosidase

• Enzyme này thủy phân nối 𝝰- 1,6 glycosidic và nối 𝝰- 1, 4 glycosidic cuối cùng ở đầu non reducing của amylose và amylopectin để cho ra glucose

• Người ta dùng enzyme này để thủy phân tinh bột trong bắp thành glucose trong tiến trình sản xuất sirô fructose nồng

độ cao

• pH tối hảo cho hoạt tính của enzyme này là khoảng pH 3

Quy trình làm bánh mì

• Đầu tiên tinh bột phải được thủy phân thành chuổi đơn vị đường, cuối cùng enzyme thủy phân thêm thành đường đơn để men có

thể xử dụng khi lên men ̣(nổi bột lên) Men chứa 𝞪-amylase, Bột

mì chứa 𝞫-amylase Do đó kết quả giai đoạn thủy phân là một

hổn hợp gồm glucose và oligosaccharide Men tiêu thụ glucose để lên men.

• Men biến đường đơn này thành rượu và CO2 trong tiến trình lên men.

• Cả hai rượu và CO2 được tạo ra trong bột nhồi Cả hai bị đẩy ra bởi nhiệt trong giai đoạn nướng bánh.

• Bánh mì ngon phải có bột nhồi đủ dẻo để có thể nở khi nó nổi

Bột nhồi cũng phải đàn hồi để có thể giử gas khi nó nổi.; và nó

cũng phải chắc để có thể giử vững hình dáng của bánh.

Chất gluten

• Gluten là nhóm protein có trong các hạt lúa mì, lúa rye và lúa barley Nó chiếm một tỉ lệ tương đối ít so với tinh bột Lúa mì chứa 63-73% tnh bột, 7-15% protein

• Gluten như nhớt và đàn hồi Khi bột pha trong nước thì gluten nở ra tạo thành mạng lưới những sợi

mỏng người ta có thể căng chúng ra mà không đứt Chúng có tính đàn hồi trở về hình dạng củ

• Gliadins và glutenins là hai protein chánh của

gluten Khi thấm nước thì hai protein này lập tức

hợp nhau tạo thành gluten

Sau khi bột nở khoảng 2 tiếng, gluten tạo thành các sợi của mạng lưới khi bột đã trương nổi hoàn toàn

• Bịnh Celiac là bịnh miển nhiểm tự hủy (autoimmune disorders) Khi người bị Celiac ăn phải gluten làm hệ miển nhiểm tấn công màng niêm ruột Khoảng 1 trong

70 New Zealanders bị Celiac

• Nhiều hảng chế biến thực phẩm dùng bột không chứa gluten như bột khoai tây Tuy nhiên các bột không có gluten thường hay thiếu các dưởng chất khác như chất

xơ, sắt, kẻm, folate, niacin (vitamin B3), thiamin (Vit B1), riboflavin (Vit B2), calcium, Vit B12 và

phosphorus

Số lượng gluten trong vài loại bột thông dụng

• Để cho bánh mì không gluten (khi dùng bột khoai

tây) còn được dẻo, người ta có thể trộn vào bột các hydrocolloids như chất nhũ hóa (emulsifier), chất ổn định, protein bột bắp, protein whey

2 Áp dụng enzymes để sản xuất các thức uống

• Hầu hết cất rượu bia bắt đầu bằng mạch nha lúa

barley Mạch nha dùng làm nguồn tinh bột, protein và enzyme cần thiết để biến thành đường đơn, amino

acid và peptide cho tiến trình lên men

• Con men (td Saccharomyces) biến đường thành rượu

và CO2 Con men dùng amino acid, peptide để tăng trưởng, sinh sản và tạo vị cho rượu

Quy trình sản xuất rượu bia

• Malting Giai đoạn hạt barley ngâm trong nước, ủ ở nhiệt độ cao

để nẩy mầm

• Milling & Mashing Giai đoạn hạt barley ủ được xay nát ra cho enzyme tiết ra và biến tinh bột thành đường đơn Kết quả là dung dịch đường cao

• Lautering là giai đoạn lược dung dịch đường vào một bể chứa lớn

• Boiling Đun nước đường (gọi là wort) với trái hop cho có vị

đắng và mùi thơm; đồng thời cũng để a/ bất hoạt hóa enzyme, b/

để trầm hiện proteins, c/ cô đặc và d/ khử trùng wort

• Lên men Sau khi tách rời chất lỏng ra khỏi trầm hiện, để cho

chất lỏng nguội lại để cho con men vào để tiến trình lên men bắt đầu.

• (Enzyme biến đường thành glucose; Men biến glucose thành

rượu)